قياس أحادي فوسفات الجوانوزين الدوري (cGMP) في الأنسجة الصلبة باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم التنافسي (ELISA)

Haleigh A. Brown; Barbora Piknova; Ji Won Park; Alan N. Schechter

doi:10.3791/68432

مقالة منهجية

قياس أحادي فوسفات الجوانوزين الدوري (cGMP) في الأنسجة الصلبة باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم التنافسي (ELISA)

DOI:

10.3791/68432

⸱

يوليو 3, 2025

Haleigh A. Brown¹ , Barbora Piknova¹ , Ji Won Park¹ , Alan N. Schechter¹

¹Molecular Biology and Genetics Section, Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقيس هذا البروتوكول تركيزات أحادي فوسفات الجوانوزين الدوري (cGMP) في الأنسجة الصلبة باستخدام مقايسة الممتز المناعي التنافسية المرتبطة بالإنزيم (ELISA). يصف البروتوكول كيفية معالجة الأنسجة الصلبة ، وإجراء ELISA التنافسي ، وتحويل الامتصاص إلى تركيزات cGMP في البيكومول لكل مليلتر ، وحساب التركيزات النهائية على أنها نانومول من cGMP لكل جرام من الأنسجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المسار الرئيسي الذي ينتج أحادي فوسفات جوانوزين الدوري (cGMP) هو مسار أكسيد النيتريك (NO) -cGMP. في هذا المسار ، يحفز NO النشاط التحفيزي لغوانيل سيكلاز القابل للذوبان (sGC) ، والذي يحول جوانوزين ثلاثي الفوسفات إلى cGMP. NO له أهمية لأنه ، في الثدييات ، يعمل كموسع رئيسي للأوعية الدموية ، ومثبط لتراكم الصفائح الدموية ، ووسيط لوظيفة المناعة ، وناقل عصبي ، ولتحسين القدرة على التحمل أثناء النشاط البدني ، من بين الأدوار الفسيولوجية الأخرى. يمكن أن يساعد قياس وفرة NO في الأنسجة المختلفة في توضيح وظائفها. ومع ذلك ، لا يمكن قياس NO مباشرة بسبب عمر النصف الذي يقل عن ثوان. عادة ، يتم قياس مستقلبات NO ، النترات والنتريت ، لتقدير وفرة NO. وذلك لأن هذه الجزيئات يمكن تحويلها في الجسم الحي من خلال تفاعلات الأكسدة والاختزال. تتطلب الطريقة الأقل شيوعا لتقدير وفرة NO قياس تركيز cGMP ، وهو جزيء إشارة في اتجاه مجرى NO. ومع ذلك ، نادرا ما يتم قياس ممارسات التصنيع الجيدة في الأنسجة ، على الرغم من خلق إمكانية فهم وظائف NO في الأعضاء بشكل أفضل. لذلك ، توجد حاجة لبروتوكول لقياس تركيزات cGMP في الأعضاء والأنسجة الصلبة. في هذا البروتوكول ، تم تجانس أنسجة الخنازير التي تم جمعها ، وتم إجراء ELISA التنافسي على عينات معالجة ، وتم تحويل الامتصاص إلى نانومول من cGMP لكل جرام من الأنسجة الأصلية. باختصار ، يحدد هذا البروتوكول طريقة مبسطة لقياس تركيزات cGMP في الأنسجة الصلبة باستخدام مجموعة GMP ELISA الدورية

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحادي فوسفات الجوانوزين الدوري (cGMP) هو جزيء إشارات قادر على إحداث تغييرات فسيولوجية من خلال مسار أكسيد النيتريك (NO)-cGMP. في مسار NO-cGMP ، يرتبط NO ب guanylyl cyclase القابل للذوبان ، وهو إنزيم العصارة الخلوية الذي يحول جوانوزين ثلاثي الفوسفات إلى cGMP ، مما يزيد من نشاطه التحفيزي¹^،². تنشط الزيادة اللاحقة في تركيزات cGMP مسارات الإشارات التي تعزز توسع الأوعية³ ، مما يؤدي إلى انخفاض ضغط الدم⁴^،⁵ ، وهي خاصية الاستجابة الفسيولوجية الرئيسية لوجود NO في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أن NO يؤثر على وظيفة المناعة⁶ ، ويحسن القدرة على التحمل أثناء النشاط البدني⁴ ، ويمنع تخثر الدم عن طريق تثبيط تراكم الصفائح^{الدموية 7}.

أصبح قياس NO مباشرة أمرا صعبا بسبب عمر النصف الذي يقل عن ثوان في الجسم الحي⁸ في معظم الأنسجة البيولوجية. وبالتالي ، فإن توضيح التأثيرات الفسيولوجية ل NO يتطلب طريقة لقياس وفرته خارج الجسم الحي. لذلك ، فإن الطرق الكمية القابلة للاستخدام تتجنب القياس المباشر ل NO. تتمثل إحدى الطرق الشائعة لتقدير تركيزات NO في الأنسجة في قياس مستقلبات NO الأكثر استقرارا: النتريت والنترات⁴^،⁵^،⁹^،¹⁰^،¹¹. يتمثل المضاعفات الرئيسية لاستخدام تركيزات النتريت والنترات كمقاييس لوفرة NO في أن كلا المستقلبين يعملان أيضا كسائف NO وجزيء تخزين ، على التوالي. مستقلبات NO ، وخاصة النترات ، وفيرة في بعض الأطعمة. لذلك ، فإن التغيرات في تركيزات cGMP ، حيث أن cGMP هو مجرى NO ، مفيدة لتقدير كميات NO النشطة ، ويمكن تحديد وفرة NO دون تدخل النتريت والنترات الموجودين سابقا.

