مقالة منهجية

Ookluc: خط برازموديوم بيرغي لتحديد المركبات التي تمنع انتقال العدوى

715 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68466

⸱

يوليو 11, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

في هذه المقالة

ملخص

يحدث التطور الجنسي المتصورة في الأمعاء الوسطى للبعوض. يعد استهداف المراحل الجنسية للطفيلي استراتيجية واعدة لمنع انتقال العدوى. قمنا بتطوير Ookluc ، وهو عبارة عن P. berghei المعدلة وراثيا التي تعبر عن nanoluciferase بعد تكوين البيضة الملقحة ، مما يتيح الفحص عالي الإنتاجية للمركبات التي تمنع الإرسال. توضح هذه المقالة بالتفصيل طرق الفحص باستخدام Ookluc.

الملخص

ولا تزال الملاريا تشكل تحديا صحيا عالميا؛ في عام 2023 ، تم الإبلاغ عن 263 مليون حالة و 597,000 حالة وفاة في جميع أنحاء العالم. دورة حياة الطفيلي معقدة ، وهناك حاجة إلى تدخلات مستهدفة في مراحل النمو الحرجة للسيطرة على المرض بشكل فعال. تهدف استراتيجيات منع انتقال العدوى إلى وقف انتقال المتصورة عن طريق استهداف ناقل البعوض أو المراحل الجنسية للطفيلي من خلال اللقاحات والأدوية. يمكن أن تركز تدخلات السل على الخلايا المشيجية في المضيف البشري أو أشكال أخرى في الأمعاء الوسطى للبعوض ، مثل الأمشاج والزيجوت والبويضات والبويضات.

يواجه تطوير نهج جديدة للسل تحديات كبيرة. تعد دراسة المراحل الجنسية للطفيلي أمرا صعبا بطبيعته ، ويعتمد الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لمركبات مبيدات الخلايا المشيجية بشكل أساسي على مزارع المتصورة المنجلية . ومع ذلك، فإن الأدوات المختبرية القوية لتقييم التدخلات ضد المراحل الجنسية اللاحقة لا تزال محدودة. لتسريع اكتشاف مركبات السل ، طورت مجموعتنا اختبار HTS جديد لتنشيط الخلايا المشيجية وتخصيبها باستخدام P. berghei ، وهو نموذج فئران لعدوى المتصورة . يعبر الطفيلي المعدل وراثيا ، Ookluc ، عن nanoluciferase حصريا بعد تكوين البيضة الملقحة ، مع ذروة اللمعان أثناء تطور ookinete. يوفر هذا الاختبار القائم على التلألؤ قراءة كمية للأمشاج إلى البيضة الملقحة والزيجوت إلى تمايز أوكينيت ، حيث يرتبط التلألؤ المتزايد ارتباطا مباشرا بتكوين أوكينيت. يعرض مقال الفيديو هذا طرق فحص مركبات السل الملاريا باستخدام Ookluc.

المقدمة

الملاريا مرض قديم شكل تاريخ البشرية بعمق. في عام 2023 وحده ، تم الإبلاغ عن 263 مليون حالة في 85 دولة موبوءة ، مما أدى إلى 597,000 حالة وفاة1. يحدث المرض بسبب الطفيليات الأولية من جنس المتصورة ، التي تنتمي إلى شعبة Apicomplexa. من بين الأنواع الخمسة التي تصيب البشر - المتصورة المنجلية ، المتصورة النشيطة ، المتصورة النولسية ، المتصورة البيضاوية ، المتصورة الملاريا - تمثل المتصورة المنجلية و المتصورة النشيطة غالبية الحالات. ويرتبط المتصورة المنجلية بالملاريا الوخيمة وهو سائد في أفريقيا، في حين أن المتصورة النشيطة لها أوسع توزيع جغرافي، حيث تكون أكثر انتشارا في أمريكا الجنوبية وآسيا2.

