هنا ، نقدم منهجية مفصلة لعزل شبكية العين عن عين الفأر لإجراء تجارب ممتدة خارج الجسم الحي . يؤكد هذا البروتوكول على جعل هذا النهج المتطلب تقنيا متاحا للباحثين الذين يرغبون في الاستفادة من سبل البحث التي يوفرها الحفاظ على الخلايا الدبقية في الشبكية في الموقع في الأنسجة الحية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نموذج Ex Vivo Explant لدراسة التفاعلات الدبقية في شبكية العين الفأر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد دور الخلايا الدبقية في الجلوكوما موضوعا بحثيا بارزا بشكل متزايد ، ولكن لا يزال الكثير مجهولا حول كيفية تأثير مجموعات هذه الخلايا الداعمة - أي الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة - على بقاء الخلايا العقدية في الشبكية. بينما توفر النماذج في الجسم الحي وفي المختبر درجة من البصيرة ، فإن كلا النهجين لهما قيود كبيرة ، مثل تأثير الاستجابة المناعية المحيطية في الأول والتغيرات في الوظيفة الفسيولوجية الناجمة عن عزل الخلايا وثقافتها في حالة الأخير. لتقليل هذه العوامل المربكة ، قمنا بتطوير نظام نبات شبكية خارج الجسم الحي يمكن من خلاله الحفاظ على الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة وأنواع خلايا الشبكية الأخرى في الموقع لفترات لا تقل عن 3 أيام ، مما يتيح التحقيق المستهدف بإنتاجية أعلى مما هو ممكن عادة مع نماذج in vivo . بشكل حاسم ، هذا النهج قابل للتطبيق إلى حد كبير للمنهجيات التي قد تكون صعبة أو غير مجدية في حي ولكنه يظل متوافقا مع المقايسات الشائعة في اتجاه مجرى النهر للأنسجة العصبية السليمة. هنا ، نقدم بروتوكولا مناسبا لعزل واستزراع مستخلصات الشبكية السليمة ، جنبا إلى جنب مع النتائج التمثيلية للفحص المجهري المناعي الذي يوثق التغييرات التي تمر بها الخلايا الدبقية والخلايا العقدية الشبكية في شبكية العين خارج الجسم الحي .
المقدمة
شبكية العين الحساسة للضوء ، وهي امتداد للجهاز العصبي المركزي (CNS) الموجود في الجزء الخلفي من العين ، ضرورية للبصر ولكنها عرضة لكل من الإصابات الحادة والأمراض المزمنة. كما هو الحال مع مناطق الجهاز العصبي المركزي الأخرى ، لا يتم استبدال الخلايا العصبية في شبكية العين البالغة عند فقدانها ، والخلايا العقدية الشبكية (RGCs) التي تجمع المعلومات المرئية وتنقلها إلى الدماغ معرضة بشكل خاص للخلل الوظيفي والموت في الجلوكوما ، مما يؤدي إلى فقدان البصر بشكل لا رجعة فيه1،2. الجلوكوما هو سبب رئيسي للعمى في جميع أنحاءالعالم 3 ، ولكن على الرغم من التأثير المدمر على الأفراد المصابين والتكاليف الإجمالية للمجتمع ، لا يزال الكثير مجهولا حول كيفية مساهمة المراحل المبكرة من المرض في فقدان RGC4. يعد دور الخلايا الدبقية مجالا رئيسيا للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للجلوكوما ، حيث أن هذه الخلايا الداعمة غير العصبية ضرورية لبقاء RGC5 ولكنها تخضع لتغيرات نمطية في المرض قد تقلل من السلوك المفيد6 أو حتى تدفع إلى اعتماد الأنماط الظاهرية الضارة7. على الرغم من أن مصطلح الخلايا الدبقية يشمل مجموعة من أنواع الخلايا المتخصصة في جميع أنحاء الجهاز العصبيالمركزي 8 ، إلا أنه يمكن تقسيمها على نطاق واسع إلى فئتين - تلك التي تشترك في سلالة تنموية مع الخلايا العصبية وتوفر دعما غذائيا وحيوياوهيكليا 9 ، وتلك ذات الأصل النخاعي ، والتي تؤدي مهام المراقبة المناعية والاستجابةالمتخصصة 10. يملأ ممثلو كلتا الفئتين - الخلايا النجمية وخلايا مولر في الأولى ، والخلايا الدبقية الصغيرة في الأخيرة - شبكيةالعين 5 ويخضعون لتغييرات كبيرة في الجلوكوما التي تثير تساؤلات مهمة حول دورها في تطور المرض وبقاء RGC11.
