يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نقص الأكسجة يغير مستويات miRNAs المشاركة في الوراثة غير المندلية لاضطراب طيف التوحد في الفئران

41K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا للحث على نقص الأكسجة في الفئران حديثي الولادة عن طريق توصيلها في بيئات خاضعة للرقابة بتركيزات متفاوتة من الأكسجين. غيرت نماذج الفئران المعرضة لتغيرات الأكسجين عند الولادة بشكل دائم في التعبير عن miRNAs المشاركة في تحريض التغيرات المظهرية السلوكية مثل التوحد.

الملخص

يمكن أن يحدث نقص الأكسجة بدرجات متفاوتة لأسباب مختلفة خلال فترة الفترة المحيطة بالولادة ، مما يؤثر على النمو. نهدف إلى فحص عواقب نقص الأكسجة الخفيف إلى الشديد لدى حديثي الولادة في الفئران ، مع التركيز على ارتباطه المحتمل باختلالات دماغ الجنين التنكسية العصبية المرتبطة باضطراب طيف التوحد (ASD).

لقد تسببنا في نقص الأكسجة في الفئران حديثي الولادة عن طريق توصيلها في بيئات خاضعة للرقابة بتركيزات متفاوتة من الأكسجين. أظهرت النتائج مستويات مرتفعة من HIF-1α (علامة نقص الأكسجة) في القشرة الدماغية والحصين ، بالإضافة إلى زيادة التنكس العصبي في هذه المناطق. علاوة على ذلك ، لاحظنا تعبيرا متغيرا عن miRNAs المرتبطة باضطراب طيف التوحد (miR-19a-3p و miR-361-5p و miR-150-5p و miR-126-3p و miR-499a-5p) في مجموعات نقص الأكسجين ، بما يتفق مع النتائج السابقة في النماذج البشرية والحيوانية لاضطراب طيف التوحد. كانت هذه التغيرات الجزيئية مصحوبة بتغيرات سلوكية مثل انخفاض الحركة والسرعة والتفاعل الاجتماعي والسلوكيات المتكررة ، فضلا عن زيادة الميل إلى إظهار سلوك البحث عن الزاوية في الفئران المعرضة لظروف نقص الأكسجين. على الرغم من أن التغيرات السلوكية والجزيئية كانت قابلة للاكتشاف في 12٪ O2 المجموعة (نقص الأكسجة الخفيف) ، فقد لوحظت التغييرات الأكثر وضوحا في مجموعات نقص الأكسجة الأكثر حدة ، عند 10٪ O2 و 8٪ O2.

بشكل عام ، تشير النتائج إلى أن نقص الأكسجة عند الأطفال حديثي الولادة يمكن أن يؤدي إلى تغييرات جزيئية دائمة مرتبطة بالأمراض التنكسية العصبية مع عواقب سلوكية. علاوة على ذلك ، حتى في الولادة الطبيعية ، يمكن أن يؤدي التعرض لنقص الأكسجة أثناء التطور المبكر إلى إضعاف الذاكرة والتعلم. تسلط النتائج الضوء على الحاجة إلى الكشف المبكر والتدخل لدى الأطفال حديثي الولادة المعرضين لنقص الأكسجة لمنع المشاكل العصبية طويلة الأمد. يتم تنظيم مستويات miRNA أثناء التطور ، وتشكل تعديلاتها في الأنسجة ، وخاصة في الخلايا الجرثومية ، عامل خطر للجيل القادم. توفر التحليلات أساسا لدراسة المسارات التنظيمية التي تؤثر على التغيرات الوظيفية والسلوكية في ظل نقص الأكسجة.

المقدمة

يمكن أن يؤدي نقص الأكسجة ، الذي يعرف بأنه حالة من نقص الأكسجين ، إلى استجابات خلوية وجزيئية فريدة ضرورية لفهم دوره في الأمراض المختلفة. يمكن أن يعطل التسلسلات التنموية ، مما يؤدي إلى تغيرات وإصابات جزيئية وخلوية وعصبية. علاوة على ذلك ، فإن التعرض المبكر لنقص الأكسجة يقطع تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، مما يضعف الاتصال المحوري وتطور المشبك1.

بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من أن نقص الأكسجة قد ثبت أن له آثارا ضارة على تطور الجهاز العصبي المركزي ، إلا أنه قد يلعب أيضا دورا فسيولوجيا مهما في ظل ظروف معينة ، مثل أثناء التطور الجنيني. يشير نقص الأكسجة الفسيولوجي الطبيعي إلى حالة تكون فيها مستويات الأكسجين منخفضة بشكل طبيعي أثناء التطور الجنيني بطريقة مفيدة. تسمح هذه العملية للخلايا الجنينية بإنتاج الطاقة عن طريق تعزيز التمثيل الغذائي اللاهوائي ، وتدعم تطور الدورة الدموية عن طريق تسريع الأوعية الدموية ، وتضمن التطور السليم للقلب والعظام ، وتحفز هجرة خلايا القمة العصبية2. على العكس من ذلك ، يمكن أن يكون لنقص الأكسجة الذي يحدث خارج سياقه الفسيولوجي آثار ضارة على النمو والصحة العامة ، بما في ذلك التطور الجنيني ، مما قد يؤدي إلى الخداج أو حتى الفتك الجنيني1. لذلك ، فهي مشكلة صحية عامة كبيرة ، حيث يعاني العديد من الأطفال حديثي الولادة من حالات نقص الأكسجين أثناء الولادة الطبيعية ، غالبا دون اعتراف فوري من قبل مقدمي الرعاية أو العاملين في المجال الطبي3. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط البدائل في الاتصال العصبي المرتبط بنقص الأكسجة باضطرابات النمو العصبي ، بما في ذلك اضطرابات طيف التوحد (ASD) والإعاقات الذهنية1.

من منظور جزيئي ، يمكن أن يؤثر نقص الأكسجة على النمو العصبي عن طريق تغيير التعبير عن الجينات التي تنظم الوظائف المشبكية ، وبالتالي تعطيل الاتصال العصبي والمساهمة في تطور اضطرابات النمو العصبي4.

سريريا ، يؤثر نقص الأكسجة عند حديثي الولادة على تطور الجهاز العصبي المركزي من خلال المسارات الهرمونية والتمثيل الغذائي1. استجابة لنقص الأكسجة الحاد ، يطلق منطقة ما تحت المهاد بسرعة الهرمون المطلق للكورتيكوتروبين والأرجينين فازوبريسين ، والذي يؤدي بعد ذلك إلى إفراز هرمون قشر الكظر من الغدة النخامية الأمامية ، يليه إنتاج الجلوكوكورتيكويد في قشرة الغدة الكظرية للجنين وترتبط درجة هذه الاستجابة بشدة ومدة نقص الأكسجة. تؤكد هذه الاستجابة السريعة لمحور الغدة النخامية والغدة الكظرية (HPA) للإجهاد الحاد على الدور الحاسم للجلوكوكورتيكويد في الحد من الآثار الفسيولوجية للإجهاد والحفاظ على توازن الجنين من خلال التأثير على التعبير الجيني المرتبط ، وتخليق البروتين ، والتمثيل الغذائي الخلوي5،6.