يسهل تعقيد دورة حياة المتصورة ، التي تنطوي على مراحل نمو متعددة عبر مضيفين ، انتقالها واستمرارها في المناطقالموبوءة 3. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذه الدورة في الانتقال من البشر إلى ناقل البعوض ، مما يجعلها هدفا رئيسيا للتدخل. يبدأ الانتقال داخل المضيف البشري ، حيث تتطور المراحل الجنسية المتصورة حيث تتمايز الميروزويت إلى خلايا مشيجية من الذكور والإناث. عند ابتلاع البعوض ، تؤدي الإشارات البيئية إلى تنشيط الخلايا المشيجية وتكوين الأمشاج ، مما يؤدي إلى الإخصاب في تجويف الأمعاء المتوسطة. يتمايز البيضة الملقحة الناتجة إلى أوكينيت متحرك ، والذي يغزو بنشاط ظهارة الأمعاء الوسطى ويتطور إلى بويضة داخل الصفيحة القاعدية. داخل البويضات ، يتم إنشاء الآلاف من البويضات ثم يتم إطلاقها لاحقا في الهيموليمفاوية ، مما يسمح لها بالهجرة إلى الغدد اللعابية. هناك ، تغزو البوغات خلايا الأسينار وتنتقل إلى تجويف الغدة ، حيث تبقى حتى تأخذ البعوضة وجبة الدم التالية ، وتنقل الطفيلي إلى جلد الإنسان4.

يعد البحث عن استراتيجيات جديدة لمنع انتقال العدوى أمرا بالغ الأهمية نظرا لمحدودية الأدوية المتاحة والمقاومة المتزايدة لمضاداتالملاريا 5. طرق الفحص التقليدية - مثل عدوى البعوض ، أو التحليل المجهري اليدوي ، أو دمج هيبوكسانثين المشع - كثيفة العمالة ، ويصعب توحيدها ، وغير مناسبة للتطبيقات عاليةالإنتاجية 6،7. أدت الأساليب الحديثة التي تستخدم الكشف القائم على التألق (على سبيل المثال ، تلطيخ الحمض النووي أو مراسلي GFP) إلى تحسين الكفاءة ، ومع ذلك لا تزال هناك تحديات كبيرة في تقييم المركبات التي تستهدف المراحل الجنسية للطفيلي6،7،8.

لمواجهة هذه التحديات ، P . بيرغي تم تطوير خط النانو لوسيفيراز (nLuc) ، المسمى Ookluc ، 8. في هذا النظام ، يتم وضع الجين nLuc تحت سيطرة محفز P. berghei Circumsporozoite و TRAP المرتبط بالبروتين (CTRP) الخاص ب ookinete ، والذي يتم تنشيطه في البيضة الملقحة ، مما يؤدي إلى بدء إنتاج nLuc بعد حوالي 6 ساعات من تنشيط الأمشاج ويصل إلى ذروته بعد 24 ساعة من اختبار التحويل8. يتيح هذا التصميم القياس الكمي الآلي القائم على اللمعان لبقاء الطفيليات بعد فترة وجيزة من الإخصاب - مما يلغي الحاجة إلى التلاعب المباشر بالنواقل - ويسهل الفحص عالي الإنتاجية لآلاف المركبات8.

