يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا الغضروفية الأولية الكافية في غضون 6-8 ساعات ، مما يسهل إجراء مزيد من التحقيقات المتعمقة لبيولوجيا الغضروف وآليات أمراض الغضروف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزل في المختبر وزراعة الخلايا الغضروفية الأولية للفئران لبيولوجيا الغضروف
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يؤدي تدمير الغضروف المفصلي إلى تغيير نشاط الخلايا الغضروفية ، وهو عامل مسبب رئيسي في مجموعة متنوعة من أمراض الغضروف ، بما في ذلك هشاشة العظام (OA) والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA). باعتباره أكثر أنواع الخلايا وفرة في الغضاريف ، فإن الدراسة المتعمقة للخصائص البيولوجية للخلايا الغضروفية ضرورية لتطوير استراتيجيات فعالة لعلاج الأمراض. يوفر عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها مواد تجريبية مهمة للتحقيق في مرض الغضروف ويساهم في كشف آليات إصابة الغضروف وإصلاحه. يقدم هذا البروتوكول وصفا تفصيليا لطرق العزل والزراعة في المختبر للخلايا الغضروفية الأولية المشتقة من الفئران. باستخدام بروتوكول الكولاجيناز II المحسن ، يمكن إكمال عزل الخلايا الغضروفية في غضون 8 ساعات لعينات غضروف مفصل ركبة الفأر حديثي الولادة. يبلغ عائد الخلية حوالي 1-2 × 10³ من الخلايا / مجم من أنسجة الغضروف ، وتختلف مع نضارة الأنسجة وكثافة الخلايا الأولية. تظهر الخلايا المعزولة >90٪ من البقاء. يستخدم هذا البروتوكول الخلايا الغضروفية الأولية للفئران كمثال ، مما يوضح الخصائص المورفولوجية وحالة الالتصاق للخلايا المزروعة لمدة 1 و 2 و 5 أيام بعد العزل. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) والنشاف الغربي أن علاج الإنترلوكين -1β (IL-1β) قلل من الكولاجين من النوع الثاني ألفا 1 (Col2a1) وزاد من تعبير Matrix Metallopeptidase 13 (Mmp13) ، مما يؤكد أن الخلايا الغضروفية المعزولة تستجيب للمنبهات الالتهابية. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، يستخدم هذا البروتوكول تركيزا أعلى من الكولاجيناز لتقليل تأثير وقت العزل المطول على بقاء الخلية ، مع تجنب تلف الخلايا المحتمل من علاج التربسين. الخلايا الغضروفية الأولية التي تم الحصول عليها نقية وقابلة للحياة ، ومناسبة للدراسات المتعمقة حول الآليات المتعلقة بإصابة الغضروف ، والتي لها آثار مهمة على البحث في المختبر والعلاج السريري لمرض الغضروف.
المقدمة
يعد تدمير الغضروف المفصلي سببا رئيسيا لأمراض الغضروف المختلفة ، مثل الزراعة العضوية و RA1،2. الخلايا الغضروفية ، نوع الخلايا السائدة في الغضروف ، ضرورية للحفاظ على التوازن وتسهيل الإصلاح استجابة للإصابة3. لا تؤثر التغيرات في نشاط الخلايا الغضروفية على السلامة الهيكلية للغضروف فحسب ، بل تؤدي أيضا إلى استجابات التهابية وتنكس الأنسجة التدريجي4. لذلك ، يعد التحقيق المتعمق في الخصائص البيولوجية للخلايا الغضروفية أمرا بالغ الأهمية لتوضيح التسبب في المرض لهذه الأمراض.
في السنوات الأخيرة ، حظي دور الخلايا الغضروفية في الاستجابات الالتهابية باهتمام متزايد. أظهرت الدراسات أن السيتوكينات الالتهابية ، مثل IL-1β وعامل نخر الورم α (TNF-α) ، تضر بشكل كبير بعمليات التمثيل الغذائي للخلايا الغضروفية ، مما يؤدي إلى زيادة التعبير عن الإنزيمات المهينة للمصفوفة وانخفاض تخليق المصفوفة5،6،7. تؤدي هذه التغييرات في النهاية إلى التنكس التدريجي للغضاريف والخلل الوظيفي في المفاصل. لذلك ، أصبح التحقيق في التغيرات البيولوجية للخلايا الغضروفية في ظل الظروف المرضية داخل النماذج المختبرية أمرا ضروريا بشكل خاص. بناء على الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) أحادية الطبقة ، تم اعتماد التطورات الحديثة في زراعة الخلايا الغضروفية ثلاثية الأبعاد (3D) وتقنيات العضوية بشكل متزايد في الأبحاث المتعلقة بالغضاريف. توفر هذه الأنظمة المكررة بيئة دقيقة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية وتوفر رؤى قيمة حول سلوك الخلايا الغضروفية في سياقات المرض8.