يؤدي انخفاض مستويات الأكسجين الطبيعية إلى تنشيط الاستجابات المختلفة لنقص الأكسجة ، والتي يتم تنظيم معظمها بواسطة عوامل النسخ ، والعوامل المحفزة لنقص الأكسجة (HIFs) ، وأجهزة استشعار الأكسجين الخلوية مثل بروليل هيدروكسيلاز (PHDs) 1. HIF-1 ، منظم توازن O2 كما هو موضح في الدراسات المختبرية 7 ، هو متغاير يتكون من HIF-1α و HIF-1β8. في ظل ظروف نقص الأكسجين ، يتم تقليل استبدال ذرة الهيدروجين بمجموعة هيدروكسيل في المركب ، مما يؤدي إلى تراكم HIF-1α ، والذي يتناقص بعد ذلك مع HIF-1β. نتيجة لذلك ، ينتقل ثنائي HIF-1 إلى النواة ، حيث ينشط نسخ مئات الجينات1.

الطبيعة المعتمدة على الأكسجين للخلايا العصبية تجعلها عرضة بشكل خاص للإجهاد الناجم عن نقص الأكسجين. لذلك ، يمكن أن يكون لنقص الأكسجة تأثير كبير على فسيولوجيا الدماغ ، مع آثار طويلة المدى على وظيفة الخلايا العصبية ، عن طريق إضعاف المسار المحوري وتطور المشبك9. يمكن أن تؤدي هذه التغيرات في الوصلات العصبية إلى اضطرابات النمو العصبي المختلفة مثل ASDs والإعاقة الذهنية9،10.

يعرف الاختناق في الفترة المحيطة بالولادة على أنه الحرمان من الأكسجين أثناء المخاض ويمكن أن يحدث نتيجة لأحداث الفترة المحيطة بالولادة مثل نزيف الأم والجنين ، أو ضغط الحبل السري ، أو مضاعفات المشيمة ، أو تمزق الرحم ، أو عسر ولادة الكتف ، أو فشل المولود الجديد في التنفس الأول. يؤثر هذا الحدث الخطير على ما يقرب من أربعة ملايين مولود جديد في جميع أنحاء العالم كل عام وينتج عنه مليون حالة وفاة حديثي الولادة11،12،13. على الرغم من أن معظم الأطفال ينجون من نوبات نقص الأكسجة ، إلا أن بعض المرضى يصابون باعتلال دماغي نقص التأكسج الإقفاري ، مما قد يؤدي إلى مشاكل عصبية دائمة مثل اضطرابات النوبات والشلل الدماغي والتأخير المعرفي والعجز الحركي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسبب الاختناق ونقص التروية خللا وظيفيا في العديد من الأعضاء والأنظمة مثل الجهاز العصبي المركزي (28٪) والجهاز القلبي الوعائي (25٪) والكلى (50٪) والرئتين (23٪)11.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم نضج نظام الأوعية الدموية الدماغية وضعف التنظيم الذاتي من العوامل التي تهيئ الأطفال حديثي الولادة لمخاطر الإقفارية. في مثل هذه العمليات ، يعد الالتهاب والإجهاد التأكسدي الوسطاء الرئيسيين لإصابة نقص التأكسج الإقفاري لحديثي الولادة وآليات موت الخلايا المرتبطة بها. يمكن أن يعرض موت الخلايا المبرمج غير الطبيعي الدماغ النامي لمخاطر الاضطرابات الحركية والمعرفية14.

نظرا لتعقيد اضطراب طيف التوحد ، من الضروري فهم علم الوراثة الأساسي الذي يبدو أن له بنية متعددة الجينات ، بالإضافة إلى العوامل البيئية التي تحدد تطوره. على وجه الخصوص ، يشير الأساس متعدد الجينات لاضطراب طيف التوحد إلى مسببات متعددة العوامل ، حيث تتفاعل الاستعدادات الوراثية مع العوامل الخارجية ، بما في ذلك نقص الأكسجة. يسلط التوافق بنسبة 60٪ -92٪ الذي لوحظ في التوائم أحادية اللاقحة الضوء على أهمية التأثيرات الجينية ، بينما يشير التناقض إلى أن العوامل البيئية تلعب دورا أيضا. يقدر انتشار مرض التوحد ب 13 / 10,000 ، ويعتقد أن هذا المعدل قد زاد في السنوات الأخيرة15. تدعم الدراسات الفرضية القائلة بأن التعرض للعوامل البيئية أثناء الحمل قد يزيد من خطر الإصابة بالتوحد ، لكن نتائج هذه الدراسات غالبا ما تكون غير متسقة بسبب الاختلافات في معايير التشخيص ومجموعات المقارنة وحجم العينة وطرق تقييمالتعرض 15،16.

على الرغم من أن النتائج المرضية العصبية المميزة غير واضحة ، إلا أن الدراسات تكشف عن تشوهات دماغية مجهرية ووظيفية. تشير هذه التشوهات إلى أن الفترة ذات الصلة المسببة قد تكون في الرحم وأن التسبب في المرض قد يبدأ خلال فترة ما قبلالولادة 15. التعرض أثناء الحمل هو المحور الرئيسي للبحوث الوبائية حول عوامل الخطر المحتملة للتوحد. على وجه الخصوص ، فإن الفرضية القائلة بأن مضاعفات التوليد قد تزيد من خطر الإصابة باضطراب طيف التوحد مدعومة بالعديد من الدراسات ، لكن حجم وعواقب هذه التأثيرات تختلف عبر الدراسات17.

بالإضافة إلى العوامل الوراثية ، تلعب آليات الوراثة دورا رئيسيا في تنظيم التعبير الجيني في ظل ظروف نقص الأكسجة. والجدير بالذكر أن miRNAs تمثل آلية تنظيمية رئيسية في الاستجابة الخلوية لنقص الأكسجة ، مثل تأثيرها على HIF. خلال المراحل المبكرة من نقص الأكسجة ، يمكن أن تساهم التغييرات المحددة في مستويات miRNA في تراكم HIF-1 والحفاظ على مستويات مستقرة من HIF-2 و HIF-318. على الرغم من أن ملف تعريف التعبير للعديد من miRNAs قد تغير في ظل ظروف نقص الأكسجة ونقص التروية ، فقد ثبت أن عددا محدودا من miRNAs المرتبطة بنقص الأكسجة تلعب دورا وظيفيا وتؤثر على تعبير HIF . وهذا ما يفسر سبب اختلاف الأنسجة البشرية المختلفة في استجابات نقص التأكسج بسبب تعبير miRNA الخاص بالأنسجة18.

