يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا الغضروفية الأولية الكافية في غضون 6-8 ساعات ، مما يسهل إجراء مزيد من التحقيقات المتعمقة لبيولوجيا الغضروف وآليات أمراض الغضروف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا الغضروفية الأولية الكافية في غضون 6-8 ساعات ، مما يسهل إجراء مزيد من التحقيقات المتعمقة لبيولوجيا الغضروف وآليات أمراض الغضروف.
يؤدي تدمير الغضروف المفصلي إلى تغيير نشاط الخلايا الغضروفية ، وهو عامل مسبب رئيسي في مجموعة متنوعة من أمراض الغضروف ، بما في ذلك هشاشة العظام (OA) والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA). باعتباره أكثر أنواع الخلايا وفرة في الغضاريف ، فإن الدراسة المتعمقة للخصائص البيولوجية للخلايا الغضروفية ضرورية لتطوير استراتيجيات فعالة لعلاج الأمراض. يوفر عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها مواد تجريبية مهمة للتحقيق في مرض الغضروف ويساهم في كشف آليات إصابة الغضروف وإصلاحه. يقدم هذا البروتوكول وصفا تفصيليا لطرق العزل والزراعة في المختبر للخلايا الغضروفية الأولية المشتقة من الفئران. باستخدام بروتوكول الكولاجيناز II المحسن ، يمكن إكمال عزل الخلايا الغضروفية في غضون 8 ساعات لعينات غضروف مفصل ركبة الفأر حديثي الولادة. يبلغ عائد الخلية حوالي 1-2 × 10³ من الخلايا / مجم من أنسجة الغضروف ، وتختلف مع نضارة الأنسجة وكثافة الخلايا الأولية. تظهر الخلايا المعزولة >90٪ من البقاء. يستخدم هذا البروتوكول الخلايا الغضروفية الأولية للفئران كمثال ، مما يوضح الخصائص المورفولوجية وحالة الالتصاق للخلايا المزروعة لمدة 1 و 2 و 5 أيام بعد العزل. أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) والنشاف الغربي أن علاج الإنترلوكين -1β (IL-1β) قلل من الكولاجين من النوع الثاني ألفا 1 (Col2a1) وزاد من تعبير Matrix Metallopeptidase 13 (Mmp13) ، مما يؤكد أن الخلايا الغضروفية المعزولة تستجيب للمنبهات الالتهابية. بالمقارنة مع الطرق التقليدية ، يستخدم هذا البروتوكول تركيزا أعلى من الكولاجيناز لتقليل تأثير وقت العزل المطول على بقاء الخلية ، مع تجنب تلف الخلايا المحتمل من علاج التربسين. الخلايا الغضروفية الأولية التي تم الحصول عليها نقية وقابلة للحياة ، ومناسبة للدراسات المتعمقة حول الآليات المتعلقة بإصابة الغضروف ، والتي لها آثار مهمة على البحث في المختبر والعلاج السريري لمرض الغضروف.
يعد تدمير الغضروف المفصلي سببا رئيسيا لأمراض الغضروف المختلفة ، مثل الزراعة العضوية و RA1،2. الخلايا الغضروفية ، نوع الخلايا السائدة في الغضروف ، ضرورية للحفاظ على التوازن وتسهيل الإصلاح استجابة للإصابة3. لا تؤثر التغيرات في نشاط الخلايا الغضروفية على السلامة الهيكلية للغضروف فحسب ، بل تؤدي أيضا إلى استجابات التهابية وتنكس الأنسجة التدريجي4. لذلك ، يعد التحقيق المتعمق في الخصائص البيولوجية للخلايا الغضروفية أمرا بالغ الأهمية لتوضيح التسبب في المرض لهذه الأمراض.
في السنوات الأخيرة ، حظي دور الخلايا الغض....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تمت الموافقة على جميع التجارب على من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شيان هونغوي (رقم 202309009) ، والتزمت الإجراءات التجريبية بشكل صارم بمبادئ 3R للاستبدال والاختزال والتحسين للتجارب على.