يتم إعاقة الجهود المبذولة للإجابة على هذه الأسئلة جزئيا بسبب الخصائص الجوهرية للشبعية الدبقية التي تمثل تحديات لكل من التحقيق في الجسم الحي وفي المختبر . على عكس الخلايا العصبية ، فهي صامتة نسبيا كهربائيا ، مما يجعل مناهج مثل ERG التي تتيح التقييم الوظيفي ل RGCs والمستقبلات الضوئية في الجسم الحي غير مناسبة للتحقيق في التغيرات في الوظيفة الدبقية والسلوك. وعلى الرغم من توفر12 نموذجا محفزا و13 نموذجا عفويا من الجلوكوما ، إلا أنه لا يزال الكثير مجهولا عن التغيرات في الخلايا الدبقية في أقرب نقاط زمنية في المرض ، والتي قد تسبق فقدان RGC القابل للاكتشاف ، وهي مشكلة تتفاقم بسبب الاختراق المتغير لحالة المرض في العديد من هذه النماذج. علاوة على ذلك ، تشير الأدلة من كل من الجلوكوما السريرية والتجريبية إلى مساهمات من الخلايا المناعية المحيطية التي يصعب توضيحها عن تلك الموجودة في الخلايا الدبقية الصغيرة ، على الرغم من المؤشرات التي تشير إلى أنها قد تعمل في "اتجاهات" مختلفة للتأثير على تطور المرض14،15.
تكثر التحديات أيضا في دراسة الخلايا الدبقية في الشبكية في المختبر. على الرغم من أن عزل واستزراع الخلايا النجمية16،17 والخلايا الدبقيةالصغيرة 18 من الدماغ راسخة ، إلا أن العمل الأخير يسلط الضوء على عدم التجانس الدبقي الواسع النطاق بين مناطق الجهاز العصبي المركزي ، خاصة في الخلايا النجمية19 ، وقد لا تكون الأنماط الظاهرية الموجودة في منطقة ما موجودة في الخلايا الدبقية من منطقة أخرى ، مثل شبكيةالعين 20،21. ومع ذلك ، فإن العزل المباشر للخلايا النجمية في الشبكية والخلايا الدبقية الصغيرة للدراسة يمثل تحديا خاصا ، حيث أن كلا النوعين من الخلايا متناثرة نسبيا - يشكل كل منهما أقل من 1٪ من 6.5 مليون خلية في شبكية الفأر22،23،24. علاوة على ذلك ، على عكس الخلايا العصبية ، فإن الخلايا الدبقية بلاستيكية للغاية وتتكيف بسرعة مع التغيرات الدراماتيكية في محيطها16،18،25. نتيجة لذلك ، قد تمثل السلوكيات التي لوحظت في هذه الخلايا في المختبر تكيفات محددة مع بيئتها الجديدة بدلا من أنماط النمط الظاهري التي يمكن رؤيتها عادة في الصحة أو المرض. نظرا لقيود كل من التجارب في الجسم الحي والثقافة الأولية للشبعية الدبقية ، فقد سعينا إلى نهج وسيط - استخلاص الشبكية - حيث يتم الحفاظ على الخلايا الدبقية ، و RGCs ، وعناصر أخرى من شبكية العين في الموقع في سياق خارج الجسم الحي . بالنسبة إلى النماذج في الجسم الحي ، يقدم هذا النهج دورة زمنية تجريبية مختصرة26 ، ويتيح التلاعب التجريبي المباشر للشبية الشبكية27 ، ويتجنب التأثير المربك المحتمل لتسلل الخلايا المناعية الطرفية14. على العكس من ذلك ، على عكس زراعة الخلايا الأولية ، هناك حد أدنى من الاضطراب في البيئة خارج الخلية ، وتظل الخلايا الدبقية سليمة ويمكن التعرف عليها شكليا ، مما يتجنب التحديات المرتبطة بإعادة نمو هذه الخلايا بشكل أساسي وتحديدها بعد الاضطراب الأنزيمي والميكانيكي16،25.
بالنسبة لمنهجيات استخراج الشبكية الموصوفة سابقا ، يؤكد هذا النهج على التركيز على الموثوقية التقنية ، وقابلية التكرار ، وتعظيم "سهولة الاستخدام" للنهج لتحسين إمكانية الوصول26،28. في الاتصالات الشخصية مع باحثين آخرين ، وجدنا أن التحديات التقنية المرتبطة بالتعامل مع شبكية العين الحية تمثل عقبة كبيرة أمام الكثيرين الذين يتطلعون إلى استخدام النباتات الخارجية ، في حين أن الحفاظ على شبكية العين المزروعة في الثقافة كان واضحا نسبيا للمجموعات التي لديها مرافق زراعة الخلايا المناسبة. لذلك ، يتضمن هذا البروتوكول عددا من الابتكارات التي تهدف إلى تقليل منحنى التعلم المرتبط بعزل شبكية العين والسماح للباحثين بالبدء بسرعة أكبر في جمع البيانات التجريبية. أخيرا ، على الرغم من أننا ركزنا بشكل خاص على إمكانات نموذج الزرع هذا للتحقيق في سلوك الخلايا الدبقية في الشبكية وتوصيفه بشكل أساسي بالفحص المجهري المناعي ، إلا أن أنواع وهياكل خلايا الشبكية الأخرى يتم الحفاظ عليها إلى حد كبير أيضا ، وتظل شبكية العين المستزرعة قابلة لمجموعة واسعة من تقنيات التحقيق الإضافية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي تشمل من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في معهد شيبينز لأبحاث العيون (بروتوكول # 2022N000030 ، تمت الموافقة عليه في 3/4/2025). تم التعامل مع وفقا لبيان جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 الخطوات الرئيسية في عزل شبكية العين الحية عن عين الفأر المنزولة.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للخطوات الرئيسية في عزل شبكية العين الحية عن عين الفأر المنزوعة. يتم توفير أرقام الخطوات المقابلة للخطوات الرئيسية في دوائر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. التحضير
- قم بتطهير ماصة سعة 1 مل وزوج من الملقط المائل وضعها في خزانة السلامة الحيوية. ستكون هناك حاجة إلى هذه في القسم 3 من البروتوكول.
