مقالة منهجية

تتبع الجسم الحي الموجه بالصور للخلايا السلفية الظهارية النهدية للرئة المزروعة للتليف الرئوي باستخدام التصوير بالجسيمات المغناطيسية

762 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68477

⸱

يونيو 27, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يقدم العلاج الخلوي تدخلا واعدا للتليف الرئوي باستخدام الخلايا السلفية لإصلاح الأنسجة التالفة وتحسين وظائف الرئة. نظرا لأن التصوير يلعب دورا محوريا في تتبع تكامل الخلايا ، فإننا نصف هنا التصوير الموجه بالجسيمات المغناطيسية في الجسم الحي لتتبع العلاج الخلوي للتليف الرئوي في نموذج الفأر.

الملخص

التليف الرئوي (PF) هو مرض رئوي تدريجي ومزمن يتميز بإصابة ظهارية سنخية متكررة تؤدي إلى ترسب مفرط للمصفوفة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى سماكة الأنسجة وتندب وضعف تبادل الغازات ، مما يؤدي إلى خلل في الجهاز التنفسي. في الولايات المتحدة ، يتم الإبلاغ عن حوالي 50,000 حالة جديدة سنويا ، حيث يواجه المرضى مضاعفات خطيرة مثل استرواح الصدر وارتفاع ضغط الدم الرئوي وفشل الجهاز التنفسي وزيادة خطر الإصابة بسرطان الرئة. الخيارات العلاجية الحالية محدودة الفعالية وتهدف في المقام الأول إلى إبطاء تطور المرض. ظهر العلاج الخلوي كتدخل واعد ، حيث يوفر إمكانية تجديد أنسجة الرئة التالفة ، وتعديل الالتهاب ، وتحسين وظيفة الرئة. ومع ذلك ، فإن فعالية هذه العلاجات تعتمد بشكل كبير على القدرة على مراقبة توزيع الخلايا المزروعة وبقائها وتكاملها داخل الرئتين المضيفتين.

تصوير الجسيمات المغناطيسية (MPI) هو طريقة تصوير جديدة وغير جراحية قبل السريرية تستخدم الجسيمات النانوية لأكسيد الحديد فائقة المغناطيسية (SPIONs) كمتتبعات. يوفر MPI حساسية عالية وخصوصية ولا توجد إشارة خلفية ، مما يسمح بالتتبع الكمي في الوقت الفعلي للخلايا المصنفة في الجسم الحي. في هذه الدراسة ، قمنا بالتحقيق في استخدام MPI لمراقبة الخلايا السلفية الظهارية للرئة البشرية البعيدة المزروعة في رئتي الفئران التي تعاني من نقص المناعة. تم تصنيف الخلايا بتركيزات SPION متفاوتة لتحسين الإشارة ، والتي تم تأكيدها عن طريق التلوين المناعي وقياس الحديد. بعد التقطير داخل القصبة الهوائية ، تم الحصول على فحوصات MPI ثنائية الأبعاد لتتبع التوزيع المكاني للخلايا المزروعة. التصوير الطولي على مدى أسبوعين مكن من تصور تكامل الخلايا والاحتفاظ بها داخل أنسجة الرئة. أظهر التقطير الناجح إشارات MPI في كل من الرئتين اليمنى واليسرى ، والتي انخفضت (~ 65٪) بمرور الوقت. تم التضحية بالفئران لاحقا من أجل التحقق من صحة النسيج. توضح هذه الدراسة فائدة MPI للتتبع الطولي غير الجراحي للعلاج الخلوي في التليف الرئوي ، وتدور حول التقنيات المعقدة المستخدمة أثناء الإجراءات.