تشير البيانات الناشئة أيضا إلى أن miRNAs محددة متورطة في أمراض ASD. في عملنا السابق ، أظهرنا أن miR-19a-3p و miR-361-5p و miR-150-5p و miR-126-3p و miR-499a-5p ، المعروفين بتنظيم بقاء الخلايا ، والتمايز ، واستجابات الإجهاد في السرطان ، تظهر تعبيرا شاذا لدى مرضى ASD ، مما قد يؤثر على نتائج النمو العصبي. ثم أكدنا هذه النتائج في عينات الدم وما تحت المهاد المنوية من نماذج الفئران لاضطراب طيف التوحد ، مما يدل على ارتباط ثابت للتغيرات التنظيمية الجينية بالمرض19. تشير هذه النتائج إلى أن تقليل تنظيم هذه miRNAs في المراحل الحاسمة من النمو والتطور قد يكون له تأثير كبير على تطور أمراض مثل ASD. يوضح هذا أيضا التأثير العميق لنقص الأكسجة عند حديثي الولادة على الخصائص الجزيئية والسلوكية.

في هذه الدراسة ، اختبرنا تأثير نقص الأكسجة الخفيف إلى المتوسط عند حديثي الولادة على خطر الإصابة بالتوحد في مرحلة البلوغ. للقيام بذلك ، تعرضت الفئران حديثي الولادة لمستويات مختلفة من نقص الأكسجة. في الواقع ، تظهر الفئران التي عانت من نقص الأكسجة عند الولادة تغيرات سلوكية في مرحلة البلوغ ، والأهم من ذلك ، على المستوى الجزيئي ، التغيرات المرتبطة باضطراب طيف التوحد. وبالتالي ، قدمت نتائجنا معلومات قيمة حول الآثار طويلة المدى لنقص الأكسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب المحلية على بجامعة إرجيس (HAYDEK) وتم إجراؤها بموجب ترخيص رقم 21/216.

1. مواضيع

ملاحظة: تضمنت هذه الدراسة فئران Balb / c من الوحدة المعدلة وراثيا في مركز Betül-Ziya EREN للجينوم والخلايا الجذعية (GENKÖK) في جامعة Erciyes.

  1. استخدم فئران Balb / c البالغة من العمر شهرين والتي يبلغ وزنها 18-25 جم في المتوسط. حافظ على الفئران عند درجة حرارة 20 ± 2 درجة مئوية ، مع رطوبة 52 ± 3٪ في دورة إضاءة / ظلام مدتها 12 ساعة (6-18 ساعة).
  2. قم بإطعام الفئران بحبيبات الفأر القياسية ، مع تغييرات الفراش الأسبوعية ، والسماح بوصول غير محدود إلى الطعام والماء.
    ملاحظة: تم إجراء الدراسات الجزيئية في مختبرات الجينوم ونقص الأكسجة في GENKÖK ومختبر الأنسجة وعلم الأجنة بجامعة بوزوك. تشير "نقطة التوقف" إلى المكان الذي يمكنك فيه إيقاف عملك مؤقتا والحفاظ عليه عند درجة الحرارة المحددة.

2. إنشاء نموذج نقص الأكسجة

  1. صمم التجربة لتشمل 4 مجموعات ، بما في ذلك 3 مجموعات ناقصة الأكسجين و 1 مجموعة تحكم زائفة.
  2. تزاوج إناث الفئران السليمة مع الفئران الذكور السليمة لتشكيل فئران حامل سليمة ، والتي سيتم تصنيفها في النهاية إلى المجموعات التالية: نقص الأكسجة الشديد (8٪ O2) (ن = 4) ، نقص الأكسجة المعتدل (10٪ O2) (ن = 4) ، نقص الأكسجة الخفيف (12٪ O2) (ن = 4) ، ونورموكسيا (21٪ O2) كمجموعة تحكم وهمية (ن = 4).
  3. للحث على نقص الأكسجة ، انقل الفئران الحامل إلى مختبر نقص الأكسجة وابدأ في مراقبتها قبل 72 ساعة من اليوم E21.5.
  4. اكتشف نقطة ولادة الفئران الحامل في مجموعات نقص الأكسجة وضعها على الفور في غرف نقص الأكسجة. اضبط مستويات الأكسجين لكل غرفة كما هو موضح لكل مجموعة (كما هو موضح في الخطوة 2.2).
  5. إبقاء حديثي الولادة في ظروف نقص الأكسجين لمدة 5 دقائق فقط ، ثم نقلهم على الفور إلى ظروف السكن العادية.
    ملاحظة: قد يؤدي إبقاء الأشخاص في ظروف نقص الأكسجين لفترات أطول إلى الفتاك.
  6. استخدام 2 حديثي الولادة (يتم اختيارهما عشوائيا) من كل مجموعة لتأكيد الضرر الناجم عن نقص الأكسجة وتحديد الجنس. احتفظ بالجراء المتبقية بجوار أمهاتهم في ظروف سكنية عادية حتى نهاية فترة الرضاعة لإجراء اختبارات جزيئية وسلوكية إضافية لمرحلة البلوغ (انظر التصميم التجريبي في الشكل التكميلي 1).

3. تحديد الجنس لتقييم الفروق المحتملة في آثار نقص الأكسجين بين الجنسين في مرحلة حديثي الولادة