على الرغم من أن تعبير nLuc يحدث بغض النظر عن قابلية ookinete للبقاء ، مما يحد من اكتشاف المركبات التي تؤثر على وجه التحديد على المراحل اللاحقة مثل تكوين ookinete ، إلا أن Ookluc يظل فعالا للغاية في تحديد مركبات السل التي تستهدف تكوين الأمشاج أو إعادة التركيب الجنسي أو بقاء الطفيليات داخل البعوض ، بما في ذلك العوامل التي تحفز إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية. أثبتت الدراسات السابقة صحة هذا النظام من خلال تحديد المركبات المعروفة بتثبيط المراحل الجنسية المتصورة 9،10،11،12،13،14،15. وبالتالي ، يمثل Ookluc منصة قوية ومبتكرة للفحص عالي الإنتاجية للمراحل الجنسية المتصورة ، مما يسهل اكتشاف مركبات السل الجديدة وتعزيز الجهود الرامية إلى القضاء على الملاريا في السنوات القادمة. يحدد هذا البروتوكول تطبيق نظام Ookluc لفحص الأدوية وتحديد التركيز المثبط بنسبة 50٪ (IC50).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات حول استخدام التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية بجامعة ساو باولو (CEUA-ICB / USP). تم إيواء وصيانتها وفقا للمعايير التي وضعتها هذه اللجنة. أجريت التجارب التي شملت طفيليات المتصورة المعدلة وراثيا ، بالإضافة إلى تخزينها بالتبريد عند -80 درجة مئوية ، وفقا للوائح التي وضعتها لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية بجامعة ساو باولو (CIBio-ICB / USP). تم استخدام ما مجموعه ثلاث أنثى فئران BALB / c ، تتراوح أعمارهن بين 3-5 أسابيع ، في هذه الدراسة - اثنتان مصابان وواحدة غير مصابة.

1. المواد والكواشف

  1. تحضير وسط أوكينيت عن طريق استكمال RPMI 1640 ب 0.025 M HEPES ، وبنسلين - ستربتومايسين - نيومايسين (PSN) ، و 50 مجم / لتر هيبوكسانثين ، و 100 ميكرومتر من حمض الزانثورينيك. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.3 8,16.
  2. قم بإعداد حل العمل لمقايسة التلألؤ عن طريق خلط حجم 1 من الركيزة مع 50 مجلدا من المخزن المؤقت للتحلل المقدم في نظام فحص لوسيفيراز.
  3. اضبط الحاضنة على 21 درجة مئوية.

2. العدوى وجمع الدم المتطفل

  1. إصابة اثنين من أنثى الفئران BALB / c (4-6 أسابيع) ب 150 ميكرولتر من سلالة Ookluc المحفوظة بالتبريد عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) (اليوم 0).
    ملاحظة: في هذا البروتوكول ، نوصي باستخدام فئران BALB / c نظرا لتوفرها الجاهز واستخدامها على نطاق واسع في مرافق. ومع ذلك ، فإن أي سلالة فأر من النوع البري معرضة للإصابة بعدوى P. berghei وتدعم تكوين الخلايا المشيجية يجب أن تكون مناسبة للاستخدام.
  2. بدءا من اليوم 3 ، قم بتقييم طفيليات الدم وخلايا الدم المشيجية عن طريق الفحص المجهري لمسحات الدم الملطخة بالجيمسا.
  3. عندما تصل الطفيليات والخلايا المشيجية إلى حوالي 5٪ و 0.5٪ على التوالي (عادة في اليوم 4) ، قم بجمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام محاقن هيبارين وتجمع الدم من كل من الفئران المصابة.
    ملاحظة: على الرغم من أن هذا خط معدل وراثيا من P. berghei ، إلا أن نموه وملف تعريف المشيجات يشبه تلك التي لوحظت في سلالة ANKA. في هذا السياق ، تكون نسبة الخلايا المشيجية بالنسبة إلى الطفيليات الكلية أقل بحوالي 10 مرات.
    ملاحظة: من الناحية المثالية ، يتم تحضير الصفيحة المركبة (انظر أدناه) قبل جمع الدم المتطفل ، لذلك يتم سحب الدم إلى اللوحة مباشرة بعد جمعها. إذا كان يجب جمع دم الفأر في غرفة مختلفة ، أو لا يمكن نقله على الفور إلى اللوحة المركبة لأي سبب آخر ، فيجب الاحتفاظ بالدم الذي تم جمعه عند 37 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 30 دقيقة.

3. فحص التحويل - الفحص في لوحات 96 بئرا

ملاحظة: لضمان نتائج متسقة ، يجب تكرار التجربة بأكملها ثلاث مرات في أيام مختلفة لتأكيد النتائج.