- قم بتعديل ماصة النقل عن طريق القطع بشكل عمودي عبر العمود حوالي 2 سم أسفل الخزان، حيث يكون التجويف أوسع، لتقصير الماصة وتوسيع الفتحة. تأكد من وجود قطع نظيف لا تتعطل عليه شبكية العين.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بهذه الأداة لإعادة استخدامها إذا كانت نظيفة وشطفها بالماء المعقم بين الاستخدامات. - تحضير 50 مل من وسائط الزرع بشكل معقم في خزانة السلامة الحيوية عن طريق استكمال 47.5 مل من الوسائط العصبية القاعدية مع 500 ميكرولتر من مكمل N-2 ، و 1 مل من مكمل B-27 ، و 500 ميكرولتر من الجلوتاماكس ، و 500 ميكرولتر من مزيج البنسلين والستربتومايسين (التركيز النهائي 100 وحدة / مل من البنسلين و 100 مجم / مل من الستربتومايسين).
ملاحظة: قم بإعداد وسائط جديدة لكل سلسلة من العزلات ؛ يمكن الاحتفاظ بالوسائط الزائدة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد واستخدامها لتغيير الوسائط إذا لزم الأمر. بعد الفتح ، استبدل الوسط العصبي القاعدي غير المستخدم بعد 1 شهر. يجب أن تبقى N-2 و B-27 مجمدة كحصص للاستخدام الواحد ، مع تجنب دورات التجميد والذوبان. - في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإعداد لوحة (صفائح) الاستزراع بشكل معقم عن طريق إضافة ملحق في كل بئر لاستخدامه ، والتعامل معه عبر "الشوكات" التي تخرج من حافة الإدخال لتجنب لمس الأسطح التي ستلامس وسائط الاستزراع.
- أضف 1 مل من وسائط الزرع إلى الملحق ، متبوعا ب 3 مل إضافية تضاف إلى البئر نفسه. أضف 2-3 مل من الماء المعقم إلى أي آبار غير مستخدمة للتحكم في التبخر.
- نقل اللوحة (اللواحات) إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للتوازن قبل 30 دقيقة تقريبا من عزل الأنسجة.
- قم بإعداد مربعات الترشيح لإنشاء ركيزة لتثبيت الأنسجة ونقلها. استخرج الفلتر من مجموعة الترشيح الموجودة أعلى الزجاجة عن طريق قطع محيط المادة بشفرة حلاقة أو مشرط. احرص على تجنب الإصابة أو إتلاف الفلتر من خلال الطي أو التمزق.
ملاحظة: تؤدي إزالة الخزان البلاستيكي الشفاف باستخدام ماكينة حلاقة متينة لقطع البلاستيك غير الشفاف الأكثر مرونة حيث يلتقي المحول الملولب بالخزان إلى تبسيط عملية الاستخراج ، ولكن يجب توخي الحذر الإضافي لمنع الإصابة.- بعد فصل الفلتر عن طريق القطع ، استخدم الملقط لاستخراجه. لاحظ اتجاه المرشح أثناء الاستخراج وبعده ؛ يجب أن يكون الجانب غير اللامع (الذي يواجه الخزان) منتصبا لتركيب شبكية العين في الخطوة 2.16 للنقل.
- قطع الفلتر إلى مربعات صغيرة حوالي 7 مم × 7 مم ؛ سيتطلب كل نبتة شبكية مربعا واحدا. انقع المربعات مسبقا في ماء معقم في طبق بتري مقاس 100 مم لمدة 20 دقيقة على الأقل.
ملاحظة: يمكن أن تظل مربعات المرشح مغمورة في ماء معقم لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الاستخدام. نظرا لميل مربعات المرشح إلى تطوير مستويات عالية من الشحنة الساكنة قبل الغمر ، قم بإعداد العديد من المربعات حسب الحاجة. يمكن الاحتفاظ بمادة المرشح الجافة المتبقية إلى أجل غير مسمى في طبق بتري معقم مقاس 100 مم لاستخدامها لاحقا.
2. العزل والتركيب
- القتل الرحيم للفأر بطريقة معتمدة قبل التأكيد بنهج ثانوي ؛ استخدمت هذه الدراسة ثاني أكسيد الكربون2 الاختناق متبوعا بخلع عنق الرحم. قم باستئصال كلتا العينين باستخدام ملقط منحني غير حاد وضعهما في PBS معقم.
- قم بإعداد مساحة العمل عن طريق ملء طبق بتري مقاس 100 مم ب PBS معقم ووضعه على مسرح نطاق التشريح المجهري.