يحدد اختيار مصدر الخلية بشكل حاسم ما إذا كانت النتائج في المختبر تلخص بدقة الفيزيولوجيا المرضية للمفاصل. على عكس خطوط الخلايا الغضروفية الخالدة أو العينات الغضروفية ، تحتفظ الخلايا الغضروفية الأولية بالخلفية الجينية الأصلية ، ومسارات إشارات الكالسيوم الحساسة للميكانيكا ، والاستقرار الظاهري للغضروف المفصلي ، وبالتالي تظهر قدرة غضروفية فائقة وسلوكيات بيولوجية تعكس بشكل وثيق تلك الموجودة في خلايا الغضروف المقيمة9. تم توثيق الاختلافات المنهجية في مصادر إشارات الكالسيوم والقنوات الأيونية الرئيسية والمسارات النهائية بين الخلايا الغضروفية الأولية وخط خلية ATDC510. وبالتالي ، عند التحقيق في فسيولوجيا المفاصل أو علم الأمراض ، يجب إعطاء الأولوية للخلايا الغضروفية الأولية. لذلك ، فإن تحسين عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها أمر ضروري لنمذجة البيولوجيا المرتبطة بالأمراض بدقة واستكشاف الأدوية العلاجية المحتملة11،12،13،14،15. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية تضر بحياة الخلية أو سلامة النمط الظاهري بسبب الهضم المطول16،17.
هنا ، نصف بروتوكولا للعزل في المختبر وزراعة الخلايا الغضروفية الأولية المشتقة من أنسجة غضروف الفأر ، والتي تنتج بسرعة خلايا كافية. بالمقارنة مع بروتوكولات الهضم التقليدية ذات التركيز المنخفض للإنزيم والمطولة ، فقد حسنت هذه الدراسة ظروف هضم الإنزيم وخطوات المعالجة المسبقة للأنسجة. أدى هذا التحسين إلى تقليل وقت الهضم بشكل كبير إلى 6-8 ساعات مع تجنب تلف الخلايا المحتمل من علاج التربسين15،17. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على ما يقرب من 1-2 × 103 خلايا غضروفية من كل ملغ من أنسجة غضروف الفأر. يقدم هذا البروتوكول دليلا موثوقا به لعزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها في المختبر ، مما يوفر نموذجا قويا لدراسات أمراض الغضاريف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شيان هونغوي (رقم 202309009) ، والتزمت الإجراءات التجريبية بشكل صارم بمبادئ 3R للاستبدال والاختزال والتحسين للتجارب على.
يوضح الشكل 1 أ مخططا تخطيطيا لإعداد الكواشف والمعدات. يتضمن جدول المواد معلومات عن الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. الفئران التجريبية
ملاحظة: تم استخدام أربعة فئران من النوع البري C57BL / 6J يبلغ من العمر 3 أيام في هذه الدراسة.
- حافظ على الأقفاص عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية ورطوبة تتراوح من 50٪ إلى 60٪ ، مع دورة إضاءة / ظلام 12 ساعة / 12 ساعة. توفير نظام غذائي محدد للفئران المعقمة الخالية من مسببات الأمراض (SPF) (معقم ب 60Co Radiation) ومياه معقمة adlibitum.
- اجمع غضروف مفصل الركبة (~ 10 مجم / فأر) من أربعة فئران عمرها 3 أيام بعد الوفاة لعزل الخلايا الغضروفية الأولية.
2. جمع عينات الغضروف ومعالجتها
- معالجة الفأر وتشريح الأنسجة
- القتل الرحيم للفئران حديثي الولادة في غضون 3 أيام بعد الولادة. تعقيم سطح الجسم عن طريق المسح بنسبة 75٪ من الكحول الطبي.