المقدمة

يوفر العلاج الخلوي1،2 إمكانات التجدد ، وتعزيز إصلاح الأنسجة ، وتقليل الالتهاب ، وتحسين النتائج في الأمراض المزمنة مثل سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية3،4 (الخلايا الجذعية المكونة للدم) ، هشاشة العظام5،6 (الخلايا الجذعية الوسيطة) ، مرض السكري من النوع1 7 (زرع الخلايا الجزرية) ، إصابات الحبل الشوكي8،9 ، الأمراض التنكسيةالعصبية 10 ،11،12 (الخلايا الجذعية العصبية) ، والتليف الرئوي13،14،15،16 (الخلايا السلفية الرئوية). توفر هذه العلاجات إمكانات كبيرة ، على الرغم من أن التحديات مثل الرفض المناعي والفعالية طويلة المدى لا تزالقائمة 17،18. التليف الرئوي (PF) هو مرض رئوي مزمن وتدريجي يتميز بالتندب المفرط لأنسجة الرئة ، مما يؤدي إلى ضعف وظائف الرئة19. يهدف العلاج الخلوي ل PF إلى تجديد أنسجة الرئة التالفة وتقليل التليف عن طريق إدخال الخلايا المتجددة ، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة أو الخلايا السلفية للرئة البعيدة ، في الرئتين المصابتين20. الخلايا السلفية للرئة البعيدة ، والتي تشمل مجموعات مثل الخلايا القاعدية ، والخلايا السنخية من النوع الثاني ، والخلايا الجذعية القصبية السنخية ، وغيرها من الخلايا السلفية متعددة القدرات ، لديها القدرة على تعزيز إصلاح الأنسجة ، وتقليل الالتهاب ، وتجديد أنسجة الرئة التالفة ، وعكس بعض تلف الرئة مع استعادة وظائف الرئة الطبيعية21. أظهرت العديد من الدراسات السريرية قبل السريرية والمراحل المبكرة أن زرع الخلايا السلفية للرئة في الرئتين الليفيتين يمكن أن يساعد في تجديد الهياكل السنخية ، وتعزيز إعادة تشكيل الأنسجة ، وتقليل الالتهاب13،22،23. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه الخلايا أن تفرز عوامل نمو وسيتوكينات مختلفة تعدل البيئة الليفية ، مما يعزز الإصلاح. على الرغم من النتائج المشجعة في تحسين وظائف الرئة ، لا تزال هناك تحديات في تحسين توصيل الخلايا ، بما في ذلك العزل الفعال وتوسيع ودمج هذه الخلايا في أنسجة الرئة التالفة ، وضمان السلامة على المدى الطويل ، ومنع الآثار الجانبية غير المرغوب فيها. هناك حاجة إلى مواصلة البحث لتحسين البروتوكولات وتقييم سلامة وفعالية علاجات الخلايا السلفية على المدى الطويل للتليف الرئوي.

يتضمن زرع الخلايا في الرئتين للتليف الرئوي عدة تقنيات ، كل منها مصمم لتحسين توصيل الخلايا والبقاء والاندماج في أنسجة الرئة التالفة. تشمل الطرق الشائعة الحقن الوريدي24،25 ، والتوصيل داخل القصبةالهوائية 26،27 ، والتقطير داخل القصبةالهوائية 28،29،30،31 ، ولكل منها مزايا وتحديات محددة. يتم إعاقة الإعطاء الوريدي للخلايا الجذعية بسبب توجيه الرئة دون المستوى الأمثل ، والعزل في الأعضاء غير المستهدفة ، ومحدودية الجدوى بعد التسريب ، وخطر الاستجابات المناعية. على الرغم من أن التوصيل داخل القصبات الهوائية أكثر موضعية ، إلا أنه مقيد بتوزيع الخلايا غير المتجانسة ، وانسداد مجرى الهواء المحتمل ، والاستجابات الالتهابية ، والتحديات الإجرائية داخل بنية الرئة الليفية. وبالمثل ، فإن التقطير داخل القصبة الهوائية ، على الرغم من تمكينه من الترسيب الرئوي المباشر ، قد يؤدي إلى تشتت الخلايا غير المتسق ، وعدم كفاية اختراق الرئة البعيدة ، والتهيج الموضعي ، والتباين في توحيد الجرعة عبر حجرات الرئة. على الرغم من أن كل هذه التقنيات تهدف إلى تحسين بقاء الخلايا وتكاملها وفعاليتها في تجديد أنسجة الرئة ، إلا أن اختيار التقنية المثلى يعتمد على عوامل مثل نوع الخلايا التي يتم زرعها ومرحلة التليف والصحة العامة للمريض.

على الرغم من التحديات التي يواجهها ، يظل التقطير داخل القصبة الهوائية أحد أكثر الطرق استخداما لتوصيل الخلايا مباشرة إلى الرئتين ، خاصة في سياق التليف الرئوي. في هذه التقنية ، يتم إدخال الخلايا في الرئة عن طريق قسطرة يتم إدخالها في القصبةالهوائية 32. ثم يتم ترسيب الخلايا في الفضاء السنخي ، حيث يمكنها إصلاح أنسجة الرئة التالفة. هذه الطريقة طفيفة التوغل وسهلة التنفيذ نسبيا مقارنة بأساليب التوصيل الأخرى مثل نضح الرئة خارج الجسم الحي . نظرا لأن الخلايا تترسب مباشرة في الرئتين ، فإنها يمكن أن تحسن فرص التكامل والإصلاح الفعال. على عكس الحقن الوريدي ، يتجنب التقطير داخل القصبة الهوائية الدورة الدموية الجهازية ، مما يقلل من خطر احتجاز الخلايا في أعضاء أخرى مثل الكبد أو الطحال ، مما يؤدي إلى تأثير علاجي أكثر تركيزا في الرئتين. على الرغم من هذه الفوائد ، لا تزال الطريقة تواجه تحديات من حيث توزيع الخلايا والاحتفاظ بها دون المستوى الأمثل ، والبقاء داخل الرئتين ، مما قد يحد من الفعالية العلاجية. تعمل الأبحاث الجارية على تحسين هذا النهج للحصول على نتائج سريرية أكثر فعالية. يمكن للباحثين تحديد ما إذا كان التقطير داخل القصبة الهوائية مناسبا لتطبيقاتهم من خلال تقييم عدة عوامل. وتشمل هذه نوع الخلايا التي يتم تسليمها ، وقدرتها على البقاء على قيد الحياة والاندماج في أنسجة الرئة ، وشدة نموذج المرض (أي التليف الرئوي).