- قم بقص شريط بعرض 1 سم من مناديل المختبر واغمرها في الطبق لتكون بمثابة ركيزة تثبيت.
- انقل إحدى العينين إلى طبق التشريح ، واترك الأخرى في PBS ، وضعها على الثلج أو في الثلاجة عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: نظرا لحساسية شبكية العين لفترات ما بعد الوفاة لفترات طويلة ، يوصى بالقتل الرحيم لفأر واحد في كل مرة.
- وضع العين وشل حركتها. استخدم الملقط لمناورة العين على منديل المختبر المغمور ، مما سيساعد على الاستقرار.
- حدد نقطة التثبيت المناسبة ، وامسكها بالملقط المائل ، ولف العين برفق بحيث يتم تثبيتها من الجانب أو من الأسفل بشكل مثالي. تأكد من أن المحور الأمامي الخلفي (أي من القرنية إلى العصب البصري) أفقي. يحسن هذا الاتجاه الرؤية ويقلل الضغط على العين أثناء التشريح.
ملاحظة: إذا أمكن ، أمسك الأنسجة خارج الحجاج لتجنب ثقب العين أو الضغط عليها ، مع تفضيل العضلات أو الملتحمة على العصب البصري أو الدهون.
- حدد نقطة التثبيت المناسبة ، وامسكها بالملقط المائل ، ولف العين برفق بحيث يتم تثبيتها من الجانب أو من الأسفل بشكل مثالي. تأكد من أن المحور الأمامي الخلفي (أي من القرنية إلى العصب البصري) أفقي. يحسن هذا الاتجاه الرؤية ويقلل الضغط على العين أثناء التشريح.
- مع الحفاظ على ثبات الملقط الزاوي ، تأكد من أن العين مغمورة بالكامل وثابتة بشكل آمن. قم بعمل شق مع طرف المشرط # 11 الموازي وحوالي 0.5 مم خلف الليفي ، حيث تنتقل القرنية إلى الصلبة.
ملاحظة: يجب أن يكون هذا الشق كبيرا بما يكفي ليناسب طرف شفرة واحدة من مقص الزنبرك. نظرا لأن حدة طرف المشرط ضرورية لثقب الكرة الأرضية بشكل نظيف ، فقم بتغيير الشفرة بعد كل شبكية العين.- أدخل شفرة واحدة من مقص الزنبرك داخل الكرة الأرضية وابدأ في القطع حول العين بشكل دائري ، وأعد وضع العين برفق حسب الحاجة باستخدام الملقط.
ملاحظة: يجب أن يكون هذا القطع مستقيما وموازيا للطرف قدر الإمكان ؛ قد تتطلب إعادة وضع العين وضع المقص واستخدام زوج واحد من الملقط مع كل يد. بمجرد تعرضها ، حافظ على شبكية العين مغمورة طوال فترة التشريح.
- أدخل شفرة واحدة من مقص الزنبرك داخل الكرة الأرضية وابدأ في القطع حول العين بشكل دائري ، وأعد وضع العين برفق حسب الحاجة باستخدام الملقط.
- بمجرد أن يحد الجرح العين ، قم بإزالة الجزء الأمامي والعدسة بعناية ، ثم قم بتدوير واقية العين لمواجهة لأعلى لتسهيل الفحص البصري وإزالة الجسم الزجاجي. إذا بقيت قطعة ممتدة من العصب البصري متصلة ، فقم بقصها إلى طول أقصر (1-2 مم) لتسهيل ذلك.
- افحص شبكية العين بحثا عن تلف مرئي والغرفة الزجاجية بحثا عن الحطام ، مثل الخلايا المصطبغة من RPE أو المشيمية التي قد تكون قد دخلت أثناء إزالة الجزء الأمامي. استخدم ملقطا مائلا لتثبيت واقية العين في هذا الوضع.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، يجب إزالة الحطام في الغرفة الزجاجية ، ويجب تقليل بقايا الجسم الزجاجي والملتصق المتبقية من الجسم الهدبي في محيط الشبكية. يمكن أن تكون هذه عملية صعبة ، ويمكن العثور على ملاحظات إضافية في قسمي "التعرف على الإصابة الميكانيكية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها" و "إصابة التمثيل الغذائي" في النتائج التمثيلية.- استخدم ماصة النقل المعدلة لشطف الغرفة الزجاجية باستخدام PBS لإزالة حطام الجسيمات الصغيرة، وتجنب فقاعات الهواء عن طريق إبقاء طرف الماصة أسفل سطح السائل والحفاظ على كمية كافية من PBS في لمبة الخزان.
- قم بإزالة الحطام الأكبر حجما بفرشاة ألوان مائية ناعمة ، مما يقلل من ملامسة سطح الشبكية. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الحطام الأكثر ثباتا باستخدام ملقط ناعم الرؤوس ؛ ومع ذلك ، تجنب الاتصال المباشر بأطراف الأدوات المعدنية بشبكية العين لمنع التلف.
- بعد إزالة الحطام المرئي ، اغسل الغرفة الزجاجية باستخدام PBS من ماصة النقل بشكل متكرر (3-5 مرات) ، كما هو موضح أعلاه. سيؤدي ذلك إلى إزالة الجسم الزجاجي اللاصق بشكل فضفاض والذي قد يبقى بعد إزالة الحطام. استخدم الفرشاة الدقيقة لفحص الغرفة برفق ، خاصة بالقرب من المحيط إذا بقيت عناصر من الجسم الهدبي. في حين أن الجسم الزجاجي شفاف بصريا ، إلا أنه سيكون بمثابة سحب على ألياف الفرشاة ويمكن اكتشافه بهذه الطريقة.
ملاحظة: لا يبدو أن الطبقة الرقيقة المتبقية من الجسم الزجاجي على شبكية العين تؤثر سلبا على عزل شبكية العين أو الحفاظ عليها خارج الجسم الحي، ولكن وجود كميات كبيرة في محيط الشبكية، والتي غالبا ما ترتبط بالهياكل المتبقية من الجسم الهدبي، يمكن أن يتسبب في طي الشبكية وفقدان العينة إذا لم تتم إزالتها.- إذا بقيت جيوب كبيرة من الجسم الزجاجي ، فاستخدم الفرشاة لإزالتها عن طريق الكنس برفق للخارج باتجاه المحيط ، مع التأكد من أنه إذا لامست ألياف الفرشاة شبكية العين ، فإنها تفعل ذلك من زاوية ضحلة وتعقب الفرشاة ، وتسحب الجسم الزجاجي بدلا من دفعه من الغرفة.
ملاحظة: تتطلب إزالة الجسم الزجاجي معالجة دقيقة بشكل خاص لتجنب تلف الشبكية الذي قد لا يكون مرئيا مجهريا. تم العثور على المشورة حول التعرف على هذا الضرر وتجنبه في قسمي "التعرف على الإصابة الميكانيكية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها" و "إصابة التمثيل الغذائي" في النتائج التمثيلية.
- إذا بقيت جيوب كبيرة من الجسم الزجاجي ، فاستخدم الفرشاة لإزالتها عن طريق الكنس برفق للخارج باتجاه المحيط ، مع التأكد من أنه إذا لامست ألياف الفرشاة شبكية العين ، فإنها تفعل ذلك من زاوية ضحلة وتعقب الفرشاة ، وتسحب الجسم الزجاجي بدلا من دفعه من الغرفة.
- بمجرد تنظيف الغرفة الزجاجية من الحطام وبقايا الحد الأدنى من الجسم الزجاجي فقط ، افصل الشبكية الخارجية برفق عن كوب العين مع الاستمرار في تثبيت العينة باستخدام ملقط بزاوية. تجنب إتلاف رأس العصب البصري واترك هذا الهيكل سليما لتثبيت شبكية العين.
- خذ زوجا من الملقط ، واحتفظ به في وضع مغلق مع ملامسة الأطراف ، وأدخله برفق بين شبكية العين والمشيمية ، باستخدام فجوة موجودة مسبقا من المناولة السابقة إن أمكن. استخدم الأذرع المسطحة للملقط ، بدلا من الأطراف ، لتكبير الجيب بين شبكية العين والمشيمية حتى يمكن فصل هذه الهياكل تماما.
ملاحظة: التأكيد على الحركات الجانبية ، بدلا من دفع الأطراف ، لتوسيع الفجوة بين شبكية العين والمشيمية. يمكن أن يؤدي لف الملقط برفق أثناء هذه الحركات إلى تحسين الفصل مع تقليل الضغط الشديد الناتج عن الاحتكاك بين الملقط والأنسجة.
- خذ زوجا من الملقط ، واحتفظ به في وضع مغلق مع ملامسة الأطراف ، وأدخله برفق بين شبكية العين والمشيمية ، باستخدام فجوة موجودة مسبقا من المناولة السابقة إن أمكن. استخدم الأذرع المسطحة للملقط ، بدلا من الأطراف ، لتكبير الجيب بين شبكية العين والمشيمية حتى يمكن فصل هذه الهياكل تماما.
- بعد فصل الشبكية الخارجية عن المشيمية ، استمر في تثبيت العينة أثناء استخدام زوج ثان من الملقط لسحب واقية العين - الصلبة ، المشيمية ، إلخ. - لأسفل. إذا تم فصل شبكية العين بنجاح ، فيجب أن تظل في مكانها ، مربوطة برأس العصب البصري ، بينما يمكن تثبيت كوب العين بواسطة زوج واحد من الملقط. إذا ضغطت شبكية العين لأسفل باستخدام قطعة العين ، فاستمر في فحص نقاط الاتصال وفصلها برفق بخلاف رأس العصب البصري.
- مع تثبيت شبكية العين في رأس العصب البصري ، استمر في تثبيت الأنسجة واستخدم الزوج الثاني من الملقط لتجميع كوب العين أسفل رأس العصب البصري.
- تحقق للتأكد من عدم وجود أي من محيط الشبكية في وضع مطوي بسبب الجسم الزجاجي الزائد في الزاوية بين الشبكية وأي جسم هدبي متبقي. إذا لزم الأمر ، اغسل الغرفة باستخدام PBS باستخدام ماصة النقل لإزالة أي حطام إضافي ، واستخدم الفرشاة برفق لفك الأنسجة والتخلص من الجسم الزجاجي الزائد ، مع الحرص على عدم شد الأنسجة بشكل مفرط.
- مع تعرض شبكية العين من كلا الجانبين ، استخدم مقص الزنبرك لعمل سلسلة من الجروح المخففة ، متباعدة بزاوية 90 درجة تقريبا ، وتمتد في خط مستقيم من المحيط باتجاه رأس العصب البصري ، وتتوقف على بعد حوالي 1 مم من المركز. هذا يقلل من استقطاع محاور الخلايا العقدية الشبكية في شبكية العين ، مما يحسن جودة المستنبتات المستزرعة.
- أثناء تثبيت الأنسجة المغمورة في مكانها ، قم بإزالة منديل المختبر برفق باستخدام ملقط لسحبه بعيدا عن الأنسجة بشكل جانبي قبل إزالته من الطبق. تجنب ملامسة الشبكية لمنع الالتصاق بالمناديل وفقدان العينة المحتمل.
- بعد ذلك ، استمر في إمساك الأنسجة واستخدم المقص الزنبركي لقطع العصب البصري أسفل الشبكية مباشرة ، ثم قم بإزالة ما تبقى من كوب العين من الطبق.
- بمجرد عزل شبكية العين عن بقية العين ، املأ طبق بتري مقاس 35 مم ب PBS واستخدم الملقط لوضع مربع مرشح في الأسفل بحيث يكون الجانب غير اللامع متجها لأعلى. احرص على تجنب تجعد الفلتر ، لأنه قد يعيق استخدام الفلتر كركيزة لتحريك شبكية العين.
- قم بسحب شبكية العين برفق باستخدام ماصة النقل وانقلها بعناية إلى طبق 35 مم. قم بمناورة شبكية العين بالفرشاة للتأكد من أن السطح الداخلي لشبكية العين في وضع مستقيم ، وأن الأنسجة تقع مباشرة فوق مربع المرشح.
- قم بشفط PBS ببطء من الطبق باستخدام ماصة النقل لخفض شبكية العين على الفلتر. توقف مؤقتا ، إذا لزم الأمر ، لإعادة ضبط الأنسجة قبل المتابعة حتى تستقر شبكية العين على الفلتر.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي الشفط السريع إلى حركة جانبية مفاجئة لشبكية العين ، مما يؤدي إلى تلف أو فقدان الأنسجة. يجب أن تستقر شبكية العين بأكملها على المربع لتجنب التلف. ومع ذلك ، إذا استقرت شبكية العين في وضع إشكالي ، فيمكن إضافة PBS مرة أخرى إلى الطبق حتى يتم تعليق شبكية العين ، ويمكن إعادة محاولة التركيب. - بمجرد أن تستقر شبكية العين على الفلتر ، استخدم الفرشاة لفتح أي شبكية محيطية قد تكون مطوية. قم بموازنة مستوى PBS بعناية حتى لا تتحرك شبكية العين بسهولة من المرشح مع التأكد من بقاء ما يكفي حتى لا تجف العينة ويمكن للفرشاة أن تتحرك بسلاسة دون الإضرار بالشبكية الداخلية.
- مرة أخرى افحص شبكية العين بحثا عن الحطام. لتجنب التلف ، قم بتنظيف شبكية العين دون التعامل المباشر باستخدام ماصة النقل لتقطير PBS على شبكية العين من حوالي 1 سم فوق الأنسجة. يجب أن يؤدي ذلك إلى التخلص من أي حطام متبقي ، ولكن إذا تمت إضافة الكثير من PBS إلى الطبق ، فقد تطفو شبكية العين مرة أخرى. إذا حدث هذا ، فقم بإجراء الشفط مرة أخرى لإعادة تركيب الأنسجة.
ملاحظة: يمكن إنشاء عينات "الشام" عن طريق نقل شبكية العين إلى صفيحة مكونة من 24 بئرا للتثبيت ، والحظر / النفاذية ، وتلوين الأجسام المضادة كما هو موضح في مكان آخر21. هذه الضوابط الوهمية مفيدة لاستكشاف أخطاء الشبكية وإصلاحها التي قد تحدث أثناء العزل.
3. النقل إلى وسائل الإعلام الثقافية والصيانة
- أغلق غطاء الطبق مقاس 35 مم لنقله إلى خزانة السلامة الحيوية ، مع الحفاظ على مستوى الطبق لتجنب إزاحة شبكية العين من الفلتر. إذا حدث هذا ، فأعد التركيب على النحو الوارد أعلاه.
- ضع الطبق المغلق مقاس 35 مم الذي يحتوي على شبكية العين في خزانة السلامة الحيوية ، مع الحرص على عدم لمس أي معدات أو أسطح داخل الخزانة قبل تطهير القفازات أو تغييرها.
- قم بتطهير القفازات بالإيثانول و / أو استبدالها ، ثم انقل اللوحة المكونة من 6 آبار المحملة مسبقا بوسائط الزرع من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية. قم بتنفيذ الخطوتين 3.4 و 3.5 داخل خزانة السلامة البيولوجية ، باستخدام الأدوات الموضوعة هناك أثناء الخطوة 1.1.
- قم بإزالة غطاء الطبق مقاس 35 مم الذي يحتوي على شبكية العين واستخدم ملقطا مائلا لرفع مربع المرشح بعناية دون لمس شبكية العين مباشرة. قم بإزالة غطاء اللوحة المكونة من 6 آبار وضع الفلتر فوق منتصف إدخال البئر المناسب ، ثم قم بخفضه ببطء في الوسائط. ستنفصل شبكية العين عن المرشح أثناء هذه الخطوة وتطفو أسفل واجهة الهواء السائل مباشرة.
- بمجرد انفصال الشبكية والفلتر ، حرك الفلتر ببطء بعيدا عن شبكية العين وقم بإزالته من الوسائط. باستخدام الماصة سعة 1 مل ، قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسائط من الملحق للتأكد من أن شبكية العين مسطحة عن طريق حبسها بين أرضية الملحق وواجهة الهواء السائل.
- استبدل الغطاء الموجود على اللوحة وأعده إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، مع الحرص على إبقاء شبكية العين بالقرب من مركز البئر. يمكن الاحتفاظ بما يصل إلى 6 شبكية العين في طبق واحد.
ملاحظة: في حالة الاحتفاظ بالنباتات الخارجة لمدة 24 ساعة أو أقل ، يمكن تركها في الحاضنة حتى نهاية التجربة. إذا تم الاحتفاظ بها لفترات أطول ، يوصى بتغيير الوسائط بنسبة 50٪ بعد يوم واحد في المختبر وفي أيام متناوبة بعد ذلك.
4. تثبيت التلوين المناعي (اختياري)
- في حالة إجراء تلطيخ مناعي ، راجع الخطوات التالية للتثبيت ؛ بينما يمكن إجراء التلوين المناعي باستخدام المعلمات المفصلة مسبقا لشبكية العين21 المسطحة ، فإن تثبيت شبكية العين المزروعة يتطلب اعتبارات محددة.
- قم بإزالة إدخالات زراعة الخلايا مع النباتات الخارجية والوسائط من لوحة الثقافة المكونة من 6 آبار وضعها على سطح غير مسامي (مثل الغطاء البلاستيكي للوحة الثقافة) يمكن التخلص منه بشكل صحيح بعد التثبيت ، حيث أن الإدخالات مسامية قليلا وستمر كميات صغيرة من المثبت إلى هذا السطح الأساسي.
- قم بإزالة وسائط المزرعة برفق من الحشوات، ثم أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى كل منها. دع شبكية العين تثبت لمدة 15 دقيقة في غطاء الدخان ، ثم قم بإزالة PFA وتخلص منها وفقا للسياسة المؤسسية.
تنبيه: بارافورمالديهايد خطير ومقدمة للفورمالديهايد ، وهو مادة مسرطنة معروفة. توخي الحذر وقم بالتثبيت في غطاء الدخان مع الاحتياطات المناسبة. - اغسل شبكية العين 3 مرات (لمدة 5 دقائق لكل منهما) باستخدام PBS لإزالة PFA ، ثم استخدم ماصة نقل معدلة لنقل شبكية العين في PBS إلى آبار فردية في صفيحة مكونة من 24 بئرا للانسداد والنفاذية والتلوين المناعي كما هو موضح في مكان آخر21. تخلص من المواد البلاستيكية الملوثة ب PFA (أطراف الماصة ، والإدخالات ، والسطح غير المسامي المستخدم أثناء التثبيت) وفقا للسياسة المؤسسية.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بأنبوب النقل لنقل شبكية العين الثابتة والملطخة إلى شريحة للتركيب والتصوير. على الرغم من أنه لا ينبغي أن يكون له اتصال مباشر مع PFA ، يوصى باستخدام ماصات نقل مختلفة للتعامل مع الأنسجة الحية والثابتة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
على المقياس العياني ، تظل شبكية العين المزروعة دون تغيير بشكل أساسي في كل من النقاط الزمنية لمدة 1 و 3 أيام ، على الرغم من أنها بحلول الوقت الأخير تصبح هشة نسبيا ، مما يستلزم معالجة دقيقة قبل التثبيت أو نقاط النهاية التجريبية الأخرى. يجب أن تكون شبكية العين مسطحة نسبيا ، دون طي (مما قد يؤدي إلى اضطراب موضعي في انتشار الأكسجين والمواد المغذية) ، ويجب تعليقها في الوسائط بين واجهة الهواء والسائل وإدخال ثقافة الخلية. بحلول اليوم 3 ، قد يتشكل خط باهت في الجزء السفلي من الإدخال أسفل الأنسجة المعلقة. يشير الفحص باستخدام الفحص ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تسخر مقاربات الثقافة العضوية32 مثل الشبكات المستخرجة الشبكية المرونة التجريبية ووقت الاستجابة السريع لزراعة الخلايا مع الحفاظ على الكثير من السياق في الموقع للدراسات في الجسم الحي ، مما يجعلها وسيلة قوية للتحقيق في التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا. نقدم هذا البروتوكول كنقطة دخول للباحثين الذين قد يكون لديهم خبرة كبيرة في العين ويكونون مرتاحين للتلاعب بشبكية العين الثابتة ولكن ليس واحدة جديدة. لذلك ، ركزنا على تقليل التحديات التقنية والتباين ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم M.A.M. من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NEI R01EY035312 ، ومؤسسة أبحاث الجلوكوما محفز للعلاج ، ومؤسسة ميلزا إم وفرانك ثيودور بار ، وروبرت إم سينسكي ، دكتوراه في الطب ، ومؤسسة عائلة روتجرز الخيرية ، ومؤسسة بي إل مانجر. P.F.C. تم دعمه من قبل NIH / NEI 2T32EY007145. تم تمكين هذا العمل أيضا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة الأساسية لأبحاث الرؤية P30 EY003176. تم إنشاء الشكل 1 باستخدام Biorender. يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور ناصر الدين على ملاحظاتهم على المخطوطة والدكتور كيورونغ تشو على المساعدة والدعم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 11 شفرات مشرط | Bard-Parker | 3،71،311 | |
| 1 مل ماصة ("Pipetman P1000") | جيلسون | F144059M | |
| بتري 100 مم | فالكون | 351029 | |
| 16٪ بارافورمالدهيد | تيد بيلا 18 | ،505 | مخفف إلى 4٪ للتثبيت |
| 24 353047 صقر لوحة البئر | للتثبيت والحجب و حضانة الأجسام المضادة | ||
| 35 مم طبق بتري | فالكون | 351008 | |
| صفيحة 6 آبار ومجموعة إدراج | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H + L) Jackson | ImmunoResearch Laboratories، Inc. | 711-545-152 | 1:800 التخفيف |
| Alexa Fluor 594 الحمار المضاد للفئران IgG (H + L) امتصاص عالي المعبر | Invitrogen | A-21209 | 1:800 تخفيف |
| Alexa Fluor 594-F (ab') 2 الحمار المضاد للفأر IgG (H + L) ؛ | مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية ، Inc. ؛ | 715-586-150 | 1: 800 تخفيف |
| Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | 1:800 تخفيف |
| Alexa Fluor 647-F (ab') 2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H + L) | مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية ، Inc. ؛ | 703-606-155 | 1: 800 تخفيف |
| ملقط بزاوية ('5/45') FST | / Dumont | 11251-35 | |
| الجسم المضاد المضاد ل Brn3a (الفأر) | Chemicon | MAB1585 | 1: 200 |
| التخفيف المضاد ل CD206 (الفئران) | Biorad | MCA2235 | 1: 200 |
| التخفيف المضاد ل GFAP (الدجاج) | Abcam | ab4674 | 1: 1000 التخفيف |
| المضاد ل Iba1 الأجسام المضادة (الأرنب) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | 1: 500 التخفيف |
| المضاد للجسم المضاد Tmem119 (خنزير غينيا) | أنظمة متشابكية | 400 004 | 1: 500 التخفيف |
| B-27 ، 50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| ملقط منحني حاد ("Extra Fine Graefe) FST | 11152-10 | ||
| مصل الأبقار الألبومين | سيجما ألدريتش | A9647 | استخدم 1٪ وزن / حجم للحجب وحضانة الأجسام المضادة |
| طقم الفلتر (0.2 & micro; م غشاء aPES ، 150 مل مرشح أعلى للزجاجة) ؛ | FB12566508 | فيشر ساينتفكيد | |
| فاين ، مقاس 3/0 | شركة برينستون آرت آند برش | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (Thermofisher) | 35050061 | |
| مناديل مختبرية (مناديل كيم) | KIMTECH | 34155 | |
| N-2 ، 100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobasal-A متوسط ، ناقص الفينول الأحمر | Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| مصل الحمار العادي | Jackson ImmunoResearch Laboratories، Inc. ؛ | 017-000-121 | استخدم بنسبة 10٪ لحضانة الأجسام المضادة |
| البنسلين والستربتومايسين | جيبكو (الرصيد الحراري) | 15140122 | |
| أطراف الماصة ، 1000 وميكرو ؛ L | TipOne | 1126-7810 | |
| مقص زنبركي ("كوهان فاناس") FST | 15000-11 | ||
| ماء معقم ("دناز ، خالي من الرنيز") | Invitrogen | 10977-015 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| ملقط مستقيم ("صغير") | FST / Dumont | 11200-14 | |
| Transfer Pipet ، 5.8 مل | فيشر ساينتاليك | 13-711-9AMMD | |
| تريتون X-100 | كيماويات علمية حرارية | A16046. AP | استخدم بنسبة 0.5٪ للحجب وحضانة الأجسام المضادة |
المراجع
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
- Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
- Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
- Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
- Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
- Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
- Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
- Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
- Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
- Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
- Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
- Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
- Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
- Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
- Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
- Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
- Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
- Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
- Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
- Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