- عزل مفاصل ركبة الفأر بأدوات جراحية معقمة. ضعها في 1x PBS معقمة.
- استئصال العضلات والعظام والغشاء الزليلي والأنسجة الضامة التكاثرية الأخرى المحيطة بمفصل الركبة بعناية باستخدام أدوات جراحية معقمة. احتفظ فقط بأنسجة الغضروف لمفصل الركبة.
- اشطف عينات الأنسجة 3x باستخدام 1x PBS معقم. تخلص من السائل.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 ب مخططا تخطيطيا مبسطا لاكتساب أنسجة الغضروف والمعالجة المسبقة.
الشكل 1: سير عمل مبسط لتحضير المواد ومعالجة عينات الغضاريف. (أ) مخطط تخطيطي لإعداد الكاشف والمعدات ، بما في ذلك الكواشف والمواد الاستهلاكية والأدوات الرئيسية. (ب) بروتوكول خطوة بخطوة لمعالجة أنسجة الغضروف من مفاصل ركبة الفأر. الاختصارات: PBS = محلول ملحي مخزن بالفوسفات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
3. عزل وثقافة الخلايا الغضروفية الأولية
- انقل أنسجة الغضروف المعزولة إلى صفيحة زراعة خلايا جديدة مكونة من 6 آبار. باستخدام شفرة جراحية معقمة رقم 11 ، قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة بحجم 0.25 مم3 تقريبا. اشطفها مرة واحدة باستخدام 1x PBS المعقمة المبردة. تخلص من السائل.
- أضف 2 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) الذي يحتوي على الكولاجناز II عالي التركيز (25 مجم / مل ، مذاب في خليط النسر المعدل / المغذيات المعقم من Dulbecco F-12 [DMEM / F12] الوسط الأساسي) لتغطية كتلة الأنسجة.
- احتضان لوحة زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للهضم الأنزمي. بعد الحضانة ، تخلص من السائل.
- كرر الخطوتين 3.2 و 3.3.
ملاحظة: يعد هضم الإنزيم عالي التركيز خطوة أولية. يهدف إلى هضم الأنسجة مسبقا ، وتحطيم هيكلها جزئيا لتحسين الهضم اللاحق ، وإزالة التصاقات المصفوفة التي قد تكون موجودة بسبب القطع من محيط الأنسجة. - أضف 2 مل من محلول الهضم المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) يحتوي على الكولاجيناز II منخفض التركيز (5 مجم / مل ، مذاب في وسط قاعدي معقم DMEM / F12) لتغطية كتلة الأنسجة.
- احتضان لوحة زراعة الخلايا في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات للهضم ومراقبة تقدم فصل الخلايا. قم أحيانا بإجراء اهتزاز أفقي بطيء (80-120 دورة في الدقيقة) أو سحب العينات اللطيف لتعزيز كفاءة التحلل.
ملاحظة: بالنسبة لأنسجة الفئران حديثي الولادة ، يكون إطلاق الخلايا مرئيا حوالي 3 ساعات ، مع إمكانية تحقيق العزل الكامل بين 6 و 8 ساعات. أثناء علاج الكولاجيناز II لمدة 6-8 ساعات ، راقب التحلل كل ساعة وقم بإنهاء عملية الهضم عندما لا تكون قطع الأنسجة واضحة مرئية للعين المجردة و 90٪ من الخلايا حرة ومعلقة تحت المجهر. أثناء عملية الهضم ، يمكن ملاحظة انفصال الخلايا الغضروفية الشبيهة بالفجوة تدريجيا عن كتلة أنسجة الغضروف تحت المجهر الضوئي. يمكن تكرار هذه الخطوة عدة مرات لتقليل الضرر الذي يلحق بالخلايا الغضروفية الناجم عن الهضم المطول ، ويمكن استبدال محلول الهضم بمحلول هضم جديد منخفض التركيز من الكولاجيناز II لزيادة إنتاجية الخلية. - قم بتصفية جميع منتجات الهضم من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل.