التصوير هو أداة لا غنى عنها لتتبع الخلايا ، وتقييم قابليتها للحياة ، وتوزيعها ، وتأثيراتها ، وتعزيز مراقبة العلاج الخلوي وتحسين استراتيجيات العلاج33. قام الباحثون بتقييم كفاءة التسليم من خلال التصوير وتحليل ما بعد الولادة لتتبع توزيع الخلايا والاحتفاظ بها. تم استخدام تقنيات مختلفة مثل التألق ، والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، والتصوير المقطعي المحوسب (CT) ، والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، والتصوير المقطعي المحوسب بإصدار الفوتون الفردي (SPECT) ، والموجات فوق الصوتية لتتبع الخلايا الجذعية المصنفة للتليف الرئوي. ومع ذلك ، فإنهم يواجهون قيودا مثل الاختراق المنخفض العمق (الفلورة) ، والحساسية الضعيفة (التصوير بالرنين المغناطيسي) ، والتعرض للإشعاع (CT ، PET ، SPECT) ، والدقة المنخفضة (الموجات فوق الصوتية)34. على الرغم من أن تحسين تباين التصوير والدقة والتوافق الحيوي يمكن أن يساعد في التغلب على هذه التحديات إلى حد ما ، إلا أن استكشاف تقنيات التصوير الأحدث يمكن أن يكون ضروريا أيضا لتتبع الخلايا الجذعية بدقة في الرئتين. في السنوات الأخيرة ، برز تصوير الجسيمات المغناطيسية (MPI) كطريقة تصوير واعدة وخالية من الإشعاع ، والتي توفر حساسية عالية ، في الوقت الفعلي ، تصويرا كميا مع تباين عال دون تدخل في الخلفية.

يستخدم MPI الجسيمات النانوية لأكسيد الحديد الفائق المغناطيسي (SPIONs) للتصور المباشر ، ويعتمد مبدأ عمله على استجابة المغنطة غير الخطية لهذه SPIONs عند تعرضها لمجال مغناطيسي متغير بمرورالوقت 35،36. تستخدم المغناطيس الكهربائي لإنشاء منطقة خالية من المجال (FFR) ، حيث تظهر الجسيمات الموجودة في هذه المنطقة فقط مغنطة غير خطية وتولد إشارة عند الإثارة بواسطة مجال مغناطيسي متذبذب. من ناحية أخرى ، فإن مغنطة الجسيمات خارج FFR مشبعة ، ولا تشارك في إنتاج الإشارة. من خلال تحريك FFR بشكل منهجي في جميع أنحاء حجم التصوير ، يقوم MPI بإنشاء خرائط مكانية لتوزيع الجسيمات النانوية والصور اللاحقة. تقدم MPI العديد من المزايا مقارنة بطرق التصوير التقليدية37،38. على عكس التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي المحوسب ، يوفر MPI إشارة فقط من جهاز التتبع ، مما ينتج عنه ضوضاء خلفية صفرية وتباين استثنائي. يوفر التصوير في الوقت الفعلي بدقة زمنية عالية ، مما يجعله مثاليا لتتبع العمليات الديناميكية مثل هجرة الخلايا أو التروية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن MPI حساس للغاية ، مما يسمح باكتشاف كميات صغيرة من SPIONs بدون إشعاع مؤين ، على عكس PET أو CT. علاوة على ذلك ، فإنه يوضح أيضا القياس الكمي الخطي الممتاز ، مما يتيح تقييما دقيقا لتركيز المتتبع. بشكل عام ، يجمع MPI بين نقاط القوة في الحساسية والسلامة والقياس الكمي ، مما يجعله أداة قوية للتصوير الطبي الحيوي. يعد MPI واعدا لتتبع الخلايا الجذعية في الرئتين ، مما يتيح المراقبة الدقيقة لهجرة الخلايا والاحتفاظ بها وتأثيراتها العلاجية. يوفر تباينا ممتازا دون تدخل إشارة الأنسجة ، مما يتيح توطين دقيق للخلايا الجذعية المصنفة39،40،41،42. توضح الأقسام التالية البروتوكولات التي تم إجراؤها لهذه الدراسات ، مما يوضح استخدام التقطير داخل القصبة الهوائية لتوصيل الخلايا المصنفة إلى رئتي الفئران والتأكيد عبر MPI.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي بجامعة ولاية ميشيغان (IACUC) وتمت الموافقة على الأشخاص الذين ينطوي عليهم من قبل Corewell Health IRB رقم 2017-198. قدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة في الدراسة.