اعتمدت الأبحاث السابقة على قياس تركيزات cGMP في البلازما¹² والصفائح^{الدموية 13} ، ولكن أقل شيوعا هو قياس تركيزات cGMP في الأنسجة الصلبة. ستسمح القدرة على قياس تركيزات cGMP في الأنسجة الصلبة بتوصيف نشاط NO في أعضاء معينة. كان الهدف هو تحديد طريقة مبسطة لقياس cGMP في الأنسجة الصلبة باستخدام ELISA التنافسي. تتمثل إحدى ميزات استخدام ELISA التنافسية في أنه يتطلب معدات موجودة بشكل شائع في معظم المختبرات المهتمة ب NO ، مثل قارئ الألواح الدقيقة الذي غالبا ما يستخدم لأغراض أخرى. بالمقارنة ، تتطلب بعض طرق القياس الأخرى معدات غير مستخدمة بشكل متكرر أثناء التجارب التي تركز على NO ، مثل المجاهر¹⁴^،¹⁵ أو عداد التلألؤ¹⁶ أو الليزر¹⁷. بالإضافة إلى إمكانية الوصول إليها ، فإن قياس cGMP باستخدام ELISA التنافسي أمر حساس. يمكن الكشف عن تركيزات cGMP حتى 0.1 بيكومول (pmol) من cGMP / مل¹⁸. مع تعديلات طفيفة على بروتوكول cGMP ELISA (جدول المواد)¹⁸ ، تم إنشاء طريقة لقياس cGMP في الأنسجة الصلبة باستخدام ELISA التنافسي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا لبروتوكول دراسة لفرع الطب الجزيئي المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام NIDDK (ASP K049-MMB-23). اتبعت مجموعة الأنسجة الإرشادات التي وضعتها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه التابعة لمعهد MedStar للبحوث الصحية (رقم البروتوكول: 2006001373 2020-017). تم استخدام خنازير يوركشاير المتقاطعة الصغيرة (ذكران وأنثى) ، تتراوح أعمارها بين 3 أشهر ووزنها بين 30-35 كجم ، في الدراسة. يوضح الشكل 1 مخططا يوضح خطوات بروتوكول مجموعة cGMP ELISA. الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيطي البروتوكول. تخطيطي يوضح خطوات بروتوكول مجموعة ممارسات التصنيع الجيد ELISA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تحضير عينة الأنسجة

ملاحظة: تم حشو الأنسجة بمحلول هيبارين الصوديوم قبل جمعها ثم تخزينها عند -80 درجة مئوية قبل الاستخدام. ارجع إلى Park et ^al.19 للحصول على تفاصيل حول جمع عينات الأنسجة.

معالجة عينات الأنسجة
1. قم بتبريد طاحن المناديل والملاقط وملعقة على الثلج الجاف لمدة 10 دقائق قبل بدء الإجراء.
2. قم بوزن فائض من الأنسجة ، حيث قد يفقد بعضها أثناء السحق (ينتج حوالي 90٪).
  ملاحظة: في السابق ، أسفرت فائضة عن 170 مجم نتائج ناجحة. يمكن زيادة الكتلة أو تقليلها ، إذا رغبت في ذلك. تأكد من أن كتلة الأنسجة تؤدي إلى حجم عينة كاف لخطوات أستلة عينة الأنسجة وتخفيف عينة الأنسجة.
3. أضف الأنسجة إلى آلة الطاحن على الثلج الجاف.
4. قم بتجميد الأنسجة بالنيتروجين السائل والسماح للنيتروجين السائل بالتبخر تماما.
5. استبدل غطاء الطاحن واضربه بمطرقة 15 مرة.
  ملاحظة: إذا لم يكن إعداد الطاحن متوفرا أو لا يمكن استخدامه ، فيجب تقطيع العينة إلى قطع صغيرة قدر الإمكان باستخدام مقص أو مشرط مع حفظها مجمدة أو على الأقل مبردة على الثلج. تضمن هذه الخطوة تجانسا جيدا وهي ضرورية ، خاصة بالنسبة للأنسجة الصلبة.
6. قم بتفريغ أنبوب الخالط المصنوع من الخرزة وانقل الأنسجة المسحوقة إلى الأنبوب باستخدام الملعقة المبردة والملاقط.
7. سجل كتلة الأنسجة المضافة إلى أنبوب الخالط الخرزة لتحويل التركيزات من المولارية إلى الشامات لكل كتلة لاحقا. احتفظ بالعينة على الجليد.
8. إلى أنبوب التجانس ، أضف حجما بالميكرولتر يبلغ 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك يساوي مضاعفات كتلة الأنسجة بالملليغرام.
  ملاحظة: تتسبب التخفيفات المناسبة في سقوط العينات المقاسة على المنحنى القياسي. تم العثور على هذه التخفيفات لأنواع مختلفة من الأنسجة من خلال التجربة والخطأ. في التجارب السابقة ، أسفرت نسبة التخفيف 1:10 لأنسجة العضلات الهيكلية ونسبة التخفيف 1: 5 لأنسجة الكبد عن نتائج ناجحة. كمرجع ، في حالة تخفيف 100 مجم من الأنسجة ، فإن نسبة التخفيف 1:10 تتطلب 1,000 ميكرولتر من 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك ، وتتطلب نسبة التخفيف 1: 5 500 ميكرولتر.
9. تجانس عينات الأنسجة باستخدام مطحنة الخرز أو الخالط أو تقنية مماثلة.
  ملاحظة: قم أحيانا بتبريد العينة أثناء التجانس باستخدام الثلج. إذا لم يكن الخالط مطحنة الخرزة متاحا ، فيمكن استبدال طرق أخرى للتجانس تعمل بشكل فعال على تعطيل الخلايا وإنشاء تجانس الأنسجة ، بما في ذلك استخدام الخالط الدوار أو الخالط بالموجات فوق الصوتية.
10. يتجانس جهاز الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة بسرعة 17,000 × جم مع الحفاظ على درجة حرارة العينة 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: تصبح متجانسات الأنسجة العضلية الهيكلية المخففة بشكل غير كاف لزجة بشكل مفرط وشبيهة بالهلام. يمكن ملاحظة ذلك بشكل أفضل بعد الطرد المركزي.
11. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بالطرد المركزي للطافي لمدة 10 دقائق عند 17,000 × جم مع الحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
12. انقل كمية من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق واحتفظ بالعينة على الجليد.
  ملاحظة: أسفر أسيتيل 250 ميكرولتر من المادة الطافية عن نتائج ناجحة. لإيقاف البروتوكول مؤقتا ، قم بتجميد هذه العينات عند -80 درجة مئوية وتخزينها لمدة تصل إلى 48 ساعة. يوصى بقياس حجم المادة الطافية لعملية الأستلة في يوم الأستلة.