  1. قم بوزن كل فأر (تم اختياره عشوائيا (x2 / مجموعة)) على حدة لحساب الجرعة المطلوبة من التخدير. يتم تطبيق الكيتامين بجرعة 100 ملغم/كغ والزيلازين بجرعة 10 ملغ/كغ داخل الصفاق.
  2. بمجرد تخدير الفأر بالكامل ، استمر في القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم واجمع أنسجة الذيل على الفور في أنابيب معقمة تحمل علامة 1.5 مل (نقطة توقف ، -80 درجة مئوية)
  3. جمع ونقل جميع أنسجة المخ على الفور إلى أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على 10٪ فورمالديهايد لمزيد من التحليل (نقطة توقف ، 25 درجة مئوية).
  4. تحضير الأنسجة لاستخراج الحمض النووي.
    1. تحضير عينات الذيل وإذابة الثلج عند 25 درجة مئوية (إذا لزم الأمر). أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل الذي يحتوي على 1 M Tris و 0.5 M EDTA و 4٪ SDS و dH2O والبروتيناز K إلى العينات.
  5. تجانس العينات.
    1. امزج العينات جيدا عن طريق الدوامة واحتضانها طوال الليل عند 55 درجة مئوية.
    2. في اليوم التالي ، أضف 100 ميكرولتر من أسيتات الأمونيوم واخلطها لفترة وجيزة عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي عند 12,000 جم لمدة 20 دقيقة عند 25 درجة مئوية
  6. إجراء فصل الطور .
    1. انقل المرحلة المائية الصافية بعناية إلى أنابيب معقمة جديدة تحمل علامة 1.5 مل.
    2. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول واحتضنه لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية (نقطة توقف ، -20 درجة مئوية). جهاز طرد مركزي عند 12,000 جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية
  7. اغسل حبيبات الحمض النووي.
    1. بعد فحص الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب ، تخلص بعناية من المادة الطافية.
    2. أضف 1000 ميكرولتر من 70٪ إيثانول واضغط برفق على الأنبوب لتعويم الحبيبات. جهاز طرد مركزي عند 7500 جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية
  8. تنقية الحمض النووي.
    1. بعد فحص الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب ، تخلص بعناية من المادة الطافية.
    2. استخدم ماصة دقيقة سعة 10 ميكرولتر لإزالة الإيثانول المتبقي وتركه يجف تماما.
    3. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز (NFW) لإعادة تعليق الحبيبات. احتضان عند +4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  9. تحديد وتخزين الحمض النووي.
    1. قياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بتخزين عينات الحمض النووي عند +4 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر. (نقطة توقف).
  10. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
    1. صمم بادئات SRY-F و SRY-R وغير المباشرة PAX6-F و PAX6-R (انظر الجدول التكميلي 1).
    2. قم بإعداد مزيج PCR على النحو التالي (لكل عينة): 5 ميكرولتر من محلول PCR (10x) ، 4 ميكرولتر من MgCl2 ، 4 ميكرولتر من dNTPs ، 0.5 ميكرولتر من كل من البادئات الأربعة ، 31 ميكرولتر من dH2O ، و 0.5 ميكرولتر من بوليميراز Taq.
      ملاحظة: يجب إضافة بوليميراز Taq أخيرا وقبل الاستخدام مباشرة لضمان التضخيم الأمثل.
    3. قم بإعداد أنابيب PCR المسماة وضعها على رف تبريد +4 درجة مئوية. وزعي 45 ميكرولتر من الخليط في الأنابيب.
    4. اضغط برفق على الكتلة للتأكد من وجود قطرات خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل في قاع الأنبوب.
    5. أضف 5 ميكرولتر من عينات الحمض النووي والماصة لفترة وجيزة. دوامة لفترة وجيزة ثم الطرد المركزي الأنابيب.
    6. ضع الأنابيب في جهاز PCR واضبط البرنامج على الشروط التالية: في البداية ، الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 40 دورة من التمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، والتلدين عند 57 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة. بعد الدورات ، تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، يليه تعليق عند 40 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
  11. تصور عينات النتائج باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز بنسبة 2٪.
    ملاحظة: العينات التي تظهر شريطين من الذكور ، وأولئك الذين لديهم فرقة واحدة فقط هم من الإناث.

4. تأكيد تلف نقص الأكسجة في الفئران حديثي الولادة

  1. قم بتقييم أنسجة المخ التي تم جمعها من الفئران المضحية مجهريا لتأكيد تلف نقص الأكسجين وفحص الأنسجة المناعية لاختبار HIF-1α.
    1. إصلاح وتضمين البارافين الأنسجة.
      1. احتفظ بالأنسجة في الفورمالديهايد لمدة 12 ساعة ، ثم اغسلها بالماء لمدة 6 ساعات.
      2. إصلاح الأنسجة عن طريق التجفيف في سلسلة الكحول الإيثيلي لمدة يوم واحد لكل تركيز: 70٪, 80٪, 90٪, ثم 3 ساعات في 100٪ الكحول الإيثيلي. ضع المناديل في الزيلين لمدة 15 دقيقة حتى تنظيفها.
      3. نقل الأنسجة إلى سلسلة البارافين الأولى والثانية والثالثة لمدة ساعة واحدة لكل منهما. بعد الساعة الثالثة ، قم بتوجيه عينات الدماغ بشكل صحيح وقم بتضمينها في البارافين النظيف.
      4. باستخدام ميكروتوم دوار ، قم بقطع أقسام بسمك 5 ميكرومتر من كتل البارافين.
    2. تحضير الشرائح.
      1. لتلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (HE) ، ضع أقساما على شرائح زجاجية عادية.
      2. بالنسبة للكيمياء المناعية ، ضع أقساما على شرائح زجاجية موجبة الشحنة.
        ملاحظة: (نقطة توقف) ، يمكن أرشفة الشرائح في هذه المرحلة لمزيد من التقييم والعمل.
    3. أداء تلطيخ HE.
      1. اغمر العينات في محلول الزيلين الأول لمدة 10 دقائق.
      2. اغمر العينات في محلول Xylene II لمدة 10 دقائق إضافية.
      3. انقل العينات إلى سلسلة من تركيزات الكحول المتناقصة ، كل منها لمدة 1 دقيقة: 100٪ و 96٪ و 80٪.
      4. اغسل العينات بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
      5. اغمر العينات في الهيماتوكسيلين لمدة 8 دقائق ، ثم اغسلها في الماء المقطر لمدة دقيقتين.
      6. بعد الغسيل ، عالج العينات بالكحول الحمضي لمدة 1 ثانية ، متبوعا بغسل لمدة 1 دقيقة.
      7. ضع العينات في ماء الأمونيا لمدة 10 ثوان ، ثم كرر الغسيل لمدة 1 دقيقة.
      8. ضع العينات في كحول بنسبة 70٪ لمدة 30 ثانية.
      9. اغمر العينات في اليوزين لمدة 10 دقائق.
      10. انقل العينات تدريجيا عن طريق زيادة تركيزات الكحول لمدة دقيقة واحدة لكل منها: 96٪ و 96٪ و 100٪.
      11. اغمر العينات في محاليل Xylene I و Xylene II و Xylene III لمدة 1 دقيقة لكل منها.
      12. غطيها بغطاء.
    4. افحص باستخدام المجهر.
      1. بعد تلطيخ HE ، افحص أنسجة المخ بالكامل لكل مجموعة تحت المجهر الضوئي.
      2. تقييم مناطق الحصين والقشرية بحثا عن تنكس الخلايا العصبية والوذمة المحيطة بالخلايا / حول الأوعية الدموية.
  2. قم بإجراء تلطيخ HIF-1α.
    1. احتضان العينات على شرائح موجبة الشحنة طوال الليل عند 67 درجة مئوية في حاضنة لضمان التثبيت المناسب.
    2. قم بتمرير الأقسام عبر محاليل الزيلين الأول والزيلين الثاني لإكمال إزالة البارافين.
    3. قم بإعادة ترطيب الأقسام عن طريق وضعها بالتتابع في محاليل الإيثانول بنسبة 100٪ و 96٪ و 80٪ و 70٪ لمدة 5 دقائق لكل منها ، متبوعة بالشطف بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    4. اكشف القناع عن الحلقات عن طريق وضع أقسام في الميكروويف في 0.01 M حامض الستريك (الرقم الهيدروجيني 6.0) عند 665 واط لمدة دورتين مدة كل منهما 5 دقائق.
    5. قم بتبريد الأقسام في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
    6. حدد محيط الأقسام بقلم مسعور ، ثم اغسل الأقسام 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
    7. احتضان أقسام في 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في الميثانول لمدة 10 دقائق لمنع نشاط البيروكسيديز الداخلي.
    8. اغسل الأقسام مرة أخرى 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    9. لمنع ارتباط الغلوبولين المناعي غير المحدد ، احتضان الأقسام بكاشف مانع للأشعة فوق البنفسجية لمدة 7 دقائق.
    10. احتضان الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد الأساسي المضاد ل HIF-1α (تخفيف 1: 200).
    11. اغسل الأقسام 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    12. ضع الجسم المضاد الثانوي البيوتينيل على الأقسام واحتضنه في RT لمدة 40 دقيقة.
    13. اغسل الأقسام مرة أخرى 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    14. ضع محلول الستربتافيدين على الأقسام واحتضنه لمدة 30 دقيقة في RT.
    15. اغسل الأقسام 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
    16. قم بتطوير تفاعل التلوين عن طريق تطبيق 3،3'-ديامينوبنزيدين (DAB) والمراقبة تحت المجهر الضوئي.
    17. قم بتلطيخ الأقسام بمحلول الهيماتوكسيلين Gill II المعدل لتلطيخ النوى.
    18. تجفيف الأقسام عن طريق تمريرها من خلال تركيزات متزايدة من الإيثانول (70٪ و 80٪ و 96٪ و 100٪ إيثانول).
    19. قم بمسح الأقسام عن طريق احتضانها في محلولي Xylene I و Xylene II لمدة 10 دقائق لكل منهما.
    20. قم بتركيب الأقسام بوسط تثبيت وغطاء.
    21. افحص الأقسام المثبتة تحت المجهر الضوئي وقم بتقييم مناطق الحصين وقشرة الفص الجبهي.
    22. قياس مستويات النشاط المناعي باستخدام برنامج معالجة الصور مفتوح المصدر.