  1. تحضير العينات المركبة باستخدام وسط أوكينيت كمخفف (تركيز نهائي 10 ميكرومتر). قم بتخفيف المخزون المركب إلى 1 ملي مولار وقم بإعداد عينات العمل عن طريق تخفيف مخزون 1 ملي مولار 1: 100 فولت: v في Ookinete Medium. لاختبار واحد في نسختين ، قم بإعداد حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر من عينة العمل.
  2. إذا تم تخفيف المركب في مذيب آخر غير الماء ، فقم بتضمين عينة تحكم تحتوي على المذيب المخفف في وسط أوكينيت بنفس النسبة كما في عينة الاختبار للتأكد من أن أي تثبيط ملحوظ يعزى إلى المركب وليس المذيب.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، سنقوم بفحص 90 مركبا.
  3. باستخدام لوحين من 96 بئرا ، ضع 80 ميكرولتر من العينات في كل بئر ، على النحو التالي والموضح في الشكل 1 ، في نسختين (لوحتين): التحكم الإيجابي: 80 ميكرولتر من وسط أوكينيت. التحكم السلبي: 80 ميكرولتر من وسط أوكينيت. التحكم في المذيبات: 80 ميكرولتر من وسط أوكينيت مع 1٪ DMSO ؛ العينات: 80 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من كل مركب في وسط أوكينيت.

figure-protocol-1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لتخطيط لوحة 96 بئرا مصمم للفحص المركب. يتضمن تخطيط اللوحة التحكم الإيجابي (C +) ، والتحكم السلبي (C-) ، ومذيب التحكم بالإضافة إلى التخفيف (C + S) ، و 90 مركبا اختباريا (S1-S90). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. أضف 4 ميكرولتر من دم الفأر المتطفل إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا بنسبة 1:20 v: v ، باستثناء عنصر التحكم السلبي (C-). تجانس بلطف عن طريق سحب العينات.
    ملاحظة: بالنظر إلى الخسائر ، نحسب الحاجة إلى ~ 400 ميكرولتر من الدم المتطفل لكل لوحة.
  2. بالنسبة للتحكم السلبي ، أضف دم الفأر غير المصاب بنسبة 1:20 (v: v ، الدم: العينة). تجانس بلطف.
  3. احتضان عند 21 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن اكتشاف نشاط nLuc مع 6 ساعات من الحضانة ويبلغ ذروته عند 24 ساعة من الفحص8. الفحص غير قادر على تحديد المركبات ذات النشاط بعد تكوين البيضة الملقحة ، مثل المركبات التي تمنع تكوين أوكينيت ، لأن البيضة الملقحة المتكونة ستتراكم nLuc بغض النظر عن استكمال التشكل. لذلك ، فإن الحضانة لمدة 6 ساعات كافية للكشف عن جميع المركبات التي ستمنع نشاط nLuc عن طريق تثبيط تكوين الأمشاج أو إعادة التركيب الجنسي أو السمية الخلوية المبكرة. ومع ذلك ، فإننا نفضل عادة الحضانات لمدة 24 ساعة للحصول على إشارات أقوى ونسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل.

4. فحص التلألؤ

  1. بعد فترة الحضانة ، قم بتجانس العينات عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لضمان خلط الدم المتوسط بشكل شامل.
  2. قم بإعداد خليط الركيزة للتحلل / لوسيفيراز مباشرة قبل الاستخدام بنسبة 1:50 (v: v ، الركيزة: مخزن التحلل).
  3. امزج خليط الركيزة مع العينات بنسبة 1: 1 (v: v) ، مع ضمان الخلط اللطيف لتجنب الفقاعات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق.
    ملاحظة: في هذا المثال ، أضفنا 84 ميكرولتر من الركيزة: مخزن التحلل إلى كل بئر.
  4. انقل العينات إلى طبق أبيض مسطح القاع مكون من 96 جيدا. قم بقياس اللمعان باستخدام قارئ اللوحة. استخدم تكوين المعلمة التالية: مرشح الانبعاث: العدسة؛ وقت الفاصل الزمني للقياس: 1 ثانية لكل بئر.