ملاحظة: استخدم مصفاة خلية 100 ميكرومتر لمنع فقدان مجاميع الخلايا الغضروفية وزيادة الإنتاجية. تتم إزالة شظايا الأنسجة المتبقية أثناء التبادل المتوسط. - اشطف لوحة زراعة الخلايا ب 1x PBS معقمة. قم بالتصفية من خلال مصفاة الخلية مرة أخرى.
- اجمع كل المرشحات من الخطوة السابقة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل الفرامل. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي.
- أضف 2 مل من 1x PBS المعقمة وأعد تعليق الراسب برفق عن طريق النفخ والشفط برفق باستخدام ماصة. انقله إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل الفرامل. تخلص من المادة الطافية بعد الطرد المركزي.
- أعد تعليق الراسب من الخطوة 4.10 مع 2 مل من الوسط الكامل المعقم حديثا DMEM / F12 ، والذي يحتوي على 15٪ مصل بقري الجنين (FBS) و 1٪ P / S. تعداد معلق الخلية المحصود باستخدام مقياس الخلايا الدموية ، ثم قم بتقسيم الخلايا إلى طبق ثقافة معقم 10 سم عند 2-2.5 × 105 خلايا / سم2. تكملة إلى الحجم النهائي 10 مل مع وسط كامل.
ملاحظة: يجب أن تكون كثافة بذر الخلايا الغضروفية 2-2.5 × 105 خلايا / سم2 ، حيث يمكن أن يؤدي البذر منخفض أو متوسط الكثافة إلى تحول ظاهري للخلايا الغضروفية المفصلية نحو الخلايا الليفية. يمكن تقييم نشاط التكاثر وقابلية الخلايا الأولية المعزولة للبقاء باستخدام فحوصات MTT الاختيارية أو تلطيخ استبعاد التربان الأزرق (الخطوة الاختيارية). - احتضان في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.
- استبدل بوسط كامل جديد DMEM / F12 (يحتوي على 10٪ FBS ، 1٪ P / S) بعد ملاحظة أن الخلايا ملتصقة تماما بالجدار تحت المجهر الضوئي.
- قم بتغيير الوسيط كل يومين. استمر في الزراعة حتى يصل الالتقاء إلى 70٪ ، وعند هذه النقطة يمكن إجراء التجارب اللاحقة.
ملاحظة: يمكن زيادة تركيز المصل في وسط المزرعة إلى 15٪ بناء على حالة الخلية. يوضح الشكل 2 مخططا تخطيطيا مبسطا لهضم أنسجة الغضروف وعزلها وزراعة الخلايا الأولية.
الشكل 2: إجراء مبسط لهضم أنسجة الغضروف وعزل الخلايا الأولية والثقافة. تم فرم الغضروف وهضمه بشكل مستمر بمحلول هضم الكولاجيناز II عالي التركيز لمدة 15 دقيقة ، وتكرر مرة واحدة ، ثم هضمه بمحلول هضم الكولاجيناز II منخفض التركيز لمدة 6-8 ساعات لعزل الخلايا. ثم تم ترشيح الأنسجة المهضومة ، وتم جمع المرشح وطرده. تم غسل حبيبات الخلية ب 1x PBS وزراعتها في وسط DMEM / F12 حتى وصل الالتقاء إلى 70٪ ، وعند هذه النقطة كانت الخلايا جاهزة للتجارب اللاحقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. التحقق الوظيفي للخلايا الغضروفية الأولية
- التمثيل الغذائي وتغيرات الخلايا الغضروفية في ظل الظروف الالتهابية.
- علاج الخلايا مع 10 نانوغرام / مل IL-1β لمدة 24 ساعة لمحاكاة الحالات الالتهابية.
- بالنسبة إلى RT-qPCR والنشاف الغربي ، قم باستخراج الحمض النووي الريبي الكلي أو البروتين الكلي للكشف عن مؤشرات التمثيل الغذائي لمصفوفة الخلايا الغضروفية خارج الخلية ، مثل COL2A1 و MMP13.
ملاحظة: يوضح الشكل 3 مخططا تخطيطيا للتحقق الوظيفي للخلايا الغضروفية الأولية والإجراءات التجريبية اللاحقة. يتم توفير معلومات الأجسام المضادة في جدول المواد. يتم توفير الإجراءات التفصيلية للنشاف الغربي و RT-qPCR في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3 والجدول 4 والجدول 5. اتبعت جميع الطرق البروتوكولات القياسية11،18.
الشكل 3: رسم تخطيطي لبرنامج التحقق الوظيفي للخلايا الغضروفية الأولية. الحالات الالتهابية الناجمة عن علاج IL-1β; التأثيرات على الأنماط الظاهرية المرتبطة بالغضروف التي تم تقييمها بواسطة RT-qPCR والنشاف الغربي. الاختصارات: IL-1β = إنترلوكين -1β ؛ RT-qPCR = تفاعل البوليميراز الكمي الكمي للنسخ العكسي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| شروط سير عمل Western Blotting | |
| درج | الحالة / الكاشف |
| تحضير جل SDS-PAGE | 8٪ (وزن / حجم) جل فصل Tris-HCl |
| التراص الرحلان الكهربائي | 80 فولت، 30-40 دقيقة |
| حل الرحلان الكهربائي | 120 فولت ، 1-1.5 ساعة |
| نقل | شبه جاف، 15 فولت، 30-60 دقيقة |
| حظر | عازلة حجب سريعة ، 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة |
الجدول 1: شروط سير عمل النشاف الغربي. ملخص لظروف النشاف الغربي ، بما في ذلك تكوين SDS-PAGE ، ومعلمات الرحلان الكهربائي ، وإعدادات النقل ، وإجراء الحظر.
| مزيج تفاعل النسخ العكسي | |
| مكون | الحجم (ميكرولتر) |
| 5× المخزن المؤقت لتفاعل النسخ العكسي للناسخ | 4 |
| مزيج ديوكسي نوكليوتيد (10 ملي لكل منهما) | 2 |
| مانع RNase الواقي (40 وحدة / ميكرولتر) | 0.5 |
| النسخ العكسي للناسخ (20 وحدة / ميكرولتر) | 0.5 |
| مياه خالية من النوكلياز | إلى 20 |
| الحجم الإجمالي | 20 |
الجدول 2: مزيج تفاعل النسخ العكسي. تكوين تفاعل النسخ العكسي لتخليق (كدنا).
| معلومات التمهيدي ل RT-qPCR للخلايا الغضروفية الأولية للماوس | ||||
| اسم الجين | التسلسل (5'3 ') | درجة حرارة التلدين (درجة مئوية) | ||
| mGapdh | أمامي | TGGCCTTCCGTTCCTAC | 60 | |
| عكس | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| إم كول2 أ1 | أمامي | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| عكس | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | أمامي | CTTCTTCTGTTGECTGGACTC | 60 | |
| عكس | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
الجدول 3: معلومات التمهيدي ل RT-qPCR للخلايا الغضروفية الأولية للفأر. التسلسلات ودرجة حرارة التلدين (60 درجة مئوية) من البادئات المستخدمة لقياس نصوص Gapdh و Col2a1 و Mmp13 في الخلايا الغضروفية الأولية للفئران.
| مزيج تفاعل RT-qPCR | |
| مكون | الحجم (ميكرولتر) |
| 2 × SYBR جرين كيو بي سي آر ماستر ميكس | 10 |
| قالب (كدنا) المخفف | 8 |
| التمهيدي الأمامي (10 ميكرومتر) | 1 |
| التمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) | 1 |
| الحجم الإجمالي | 20 |
الجدول 4: مزيج تفاعل RT-qPCR. مزيج تفاعل RT-qPCR (20 ميكرولتر) مع مزيج SYBR Green الرئيسي والقالب والبادئات.
| بروتوكول ركوب الدراجات RT-qPCR | ||
| درج | درجة الحرارة (درجة مئوية) | الوقت |
| التمسخ الأولي (×1) | 95 | 10 دقائق |
| التمسخ (×40) | 95 | 5 ث |
| التلدين / التمديد (×40) | 60 | 15 ثانية |
| الرقم الداخلي (×40) | 72 | 30 ثانية |
| منحنى الذوبان (×1) | 95 55 95 | 60 ثانية 30 ثانية 30 ثانية |
الجدول 5: بروتوكول ركوب الدراجات RT-qPCR. تم إجراء التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، والتلدين / التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، وتحليل منحنى الذوبان النهائي لمدة 40 دورة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 ، قمنا بإجراء البروتوكول ونجحنا في عزل الخلايا الغضروفية الأولية من مفاصل ركبة الفأر. من حوالي 10 مجم من غضروف الفئران حديثي الولادة ، حصلنا على حوالي 1 × 104 خلايا ذات قابلية للحياة بنسبة >90٪. في اليوم الأول من الثقافة في المختبر ، أظهرت الخلايا الغضروفية الأولية للفئران مورفولوجيا مستديرة ، مع تعليق معظم الخلايا ولم تلتصق بالكامل بعد بقاع طبق الاستزر...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها أمرا ضروريا لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الغضاريف22. في ثقافة الخلايا الغضروفية الأولية ، يعد تحسين تركيز الكولاجيناز ووقت الهضم أمرا بالغ الأهمية ، لأنه يوازن بين تدهور المصفوفة خارج الخلية مع تقليل الضرر الخلوي المحتمل17. هنا ، نصف طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل الخلايا الغضروفية الأولية عن أنسجة غضروف الفئران. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على ما يقرب من 1-2 × 103 خلايا غضروفية من كل 1 مجم من أنسجة غضروف ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82370909). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 باستخدام Figdraw.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1&مرات ؛ مسحوق PBS (2 لتر) | سيرفيسبيو | جي 0002-2 لتر | |
| أطباق زراعة الخلايا 100 مم | سيرفيسبيو | CCD-100 | |
| 100 μ غربال الخلية M | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | F613463-0001 | |
| أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل (معقم وخالي من الإنزيم) | سيرفيسبيو | EP-1501-J | |
| أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل (معقم وخالي من الإنزيم) | سيرفيسبيو | EP-5001-J | |
| لوحة زراعة الخلايا 6 آبار | سيرفيسبيو | CCP-6H | |
| الأجسام المضادة للأرنب متعدد النسيلة المضادة COL2A1 | إيمونواي | واي تي 1022 | الأجسام المضادة الأولية; WB: 1/500 |
| الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر المضادة ل GAPDH | بروتين تك | 60004-1-IG | الأجسام المضادة الأولية; البنك الدولي: 1/2000 |
| الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب المضادة MMP13 ؛ | إيمونواي | واي تي 2796 | الأجسام المضادة الأولية; البنك الدولي: 1/1000 |
| مقعد معقم فائق النظافة | ثيرمو فيشر | 51029704 | |
| حاضنة زراعة الخلايا | ثيرمو فيشر | 51033782 | |
| الكولاجيناز الثاني | سولاربيو | طراز C8150 | |
| الاشعال المخصصة (Gapdh ، Col2a1 ، Mmp13) ؛ | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | مصممة باستخدام Primer BLAST | |
| DMEM / F12 متوسط | هيكلون | SH30023.01 | |
| مصل أبقار الجنين | إكسسيل | إف سي إس 500 | |
| HRP-الماعز الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للفأر | إيمونواي | رص0001 | الأجسام المضادة الثانوية; البنك الدولي: 1/10000 |
| HRP-Goat Anti-Rabbit الأجسام المضادة متعددة النسيلة | إيمونواي | روبية 0002 | الأجسام المضادة الثانوية; WB: 1/10000 |
| مجهر تباين الطور المقلوب | أوليمبوس | CKX53 | |
| ماصة دقيقة | ثيرمو فيشر | ||
| جهاز طرد مركزي مصغر على الطاولة | صن | SN-TDL-6 | |
| الشفرة الجراحية رقم 11 | سيرفيسبيو | كيوكس جي زي -11 | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين (100X) | بيوتايم | ج0222 | |
| مجموعة أدوات تشريح الصغيرة | سيرفيسبيو | كيوXTZ01 |
المراجع
- Makris, E. A., Gomoll, A. H., Malizos, K. N., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 21-34 (2015).
- Bierma-Zeinstra, S., Van Middelkoop, M., Runhaar, J., Schiphof, D. Nonpharmacological and nonsurgical approaches in OA. Best Pract Res Clin Rheumatol. 34 (2), 101564(2020).
- Urlic, I., Ivkovic, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhao, K., Ruan, J., Nie, L., Ye, X., Li, J. Effects of synovial macrophages in osteoarthritis. Front Immunol. 14, 1164137(2023).
- Wang, B. W., et al. Aucubin protects chondrocytes against IL-1β-induced apoptosis in vitro and inhibits osteoarthritis in a mouse model. Drug Des Devel Ther. 13, 3529-3538 (2019).
- Kuswanto, W., Baker, M. C. Repurposing drugs for the treatment of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (8), 886-895 (2024).
- Heywood, H. K., Thorpe, S. D., Jeropoulos, R. M., Caton, P. W., Lee, D. A. Modulation of sirtuins during monolayer chondrocyte culture influences cartilage regeneration upon transfer to a 3d culture environment. Front Bioeng Biotechnol. 10, 971932(2022).
- Piñeiro-Ramil, M., et al. Generation of human immortalized chondrocytes from osteoarthritic and healthy cartilage : A new tool for cartilage pathophysiology studies. Bone Joint Res. 12 (1), 46-57 (2023).
- Li, W., Zhou, Y., Han, L., Wang, L., Lucas Lu, X. Calcium signaling of primary chondrocytes and atdc5 chondrogenic cells under osmotic stress and mechanical stimulation. J Biomech. 145, 111388(2022).
- Zhao, Y., et al. Protein folding dependence on selenoprotein m contributes to steady cartilage extracellular matrix repressing ferroptosis via PERK/ATF4/CHAC1 axis. Osteoarthritis Cartilage. 33 (2), 261-275 (2025).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- Tang, H., et al. The IRF1/GBP5 axis promotes osteoarthritis progression by activating chondrocyte pyroptosis. J Orthop Translat. 44, 47-59 (2024).
- Bittner, N., et al. Primary osteoarthritis chondrocyte map of chromatin conformation reveals novel candidate effector genes. Ann Rheum Dis. 83 (8), 1048-1059 (2024).
- Ramser, A., Greene, E., Rath, N., Dridi, S. Primary growth plate chondrocyte isolation, culture, and characterization from the modern broiler. Poult Sci. 102 (1), 102254(2023).
- Mao, J., et al. Insufficiency of collagenases in establishment of primary chondrocyte culture from cartilage of elderly patients receiving total joint replacement. Cell Tissue Bank. 24 (4), 759-768 (2023).
- Lau, T. T., Peck, Y., Huang, W., Wang, D. A. Optimization of chondrocyte isolation and phenotype characterization for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (2), 105-111 (2015).
- Pagani, S., et al. Rna extraction from cartilage: Issues, methods, tips. Int J Mol Sci. 24 (3), 2120(2023).
- Goldring, M. B., Otero, M., Tsuchimochi, K., Ijiri, K., Li, Y. Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis. 67 (Suppl 3), 75-82 (2008).
- Wang, G., et al. TGFbeta attenuates cartilage extracellular matrix degradation via enhancing FBXO6-mediated MMP14 ubiquitination. Ann Rheum Dis. 79 (8), 1111-1120 (2020).
- Pang, Y., Zhao, L., Ji, X., Guo, K., Yin, X. Analyses of transcriptomics upon IL-1β-stimulated mouse chondrocytes and the protective effect of catalpol through the NOD2/NB-κb/MAPK signaling pathway. Molecules. 28 (4), 1606(2023).
- Naranda, J., Gradisnik, L., Gorenjak, M., Vogrin, M., Maver, U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). PeerJ. 5, e3079(2017).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sci. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Lawrence, J. E. G., et al. Single-cell transcriptomics identifies chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro. Dev Cell. , (2025).
- Huang, C., et al. Single-cell transcriptomic analysis of chondrocytes in cartilage and pathogenesis of osteoarthritis. Genes Dis. 12 (2), 101241(2025).
- Wu, C. L., et al. Single cell transcriptomic analysis of human pluripotent stem cell chondrogenesis. Nat Commun. 12 (1), 362(2021).
- Zhang, H., Huang, J., Alahdal, M. Exosomes loaded with chondrogenic stimuli agents combined with 3d bioprinting hydrogel in the treatment of osteoarthritis and cartilage degeneration. Biomed Pharmacother. 168, 115715(2023).
- Mahapatra, C., Jin, G. Z., Kim, H. W. Alginate-hyaluronic acid-collagen composite hydrogel favorable for the culture of chondrocytes and their phenotype maintenance. Tissue Eng Regen Med. 13 (5), 538-546 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.