تم جمع عينات من نبات الرئة البشرية من مرضى التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) الذين يخضعون لعملية زرع الرئة من Corewell Health. قبل إجراء الزرع ، استوفى جميع المرضى المعايير التشخيصية للتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والذي يتميز بنقص تأكسج الدم وضيق التنفس وانخفاض حجم الرئة43. أكد التحليل المرضي للأنسجة المأخوذة من الطرف البعيد من فص الرئة وجود التليف.

تم شراء ذكور الفئران NOD / SCID في عمر 8 أسابيع وسمح لها بالتأقلم لمدة أسبوع واحد ثم عمرها حتى 12 أسبوعا قبل الإجراء.

1. عزل وتوسيع الخلايا الظهارية في مجرى الهواء البشري

  1. ضع عينة الرئة المزروعة على الجليد للحفاظ على سلامة الخلية أثناء التشريح. تحديد الشعب الهوائية / الشعب الهوائية الكبيرة الموجودة في العينة ؛ تقع المسالك الهوائية الصغيرة في الأجزاء البعيدة من عينة الرئة ، وهي أبعد ما تكون عن الشعب الهوائية الكبيرة. باستخدام أدوات معقمة ، قم باستئصال الجزء البعيد من عينة الرئة ومعالجته إلى أجزاء أصغر للمساعدة في هضم الأنسجة. اشطف العينة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco لإزالة الدم الزائد والسوائل ، ثم هضم أنسجة الرئة المستزرعة التي تحتوي على الشعب الهوائية الصغيرة في مخزن مؤقت يتكون من البروتياز من Streptomyces griseus ، و 1x البنسلين / الستربتومايسين ، و DNase I ، و 1x Gentamicin في أنبوب سعة 50 مل. ضع الأنسجة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية للهزاز لمدة 4 ساعات تقريبا ، أو حتى يتم هضم الأنسجة بشكل كاف.
  2. مرر محتويات الأنبوب سعة 50 مل من خلال مصفاة خلية معقمة 100 ميكرومتر. اشطف المنديل 3 مرات باستخدام DPBS ومرر الغسالات عبر المصفاة. قم بتحبيير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط المزرعة عن طريق سحب تعليق الخلية 50x مع ضبط الماصة على 500 ميكرولتر.
  3. أضف معلق الخلية إلى قارورة ثقافة مقاس 75 سم2 تحتوي على وسط النمو الظهاري لمجرى الهواء. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة أسبوعين تقريبا.

2. وضع العلامات على الخلايا الظهارية في مجرى الهواء بالجسيمات النانوية (تتبع أكسيد الحديد)

  1. عندما تكون المزارع الظهارية ملتقية بنسبة 80٪ ، قم بتسمية الخلايا بتتبع أكسيد الحديد بتركيز نهائي يبلغ 250 ميكروغرام / مل. أضف الحجم المناسب من متتبع أكسيد الحديد إلى 10 مل من وسط المزرعة لكل قارورة من الخلايا الظهارية واحتضنه لمدة 48 ساعة.
    ملاحظة: تم تقييم تركيزات مختلفة من تتبع أكسيد الحديد (50 و 100 و 200 و 250 ميكروغرام / مل) لوضع العلامات على الخلايا متبوعا بفحوصات MPI ثنائية الأبعاد (الشكل 1 أ). تم الانتهاء من تركيز 250 ميكروغرام / مل ، إلى جانب 50.000 خلية للزرع ، لهذه الدراسة.
  2. بعد 48 ساعة ، اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام DPBS لإزالة الجسيمات النانوية الزائدة.
  3. افصل الخلايا باستخدام كاشف فصل الخلية واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، أو حتى تبدأ الخلايا في الرفع من سطح القارورة.
  4. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 1 مل من مصل الأبقار الجنينية. اشطف القارورة 3 مرات ب 5 مل من DPBS ، وأضف الغسالات إلى الأنبوب الذي يحتوي على 50 مل يحتوي على الخلايا.
  5. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط المزرعة عن طريق سحب معلق الخلية 50x مع ضبط الماصة على 500 ميكرولتر.
  6. استخدم مقياس كثافة الدم لتحديد تركيز الخلية وتحديد حجم تعليق الخلية المطلوب لزراعة الخلايا في الجسم الحي .
  7. Aliquot 100 ميكرولتر من تعليق الخلية وتثبيتها في 4٪ بارافورمالدهايد.