5. تحليل البيانات - الفحص

  1. بعد مقايسة التلألؤ ، قم بتدوين البيانات الأولية التي تظهر (الشكل 2).
    ملاحظة: تعتمد وحدات الضوء النسبي (RLU) التي تم الحصول عليها على مقياس الإضاءة المستخدم. في حالتنا ، تراوحت قيم RLU للتحكم الإيجابي من 10,000 إلى 500,000 في اختبار حضانة لمدة 24 ساعة. ستؤدي أوقات الحضانة الأقصر (6 ساعات) إلى انخفاض قيم RLU.

figure-protocol-2
الشكل 2: النتائج التي تم الحصول عليها من قراءة محاكاة لمقايسة التحويل للفحص المركب. تعرض الصورة قراءات تلألؤ محاكاة من اختبار تم إجراؤه بعد تحويل البوكينيت في وجود لوحة من 90 مركبا. تشير قيم وحدة الضوء النسبي المنخفضة إلى انخفاض تكوين أوكينيت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. باستخدام جدول بيانات، احسب متوسط كل قياس باستخدام الصيغة أدناه. يستعاض عن XX بعنوان خلية القياس الأولى و YY بعنوان خلية القياس الثانية. كرر الصيغة لجميع العينات.
    =(المتوسط (XX: YY)
  2. قم بتحويل البيانات إلى تثبيط٪ لتحليل أفضل للنتائج. في جدول البيانات، استخدم الصيغة أدناه. استبدل A بقيمة RLU النموذجية و B بقيمة RLU للتحكم. كرر الصيغة لجميع المركبات التي تم اختبارها:
    = 1 - (أ / ب) × 100
    ملاحظة: ستظهر البيانات كما هو موضح في الشكل 3.

figure-protocol-3
الشكل 3: النتائج التي تم الحصول عليها من قراءة محاكاة لمقايسة التحويل للفحص المركب ممثلة كنسبة مئوية من التثبيط لكل مركب. النسبة المئوية لتثبيط التحويل لكل مركب تم اختباره ، محسوبة كما هو موضح أعلاه. تشير المربعات المميزة إلى المركبات التي تعزز تثبيط التحويل بنسبة تزيد عن 95٪. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تحديد المركبات التي تظهر تثبيط أكثر من 95٪.
    ملاحظة: تظهر هذه المركبات نشاطا عاليا ضد المراحل الجنسية بتركيز 10 ميكرومتر. في مثالنا ، وجدنا خمسة مركبات ذات نشاط عال ضد المراحل الجنسية.
  2. بالنسبة للمركبات المحددة ، قم بإجراء تحديد IC50 كما هو موضح أدناه.