2. الإعداد القياسي

ملاحظة: قم بإعداد المعايير في يوم تحضير صفيحة ELISA microplate.

تحضير المخزن المؤقت ELISA
1. أضف مركز ELISA المخزن المؤقت المذاب 10x إلى زجاجة زجاجية تحتوي على 90 مل من الماء عالي النقاء.
  ملاحظة: احرص على شطف بقايا 10x ELISA Buffer Concentrate باستخدام المخزن المؤقت ELISA المحضر وإعادة المخزن المؤقت إلى الزجاجة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
إعداد المخزون القياسي
1. أضف 1 مل من المخزن المؤقت ELISA إلى القارورة القياسية ورجه حتى يذوب.
  ملاحظة: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 6 أسابيع.
التخفيف التسلسلي القياسي
1. قم بتسمية معيار الأنبوب B وتسعة أنابيب قياسية من 0 إلى معيار 8.
2. أضف 9.9 مل من المخزن المؤقت ELISA إلى الأنبوب المسمى المعيار B.
3. انقل 100 ميكرولتر من المخزون القياسي (300 pmol / مل من cGMP) إلى الأنبوب B القياسي ودوامة تماما.
4. انقل 1,000 ميكرولتر من المحلول في الأنبوب B القياسي إلى الأنبوب 1 القياسي.
5. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ELISA إلى الأنبوب المسمى بالمعيار 0 والأنابيب المسماة بالمعيار 2 إلى المعيار 8.
6. معيار الدوامة 1 ثم نقل 500 ميكرولتر من المحلول من المعيار 1 إلى المعيار 2.
7. معيار Vortex 2 ثم نقل 500 ميكرولتر من المحلول من المعيار 2 إلى المعيار 3.
8. استمر في نقل 500 ميكرولتر من المعيار n-1 إلى المعيار n ، مع التأكد من دوامة المعايير جيدا بعد كل إضافة.
9. تخلص من 500 ميكرولتر من المحلول من المعيار 8.
  ملاحظة: تأكد من معايير الدوامة عند تحديدها للحصول على منحنى قياسي مثالي. المعايير من 0 إلى 8 بحجم 500 ميكرولتر. قم بتخزين المعايير في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. استخدم المعايير في يوم تخفيفها.

3. الأسيتيل

ملاحظة: أثناء تفاعل الأستلة ، تتم إضافة مجموعة الأسيتيل إلى مجموعة الهيدروكسيل 2 'من جزيء cGMP ، مما يعدل بنية cGMP ويؤدي إلى زيادة تقارب ربط الأجسام المضادة ، مما يعزز حساسية الفحص ~ 10 أضعاف. في العينات التي تحتوي على أكثر من 1.0 pmol / مل من cGMP ، يمكن إجراء القياسات بدون الأستلة ، ويمكن حذف هذه الخطوة. يجب تحديد الحاجة إلى الأستلة تجريبيا ، على أساس كل حالة على حدة.

تحضير هيدروكسيد البوتاسيوم
1. أضف 10 مل من الماء فائق النقاء إلى زجاجة هيدروكسيد البوتاسيوم لإنشاء محلول 4 أمتار.
  ملاحظة: لا تقم بتغطية الزجاجة حيث يذوب هيدروكسيد البوتاسيوم. يحفظ لأشهر في درجة حرارة الغرفة.
أستلة عينة الأنسجة
1. إلى 250 ميكرولتر من العينة ، أضف 50 ميكرولتر (5: 1) من 4 M هيدروكسيد البوتاسيوم واتبع الإضافة بسرعة مع 12.5 ميكرولتر (20: 1) من أنهيدريد الخليك.
2. دوامة لمدة 15 ثانية.
3. أضف 12.5 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 4 M إلى العينة والدوامة لفترة وجيزة.
4. اختياري: إذا تصلبت عينات العضلات الهيكلية باتباع خطوات الأستلة ، فقم بالطرد المركزي للعينات عند 17,000 × جم لمدة 10 دقائق.
أستيل المعايير
1. إلى الأنبوب المسمى المعيار 0 ، أضف 100 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 4 M ، متبوعا مباشرة ب 25 ميكرولتر من أنهيدريد الخل.
2. دوامة المعيار لمدة 15 ثانية.
3. أضف 25 ميكرولتر من هيدروكسيد البوتاسيوم 4 M إلى المعيار والدوامة لفترة وجيزة.
4. كرر هذه الخطوات للمعايير المرقمة المتبقية.
  ملاحظة: قم بتدوير جميع العينات والمعايير لنفس المدة لضمان نتائج متسقة.

4. تخفيف عينة الأنسجة

أضف نسب محددة مسبقا من المخزن المؤقت ELISA وكمية من العينة الأسيتيل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
ملاحظة: يلزم وجود تخفيفين مختلفين لكل عينة. تم العثور على نسب التخفيف التي تتسبب في انخفاض تركيزات cGMP المقاسة على المنحنى القياسي من خلال التجربة والخطأ. يجب تحديد التخفيفات تجريبيا لكل نوع من أنواع الأنسجة حتى تنخفض النسبة المئوية بين 20٪ و 80٪. في التجارب السابقة التي تقيس أنسجة الكبد ، أسفرت نسب التخفيف 1: 2 و 1: 3 عن نتائج ناجحة بقيم النسبة المئوية المناسبة. أسفرت هذه النسب أيضا عن نتائج ناجحة للعضلات والهيكل العظمي. ومع ذلك ، قد تتطلب الاختلافات في أنسجة العضلات الهيكلية عينات أكثر تخفيفا.
اختياري: إذا تشكل راسب عند إضافة عينة الأنسجة إلى المخزن المؤقت ELISA ، فقم بالطرد المركزي للعينة لمدة 10 دقائق عند 17,000 × جم.