3. التلوين المناعي في المختبر والفحص المجهري

  1. قم بتحميل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في خرطوشة تدور الخلوي تحتوي على شريحة ومرشح وتدور لمدة 5 دقائق عند 1,000 دورة في الدقيقة.
  2. حدد الخلايا الموجودة على الشريحة باستخدام قلم مسعور.
  3. اغسل الشرائح لمدة 2 × 15 دقيقة باستخدام DPBS.
  4. قم باختراق الخلايا على الشريحة عن طريق احتضانها بنسبة 0.1٪ Triton X-100 في DPBS لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. اغسل الخلايا لمدة 2 × 2 دقيقة باستخدام DPBS.
  6. قم بسد الشرائح باستخدام 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) / 1٪ مصل الماعز في DPBS لمدة ساعتين.
  7. احتضان الشرائح في الجسم المضاد الأولي (مضاد ديكستران) في مصل الماعز 2.5٪ BSA / 0.5٪ في DPBS بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
  8. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي وغسل الشرائح 3 × 5 دقائق في 1x Tris-Buffered Saline مع Tween 20 (TBST).
  9. احتضان الشرائح بجسم مضاد ثانوي 1: 1,000 في مصل الماعز 2.5٪ BSA / 0.5٪ في DPBS لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  10. اغسل الشرائح لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام 1x TBST.
  11. أضف عامل تلطيخ نووي ، 4 ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، إلى الشريحة بتركيز 1: 1,000 في DPBS واتركه يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  12. اغسل الشرائح 2 × 5 دقائق باستخدام 1x TBST. قم بإزالة 1x TBST الزائد من الشريحة.
  13. أضف وسيط التثبيت باستخدام DAPI وضع غطاء زجاجي فوق المنزلق ، مع الحرص على تجنب أي فقاعات هواء.
  14. بعد تثبيت الشريحة، أغلق حواف الغطاء باستخدام طلاء أظافر شفاف.
  15. صور الشرائح على مجهر متحد البؤر.

4. زرع الخلايا باستخدام التقطير داخل القصبة الهوائية

  1. اعداد
    1. قم بوزن الماوس لحساب جرعة البليومايسين (BLM) المطلوبة لكل فأر.
    2. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 مل ، قم بإعداد محلول BLM المطلوب (المخفف في محلول ملحي معقم) بحجم لا يتجاوز 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: سيختلف تركيز الدواء اعتمادا على الأهداف التجريبية. تم استخدام BLM عند 0.6 وحدة / كجم لهذا الإجراء.
    3. قم بتحميل محلول BLM في ماصة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتحميل حقنة مسبقا ب 200 ميكرولتر من الهواء لضمان طرد كل حجم السائل إلى القصبة الهوائية.
      ملاحظة: بعد 72 ساعة من علاج BLM ، سيتم إعطاء تعليق الخلية المسمى بطريقة مماثلة.
    4. استخدم عدد الخلايا الذي تم الحصول عليه من الخطوة 2.6 لحساب حجم تعليق الخلية ، الذي يحتوي على 50,000 خلية ، ليتم إعطاؤه.
    5. قم بتخدير الفأر عن طريق وضعه في صندوق تحريضي متصل بوحدة التخدير التي تزود الأيزوفلوران (2.5-3٪) حتى يتم تخديره.
      ملاحظة: يتم تخدير الفئران مرتين خلال الإجراء بأكمله: (1) في يوم إعطاء BLM و (2) في يوم تقطير الخلايا داخل القصبة الهوائية ، أي بعد 72 ساعة من جرعة BLM.
    6. قم بإعداد مجموعة التنبيب الضوئية الليفية كما هو موضح في الشكل 2 أ مع مرور مسبار الألياف الضوئية عبر منظار الحنجرة والقسطرة.
      ملاحظة: يجب وضع الطرف المضيء للألياف خارج (1-2 مم) أنبوب القسطرة.
  2. التقطير داخل القصبة الهوائية
    1. تأكد من التخدير عن طريق فحص منعكس الدواسة عن طريق الضغط على إصبع القدم في أي من الساقين الخلفيتين. بمجرد تأكيد التخدير الكافي ، قم بتعليق الفأر بواسطة قواطعه في وضع ضعيف على حامل تنبيب القوارض بزاوية (الشكل 2B-D).
    2. باستخدام ملقط غير حاد ، أمسك اللسان بعناية ، وفي حركة تصاعدية ويسارا ، ضع اللسان للحصول على تصور مناسب للحنجرة.
    3. قم بتشغيل مسبار الألياف الضوئية وادخل الفم للاقتراب من القصبة الهوائية. استخدم مكبر منظار الحنجرة لتحسين تصور الحنجرة وحدد موقع الحبال الصوتية عند فتحة القصبة الهوائية.
    4. أدخل القسطرة في فتحة القصبة الهوائية وافصل منظار الحنجرة بعناية فائقة واسحبه للخارج. ضع قطرة صغيرة من المحلول الملحي (20 ميكرولتر) في الطرف العلوي من القسطرة.
      ملاحظة: سيتحرك مستوى السائل لأعلى ولأسفل ، محاذاة مع معدل تنفس الماوس. سيؤكد هذا وضع القسطرة في القصبة الهوائية وليس عن طريق الخطأ في المريء.
    5. قم بتوصيل حقنة بسعة 200 ميكرولتر من الهواء محملة مسبقا وادفع القطرة إلى الداخل. ضع معلق الخلية (≤50 ميكرولتر) في القسطرة وقم بغرسه باستخدام المحقنة المحملة بالهواء كما كان من قبل.
    6. لمنع السائل المغرس من الهروب من القصبة الهوائية ، اترك القسطرة في مكانها لمدة 5-7 ثوان. ثم اسحب القسطرة برفق.
    7. حافظ على الماوس في نفس الوضع على حامل التنبيب لمدة 30 ثانية على الأقل.
    8. قم بإزالة الماوس وضعه في قفص استرداد يوضع على وسادة تدفئة. راقب حتى يتعافى تماما من التخدير.

5. تصوير الجسيمات المغناطيسية

  1. قم بتخدير الفأر عن طريق وضعه في صندوق تحريضي متصل بوحدة التخدير التي تغذي الأيزوفلوران (2-2.5٪) حتى يتم تخديره.
  2. قم بإعداد سرير الماوس في ماسح ضوئي MPI مع مرور خط التخدير أسفل السرير من خلال التوصيلات المناسبة.
  3. أثناء تخدير الماوس ، قم بإعداد الماسح الضوئي MPI للتصوير. ابدأ البرنامج المرتبط وحدد اسم المجلد في Project والمسح الضوئي في مجال اسم الاختبار لتحديد الهوية ، وقم بتعيين معلمات الفحص وفقا للمتطلبات. لاتباع هذا الإجراء ، استخدم معلمات المسح الضوئي التالية: نوع المسح: مسح ثنائي الأبعاد ؛ وضع المسح: قياسي. قنوات الإرسال: متعددة القنوات (متناحية) ؛ المتوسطات لكل إسقاط: 2.
  4. تحقق من التخدير كما هو موضح في الخطوة 4.2.1. ضع الماوس بإحكام على سرير MPI كما هو موضح في الشكل 2E.
    ملاحظة: تأكد من محاذاة الخطم بشكل صحيح مع مخروط الأنف المدمج في السرير للحفاظ على التخدير بشكل صحيح أثناء المسح.
    تنبيه: يمكن أن يتسبب عدم كفاية التخدير أثناء الفحص في استيقاظ الماوس أثناء تشغيل الفحص.
  5. بمجرد وضع الماوس في الماسح الضوئي ، ادفع السرير داخل التجويف وانقر فوق بدء المسح.
  6. بعد اكتمال الفحص ، قم بإزالة الماوس من سرير MPI وضعه في قفص استرداد يوضع على وسادة تدفئة. راقب حتى يتعافى تماما من التخدير.
  7. تحليل الصور باستخدام برنامج تحليل الصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أجريت الدراسة التجريبية على ستة فئران. من بين هؤلاء ، مات فأر واحد فقط قبل الانتهاء من الدراسة ، في اليوم العاشر. تم تقييم شدة إشارة 2D MPI لتركيزات وضع العلامات المختلفة كدالة لعدد الخلايا (الشكل 1 أ). لوحظ أن شدة الإشارة تتناسب طرديا مع تركيز متتبع أكسيد الحديد. لذلك ، تم اعتبار تركيز 250 ميكروغرام / مل كتركيز وضع العلامات الأمثل واستخدم في الدراسات اللاحقة. كما تم تأكيد وضع العلامات على الخلايا في المختبر باستخدام التلوين المناعي والفحص المجهري ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التقطير داخل القصبة الهوائية في الفئران هو تقنية دقيقة لتوصيل المواد مباشرة إلى الرئتين. مطلوب عناية دقيقة خلال العديد من الخطوات الحاسمة خلال هذا الإجراء. بدءا من ضمان عمق التخدير المناسب لمنع الانزعاج والحركة ووضع الفأر ضعيفا مع تمديد الرقبة لمحاذاة مجرى الهواء للوصول الواضح إلى فتحة القصبة الهوائية. قد يساعد استخدام خافض اللسان في إبقاء مجرى الهواء مفتوحا. تأكد من إدخال القسطرة بعناية ويجب غرس المواد (مثل الخلايا الجذعية والأدوية والجسيمات النانوية) ببطء لتجنب الارتجاع أو الشفط. بعد ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم توفير تمويل هذه الدراسة جزئيا من خلال المنحة من R01HL153165-01A1 إلى XPL و R21AI159928-01 إلى P.W.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMTلجمع الخلايا وإعداد تخفيفات BLM
Anti-Dextran antibdoySTEMCELL Technologies60026Antibody أساسي
BD Luer-Lok SyringeBecton, Dickinson309628لإدارات الهواء أثناء التثبيت داخل القصبة الهوائية
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS -/-) Gibco14190250
Fetal Bovine Serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamicin Gibco15750060
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568ThermoFisher ScientificA-11004Antibody ثانوي
Goat SerumMillipore-SigmaG9023
IsofluraneCovetrus11695067772تخدير بالغاز
Isoflurane vaporizerSOMNI ScientificVS6002جهاز التخدير
MomentumMagnetic Insight Incماسح التصوير المغناطيسي للجسيمات (MPI) قبل السريري
Mouse intubation kitOHANOhan-201مجموعة كاملة لإدخال أنبوب التنفس مع جميع الملحقات المطلوبة
NOD/SCID MiceJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303نموذج الفأر ضعيف المناعة
Penicillin/Streptomycin Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI InvitrogenP36962وسط تثبيت الشرائح الملطخة مناعيًا
Protease from Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Surgical kitملقط حاد الطرف يستخدم لتثبيت لسان الفأر
Tris-Buffered Saline with Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzyme ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01مسبار أكسيد الحديد لوضع العلامات على الخلايا في المختبر والتصوير المغناطيسي للجسيمات اللاحق

المراجع

  1. Biehl, J. K., Russell, B. Introduction to Stem Cell Therapy. J Cardiovasc Nurs. 24 (2), 98-103 (2009).
  2. Herberts, C. A., Kwa, M. S. G., Hermsen, H. P. H. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 (1), 29(2011).
  3. Bair, S. M., Brandstadter, J. D., Ayers, E. C., Stadtmauer, E. A. Hematopoietic stem cell transplantation for blood cancers in the era of precision medicine and immunotherapy. Cancer. 126 (9), 1837-1855 (2020).
  4. Xuan, L., Liu, Q. Maintenance therapy in acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Hematol Oncol. 14 (1), 4(2021).
  5. Zhu, C., Wu, W., Qu, X. Mesenchymal stem cells in osteoarthritis therapy: a review. Am J Transl Res. 13 (2), 448-461 (2021).
  6. Giorgino, R., et al. Knee osteoarthritis: Epidemiology, pathogenesis, and mesenchymal stem cells: What else is new? An update. Int J Mol Sci. 24 (7), 6405(2023).
  7. Jeyagaran, A., et al. Type 1 diabetes and engineering enhanced islet transplantation. Adv Drug Deliv Rev. 189, 114481(2022).
  8. Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. Mechanisms of stem cell therapy in spinal cord injuries. Cells. 10 (10), 2676(2021).
  9. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  10. Kim, S. W., et al. Neural stem cells derived from human midbrain organoids as a stable source for treating Parkinson's disease: Midbrain organoid-NSCs (Og-NSC) as a stable source for PD treatment. Prog Neurobiol. 204, 102086(2021).
  11. Nie, L., et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9 (1), 215(2023).
  12. Yue, C., Feng, S., Chen, Y., Jing, N. The therapeutic prospects and challenges of human neural stem cells for the treatment of Alzheimer's Disease. Cell Regen. 11 (1), 28(2022).
  13. Kim, J. -H., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids for modeling pulmonary fibrosis and drug testing. Cell Death Discov. 7 (1), 48(2021).
  14. Cheng, W., Zeng, Y., Wang, D. Stem cell-based therapy for pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 492(2022).
  15. Milman Krentsis, I., et al. Lung cell transplantation for pulmonary fibrosis. Sci Adv. 10 (34), eadk2524(2024).
  16. Suezawa, T., et al. Disease modeling of pulmonary fibrosis using human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Rep. 16 (12), 2973-2987 (2021).
  17. Madrid, M., Sumen, C., Aivio, S., Saklayen, N. Autologous induced pluripotent stem cell-based cell therapies: Promise, progress, and challenges. Curr Protoc. 1 (3), e88(2021).
  18. Balistreri, C. R., et al. Stem cell therapy: old challenges and new solutions. Mol Biol Rep. 47 (4), 3117-3131 (2020).
  19. Richeldi, L., Collard, H. R., Jones, M. G. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 389 (10082), 1941-1952 (2017).
  20. Tzouvelekis, A., Antoniadis, A., Bouros, D. Stem cell therapy in pulmonary fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (5), 368-373 (2011).
  21. Rawlins, E. L. Lung epithelial progenitor cells. Proc Am Thorac Soc. 5 (6), 675-681 (2008).
  22. Han, M. -M., et al. Nanoengineered mesenchymal stem cell therapy for pulmonary fibrosis in young and aged mice. Sci Adv. 9 (29), eadg5358(2023).
  23. Averyanov, A., et al. First-in-human high-cumulative-dose stem cell therapy in idiopathic pulmonary fibrosis with rapid lung function decline. Stem Cells Transl Med. 9 (1), 6-16 (2019).
  24. Glassberg, M. K., et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis via intravenous delivery (AETHER): A phase I safety clinical trial. Chest. 151 (5), 971-981 (2017).