6. اختبار التحويل - تحديد IC 50

  1. إصابة الفئران ب Ookluc وجمع الدم المتطفل ، كما هو موضح في القسم 2.
  2. تحضير العينات باستخدام وسط أوكينيت كمخفف. استخدام تركيز أولي في أي 100٪ لوحظ تثبيط التحويل بواسطة المركب.
    ملاحظة: نظرا لأنه تم تحديد المركبات النشطة في شاشة بتركيز 10 ميكرومتر ، فإننا نستخدم 20 ميكرومتر كتركيز أولي لمنحنى استجابة الجرعة الأول. للحصول على منحنى دقيق للجرعة والاستجابة ، من المهم أن يتضمن الفحص تركيزات أولية تؤدي إلى تثبيط التحويل والتركيزات النهائية بنسبة 100٪ التي تؤدي إلى تثبيط 0٪. يضمن هذا النهج حسابا دقيقا ل IC50 . سيبلغ منحنى الاستجابة الجرعة الأول أدنى تركيزات المركب مع تثبيط ~ 100٪. في هذا البروتوكول ، سنستخدم PyAz90 ، الذي تم تحديده مؤخرا باستخدام Ookluc13 ، كمثال.
  3. في طبق مكون من 96 بئرا ، أضف ثلاث نسخ (انظر الشكل 4): التحكم الإيجابي (C +): 80 ميكرولتر من وسط أوكينيت. التحكم السلبي (C-): 80 ميكرولتر من وسط أوكينيت. تخفيف العينة الأولى (Cpd D1): 160 ميكرولتر من المركب بتركيز أولي في وسط أوكينيت ينتج عنه تثبيط التحويل بنسبة 100٪. آبار D2 إلى D12: 80 ميكرولتر من وسط أوكينيت.
  4. قم بعمل تخفيفات تسلسلية ذات شقين عن طريق سحب 80 ميكرولتر من البئر D1 إلى D2 ، والتجانس ، والماصة 80 ميكرولتر من البئر D2 إلى D3 وما إلى ذلك. تأكد من أن جميع الآبار تحتوي على 80 ميكرولتر من الحجم الكلي ، لذا تخلص من آخر 80 ميكرولتر تمت إزالتها من البئر D12.
    ملاحظة: قم بإجراء التجربة بثلاث نسخ مكررة على الأقل لجميع العينات، كما هو موضح في الشكل 4. لضمان موثوقية نتائجك وقابليتها للتكرار ، يجب تكرار التجربة بأكملها في ثلاثة أيام منفصلة باستخدام المصابة حديثا في كل مرة.
    ملاحظة: إذا أظهرت النتائج في الشاشة الأولى عدم وجود تأثير للمذيب في التحويل ، فليس من الضروري تضمين عناصر التحكم هذه في التخفيفات التسلسلية. خلاف ذلك ، يجب أيضا تضمين التخفيفات التسلسلية للمذيب.

figure-protocol-4
الشكل 4: تخطيط لوحة 96 بئرا مصمم لتحديد مركب IC50 . يتضمن تخطيط اللوحة تحفيفا إيجابيا (C +) وتحكم سلبي (C-) وتخفيفات مركبة (Cpd) (D1 إلى D12). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. أضف دم الفأر المتطفل إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا عند 1:20 فولت: حجم. تجانس بلطف عن طريق سحب العينات.
    ملاحظة: سيتم إضافة ما مجموعه 4 ميكرولتر من الدم المتطفل إلى كل بئر ، باستثناء التحكم السلبي (C-). بالنظر إلى الخسائر ، نحسب الحاجة إلى ~ 200 ميكرولتر من الدم المتطفل لكل مركب يتم اختباره.
  2. في آبار التحكم السلبي ، أضف دم الفأر غير المصاب بنسبة 1:20 (v: v ، الدم: العينة). تجانس بلطف.
  3. احتضان عند 21 درجة مئوية لمدة 6 ساعات أو 24 ساعة.
  4. قم بإجراء مقايسة اللمعان ، كما هو موضح في القسم 4.

7. تحليل البيانات - تحديد IC 50

ملاحظة: يعرف IC50 بأنه تركيز مركب مطلوب لتثبيط 50٪ من النشاط البيولوجي / التثبيط. في هذا الاختبار ، يشير التثبيط إلى انخفاض تحويل أوكينيت. يتم تمثيل البيانات كمنحنى استجابة للجرعة السيني ، حيث يمثل المحور X تركيزا مركبا (محول لوغاريتم) ويمثل المحور Y نسبة تثبيط.

  1. احسب النسبة المئوية للتثبيط كما هو موضح في القسم 5، الخطوة 5.3.
  2. افتح البرنامج وأنشئ جدول XY.
  3. قم بتعيين خيارات المحور Y لإدخال 3 قيم نسخ متماثل في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب.
  4. لصق البيانات ، حيث يمثل X تركيزا مركبا و Y يمثل النسبة المئوية للتثبيط (الشكل 5 أ).
  5. في شريط القائمة ، انقر فوق تحليل وحدد الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) ثم منحنيات استجابة الجرعة - التثبيط و [المثبط] مقابل الاستجابة الطبيعية - المنحدر المتغير ؛ انقر فوق موافق.
  6. في اللوحة اليسرى ، راقب منحنى استجابة الجرعة للبيانات. قم بتطبيق التخصيص المطلوب، مثل تغييرات الألوان وتنسيقات النقاط.
  7. حدد موقع جدول ملاءمة Nonlin للعثور على فاصل الثقة IC50 و 95٪ المحسوب (95٪ CI) (الشكل 5 ب).