5. إعداد الصفيحة الدقيقة ELISA

أستيل كولينستراز (AChE) إعداد التتبع
1. أضف 6 مل من المخزن المؤقت ELISA إلى قارورة تتبع AChE ورجه برفق حتى يذوب.
  ملاحظة: قم بتخزين العينة في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. لا تدوام.
تحضير المصل المضاد
1. أضف 6 مل من محلول ELISA إلى قارورة المصل المضادة ورجه برفق حتى يذوب.
  ملاحظة: يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 4 أسابيع على الأقل. لا تدوام.
العينة والحضانة القياسية
1. معيار دوامة 0.
2. إلى صفيحة ELISA الدقيقة ، أضف 50 ميكرولتر من الآبار القياسية من 0 إلى 5 آبار (NSB و B₀ ؛ الشكل 2).
3. إلى اثنين من الآبار (NSB; الشكل 2) يحتوي على المعيار 0 ، أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت ELISA.
4. استخدم طرف ماصة واحد لإضافة 50 ميكرولتر من حصصات المعايير من 1 إلى 8 إلى صفيحة ELISA الدقيقة في نسختين. ابدأ بالمعيار الأكثر تمييعا (المعيار 8) ثم انتقل إلى المعيار التالي الأكثر تخفيفا حتى تتم إضافة جميع المعايير.
  ملاحظة: قم بالشفط والاستغناء عن كل معيار عدة مرات قبل إضافته إلى البئر. معايير الدوامة قبل إضافتها إلى الآبار.
5. دوامة كل عينة قبل إضافة 50 ميكرولتر من الآبار في نسخ مكررة أو ثلاثية.
6. أضف 50 ميكرولتر من متتبع AChE إلى كل NSB و B₀ ومعيار وعينة جيدة (الشكل 2).
7. أضف 50 ميكرولتر من المصل المضاد لكل B₀ ، قياسي ، وأخذ عينات جيدا (الشكل 2).
8. قم بتغطية صفيحة ELISA الدقيقة واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة 18 ساعة.
  ملاحظة: تأكد من الدوامة كلما طلب منك الحصول على نتائج متسقة.
تحضير عازلة الغسيل
1. أضف إلى زجاجة زجاجية 200 مل من الماء فائق النقاء و 500 ميكرولتر من مركز الغسيل المخزن المؤقت 400x.
2. باستخدام حقنة ، أضف 100 ميكرولتر من بولي سوربات 20 إلى الزجاجة.
3. رج الزجاجة برفق حتى تمتزج.
  ملاحظة: قم بتخزين مخزن الغسيل في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهرين. مضاعفة أحجام الماء فائق النقاء ، وتركيز عازلة الغسيل 400x ، والبوليسوربات 20 للحصول على صفيحة دقيقة كاملة من 96 بئرا من العينات.
4. انقل مخزن الغسيل إلى زجاجة غسيل قبل الاستخدام.
تحضير كاشف إلمان
ملاحظة: جهز يوم تطوير الصفيحة الدقيقة ELISA.
1. أضف 20 مل من الماء عالي النقاء إلى حاوية محمية من الضوء.
2. استخدم كمية من الماء فائق النقاء لإذابة كاشف إلمان.
3. انقل كاشف Ellman إلى الحاوية المحمية بالضوء.
4. استخدم كاشف إلمان لشطف الزجاجة التي أتت فيها.
5. انقل كل المحلول مرة أخرى إلى الحاوية المحمية من الضوء باستخدام ماصة.
غسل الألواح الدقيقة ELISA
1. تخلص من محتويات صفيحة ELISA الدقيقة عن طريق قلبها. تأكد من إفراغ الآبار عن طريق النقر على صفيحة ELISA المقلوبة على منشفة ورقية.
2. املأ الآبار بمحلول غسيل باستخدام زجاجة الغسيل.
3. حرك صفيحة ELISA الدقيقة برفق لمدة 5 ثوان ثم قم بتفريغ مخزن الغسيل واضغط على السائل المتبقي على منشفة ورقية.
4. املأ صفيحة ELISA الدقيقة بمحلول غسيل ، وحرك صفيحة ELISA الدقيقة برفق لمدة 30 ثانية ، وتخلص من محتوياتها. كرر هذا أربع مرات ، مع النقر على صفيحة ELISA الدقيقة على منشفة ورقية بعد كل تفريغ لإزالة السائل المتبقي.
  ملاحظة: امنع قراءات الامتصاص غير الدقيقة عن طريق غسل صفيحة ELISA الدقيقة جيدا.
تطوير وقراءة الصفيحة الدقيقة ELISA
1. انقل كاشف إلمان إلى خزان.
2. العمل بسرعة، استخدم ماصة متعددة القنوات لنقل 200 ميكرولتر من كاشف إلمان إلى الآبار الفارغة، NSB،_B0، TA، القياسية، والعينات.
3. أضف 5 ميكرولتر من متتبع AChE إلى بئر TA.
4. قم بتغطية صفيحة ELISA الدقيقة بالبارافيلم ، وضعها في وعاء محمي من الضوء ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 60-90 دقيقة مع التحريض.
  ملاحظة: استخدم آبار B₀كمؤشرات لوقت الحضانة المناسب. تظهر آبار Ideal B₀ صفراء بشكل واضح ولكنها ليست داكنة.
5. قم بإزالة فيلم البارافين واقرأ صفيحة ELISA الدقيقة بكثافة بصرية تبلغ 412 نانومتر.
  ملاحظة: تشير الآبار B₀ ذات الامتصاص بين 0.3 AU و 1.0 AU ، مع طرح الفراغات ، إلى أن صفيحة ELISA الدقيقة قد تم تطويرها بشكل كاف.
6. اختياري: إذا كانت صفيحة ELISA الدقيقة متخلفة ، فاستبدل فيلم البارافين واتركه يحتضن في حاوية محمية من الضوء لفترة إضافية. إذا كانت صفيحة ELISA الدقيقة مفرطة التطور ، فتخلص من كاشف Ellman ، واشطفها مرة واحدة باستخدام مخزن الغسيل ، وأعد تطوير صفيحة ELISA الدقيقة باستخدام كاشف Ellman.

figure-protocol-4
الشكل 2: تخطيط Microplate. مثال على تخطيط الصفيحة الدقيقة ل ELISA التنافسي. يشير NSB إلى بئر ربط غير محدد. يشير B₀ إلى الحد الأقصى لبئر الربط. يشير TA إلى إجمالي النشاط بشكل جيد. تشير الأمراض المنقولة بالبحث العلمي إلى بئر قياسي بالرقم المقابل له. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