5. التجارب السلوكية

  1. بعد تأكيد نقص الأكسجة ، اسمح للفئران المتبقية بإكمال فترة الرضاعة مع أمهاتها.
  2. قم بتحديد الجنس في اليوم 21 بعد الولادة بناء على المسافة التناسلية ، ثم قم بإيواء في أقفاص مختلفة بناء على جنسها. عندما تصل الفئران في مجموعات التحكم الناقصة للأكسجين والزائفة إلى شهرين من العمر ، أخضعها لتجارب سلوكية.
  3. قبل إجراء الاختبارات السلوكية ، تأقلم الأشخاص مع بيئة الاختبار لمدة 15-30 دقيقة قبل الاختبار.
  4. تأكد من تطهير جميع الأجهزة / الأجهزة بين الموضوعات والتجارب باستخدام 70٪ من الإيثانول.
  5. إجراء اختبار التعرف على الكائنات الجديدة (NOR).
    1. اضبط الكاميرا في وضع يمكن من خلاله رؤية الأهداف ومراقبتها بوضوح.
    2. قم بتثبيت برنامج تتبع الفيديو المناسب.
    3. جهز ساحة الاختبار (صندوق 60 سم × 60 × سم × 40 سم) بجسمين لا يزيد حجمهما عن الماوس. تأكد من أن الجسمين متشابهان في الحجم والشكل ويمكن الوصول إليهما بسهولة (10 سم × 10 سم بعيدا عن الجدران ومتوازيهما).
    4. اليوم 1: مرحلة التعريف:
      1. ضع الماوس في الساحة مع الكائنين المتطابقين. اسمح للماوس باستكشاف الكائنات بحرية لفترة زمنية محددة (على سبيل المثال ، 10 دقائق).
      2. خلال هذه الجلسة ، راقب وسجل مقدار الوقت الذي يقضيه الماوس مع كل كائن. أيضا ، سجل عدد المرات التي استدار فيها الماوس نحو كل كائن أو تفاعل معه
    5. اليوم 2: مقدمة كائن جديد:
      1. استبدل أحد الكائنات المألوفة من اليوم الأول بكائن جديد (مختلف في المظهر أو الملمس أو الشكل).
      2. أعد الماوس إلى الساحة ، مما يسمح له بالاستكشاف بحرية مرة أخرى لنفس الفترة الزمنية كما في الجلسة الأولى.
    6. سجل إجمالي الوقت الذي يقضيه الماوس مع الكائن المألوف (من اليوم الأول) والكائن الجديد. سجل عدد المرات التي استدار فيها الماوس نحو كل كائن أو تفاعل معه.
    7. احسب مؤشر التمييز (DI) لتقييم ذاكرة الماوس وتعلمه باستخدام الصيغة:
      مؤشر التمييز (DI) = {(الوقت المستغرق مع كائن جديد - الوقت المستغرق مع كائن مألوف) / (إجمالي الوقت المستغرق مع كلا الكائنين)} × 100.
      ملاحظة: يشير DI الأعلى إلى اهتمام أكبر بالكائن الجديد ، مما يشير إلى ذاكرة وقدرات تعلم أفضل. يشير DI القريب من 0 إلى عدم وجود تفضيل ، مما يشير إما إلى الاهتمام المتساوي أو الذاكرة الضعيفة للكائن المألوف.
    8. استخدم DI لتقييم قدرات الماوس في التعلم والذاكرة بشكل موضوعي ، بناء على فضوله الطبيعي وقدرته على التعرف على الأشياء المألوفة والجديدة والتمييز بينها.
  6. إجراء اختبار تعليق الذيل (TST)
    1. قم بتثبيت الكاميرا في وضع تكون فيه الفئران مرئية بوضوح ويمكن مراقبتها. قم بتثبيت برنامج تتبع الفيديو المناسب.
    2. قم بإعداد الإعداد التجريبي بمساحة لاستيعاب 3 فئران في وقت واحد .
    3. استخدم ألواح من الورق المقوى بارتفاع 25 سم بفواصل زمنية 20 سم لعزل الفئران حتى لا تتمكن من رؤية بعضها البعض أثناء الاختبار.
    4. قم بقص شرائط من الشريط اللاصق بطول 12 سم وقم بتثبيتها بعناية على ذيل كل فأر ، مع التأكد من تثبيت الذيل بإحكام دون التسبب في ضرر. ضع الشريط في نهاية الذيل (2 سم) بحيث يمكن تعليق الماوس دون إصابة نفسه.
    5. سجل الفئران لمدة 6 دقائق أثناء تعليقها.
    6. في نهاية المدة ، أوقف التسجيل ، وقم بإزالة الماوس ، وإعادته إلى قفص السكن. قم بتحليل مقاطع الفيديو لتحديد مدة الحركة النشطة ومدة الجمود.
      ملاحظة: سيوفر هذا نظرة ثاقبة للاستجابة للإجهاد ، حيث يشير الجمود غالبا إلى حالة من العجز أو الإجهاد المكتسب. تستخدم درجة الجمود بشكل شائع لقياس اليأس السلوكي أو الاستجابة للإجهاد في الفئران ، والتي قد تكون مرتبطة بآثار الإجهاد أو حالات الاكتئاب.
    7. بناء على أنماط الحركة والجمود الملحوظة ، قم بتقييم الحالة العاطفية وآليات التأقلم مع الإجهاد للفئران استجابة للتعليق القسري.
  7. إجراء اختبار دفن الرخام
    1. املأ قفصا فارغا (20 سم × 35 سم × 15 سم) بارتفاع 5 سم من قطعة خبز الذرة. رتب 20 قطعة من الكرات في 5 صفوف مع 4 كرات لكل منها. تأكد من توزيع الكرات بالتساوي على السطح.
    2. ضع الموضوع في زاوية من القفص ، مما يضمن الوصول المجاني إلى القفص بأكمله.
    3. امنح الماوس 20 دقيقة لاستكشاف القفص. خلال هذا الوقت ، قد يظهر الفأر بعض سلوك الدفن ، في محاولة لتغطية الكرات بقطعة خبز الذرة. بعد 20 دقيقة ، أخرج الماوس من القفص.
    4. احسب العدد الإجمالي للكرات التي دفنها الفأر تحت قطعة خبز الذرة خلال فترة 20 دقيقة. سجل العدد الإجمالي للكرات الدفنة ، لأن هذا هو المقياس الرئيسي للسلوك.
      ملاحظة: يشيع استخدام عدد الكرات الدفونة كمؤشر على القلق أو السلوك القهري أو رهاب القوارض. غالبا ما يرتبط عدد أكبر من الرخام المدفون بمستويات أعلى من القلق أو الميول القهرية.
    5. بناء على العدد الإجمالي للكرات الدفونية ، قم بتقييم السلوكيات المرتبطة بالقلق والميول القهرية في الفئران ، والتي يمكن استخدامها لتقييم آثار العلاجات أو الظروف التجريبية.
  8. إجراء اختبار التفاعل الاجتماعي.
    1. قم بتثبيت الكاميرا في وضع تكون فيه الفئران مرئية بوضوح ويمكن مراقبتها.
    2. قم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر وقم بإعداد برنامج تتبع الفيديو المناسب. قم بإعداد صندوق مستطيل (60 سم × 40 سم × 25 سم) بجدارين (40 سم × 25 سم) ببابين (8 سم) لفصل الغرف الثلاث.
    3. ضع قفصا (15 سم × 10 سم) يحتوي على فأر مألوف لموضوع التجربة وقفص آخر (15 سم × 10 سم) يحتوي على فأر لم يكن له تفاعل سابق مع موضوع التجربة.
    4. ابدأ التسجيل وضع الموضوع في الحجرة الوسطى.
      ملاحظة: يجب أن تكون الفئران المستخدمة في هذا الاختبار بخلاف التجربة من نفس الجنس وبصحة جيدة.
    5. راقب الموضوع لمدة 5 دقائق وقم بتسجيله بكاميرا الفيديو. في نهاية المدة ، أوقف التسجيل ، وقم بإزالة الماوس وإعادته إلى قفص السكن.
    6. باستخدام برنامج SIT ، قم بتحليل وقت التفاعل الاجتماعي وميول الحداثة الاجتماعية للفئران ومقارنتها بمجموعة التحكم الوهمية.
      ملاحظة: يمكن تفسير المزيد من الوقت الذي يقضيه في السلوكيات الاجتماعية (على سبيل المثال ، الاستمالة أو الاستنشام) وقضاء وقت أقل في تجنب العدوان أو إظهاره على أنه إظهار التواصل الاجتماعي العالي. يمكن أن يشير تجنب التفاعل أو قضاء المزيد من الوقت في عزلة أو إظهار عدوانية متزايدة إلى القلق أو الانسحاب الاجتماعي أو انخفاض القدرة على التفاعل الاجتماعي.
  9. إجراء اختبار المجال المفتوح.
    1. ضع الكاميرا حيث يمكن رؤية الفئران بوضوح ومراقبتها. قم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر وقم بإعداد برنامج تتبع الفيديو المناسب.
    2. قم بإعداد ساحة الاختبار (صندوق 60 سم × 60 سم × 40 سم) وقسم الصندوق بخطوط خيالية لإنشاء 16 مربعا.
    3. ابدأ التسجيل وضع الماوس بعناية في وسط الساحة. راقب وسجل سلوك الماوس لمدة 5 دقائق.
    4. في نهاية المدة ، أوقف التسجيل ، وقم بإزالة الماوس ، وإعادته إلى قفص السكن.
    5. باستخدام برنامج التتبع ، قم بقياس السلوكيات الخارجية والداخلية للمشي ، والتسلق ، والهروب ، والاستمالة ، والجمود ، والعبور الكلي ، والتغوط ، والتبول لتقييم مستويات القلق والحركة والاستكشافية والنشاط العاطفي لدى الأشخاص
  10. قم بإجراء اختبار متاهة موريس المائية (MWM).
    1. تحضير متاهة الماء التي يبلغ قطرها 120 سم وعمق 60 سم في وضع مستقر في مختبر سلوكي عند 23 ± 1 درجة مئوية.
    2. قسم المتاهة إلى أربعة أرباع خيالية إشارات بصرية مختلفة (في الشكل واللون) في وسط كل ربع من جدران المتاهة على بعد حوالي 20 سم من القاعدة. ضع منصة بطول 17 سم وقطر 10 سم على بعد 20 سم من الحائط.
      ملاحظة: يجب ألا تغير المتاهة والإشارات والمنصة موضعها أو موقعها حتى تتمكن الفئران من تدريب ذاكرتها بدقة.
    3. املأ المتاهة بماء 21-26 درجة مئوية إلى 1 سم أسفل المنصة وصخها بصبغة أكريليك سوداء متعددة الأسطح.
      ملاحظة: في حالة استخدام سلالات أخرى من الفئران ، يجب تلوين الماء بلون تباين للفئران حتى تتمكن من مراقبتها.
    4. ضع الكاميرا في وضع يلتقط الصورة الكاملة وقم بتوصيلها ببرنامج MWM على الكمبيوتر.
      ملاحظة: يجب تعيين مكان النظام الأساسي في البرنامج لليوم الخامس من التجربة.
    5. يستمر الاختبار لمدة 5 أيام مع أربع تجارب لكل منها. في الأيام الأربعة الأولى ، ابدأ التسجيل وابدأ التجربة عن طريق وضع الموضوع بعناية في ربع مختلف كل يوم ، مع توجيه وجهه نحو جدار الخزان.
    6. قم بتعيين موقع النظام الأساسي في جدول اختبار اليوم 5.
      ملاحظة: هذا يمنع الأشخاص من تكوين ذاكرة ترابطية. يعد وضع الأشخاص في الماء بعناية والحفاظ على درجة الحرارة الصحيحة أمرا ضروريا لتجنب إضافة الضغط الخارجي. تستمر التجارب لمدة 5 دقائق وتنتهي تلقائيا عندما (1) يتم الوصول إلى النظام الأساسي (2) انتهاء المهلة الزمنية البالغة 5 دقائق. على مدار أيام ، يجب أن يتعلم الأشخاص موقع النظام الأساسي والعثور عليه في وقت أقل.
    7. في اليوم الخامس ، قم بإزالة المنصة وضع الفئران بعناية في مربع من المتاهة كما هو موضح سابقا.
      ملاحظة: تنتهي الفترة التجريبية تلقائيا عندما (1) يعثر الماوس على النظام الأساسي ويخطو إليه ، (2) تنتهي صلاحية المهلة الزمنية البالغة 5 دقائق. يجب أن يجد الأشخاص الأصحاء موقع النظام الأساسي السابق. سيقوم البرنامج تلقائيا بحساب الوقت الذي يستغرقه الماوس للعثور على النظام الأساسي في كل تجربة ويساعد في تقييم الذاكرة قصيرة وطويلة المدى وقدرات التعلم للأشخاص.

6. تأكيد تلف نقص الأكسجة للفئران البالغة

  1. بعد الانتهاء من الاختبار السلوكي ، ضحي بالأشخاص عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. اجمع عينات أنسجة الحصين والدم من 6 فئران من كل مجموعة ، بما في ذلك المجموعة الضابطة الزائفة ، للتحليل الجزيئي (القسم 7).
  3. ضع أدمغة الفئران الأربعة المتبقية في محلول فورمالديهايد بنسبة 10٪ لفحص آثار التعرض لنقص الأكسجة خلال فترة حديثي الولادة على مورفولوجيا دماغ البالغين.
  4. استخدم نفس التقنية كما هو موضح سابقا في القسم 4 لإجراء تحليل نسيجي لأدمغة الفئران البالغة.

7. العزل الكلي للحمض النووي الريبي من عينات الطور البالغة

  1. أضف 500 ميكرولتر من التریزول إلى كل عينة من الأنسجة و 500 ميكرولتر من الدم.
  2. بالنسبة لأنسجة المخ ، قم بتجانس العينات باستخدام حقنة.
  3. احتضن الخليط في RT لمدة 5 دقائق.
  4. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب واحتضنه لمدة 5 دقائق إضافية في RT.
  5. جهاز طرد مركزي عند 12,000 جم لمدة 20 دقيقة عند +4 درجة مئوية.
  6. انقل الطور المائي (RNA) بعناية إلى أنبوب معقم جديد.
  7. أضف الأيزوبروبانول (نسبة 1: 1 إلى المرحلة المائية) واحتضن الخليط طوال الليل. (نقطة توقف / -20 درجة مئوية).
  8. في اليوم التالي ، جهاز الطرد المركزي عند 12,000 جم لمدة 10 دقائق عند +4 درجة مئوية.
  9. تخلص من المادة الطافية بعناية وأضف 1000 ميكرولتر من 75٪ إيثانول إلى الحبيبات.
  10. جهاز طرد مركزي عند 7,500 × جم لمدة 5 دقائق عند +4 درجة مئوية.
  11. كرر خطوة غسل الإيثانول مرتين.
    ملاحظة: إذا كانت الحبيبات صغيرة جدا ، يكفي غسل واحد.
  12. تخلص من المادة الطافية واترك الحبيبات تجف في الهواء عند RT.
  13. بمجرد أن تجف تماما ، أعد تعليق الحبيبات ب 50 ميكرولتر من NFW واحتضانها على الثلج عند +4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
  14. قياس تركيز الحمض النووي الريبي بشكل طيفي ضوئي.
  15. قم بتخزين عينات الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

8. تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)

  1. العمل على رف تبريد +4 درجة مئوية ، قم بإعداد عينات الحمض النووي الريبي المعزولة من أنسجة الدم والدماغ.
  2. قم بإعداد أنابيب PCR المسماة.
  3. امزج كواشف مجموعة توليف (كدنا) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  4. قم بإعداد ما مجموعه 14 ميكرولتر من خليط التفاعل لكل عينة وتوزيعها على الأنابيب.
  5. أضف 6 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي إلى المزيج.
  6. قم بإجراء تخليق (كدنا) في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع ظروف درجة الحرارة والوقت المحددة من قبل الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين (كدنا) المركب في هذه المرحلة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  7. تمييع (كدنا) المركب بنسبة 1: 5.
  8. قم بتخزين (كدنا) المخفف عند -80 درجة مئوية لتحليل qPCR في المستقبل.

9. تعبير تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ل miRNA (miR-19a-3p و miR-361-5p و miR-150-5p و miR-126-3p و miR-499a-5p و U6 الحمض النووي الريبي النووي الصغير كتحكم في التطبيع)

  1. صمم البادئات لكل miRNA (انظر الجدول التكميلي 2 للتسلسلات).
  2. تحضير خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. قم بتوزيع 14 ميكرولتر من مزيج التفاعل في كل بئر من لوحة PCR سعة 96 بئرا.
  4. أضف 6 ميكرولتر من 1: 5 (كدنا) المخفف إلى كل بئر لحجم تفاعل إجمالي يبلغ 20 ميكرولتر.
  5. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل مكرر لكل عينة لتقليل التباين باتباع هذا البرنامج: التمسخ الأولي عند 95 درجة مئوية لمدة 120 ثانية ، و 45 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، والتلدين والتضخيم عند 56 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، وتحليل منحنى الانصهار عند 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، ثم عند 95 درجة مئوية.
  6. قم بتحليل النتائج باستخدام قيم Ct (عتبة الدورة) وتطبيع البيانات باستخدام طريقة 2-ΔΔCt .

10. التحليل الإحصائي

  1. . قم بتقييم طبيعية البيانات باستخدام الرسوم البيانية ومخططات Q-Q واختبار Shapiro-Wilk لتحليل بيانات تعبير miRNA.
    1. إذا كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي ، فاستخدم ANOVA أحادي الاتجاه.
    2. إذا لم يتم توزيع البيانات بشكل طبيعي ، فقم بتطبيق اختبار Kruskal-Walli أو اختبار t للطالب أو اختبار Mann-Whitney U.
  2. عند تقييم الفروق بين الجنسين داخل كل مجموعة ، استخدم إما اختبار t للطالب أو اختبار Mann-Whitney U ، اعتمادا على توزيع البيانات. يتم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال قيمة p تبلغ <0.05.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع التحليلات باستخدام البرامج الإحصائية المناسبة. هنا ، يتم استخدام GraphPad Prism 8.
  3. تقييم طبيعية البيانات باستخدام الرسوم البيانية ومخططات Q-Q واختبار شابيرو ويلك لتحليل نتائج التجارب السلوكية.
    1. إذا تم توزيع البيانات بشكل طبيعي ، فاستخدم ANOVA ثنائي الاتجاه.
    2. بالنسبة للبيانات التي لا يتم توزيعها عادة ، قم بإجراء اختبار Kruskal-Walli أو اختبار Student's t أو اختبار Mann-Whitney U.
    3. تقييم الفروق بين الجنسين داخل كل مجموعة باستخدام اختبار t للطالب أو اختبار Mann-Whitney U ، اعتمادا على توزيع البيانات. مرة أخرى ، ضع في اعتبارك النتائج ذات دلالة إحصائية إذا كانت قيمة p < 0.05.
  4. للتحليلات الكيميائية المناعية ، استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey اللاحق لمقارنة مجموعات الإناث والذكور.
  5. لمقارنة مجموعات الإناث والذكور في كل حالة نقص الأكسجة ، استخدم اختبار Sidak اللاحق. يتم تحديد الدلالة الإحصائية إذا كانت قيمة p < 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه الدراسة ، تعرضت الفئران الحامل Balb / c لظروف نقص الأكسجين بنسبة 8٪ O2 (شديد) و 10٪ O2 (معتدل) و 12٪ O2 (خفيف) أثناء الولادة ، وتم الحفاظ على الفئران حديثي الولادة في ظل ظروف نقص الأكسجة هذه لمدة 5 دقائق لإنشاء نماذج لنقص الأكسجة الخفيف والمتوسط والشديد عند الأطفال حديثي الولادة. تعرضت المجموعة المصنفة على أنها المجموعة الشاهدة الوهمية لظروف الولادة العادية (21٪ O2) ثم سمح لها بالعيش في ظل ظروف الرعاية القياسية. يساعد هذا في عزل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمكن أن يسبب نقص الأكسجة في الفترة المحيطة بالولادة ، وهو مشكلة صحية رئيسية لحديثي الولادة ، تغيرات جزيئية وخلوية وعصبية عن طريق تعطيل العمليات التنموية الحرجة وقد ارتبط بالعديد من اضطرابات النمو العصبي ، بما في ذلك اضطراب طيف التوحد (ASD)1. في حين أن نقص الأكسجة الشديد قد تمت دراسته على نطاق واسع لآثاره الفورية ، إلا أن العواقب طويلة المدى لنقص الأكسجة الخفيف إلى المتوسط خلال فترة الفترة المحيطة بالولادة لا تزال أقل فهما. هدفت دراستنا إلى سد هذه الفجوة من خلال فح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل مجلس البحوث العلمية والتكنولوجية في تركيا (TÜBİTAK) ، ويشكر المؤلفون Celalettin Göktaş (منشأة المعدلة وراثيا) وعالمة الأحياء Selda Taşdemir (المختبر السلوكي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(-20 & درجة؛ ج) فريزرسيمنز KD86NAWE0N
(+4 ° ج) الكتلةعلم الأحياء المضادhttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 ° ج) الثلاجةسيمنز KD86NAWE0N
(-20 & درجة؛ ج) الكتلةكليفر سينتيفhttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
الإيثانول المطلقميرك1070172511
أسيتات الأمونيومسيغما238074-500G
التوازن التحليلي  آدم إكويبمنتLAB214i
الكلوروفورمميرك1024451000
حمض الستريك  ميرك100241
الحاسوبHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTAسيغماE9884-1KG
إنتيلان ميرك107961
إيوسينميرك109844
إبندورف (1.5 مل)؟solab078.03.021
نظام الإيثوفيجننولدوسhttps://noldus.com/ethovision-xt
إيتوفNUVEEN 400/500 غير متوفر
أنابيب فالكون (15 مل)إيزولاب078.02.001
الفورمالديهايدميرك104002
كاميرا الحرارةسامسونجSC2000
الهيماتوكسيلينميرك105175
HIF-1α الأجسام المضادةالبيوسbs-20398R 
تشامبرز نقص الأكسجين بيوسفيركسغرفة A
الإيزوبروبونالميرك1096342511
لايت سايكلر 480 IIروش5015278001
قفص اختبار دفن الرخامفيشنو https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
أنابيب الطرد المركزي الدقيق (1.5 مل)غرينر616201
رؤوس الميكروبايبت (100 وميكرو؛ L)غرينر774353
أطراف الميكروبايبت (1000 وميكرو؛ L)غرينر778353
الميكروبايبتات (10 وميكرو؛ L)جيلسونFD10001
الميكروبايبتات (100 وميكرو؛ L)جيلسونFD10004
الميكروبايبتات (1000 وميكرو؛ L)جيلسونFD10003
أطراف الميكروبايبتات (10 وميكرو؛ L)غرينر772353
الميكروبايبتات (2 وميكرو؛ L)جيلسونGFAM00064
المجهرأوليمبوسBx53
مجموعة ميركوري LNA RT (مجموعة تخليق cDNA)تشياغن339340
ميركوري LNA Sybr Green PCRتشياغن339346
ألواح متعددة الحفرروش4729692001
مطياف نانو فوتومتريشيمادزوC101-E112
ساحة اختبار التعرف على الأشياء الجديدةالتقنية الحيوية العالمية137
صالة اختبار الميدان المفتوحالتقنية الحيوية العالمية117
أوكسي سايكلر بيوسفيركسA42OC
بارافين Leica 39602012
تابلت PBSسيغماP4417-50TAB
جهاز PCRسينسوكويستT3-0140
دوران اللوحةبيكلاب91-PSPIN-P
المنشورجراف بادhttps://www.graphpad.com/
إنزيم البروتيناز KسيغماP6556-10MG
كاشف عزل كاشف التحليل QIAzolتشياغن79306
SDSسيغما8170342500
الأجسام المضادة الثانية  أبكامA0545-1ML
الغرف الثلاثة لاختبار التفاعل الاجتماعيالتقنية الحيوية العالمية118
دورانجيلسونPMC880
حقنة (2 مل)بيبيhttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
إعداد اختبار تعليق الذيل"صنع ذاتي"، يمكنك العثور على أعمال مشابهة في هارفارد أبريتوسصنع النفس، يمكنك العثور على شيء مشابه على (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
خلاط حراريإبندورف#5355
قاعدة تريزماسيغما1503-1 كجم
الدوامةهايدولف541-10000-00-1
زيلينيس Isolab 9,90,01,92,501

المراجع

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نقص الأكسجة لحديثي الولادةاختلال تنظيم الحمض النووي الريبوزي الميكرويالاختبارات السلوكيةمتاهة موريس المائيةالتعرف على الأشياء الجديدةاختبار دفن الكرات الزجاجيةاختبار التفاعل الاجتماعيمؤشرات التدهور العصبيالتدخل المبكر
نقص الأكسجة يغير مستويات miRNAs المشاركة في الوراثة غير المندلية لاضطراب طيف التوحد في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.