  25. Zhao, X., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cell therapy for reverse bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Sci Rep. 13 (1), 13183(2023).
  26. Tzouvelekis, A., et al. A prospective, non-randomized, no placebo-controlled, phase Ib clinical trial to study the safety of the adipose derived stromal cells-stromal vascular fraction in idiopathic pulmonary fibrosis. J Transl Med. 11 (1), 171(2013).
  27. Tzouvelekis, A., et al. Stem cell therapy for idiopathic pulmonary fibrosis: a protocol proposal. J Transl Med. 9 (1), 182(2011).
  28. Choi, S. M., et al. Classical monocyte-derived macrophages as therapeutic targets of umbilical cord mesenchymal stem cells: comparison of intratracheal and intravenous administration in a mouse model of pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 68(2023).
  29. Llontop, P., et al. Airway transplantation of adipose stem cells protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Investig Med. 66 (4), 739-746 (2018).
  30. Gad, E. S., et al. The anti-fibrotic and anti-inflammatory potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and nintedanib in bleomycin-induced lung fibrosis in rats. Inflammation. 43 (1), 123-134 (2020).
  31. Aal Porzionato,, et al. Intratracheal administration of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles reduces lung injuries in a chronic rat model of bronchopulmonary dysplasia. Am Jl Physiol Lung Cell Mol Physiol. 320 (5), L688-L704 (2021).
  32. Ortiz-Muñoz, G., Looney, M. R. Non-invasive Intratracheal Instillation in Mice. Bio Protoc. 5 (12), e1504(2015).
  33. Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev. 62 (11), 1080-1093 (2010).
  34. Li, Z., Tong, L., Zhao, H., He, Z. Medical Imaging in Clinical Practice. Erondu, F. O. , IntechOpen. (2013).
  35. Knopp, T., Gdaniec, N., Möddel, M. Magnetic particle imaging: from proof of principle to preclinical applications. Phys Med Biol. 62 (14), R124-R178 (2017).
  36. Borgert, J., et al. Fundamentals and applications of magnetic particle imaging. J Cardiovasc Computed Tomogr. 6 (3), 149-153 (2012).
  37. Mohapatra, J., et al. Principles and applications of magnetic nanomaterials in magnetically guided bioimaging. Mater Today Phys. 32, 101003(2023).
  38. Pablico-Lansigan, M. H., Situ, S. F., Samia, A. C. S. Magnetic particle imaging: advancements and perspectives for real-time in vivo monitoring and image-guided therapy. Nanoscale. 5 (10), 4040-4055 (2013).
  39. Bulte, J. W. M., et al. Quantitative "hot-spot" imaging of transplanted stem cells using superparamagnetic tracers and magnetic particle imaging. Tomography. 1 (2), 91-97 (2015).
  40. Lemaster, J. E., Chen, F., Kim, T., Hariri, A., Jokerst, J. V. Development of a trimodal contrast agent for acoustic and magnetic particle imaging of stem cells. ACS Appl Nano Mater. 1 (3), 1321-1331 (2018).
  41. Shalaby, N., et al. Complementary early-phase magnetic particle imaging and late-phase positron emission tomography reporter imaging of mesenchymal stem cells in vivo. Nanoscale. 15 (7), 3408-3418 (2023).
  42. Wang, Q., et al. Artificially engineered cubic iron oxide nanoparticle as a high-performance magnetic particle imaging tracer for stem cell tracking. ACS Nano. 14 (2), 2053-2062 (2020).
  43. Li, X., et al. Extravascular sources of lung angiotensin peptide synthesis in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (5), L887-L895 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SPION

مقالات ذات صلة