figure-protocol-5
الشكل 5: منحنى استجابة الجرعة ل PyAz90. تم قياس النسبة المئوية للتثبيط كدالة لتركيز PyAz90 (ميكرومتر) على مقياس لوغاريتمي. يمثل المنحنى السيني البيانات الملائمة المستخدمة لتحديد IC50 ، والتي كانت 0.013 ميكرومتر (فاصل ثقة 95٪: 0.012-0.014 ميكرومتر). تمثل نقاط البيانات متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط من التكرارات التجريبية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتيح توليد طفيليات Ookluc تقييم الأدوية المرشحة الجديدة لمرض السل من منظور لا تقدمه المقايسات الحالية ، لا سيما في تقييم آثار المركبات على تنشيط الأمشاج والتخصيب وتكوين البيضةالملقحة 8. يوضح الشكل 2 والشكل 3 قدرة الطريقة على فحص لوحة من المركبات ضد المراحل الجنسية للطفيلي بطريقة عالية الإنتاجية ، مما يسهل تحديد المرشحين الواعدين في اختبار واحد (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تركز معظم طرق HTS المستخدمة لتطوير مركبات السل الجديدة على تثبيط تكوين الخلايا المشيجية أو نشاط مبيد الخلايا المشيجية. حتى الآن ، تم تطوير نموذجين فقط ل P. berghei يسمحان بتقييم وظيفة الخلايا المشيجية ، وتكوين الأمشاج ، وتكوين البيضة الملقحة ، وتشكل الأوكينيت5.

يشبه أحد هذه النماذج Ookluc ، حيث يستخدم مراسل مضان مرتبط بمروج ctrp 17. ومع ذلك ، يقدم Ookluc تحسينات رئيسية ، مثل اس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا المشروع بمنح من مؤسسة أمبارو في Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) ومعهد Serrapilheira (منحة G-1709-16618).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418
GraphPad Prism الإصدار 10.0.0 لنظام التشغيل Windowsبرنامج GraphPad ، بوسطن ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية
ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي للأمعاء الخنازيرسيجما ألدريتشH3393
HEPES (1 م)ثيرمو ساينتفيك15630106
هيبوكسانثينسيجما ألدريتش[إتش9636]
فئران------إناث فئران BALB / c ، تتراوح أعمارها بين 3 إلى 5 أسابيع
نظام فحص Nano-Glo Luciferaseبروميجارقم 1110
البنسلين والناقص. الستربتومايسين والناقص. استقر محلول نيومايسينسيجما ألدريتشص 4083
قارئ الألواح الدقيقة من Polarstar Omega   ؛بي إم جي لابتيك----
RPMI 1640 متوسط ، مكمل GlutaMAXثيرمو ساينتفيك61870036
حمض Xanthurenicسيجما ألدريتشD120804

المراجع

  1. World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024 (2025).
  2. Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).
  3. Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era. Vaccines. 11 (9), 1452(2023).
  4. Ménard, R., et al. Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity. Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).
  5. Appetecchia, F., et al. Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development. Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).
  6. Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).
  7. Delves, M., et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites. PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).
  8. Calit, J., et al. Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).
  9. Calit, J., et al. Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc. Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).
  10. Lima, M. N. N., et al. Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits. Front Chem. 7, 773(2019).
  11. Ferreira, L. T., et al. Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparum and P. vivax. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).
  12. Krishnan, K., et al. Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol). Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).
  13. Calit, J., et al. Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity. JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).
  14. Lima, M. N., et al. Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria. Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).
  15. Ferreira, L. T., et al. A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants. PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).
  16. Blagborough, A. M., et al. Assessing transmission blockade in Plasmodium spp. Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).
  17. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).
  18. Gaitán, X. A., et al. Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen. Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IC50

مقالات ذات صلة