يوضح الشكل 1 أ مخططا تخطيطيا لإعداد الكواشف والمعدات. يتضمن جدول المواد معلومات عن الكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. الفئران التجريبية
ملاحظة: تم استخدام أربعة فئران من النوع البري C57BL / 6J يبلغ من العمر 3 أيام في هذه الدراسة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 ، قمنا بإجراء البروتوكول ونجحنا في عزل الخلايا الغضروفية الأولية من مفاصل ركبة الفأر. من حوالي 10 مجم من غضروف الفئران حديثي الولادة ، حصلنا على حوالي 1 × 104 خلايا ذات قابلية للحياة بنسبة >90٪. في اليوم الأول من الثقافة في المختبر ، أظهرت الخلايا الغضروفية الأولية للفئران مورفولوجيا مستديرة ، مع تعليق معظم الخلايا ولم تلتصق بالكامل بعد بقاع طبق الاستزر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعد عزل الخلايا الغضروفية الأولية وزراعتها أمرا ضروريا لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الغضاريف22. في ثقافة الخلايا الغضروفية الأولية ، يعد تحسين تركيز الكولاجيناز ووقت الهضم أمرا بالغ الأهمية ، لأنه يوازن بين تدهور المصفوفة خارج الخلية مع تقليل الضرر الخلوي المحتمل17. هنا ، نصف طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لعزل الخلايا الغضروفية الأولية عن أنسجة غضروف الفئران. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على ما يقرب من 1-2 × 103 خلايا غضروفية من كل 1 مجم من أنسجة غضروف .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82370909). تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3 باستخدام Figdraw.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1&مرات ؛ مسحوق PBS (2 لتر) | سيرفيسبيو | جي 0002-2 لتر | |
| أطباق زراعة الخلايا 100 مم | سيرفيسبيو | CCD-100 | |
| 100 μ غربال الخلية M | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | F613463-0001 | |
| أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل (معقم وخالي من الإنزيم) | سيرفيسبيو | EP-1501-J | |
| أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل (معقم وخالي من الإنزيم) | سيرفيسبيو | EP-5001-J | |
| لوحة زراعة الخلايا 6 آبار | سيرفيسبيو | CCP-6H | |
| الأجسام المضادة للأرنب متعدد النسيلة المضادة COL2A1 | إيمونواي | واي تي 1022 | الأجسام المضادة الأولية; WB: 1/500 |
| الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر المضادة ل GAPDH | بروتين تك | 60004-1-IG | الأجسام المضادة الأولية; البنك الدولي: 1/2000 |
| الأجسام المضادة متعددة النسيلة للأرانب المضادة MMP13 ؛ | إيمونواي | واي تي 2796 | الأجسام المضادة الأولية; البنك الدولي: 1/1000 |
| مقعد معقم فائق النظافة | ثيرمو فيشر | 51029704 | |
| حاضنة زراعة الخلايا | ثيرمو فيشر | 51033782 | |
| الكولاجيناز الثاني | سولاربيو | طراز C8150 | |
| الاشعال المخصصة (Gapdh ، Col2a1 ، Mmp13) ؛ | سانغون للتكنولوجيا الحيوية | مصممة باستخدام Primer BLAST | |
| DMEM / F12 متوسط | هيكلون | SH30023.01 | |
| مصل أبقار الجنين | إكسسيل | إف سي إس 500 | |
| HRP-الماعز الأجسام المضادة متعددة النسيلة المضادة للفأر | إيمونواي | رص0001 | الأجسام المضادة الثانوية; البنك الدولي: 1/10000 |
| HRP-Goat Anti-Rabbit الأجسام المضادة متعددة النسيلة | إيمونواي | روبية 0002 | الأجسام المضادة الثانوية; WB: 1/10000 |
| مجهر تباين الطور المقلوب | أوليمبوس | CKX53 | |
| ماصة دقيقة | ثيرمو فيشر | ||
| جهاز طرد مركزي مصغر على الطاولة | صن | SN-TDL-6 | |
| الشفرة الجراحية رقم 11 | سيرفيسبيو | كيوكس جي زي -11 | |
| محلول البنسلين والستربتومايسين (100X) | بيوتايم | ج0222 | |
| مجموعة أدوات تشريح الصغيرة | سيرفيسبيو | كيوXTZ01 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.