6. التحويل إلى التركيز

حسابات تتبع AChE المرتبط
1. متوسط امتصاص الفراغين واطرح المتوسط من امتصاص كل بئر.
  ملاحظة: استخدم الامتصاصات المطروحة الفارغة لبقية العمليات الحسابية.
2. احسب متوسط امتصاص NSB و B₀ والآبار الفارغة.
3. استخدم المعادلة التالية لحساب امتصاص B₀المصحح:
  
  ملاحظة: Corr. تعني Corrected ، و Abs. تعني الامتصاص ، و Avg. تعني المتوسط. إذا كان متوسط امتصاص الآبار الفارغة (مع طرح المتوسط الفارغ) رقما سالبا ، فاستخدم صفرا للحساب.
4. احسب النسبة لكل معيار وعينة باستخدام المعادلة التالية:
5. اضرب نسبة كل عينة في 100 لحساب النسبة المئوية .
  ملاحظة: تقع العينات بين 20٪ و 80٪ على المنحنى القياسي.
حسابات المنحنى القياسية
1. متوسط نسبة الآبار المكررة لكل معيار (1 إلى 8).
2. احسب لوجيت نسبة متوسط كل معيار باستخدام المعادلة التالية:
3. باستخدام التركيزات المعروفة لكل معيار (الجدول 1) كقيم X وليغاريتم كل معيار كقيم Y ، احسب المنحدر وتقاطع Y.
4. احسب معامل التحديد باستخدام السجل₁₀من التركيزات القياسية المعروفة cGMP كقيم X ولوجيت كل معيار كقيم Y.
  ملاحظة: تحقق من أن معامل التحديد قريب من 1.
حسابات تركيز cGMP بالبمول / مل
1. احسب لوجيت كل عينة باستخدام المعادلة التالية:
2. لحساب تركيز cGMP في كل عينة (في بيكومول cGMP لكل مليلتر من العينة) ، استخدم المعادلة التالية:
  
  ملاحظة: DR تعني نسبة التخفيف. مجموع DR المتجانس لعينات الكبد المخففة بنسبة تخفيف 1: 5 من حمض الهيدروكلوريك يساوي 6. المخزن المؤقت D.R. مجموع عينات الكبد المخففة بنسبة تخفيف 1: 2 من المخزن المؤقت ELISA يساوي 3. لذلك ، يتم ضرب المصطلحات المجمعة بين قوسين في 18.
حسابات تركيز cGMP بالنانومول / جم
1. احسب نانومولات cGMP لكل بئر بالمعادلة التالية:
2. احسب جرامات الأنسجة في كل عينة أسيتيلاتها بالمعادلة التالية:
  
  ملاحظة: "ملغ من الأنسجة" هي كتلة الأنسجة المضافة إلى أنبوب التجانس بالملليغرام. "حجم حمض الهيدروكلوريك المستخدم" هو حجم 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك المستخدم لتخفيف العينات للتجانس.
3. احسب جرامات الأنسجة في كل عينة مخففة باستخدام المخزن المؤقت ELISA باستخدام المعادلة التالية:
  
  ملاحظة: "حجم العينة المخفف" هو حجم العينة المخففة بواسطة المخزن المؤقت ELISA. "250 ميكرولتر" هو حجم العينة الأسيتيلة. "الكواشف" المذكورة هي كواشف الأستلة 4 M KOH وأنهيدريد الخليك.
4. احسب جرامات الأنسجة لكل بئر بالمعادلة التالية:
  
  ملاحظة: "حجم المخزن المؤقت" هو حجم المخزن المؤقت ELISA المستخدم لتخفيف عينات الأنسجة قبل إضافة العينات إلى الآبار.
5. اقسم نانومول cGMP لكل بئر على جرامات الأنسجة لكل بئر لحساب تركيز cGMP بالنانومول / جم.

الرقم القياسي	تركيزات cGMP (pmol / مل)
المعيار 1	3.0
قياسي 2	1.5
قياسي 3	0.75
قياسي 4	0.375
قياسي 5	0.1875
قياسي 6	0.09375
قياسي 7	0.046875
قياسي 8	0.0234375

الجدول 1: التركيزات القياسية. التركيزات المعروفة للمعايير من 1 إلى 8.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خنازير يوركشاير الداجنة المعالجة بكلوريد الصوديوم الغذائي (0.15 مليمول / كغ) أو ¹⁵نترات تحمل علامة N (0.15 مليمول / كغ) تم إعطاؤها مرة واحدة يوميا لمدة خمسة أيام متتالية كبلعة في تشاو مع محلول هيبارين الصوديوم (0.9٪ كلوريد الصوديوم) قبل جمع الأنسجة. تم نشر جميع تفاصيل المجموعة سابقا¹⁹. تم قياس تركيزات cGMP في عضلات الألوية والكبد لأربعة خنازير يوركشاير الداجنة وفقا لبروتوكول ELISA الموصوف. تم تخفيف أنسجة الكبد بنسبة تخفيف 1: 5 ، وعضلات الألوية بنسبة تخفيف 1: 10 ، مع 0.1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (HCl) لترسيب البروتينات. تم أسيتيل المتجانسات المخففة بحمض الهيدروكلوريك ثم تخفيفها باستخدام عازلة ELISA بنسبة تخفيف 1: 2 و 1: 3 لكل من عينات الكبد وعضلات الألوية. تم قياس تركيزات ممارسات التصنيع الجيدة كما هو موضح أعلاه. تم تحويل الامتصاصات إلى بيكومولات من cGMP لكل مليلتر من العينة المحضرة ثم إلى نانومول من cGMP لكل جرام من الأنسجة (نانومول / غرام من الأنسجة) كما هو مذكور في البروتوكول أعلاه.

أنتجت تركيزات cGMP المقاسة في أنسجة الكبد نتائج تجريبية مثالية في ظل الظروف المذكورة أعلاه. تركيزات cGMP في المجموعة الضابطة وفي المجموعة المعالجة بالنترات في كبد الخنازير هي 0.0202 نانومول / جم ± 0.003 نانومول / غرام من الأنسجة و 0.0364 نانومول / جم ± 0.011 نانومول / غرام من الأنسجة ، على التوالي (الشكل 3). تؤكد العديد من القيم موثوقية النتائج. تقع امتصاص آبار B₀مع طرح الفراغات ، والتي تتراوح من 0.466 إلى 0.475 ، ضمن نطاق 0.3 AU إلى 1.0 AU ، مما يتحقق من تطوير صفيحة دقيقة كافية باستخدام كاشف Ellman. تظهر الجودة العالية للمنحنى القياسي من خلال الزيادات التدريجية في الامتصاص من المعيار 1 إلى المعيار 8 وخطية المنحنى القياسي ، التي تم التحقق منها بواسطة معامل تحديد 0.99. تتراوح النسبة المئوية figure-results-1 لكل بئر تم قياسه (31.5٪ -71.2٪) بين 20٪ و 80٪ ، مما يثبت أن جميع العينات تقع على المنحنى القياسي. العينات التي تمتلك الخصائص المذكورة مناسبة للتفسير.

تركيزات cGMP المقاسة في أنسجة عضلات الألوية أسفرت عن نتائج تجريبية دون المستوى الأمثل. يتم تعيين الملصق دون المستوى الأمثل لنتائج عضلة الألوية لأن معظم قيم النسبة المئوية figure-results-2 لآبار عضلات الألوية (3.69٪ -27.3٪) انخفضت إلى أقل من 20٪ ، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى مزيد من العينات المخففة حتى تقع الامتصاص على المنحنى القياسي. تركيزات cGMP في المجموعة الضابطة وفي المجموعة المعالجة بالنترات في عضلة الألوية الخنازير هي 1.22 نانومول / جم ± 0.49 نانومول / غرام من الأنسجة و 0.732 نانومول / جم ± 0.18 نانومول / غرام من الأنسجة ، على التوالي (الرسم البياني غير معروض). تشترك عينات عضلات الألوية في امتصاص عينات الكبد ب₀ الآبار والمعايير. قد يؤدي استخدام هذه العينات دون المستوى الأمثل إلى استنتاجات غير صحيحة. لذلك ، هناك حاجة إلى إعداد المزيد من العينات المخففة وإعادة قياس تركيزات cGMP.

figure-results-3
الشكل 3: تركيز cGMP في أنسجة الكبد. متوسط تركيز cGMP لكبد الخنازير المعالج بكلوريد الصوديوم (0.15 مليمول / كجم) أو ¹⁵نترات تحمل علامة N (0.15 مليمول / كجم) في نانومول / غرام من الأنسجة. ن = 4 ؛ تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري ؛ تم تحليل البيانات بواسطة اختبار ويلش تي. NS لا تعني أي أهمية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول تعليمات حول الخطوات المطلوبة لقياس تركيزات cGMP في الأنسجة الصلبة باستخدام ELISA التنافسي. يمكن أن تشير الاختلافات في تركيزات cGMP إلى اختلافات في وفرة NO في الأنسجة. من خلال التحقيق في هذه الاختلافات في الأنسجة الصلبة ، يمكن توضيح المعلومات حول NO في الأعضاء المختلفة.

في البروتوكول ، تم تجانس عينات الأنسجة أولا استعدادا ل ELISA. بدأ هذا بتجميد كتلة من الأنسجة الصلبة ثم سحقها. يهدف تفتيت الأنسجة قبل خطوة التجانس إلى مساعدة الخالط الخرزة على تحلل الخلايا. تم تجانس الأنسجة في حمض الهيدروكلوريك 0.1 نيوتن لترسيب البروتينات ، وهي تقنية تستخدم في طرق أخرى²⁰^،²¹. أخيرا ، تم فصل المواد الصلبة والراسب عن المكونات القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي. لعمل المنحنى القياسي ، تم تخفيف مخزون cGMP (300 مليون دولار من cGMP / مل) بشكل متسلسل لعمل ثمانية معايير مختلفة. تم أسيتيل المعايير والعينات لتحسين حساسية المقايسة عن طريق الكشف عن تركيزات تصل إلى 0.1 مليون مول من cGMP / mL. يتم تحقيق هذه الزيادة في الحساسية عندما تشكل مجموعة الأسيتيل رابطة مع cGMP ، مما يحسن قدرة كل جسم مضاد (موجود في المصل) على الارتباط ب cGMP¹⁸ الأسيتيل. يضمن إسيتيل كل من المعايير والعينات التوحيد في ربط cGMP بين الآبار. قد يتم حذف خطوة الأستلة لكل من المعايير والعينات إذا كان من المتوقع أن يتجاوز تركيز cGMP في آبار الصفيحة الدقيقة 1.0 pmol / mL¹⁸.

استعدادا لإضافة عينات إلى الآبار ، تم تخفيف العينات بشكل أكبر باستخدام عازلة ELISA. سمح التخفيف الإضافي للعينات بالسقوط على المنحنى القياسي وتشبه إلى حد كبير محتويات NSB و B₀ والآبار القياسية ، مما يخلق التوحيد. إلى جانب العينات والمعايير ، يتم خلط العديد من الحلول الأخرى في الآبار. في آبار NSB ، تتم إضافة عازلة ELISA (مع وبدون كواشف الأستلة) بينما يتم حجب مضاد المصل. هذا لتحديد كمية تتبع AChE (أستيل كولينستراز مرتبط ب cGMP) الذي يرتبط بالفأر IgG الملتصق بالبئر في حالة عدم وجود الجسم المضاد المحدد الذي يتكون من مضاد المصل. احتوت الآبار B₀على عازلة ELISA (مع كواشف الأستلة) ، وتتبع AChE ، ومضاد للمصل. لذلك ، تظهر آبار B₀ قدرة الربط لتتبع AChE دون منافسة cGMP. بعد ملء جميع الآبار بشكل مناسب ، يتم تحضين الصفيحة الدقيقة ثم غسلها. تمت إضافة كاشف إلمان إلى الآبار. أخيرا ، تمت إضافة متتبع AChE إلى TA جيدا بعد إضافة كاشف Ellman. يمثل هذا البئر النشاط التحفيزي لتتبع AChE بغض النظر عن مقدار التتبع المرتبط بالصفيحة الدقيقة بواسطة الأجسام المضادة. تم تطوير الصفيحة الدقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مما يسمح لتتبع AChE بتحفيز تفاعل اللون.

قد تؤدي عدة خطوات في البروتوكول إلى تغيير نتائج المقايس. يجب توخي مزيد من الحذر عند تنفيذ الخطوات التالية للحصول على أفضل النتائج. هناك حاجة إلى تحديد التخفيفات المناسبة لكل نوع من أنواع الأنسجة لخطوة التجانس وبعد الأستلة لضمان سقوط العينات على المنحنى القياسي. عند إعداد المعايير ، يجب أن تكون المحاليل دوامة أو مختلطة جيدا قبل إزالة الحصة أو بعد إضافة حصة. هذه الخطوة مهمة للوصول إلى تركيزات cGMP المتوقعة لكل معيار. أثناء خطوات الأستلة ، يجب أن يتم دوامة كل معيار وعينة لنفس المدة لتحقيق قراءات امتصاص متسقة. يجب أيضا أن تكون المعايير والعينات دوامة مباشرة قبل إضافة حصة إلى البئر المناسب. هذه الممارسة ينتج عن تركيزات أكثر دقة cGMP. كما أن الغسيل الشامل للصفيحة الدقيقة يحسن دقة قيم الامتصاص ، حيث يزيل جميع أدوات تتبع AChE غير المرتبطة من البئر. بعد إضافة كاشف إلمان ، يجب السماح بوقت كاف لتطوير الصفيحة الدقيقة ، مع إيلاء الاهتمام للون ، والأهم من ذلك ، امتصاص آبار B₀ . من المهم أن ندرك أن تركيز ممارسات التصنيع الجيدة بين النسخ المكررة أو الثلاثية قد يختلف أكثر في العينات ذات مستويات أقل من ممارسات التصنيع الجيدة مقارنة بتلك ذات التركيزات الأعلى. قد يساعد قياس عينة أكثر تركيزا في معالجة هذه المشكلة. بالإضافة إلى ذلك ، لحساب أي تباين بين الصفائح الدقيقة ، يجب قياس عينات من نفس نوع الأنسجة على نفس اللوحة ، كلما أمكن ذلك. من المتوقع أن يؤدي اتباع هذه الإرشادات إلى تحسين جودة البيانات الناتجة عن المقايس.

يمكن استقراء البروتوكول أعلاه على الأنسجة الرخوة والصلبة الأخرى. قد يؤدي التطوير الإضافي للقسم الفرعي لإعداد الأنسجة من البروتوكول أعلاه إلى طريقة مناسبة لمعالجة الأنسجة الصلبة ، بما في ذلك العظام ، والتي قد تكون ذات أهمية بسبب الأوعية الدموية. قد يؤدي التطوير المستمر لهذه التقنية إلى طريقة مناسبة لقياس تركيزات cGMP في مجموعة متنوعة من الأنسجة الصلبة ، مما يؤدي إلى طريقة مفيدة لجمع معلومات إضافية حول وفرة NO في أي نسيج تقريبا. في حين أن بروتوكول ELISA التنافسي المذكور أعلاه هو تقنية مفيدة لقياس cGMP وتقدير وفرة NO ، إلا أنه يحتوي على قيدين ملحوظين: (1) لا يميز هذا الاختبار بين cGMP الذي يتم تصنيعه بواسطة جوانليل سيكلاز قابل للذوبان و cGMP المركب بواسطة الجسيمات جوانليل سيكلاز (pGC). تحفز الببتيدات الطبيعية نشاط pGC²² ، وبالتالي ، فإن التغييرات في cGMP من خلال هذا المسار لا تشير إلى تغييرات في وفرة NO. (2) بالإضافة إلى ذلك ، تؤثر إنزيمات الفوسفوديستراز (PDE) على نتائج اختبار ELISA. تقوم العديد من PDEs بتحلل cGMP ، مما يقلل من تركيزه بعد تحفيز sGC بواسطة NO²³. لذلك ، قد يحجب النشاط التحفيزي ل PDEs العلاقة بين تركيزات cGMP ووفرة NO. ينصح بإضافة مثبط PDE5 ، مثل السيلدينافيل ، لمنع فقدان cGMP للتجارب التي تركز بشكل أساسي على الحصول على تركيزات cGMP الدقيقة ، بدلا من الحصول على قياسات لمراقبة الاتجاهات في تركيزات cGMP. يمكن إعطاء مثبطات PDE5 على شكل سيلدينافيل للحيوانات قبل حوالي ساعة واحدة من جمع العينات (تستمر التأثيرات حتى 4 ساعات^{و 24}) أو ، إذا لم تكن هذه الإدارة قابلة للتنفيذ ، فيمكن إضافة السيلدينافيل إلى العينات التي تم جمعها. عند تثبيط PDEs بعد جمع الأنسجة ، أضف السيلدينافيل إلى حمض الهيدروكلوريك 0.1 نيوتن بحيث يتم تجانس الأنسجة في وجود السيلدينافيل. يجب أخذ القياسات مع السيلدينافيل وبدونها لضمان عدم وجود حديث متبادل بين العلاج الحيواني والسيلدينافيل.

حتى مع قيوده ، يتم استخدام الاختبار كنظرة ثاقبة إعلامية لإرسال المصب لإشارة NO. في الختام ، فإن اقتران قياس تركيزات cGMP في الأنسجة الصلبة مع طرق أخرى لقياس NO يسمح بفهم أفضل لتأثيرات NO في الأعضاء.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفان أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال المنحة 1ZIADK025104-18 الممنوحة ل Alan N. Schechter من قبل NIDDK / NIH داخلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1 مل حقنة فموية شفافة BD	بيكتون ديكنسون	50382903052177
14 مل أنبوب اختبار دائري قاع	صقر	352059
2.0 مل أنابيب دقيقة متنوعة	أوليمبوس للبلاستيك	24-283 أ
30-300 & L ماصة متعددة القنوات	إيبندورف	3125000052
أنهيدريد الخليك (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400031	98٪ نقي < / > <قوي > خطر< / قوي>: قابل للاشتعال ، قابل للتآكل: يحرق الجلد بشدة ، وتلف العين ، والسموم الحادة < br / > <قوي > التعامل الآمن < / قوي>: يحفظ بعيدا عن مصادر الاشتعال ، واعمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد قفازات
cGMP Acetylcholinesterase Tracer (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	481020	فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، كلوريد الصوديوم ، ؛ فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، ألبومين البقر ، أزيد الصوديوم ، EDTA ، cGMP AChE tracer Hazard< / قوي>: المخاطر الصحية: سمية الأعضاء من التعرض المتكرر ، تآكل: تلف العين ، مهيج الجلد والجهاز التنفسي < قوي > التعامل الآمن < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، ارتداء القفازات
مضاد مصل cGMP ELISA (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	481022	فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، كلوريد الصوديوم ، ؛ فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، الألبومين البقري ، ؛ أزيد الصوديوم ، EDTA ، الأرانب المضادة لمGMP مضاد السيروم متعدد النسيلة < br / > <قوي>خطر< / قوي>: المخاطر الصحية: سمية الأعضاء من التعرض المتكرر ، التآكل: تلف العين ، مهيج الجلد والجهاز التنفسي ، السمية الحادة <قوي> التعامل الآمن < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات
معيار cGMP ELISA (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	481024	فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، كلوريد الصوديوم ، ؛ فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، الألبومين البقري ، ؛ أزيد الصوديوم ، EDTA ، معيار cGMP <قوي > خطر < / قوي>: خطر صحي: سمية الأعضاء من التعرض المتكرر ، تآكل: تلف العين ، مهيج الجلد والجهاز التنفسي < قوي > التعامل الآمن < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات
مجموعة ELISA GMP الدورية	شركة كايمان للكيماويات	581021
مركز ELISA Buffer 10X (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400060	1 م فوسفات ، 1٪ BSA ، 4 M كلوريد الصوديوم ، 10 ملي EDTA ، 0.1٪ أزيد الصوديوم <قوي >خطر< / قوي>: خطر صحي: سمية الأعضاء من التعرض المتكرر ، تآكل: تلف العين ، مهيج الجلد والجهاز التنفسي < قوي > التعامل الآمن < / قوي>: اعمل في منطقة جيدة التهوية ، واحفظها في وعاء بغطاء قابل للإغلاق ، وارتد قفازات
خزان كاشف ELISA	بيرس (الآن ثيرمو فيشر العلمي)	15075
كاشف Ellman (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400050	فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، كلوريد الصوديوم ، فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، أسيتيل ثيوكولين (يوديد) ، 5،5 '-dithiobis- (2-نيتروبنزويك) <قوي>خطر< / قوي>: سمية حادة ، خطر صحي: سمية الأعضاء ، تآكل: تلف العين ، مهيج الجلد ، مهيج متكرر <قوي> معالجة آمنة < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات
حمض الهيدروكلوريك	سيجما ألدريتش	320331	<قوي>خطر: أكال: تآكل المعدن ، حروق الجلد بشدة ، تلف العين ، تهيج الجهاز التنفسي < / > <قوي > التعامل الآمن < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات
النيتروجين السائل	أكسجين روبرت		النيتروجين <قوي > خطر < / قوي>: الغاز المضغوط: خطر الحروق المبردة ، frosbite ، الاختناق <قوي > التعامل الآمن < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات
لوحة مطلية ب IgG مضاد للأرانب (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400006	خطر: لا يوجد
توازن MF الكلاسيكي الجديد	ميتلر توليدو
شاكر المداري	شركة Stovall Life Science Inc. (الآن IBI Scientific)	15-453-211 (يختلف)
بارافيلم	شركة بيميس ، إنك	3023-4526 (متفاوت)
بولي سوربات 20 (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400035	خطر: لا يوجد
هيدروكسيد البوتاسيوم (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400029	85٪ نقي < / > <قوي > خطر < / قوي>: قابل للتآكل: تآكل المعادن والجلد ، تلف العين ، السمية الحادة < قوي> التعامل الآمن < / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات
الخالط Precellys Evolution	بيرتين تكنولوجيز	PE000062-PEVO0-A
Precellys Lysing Kit تجانس الأنسجة الصلبة	بيرتين تكنولوجيز	P000911-LYSK0-A
قارئ الصفيحة الدقيقة Sense	هيديكس	425-301
جهاز طرد مركزي سورفال ليجند مايكرو 17R	ثيرمو فيشر العلمي	75002441
مطحنة الأنسجة	كسارة السيلان	طقم كسارة السيلان
دوامة الجني 2	الصناعات العلمية	SI-0246
زجاجة غسيل	سيجما ألدريتش	Z423092
مركز الغسيل المؤقت 400X (في مجموعة cGMP)	شركة كايمان للكيماويات	400062	فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة ، فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، الماء < br / > <قوي>خطر< / قوي>: تآكل: تلف العين ، السمية الحادة ، مهيج الجلد ، سمية الأعضاء <قوي> التعامل الآمن< / قوي>: العمل في منطقة جيدة التهوية ، وارتد القفازات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierks, E. A., Burstyn, J. N. Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase. Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).
Koglin, M., Behrends, S. A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding. J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).
Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation. Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).
Bailey, S. J., et al. Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans. J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).
Vanhatalo, A., et al. Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).
Qin, X., et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice. Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).
Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).
Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2. PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).
Park, J. W., et al. Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements. J Vis Exp. (173), e62427(2021).
Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).
Srihirun, S., et al. Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures. Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).
Montoliu, C., et al. Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis. Liver Int. 25, 787-795 (2005).
Origlia, C., et al. Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects. J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).
Calamera, G., et al. Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons. Commun Biol. 2, 394(2019).
Rutkowski, N., et al. Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes. Sci Rep. 14, 26099(2024).
Straub, A. C., Beuve, A. A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation. Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).
Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber. Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).
Cyclic gmp elisa kit. , https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf (2024).
Park, J. W., et al. Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation. Nutrients. 16 (8), 1154(2024).
Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V (2025).
Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf (2025).
Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle. Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).
Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).
Corbin, J. D., et al. [3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP. Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cyclic GMP

قياس أحادي فوسفات الجوانوزين الدوري (cGMP) في الأنسجة الصلبة باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم التنافسي (ELISA)

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة