مقالة منهجية

تسجيلات مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية عالية الكثافة لموجات الشبكية باستخدام منصة الفيزيولوجيا الكهربية

DOI:

10.3791/68493

⸱

يونيو 24, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Brain Institute, Vanderbilt University, 3Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية عالية الكثافة (HD-MEAs) لدراسة موجات الشبكية التلقائية ، والتي تلعب دورا مهما في تطوير الدوائر العصبية. يحدد هذا البروتوكول خطوات تحضير أنسجة شبكية العين في الفئران وإجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية باستخدام HD-MEAs على منصة الفيزيولوجيا الكهربية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد موجات الشبكية العفوية سمة مميزة لنشاط شبكة الشبكية أثناء التطور ، وتلعب دورا مهما في تكوين النظام البصري من خلال التأثير على صقل المحاور ، ونفاذية الأوعية الدموية ، والنضج العام للدوائر العصبية. تتم دراسة هذه الموجات بشكل شائع في مستحضرات الشبكية خارج الجسم الحي باستخدام مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية (MEAs) ، والتي تتيح التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لمجموعات كبيرة من نشاط الخلايا العقدية الشبكية (RGC). أصبح الفيزيولوجيا الكهربية المستندة إلى الشرق الأوسط وأفريقيا أداة قوية نظرا لسهولة استخدامها لجمع البيانات عالية الإنتاجية بسرعة ، مما يجعلها مناسبة بشكل مثالي لدراسة نشاط الشبكية في مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية.

في هذا البروتوكول ، نحدد الخطوات الحاسمة لإعداد أنسجة الشبكية للحصول على البيانات الفيزيولوجية الكهربية باستخدام MEA عالي الكثافة (HD-MEA) على منصة الفيزيولوجيا الكهربية. تبدأ العملية بالعزل الدقيق لشبكية العين السليمة عن حديثي الولادة في ظل ظروف فسيولوجية. بمجرد التحضير ، يتم تثبيت شبكية العين بعناية على شريحة HD-MEA ، والتي تتكون من شبكة من 26,400 قطب كهربائي قادرة على إجراء تسجيلات متزامنة خارج الخلية من 1,000 RGCs على الأقل. في النهاية ، يقدم هذا النهج المنهجي تطبيقات قيمة في التحقيق في تطور الشبكية ، والمرض ، والدراسات المقارنة المحتملة عبر الأنواع ، مما يساهم في التقدم الأوسع في علم الأعصاب وأبحاث الرؤية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

موجات الشبكية العفوية هي رشقات نارية دورية من النشاط المرتبط لوحظ في شبكية العين النامية قبل بداية الرؤية. في الفئران ، تتغير الدوائر التي تبدأ وتنشر موجات الشبكية بسرعة أثناء التطور ، وتبدأ جنينا وتنتهي عند فتح العين (يوم ما بعد الولادة 14) 1. مع تطور دوائر الشبكية ، تتغير الخصائص الزمانية المكانية لموجات الشبكية بشكل كبير2،3. تدعم العديد من الدراسات أن هذه الخصائص الزمانية المكانية المحددة توجه تطوير النظام البصري: النشاط غير المتزامن بين العينين يوجه الفصل الخاص بالعين4 ، وحجم منطقة الموجة يوجه إلى صقل محاور الشبكية في مناطق الدماغ المجهرية5،6 ، وقد تورط اتجاه انتشار الموجات لتوجيه دوائر انتقائية الاتجاه في القولون العلوي3. خارج الدوائر العصبية ، تكون موجات الشبكية مسؤولة عن تطور نفاذية الأوعية الدموية7. بالإضافة إلى ذلك ، تم اكتشاف أن موجات الشبكية في المرحلة الثانية تتحكم في نمو مناطق المجال الاستقبالي وتثبيتها في الخلايا العقدية الشبكية (RGCs) 8. بشكل حاسم ، يمكن أن تكون موجات الشبكية الشاذة أثناء التطور أساسا لاضطرابات النمو العصبي المختلفة ، وفي الواقع ، تكون موجات الشبكية غير طبيعية في نموذج الفأر من الرأرأة الخلقية3. نظرا لدورها الحاسم في تطور النظام البصري المبكر والآثار المترتبة على المرض ، هناك حاجة لتسجيل الديناميكيات الزمانية المكانية لموجات الشبكية في أي عمر وفي أي نموذج حيواني.

ظهرت عدة طرق لدراسة موجات الشبكية. أدى كل من الفيزيولوجيا الكهربية أحادية الخلية9،10 وتصوير الكالسيوم11،12،13،14،15 إلى نتائج أساسية حول الدوائر ووظيفة موجات الشبكية. هنا ، نركز على تسجيلات مصفوفة الأقطاب الكهربائية المتعددة (MEA) ، وهي طريقة تم استخدامها منذ التحقيق المبكر لموجات الشبكية16 واستمرت في التحسن كتقنية2. تتيح الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التسجيل المتزامن خارج الخلية لإمكانات الفعل من مئات إلى آلاف RGCs ، مما يسمح للباحثين بتتبع بدء الموجة وانتشارها وإنهائها بشكل مشابه لما هو ممكن مع تصوير الكالسيوم. نظرا لأن الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تسجل بشكل مباشر إمكانات الفعل من RGCs ، يمكن استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة لدراسة نماذج الفئران الجينية المختلفة أو الكائنات الحية غير النموذجية دون التعقيد الإضافي المتمثل في إدخال مؤشر الكالسيوم. يمكن أيضا زراعة الأنسجة مباشرة في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا، مما يتيح أوقات تسجيل طويلة جدا. كما أن الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف قابلة للتطوير بدرجة كبيرة، حيث تتيح المنتجات الحالية ما يصل إلى ستة اتفاقات متوسطة ومتوسطة نشطة في وقت واحد، مما يمكن أن يتيح التقييم السريع لشبكية العين ويحفز اكتشاف الأدوية. ولعل أكبر قوة للمناطق المتعددة الأطراف هي قدرتها على أخذ عينات من العديد من الخلايا بمعدل أخذ عينات مرتفع، مما يمكن المختبرات في جميع أنحاء العالم من الحصول بسرعة على مجموعات بيانات غنية ولكنها تتطلب خبرة في المعالجة اللاحقة.

الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير بروتوكول مفصل وقابل للتكرار لإعداد أنسجة الشبكية وإجراء تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية باستخدام نظام MEA عالي الكثافة (HD-MEA) أحادي البئر لدراسة موجات الشبكية التلقائية خارج الجسم الحي. تضمن هذه الطريقة الحصول على بيانات عالية الإنتاجية وطويلة الأمد ، مما يجعلها مناسبة لمجموعة واسعة من الدراسات التنموية والمتعلقة بالأمراض. يوفر نظام HD-MEA المتقدم الجديد القائم على CMOS ، والذي يسمح ب >1,000 موقع قطب كهربائي في وقت واحد ، العديد من المزايا مقارنة بأساليب الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية. تتيح مصفوفة الأقطاب الكهربائية عالية الكثافة (26,400 قطب) تسجيلات دقيقة ومتزامنة خارج الخلية من ما يصل إلى 1,012 RGCs ، والتقاط أنماط النشاط المكاني على نطاق دقيق. يوفر تصميم البئر الفردي ظروف تسجيل موحدة17. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح هذا النظام بتسجيلات طويلة المدى تستمر لعدة ساعات ، مما يجعل من الممكن دراسة ديناميكيات الموجات في ظل ظروف فسيولوجية ودوائية مختلفة دون تدهور كبير في الإشارة18. من خلال توفير بروتوكول ، تهدف هذه الدراسة إلى جعل تقنية HD-MEA في متناول جمهور أوسع من الباحثين في علم الأعصاب وطب العيون وعلوم الرؤية. تمثل هذه الطريقة خطوة مهمة إلى الأمام في دراسة موجات الشبكية ، وتوفر طرقا جديدة لدراسة التطور المبكر للنظام البصري ، وآليات المرض ، والتدخلات العلاجية المحتملة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول خطوات عزل وإعداد أنسجة الشبكية من الفئران حديثي الولادة لتسجيلات MEA لموجات الشبكية باستخدام منصة Maxwell Biosystems HD-MEA. تم تصميم الإجراء للحفاظ على الظروف الفسيولوجية ، وضمان بقاء أنسجة الشبكية سليمة من الناحية الهيكلية ، وخالية من التلف ، وإعدادها بشكل صحيح للتلامس الأمثل مع القطب. تمت الموافقة على هذه التجارب من قبل برنامج فاندربيلت لرعاية واستخدامها ، بموجب البروتوكول رقم M2200056-00. تم إيواء الفئران (1-2 أسبوع ، كلا الجنسين) في دورة نهارية / ليلية لمدة 12 ساعة وأطعمت نظاما غذائيا منتظما.

1. تحضير أنسجة الشبكية

  1. عزل شبكية العين
    ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المواد والمعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول (انظر أيضا الشكل 1).
    1. إعداد مساحة العمل
      1. تحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF): 125 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد كلوريد ، 1.25 ملي هيدروجينهيدروجيني 2PO4 ، 26 ملي NaHCO3 ، 2 ملي كلوريد المكالسيوم2 ، 1 ملي ملي كلوريد2 ، 10 ملي مولار جلوكوز ، فقاعات مع الكربوجين: 95٪ O2/5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 (درجة الحموضة 7.4 ، الأسمولية 290 ± 10 ملي أسم) وتخزينها عند 5 درجات مئوية. احتفظ ب aCSF على الجليد أثناء تزويده بالأكسجين لمدة 10 دقائق قبل التشريح.
        ملاحظة: يجب إضافة CaCl2 أخيرا ، بعد أن يتم غلي المحلول بالكربوجين لمدة 10 دقائق.
      2. ابدأ بأكسجة aCSF الطازج المثلج (لمدة 10 دقائق على الأقل).
      3. قم بإعداد أدوات التشريح والمجهر.
    2. قتل رحيما وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
    3. استئصال العينين باستخدام مقص زنبركي منحني-
      1. نظرا لأن صغار ما بعد الولادة قد أغمضت عينيها حتى P11-13 (في الفأر) ويجب فتح الجفون بعناية ، استخدم ملقطا دقيقا لإمساك الجفون والمقص الزنبركي لإزالتها. أخرج العينين بعناية باستخدام مقص زنبركي ، وتجنب تلف العين.
      2. قطع العصب البصري ووضع العينين في aCSF المؤكسج. استخدم ماصة النقل لتحريك العين برفق بين أطباق بتري.
        ملاحظة: بالنسبة لبقية بروتوكول التشريح ، قم بالتحديث باستخدام aCSF المؤكسج كل 10 دقائق.
    4. تحت مجهر التشريح ،
      1. قم بعمل شق صغير في القرنية باستخدام إبرة مع تثبيت العين بالملقط.
      2. تشريح القرنية بصراحة عن طريق التمزيق برفق على طول محيط الصلبة.
      3. قم بإزالة القزحية والعدسة. إذا كانت شبكية العين متصلة بالعدسة في الصغيرة ، فافصلها برفق باستخدام الملقط.
        ملاحظة: في الصغيرة ، يتم ربط شبكية العين أحيانا بالعدسة. استخدم الملقط لسحب العدسة برفق من شبكية العين باستخدام زوج واحد من الملقط لسحب العدسة والآخر يستقر على الحواف الخارجية لشبكية العين للحفاظ على الشبكية في مكانها أثناء إزالة العدسة.
    5. توجيه الشبكية.
      1. حدد الجانب البطني باستخدام النسيج المشيمي (انظر Sondereker et al.19 للحصول على بروتوكول مفصل حول التوجيه) وضعه في مواجهة الباحث مع توجيه طبقة RGC لأعلى.
      2. استخدم مشرطا منحنيا لعمل قطع مرجعي بزاوية 45 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة من المحور البطني.
      3. باستخدام ملقط دقيق، افصل الشبكية برفق عن ظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) والصلبة.
        ملاحظة: في الفئران الأصغر سنا ، يتقشر RPE بسهولة من شبكية العين. في الفئران الأكبر سنا ، يكون RPE أكثر ارتباطا بشبكية العين. إذا كان RPE لا يزال مثبتا في شبكية العين عبر العصب البصري بعد إزالة RPE من غالبية شبكية العين ، فاستخدم مقصا زنبركيا لقطع هذا الاتصال. هذا يمنع تلف أنسجة الشبكية بالقرب من العصب البصري.
    6. لا تحتوي شبكية العين حديثي الولادة على جسم زجاجي تقريبا ، لكن شبكية العين القديمة تفعل ذلك (تظهر على شكل خيوط بنية على طول حافة شبكية العين ، لكن الألياف تتصل ببعضها البعض داخل الخلط الزجاجي أيضا). باستخدام الملقط الناعم ، قم بإزالة الأنسجة الزجاجية الموجودة فوق طبقة RGC.
      ملاحظة: هذه الطبقة الليفية تنفصل أحيانا عند إزالة العدسة. إذا لم يحدث ذلك ، فمن المهم إزالة أكبر قدر ممكن منه ، أو سيمنع الاتصال السليم ل RGCs بأقطاب كهربائية.
    7. باستخدام مشرط ، قم بعمل أربع جروح إغاثة لمساعدة شبكية العين على الاستلقاء بشكل مسطح في الطبق. لمعرفة الاتجاه والحفاظ عليه لاحقا ، قم بقص زاويتين من الربع البطني بمشرط.

2. تركيب شبكية العين على شريحة MEA

  1. تركيب شبكية العين-
    1. انقل شبكية العين برفق من طبق بتري إلى شريحة MEA باستخدام ماصة النقل مع قطع الطرف. تأكد من وجود ما يكفي من aCSF في الرقاقة لتغطية قاع البئر.
    2. استخدم فرشاة الشعر الفردي لمناورة شبكية العين برفق ليتم وضعها فوق الأقطاب الكهربائية ، وطبقة RGC المواجهة للأقطاب الكهربائية.
    3. باستخدام ماصة 10 ميكرولتر، قم بإزالة aCSF الزائد برفق حول أنسجة الشبكية. قم بإمالة الشريحة بزاوية للتخلص من aCSF الإضافي.
      ملاحظة: لا تلمس أبدا الأقطاب الكهربائية أو مكبرات الصوت بطرف الماصة. عند إزالة aCSF ، سوف تتسطح شبكية العين أكثر. إذا تم طي أي جزء من شبكية العين تحت نفسه، فاستخدم فرشاة الشعر الواحد لوضعها برفق تحت النشرة المرغوبة لفتحها. لمنع شبكية العين من الحركة أثناء فتح أي جزء من الوريقات ، يمكن استخدام فرشاة ثانية أحادية الشعر لتطبيق ضغط لطيف في وسط شبكية العين ، حيث يتصل العصب البصري.
    4. جفف البئر قدر الإمكان عن طريق إمالة الشريحة بزاوية 45 درجة وإزالة آخر aCSF الذي يتجمع في الجزء المائل من الشريحة.
      ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى زيادة الاتصال بين شبكية العين والأقطاب الكهربائية.
    5. استخدم ورق الترشيح لتربيت حواف شبكية العين وتجفيفها برفق. ضع شريحة MEA في غرفة التسجيل.
  2. تعزيز ملامسة القطب-
    1. استخدم ملحق حامل مناديل قابل للاستبدال لدفع شبكية العين برفق على الأقطاب الكهربائية ، مما يضمن الاتصال الأمثل وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
      ملاحظة: يجب أن يتوقف إدخال حامل المناديل عن الخفض بمجرد ملامسته لشبكية العين (ستظهر "بقعة مبللة" واضحة عند نقطة التلامس). يؤدي الخفض الإضافي لحامل القطب الكهربائي إلى إتلاف أنسجة الشبكية. الانتقال بسرعة من الخطوة 2.1.4 إلى 2.2.1 لتقليل المدة التي تبقى فيها شبكية العين بدون aCSF المؤكسج ؛ هذه الخطوة حاسمة ويجب إكمالها بأسرع ما يمكن. من المهم التحرك بسرعة عند تسطيح شبكية العين على الشريحة ، ومع ذلك ، من المهم أيضا تجفيف معظم aCSF من التشريح حتى تتلامس شبكية العين بشكل جيد مع القطب. يؤدي السير بسرعة كبيرة لوضع شبكية العين تحت الأكسجين إلى عدم الاتصال الجيد بأقطاب التسجيل ، كما أن السير ببطء شديد يخاطر بإصابة خلايا الشبكية بنقص الأكسجين والموت. نجد أن 30-60 ثانية تؤدي إلى اتصال جيد وشبكية العين صحية (أي نلاحظ موجات الشبكية النموذجية).
    2. باستخدام نظام التروية المشار إليه ، ابدأ في ملء شريحة MEA جيدا ب aCSF المؤكسج بمعدل تدفق 2 مل / دقيقة.
      ملاحظة: يوصى باستخدام نظام نضح مفتوح ، حيث تظل الضوضاء الكهربائية منخفضة وتوفر aCSF جديدا لشبكية العين. تأكد من توصيل نظام تسخين مدمج بإعداد التروية لتسخين aCSF للظروف الفسيولوجية.
    3. قم بتشغيل السخان المضمن لنظام التروية لتسخين aCSF إلى 32-34 درجة مئوية.

3. التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية

  1. التسجيلات خارج الخلية-
    1. قم بتشغيل نظام التسجيل.
    2. على كمبيوتر الاكتساب ، انقر نقرا مزدوجا أولا على أيقونة الخادم ثم على النطاق لفتحه.
    3. انقر فوق أيقونة التهيئة في واجهة النطاق وأدخل معرف شريحة MEA لبدء التسجيلات خارج الخلية باستخدام نظام MEA.
    4. انقر فوق أيقونة الإزاحة في واجهة النطاق لإعداد الإزاحة.
    5. اضبط إعدادات الكسب والتصفية لتحسين اكتشاف الإشارة. استخدم الإعدادات الافتراضية لكسب 512 وارتفاع 300 هرتز ؛ اضبط معدل أخذ العينات على 20 كيلو هرتز.
    6. حدد تكوين التسجيل المناسب. إجمالي المساحة النشطة التي يمكن أخذ عينات منها هو 3.85 × 2.1 مم2. يتيح البرنامج للمستخدمين اختيار كيفية تكوين تباعد القطب الكهربائي ؛ لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم الإعداد الافتراضي الذي يوزع أقطاب التسجيل بالتساوي على أقصى مساحة نشطة ، حيث يتم أخذ عينات عبر أكبر قدر ممكن من شبكية العين. هذا يؤدي إلى تباعد 87.5 ميكرومتر لكل قطب تسجيل.
    7. اسمح لشبكية العين بالتأقلم مع غرفة التسجيل لمدة 60 دقيقة.
    8. ابدأ تسجيلات النشاط التلقائي من RGCs بالانتقال إلى علامة التبويب الفحص وتحديد أيقونة إنشاء فحص جديد . أختر نوع مقايسة الشبكة ، وقم بتعيين اسم ملف مناسب، ثم انقر فوق موافق لحفظ التكوين. قم بتعيين المدة المطلوبة للتسجيل عن طريق ضبط معلمة وقت التسجيل (ثانية ). قم بتمكين خيار Only Spike للتركيز على بيانات الارتفاع ، ثم انقر فوق أيقونة Run Assay لبدء جلسة التسجيل.
      ملاحظة: بالنسبة لتسجيلات موجات الشبكية لمدة 10 دقائق أو أكثر، نوصي باستخدام إعداد المسامير فقط ، والذي يوفر فقط الطوابع الزمنية لإمكانات الفعل باستخدام أداة مدمجة للكشف عن الارتفاع بدلا من التتبع الفيزيولوجي الكهربي الخام الكامل لكل قناة. وذلك لأن التسجيل المطول (>10 دقائق) عبر 1,024 قناة يمكن أن يؤدي بسهولة إلى ملفات بيانات بحجم TB يصعب تحليلها تقنيا وإبطاء تقدم البحث بشكل كبير. لقد أكدنا أن البيانات الأولية باستخدام مرات المسامير تكرر فقط الخصائص الزمانية المكانية المعروفة لموجات الشبكية: بالنسبة لموجات المرحلة الثانية ، نلاحظ موجات كبيرة تغطي معظم شبكية العين وتحدث بترددات تتطابق مع التقارير السابقة (انظر الشكل 2). نلاحظ أنه إذا كان المشروع البحثي يتطلب مزيدا من التحليل المتعمق لأشكال موجات السنبلة ، فإن تسجيل الأثر الفيزيولوجي الكهربي الخام أمر ضروري.
    9. مراقبة التسجيل المستمر بشكل دوري للتأكد من أن الحصول على البيانات يسير كما هو متوقع وأن النظام يعمل بشكل صحيح.

4. إجراء التنظيف

  1. بمجرد اكتمال التسجيل وحفظ البيانات ، قم بإيقاف تشغيل السخان المضمن ثم قم بإيقاف تشغيل نظام التروية.
  2. قم بإزالة حامل المناديل بعناية وإدخال شريحة MEA. نظف الشريحة عن طريق شطفها أولا بنسبة 70٪ من الإيثانول ، متبوعا بالماء منزوع الأيونات (DI).
  3. لمنع انسداد الأنبوب ، اغسل نظام التروية بماء DI لمدة 15 دقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسجيلات عالية الإنتاجية وتحليل موجات الشبكية باستخدام HD-MEAs
أجرينا تسجيل HD-MEA لمدة ساعة لموجات الشبكية التلقائية (الشكل 2). تظهر المخطط النقطي للنشاط العصبي النمط المنظم لموجات الشبكية ، حيث تمثل كل نقطة جهد فعل تم اكتشافه من قطب فردي (الشكل 2 أ ، أسفل). ينتج عن جمع النشاط عبر الأقطاب الكهربائية تتبع واحد ، مما يجعل من السهل تصور توقيت الموجات خلال تسجيل 1 ساعة (الشكل 2 أ ، أعلى

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول الموصوف هنا طريقة قابلة للتكرار وعالية الإنتاجية لإعداد أنسجة الشبكية وإجراء تسجيلات HD-MEA ، مما يوفر طريقة قوية لدراسة نشاط شبكة الشبكية. توفر تقنية HD-MEA مزايا كبيرة مقارنة بتقنيات الفيزيولوجيا الكهربية وتقنيات التصوير التقليدية ، لا سيما في التقاط البيانات عالية الإنتاجية. يوفر HD-MEA تسجيلات دقيقة في الوقت الفعلي على نطاق مللي ثانية لديناميكيات موجات الشبكية التلقائية ، مما يتيح توصيف بدء الموجة والانتشار والمزامنة بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتجاوز HD-MEA طرق مشبك الت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدعم من منح المعاهد الوطنية للصحة R00EY030909 إلى A.T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3 مل ماصة نقل يمكن التخلص منها (مع قطع النهاية)يساعد Fisherbarnd13-711-9CMفي تحريك شبكية العين بين أطباق بتري.
الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)يحافظ على الظروف الفسيولوجية لأنسجة الشبكية ؛ يتكون من كلوريد الصوديوم ، KCl ، NaH 2< / sub>PO4< / sub> ، NaHCO3< / sub> ، CaCl 2< / sub> ، MgCl 2< / sub> ، الجلوكوز ، والفقاعات مع الكربوجين.
CaCl2< / sub>Fisher ChemicalsC79-500لتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)
إمدادات الكربوجين (95٪ O2< / sub> ، 5٪ CO2< / sub>)تستخدم لتزويد aCSF بالأكسجين والحفاظ على بقاء الأنسجة.
مشرط ذو شفرة منحنية (# 10)Integra4-110يستخدم لقطع الأنسجة بدقة.
مجهر تشريح (مجسم)ZeissStemi 508ضروري لتصور أنسجة الشبكية والتعامل معها.
الجلوكوزفيشر للكيماوياتBP350-1لتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)
سخان في الخطنظام متعدد القنواتTC02يسخن aCSF إلى 32-34 درجة ؛ C للظروف المثلى.
يحافظ نظام Ismatec PerfusionISM4208على التدفق المستمر ل aCSF المؤكسج.
KClFisher ChemicalsP271-500لتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma AldrichP5504-100gلتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)
MaxOne وحدة التسجيلMaxwell BiosystemsMX1-BRDواجهة بين شريحة MaxOne
ونظام MaxOneMaxwell BiosystemsMX1-SYSالأساسي لعمليات الترتيبات الفيزيولوجية الكهربية القائمة على الشرق الأوسط وأفريقيا.
حامل مناديل MaxOne مع معالج دقيق ثلاثي المحاور وإدخالات قابلة للاستبداليضمن Maxwell BiosystemsMX1-HLDوضعا دقيقا لشبكية العين على شريحة MEA.
شريحة MEA (MX1-S-CHP ، MaxWell Biosystems)Maxwell BiosystemsMX1-S-CHPمصفوفة أقطاب كهربائية دقيقة عالية الكثافة لتسجيل النشاط العصبي.
MgCl2< / sub>Fisher ChemicalsM33-500لتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF) NaCl
Fisher ChemicalsS271-1لتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)
NaHCO3< / sub>Fisher ChemicalsS233-500لتحضير السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي (aCSF)
إبرة (30 جم × frac12;)BD Biosciences305106في عمل شقوق في القرنية.
حديثي الولادة (P1-P14 ؛ فأر)الكائنات الحية النموذجية مثل الفئران أو الفئران أو غيرها المستخدمة في دراسات الشبكية.
كمبيوتر شخصي مزود ببرنامج MaxLab Live ScopeHPZ4يستخدم للحصول على البيانات وتحليل التسجيلات.
طبق بتري (35 مم أو 60 مم)Pyrex3483E12يستخدم كمساحة عمل للتشريح.
ملقط Roboz micro Adson (RS-5232 ، 4.75 بوصة ، 1 × 2 أسنان ، طرف 0.5 مم)ملقط RobozRS-5232متخصص للتشريح الدقيق.
مقص زنبركي Roboz (RS-5671 ، حافة قطع 10 مم ، عرض طرف 0.15 مم ، 3 & frac34 ؛ "الطول الكلي)RobozRS-5671مقص دقيق لقطع الأنسجة الحساسة.
فرشاةفرشاة رسم صغيرة معدلة إلى شعرة واحدة للتعامل مع الأنسجة الحساسة.
ملقطان ذو رؤوس دقيقةRobozRS-5060يستخدم لمناولة الأنسجة الحساسة.
أوراق ترشيح Whatman (# 1) ، مقطعة إلى قطع صغيرةGE Healthcare1001-042تستخدم لمناولة وتجفيف أنسجة الشبكية.
السائل نظام يساعد شعر واحد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ford, K. J., Feller, M. B. Assembly and disassembly of a retinal cholinergic network. Vis Neurosci. 29 (1), 61-71 (2012).
  2. Maccione, A., et al. Following the ontogeny of retinal waves: Pan-retinal recordings of population dynamics in the neonatal mouse. J Physiol. 592 (7), 1545-1563 (2014).
  3. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), eabd0830(2021).
  4. Zhang, J., Ackman, J. B., Xu, H. P., Crair, M. C. Visual map development depends on the temporal pattern of binocular activity in mice. Nat Neurosci. 15 (2), 298-307 (2011).
  5. Xu, H. P., et al. An instructive role for patterned spontaneous retinal activity in mouse visual map development. Neuron. 70 (6), 1115-1127 (2011).
  6. Wong, R. O. L. Retinal waves: Stirring up a storm. Neuron. 24 (3), 493-495 (1999).
  7. Biswas, S., et al. Glutamatergic neuronal activity regulates angiogenesis and blood-retinal barrier maturation via norrin/beta-catenin signaling. Neuron. 112 (12), 1978-1996.E6 (2024).
  8. Sernagor, E., Grzywacz, N. M. Influence of spontaneous activity and visual experience on developing retinal receptive fields. Curr Biol. 6 (11), 1503-1508 (1996).
  9. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat Rev Neurosci. 11 (1), 18-29 (2010).
  10. Ford, K. J., Felix, A. L., Feller, M. B. Cellular mechanisms underlying spatiotemporal features of cholinergic retinal waves. J Neurosci. 32 (3), 850-863 (2012).
  11. Tiriac, A., Smith, B. E., Feller, M. B. Light prior to eye opening promotes retinal waves and eye-specific segregation. Neuron. 100 (5), 1059-1065.e4 (2018).
  12. Voufo, C., et al. Circuit mechanisms underlying embryonic retinal waves. Elife. 12, e81983(2023).
  13. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  14. Burbridge, T. J., et al. Visual circuit development requires patterned activity mediated by retinal acetylcholine receptors. Neuron. 84 (5), 1049-1064 (2014).
  15. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723.e3 (2019).
  16. Meister, M., Wong, R. O., Baylor, D. A., Shatz, C. J. Synchronous bursts of action potentials in ganglion cells of the developing mammalian retina. Science. 252 (5008), 939-943 (1991).
  17. Rathbun, D. L., Jalligampala, A., Zrenner, E., Hosseinzadeh, Z. Improvements for recording retinal function with microelectrode arrays. MethodsX. 12, 102543(2024).
  18. Muller, J., et al. High-resolution CMOS MEA platform to study neurons at subcellular, cellular, and network levels. Lab Chip. 15 (13), 2767-2780 (2015).
  19. Sondereker, K. B., Stabio, M. E., Jamil, J. R., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Where you cut matters: A dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks. J Vis Exp. (138), e57861(2018).
  20. Fiscella, M., et al. Recording from defined populations of retinal ganglion cells using a high-density cmos-integrated microelectrode array with real-time switchable electrode selection. J Neurosci Methods. 211 (1), 103-113 (2012).
  21. Frega, M., et al. Neuronal network dysfunction in a model for Kleefstra syndrome mediated by enhanced NMDAR signaling. Nat Commun. 10 (1), 4928(2019).
  22. Berdondini, L., et al. Active pixel sensor array for high spatio-temporal resolution electrophysiological recordings from single cell to large scale neuronal networks. Lab Chip. 9 (18), 2644-2651 (2009).
  23. Gollisch, T., Meister, M. Eye smarter than scientists believed: Neural computations in circuits of the retina. Neuron. 65 (2), 150-164 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة