نموذج الأنسجة ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية لقياس عتبات التثقيب الكهربائي

Robert  H. Williamson; Alexia K. Cash; Anna E. Riordan; Michael B. Sano

doi:10.3791/68494

Method Article

نموذج الأنسجة ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية لقياس عتبات التثقيب الكهربائي

DOI:

10.3791/68494

⸱

August 19th, 2025

Robert H. Williamson¹ , Alexia K. Cash¹ , Anna E. Riordan¹ , Michael B. Sano¹

¹North Carolina State University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول النمذجة الحسابية لتحديد عتبات التثقيب الكهربائي القابلة للانعكاس والتي لا رجعة فيها باستخدام التوزيع المكاني للخلايا المنقولة داخل تقليد نسيج ثلاثي الأبعاد لتحليل الإنتاجية العالية لبروتوكولات التثقيب الكهربائي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التثقيب الكهربائي هو تقنية واعدة تستخدم النبضات الكهربائية لتوصيل الجزيئات الكبيرة واستئصال الأنسجة الرخوة ، مع تطبيقات تشمل الجيل التالي من الأدوية الوقائية وعلاج الأمراض الوراثية مثل السرطان. توضح هذه الدراسة نموذجا ثلاثي الأبعاد لزراعة الأنسجة عالي الإنتاجية لتقدير عتبات التثقيب الكهربائي القابلة للانعكاس والتي لا رجعة فيها لبروتوكول التثقيب الكهربائي المعين. باستخدام مجال كهربائي غير منتظم وتحليل التوزيع المكاني للخلايا المنقولة ، يمكن تحديد كل من العتبات القابلة للانعكاس والتي لا رجعة فيها داخل عينة واحدة ، مما يزيد من الكفاءة التي يمكن بها توصيف بروتوكولات التثقيب الكهربائي ، خاصة للترجمة في الجسم الحي . لإظهار هذه القدرة ، تم نقل تقليد الأنسجة ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على خلايا HEK293 باستخدام قطب كهربائي دائري ودبوس لتقديم بلازميد مشفر GFP. ثم تم اشتقاق عتبات التثقيب الكهربائي بناء على صور المجهر الفلوري للعينات المنقولة. يوضح هذا النموذج إمكانية الاستخدام كوسيلة لتقييم بروتوكولات التثقيب الكهربائي عالية الإنتاجية ، وهي ميزة رئيسية على الطرق الحالية لتقييم هذه العتبات ، والتي تميل إلى أن تكون تستغرق وقتا طويلا وأقل تمثيلا لظروف الجسم الحي .

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التثقيب الكهربائي القابل للانعكاس (RE) هو منهجية راسخة لتوصيل مجموعة متنوعة من المركبات والجزيئات غير المنفذة للغشاء عادة في الخلايا¹^،²^،³. هنا ، يتم استخدام المجالات الكهربائية النبضية (PEFs) لتحقيق شدة المجال الكهربائي الحرجة التي تحفز المسام النانوية العابرة والموضعية على طول أجزاء من غشاء الخلية. تم استخدام الطاقة المتجددة لتوصيل مجموعة متنوعة من الجزيئات والمركبات التي تتراوح من الأصباغ والأحماض النووية إلى العلاج الكيميائي والأدوية الأخرى⁴^،⁵^،⁶

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الخلية

في خزانة السلامة الحيوية ، اللوحة 1 ×^{10 5}خلايا / مل من خط الخلية HEK293 بحجم 10 مل لكل قارورة T75 لزراعة الأنسجة في Eagle's Minimum Essential Medium مكملا بنسبة 10٪ (v / v) مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
احتضان خلايا HEK293 في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية مع بيئة 5٪ CO₂ .
حصاد الخلايا للتجارب بعد يومين من البذر عن طريق إزالة وسط الاستزراع ومعالجة الخلايا ب 4 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA.
احتضان الخلايا والتربسين لمدة 3-5 دقا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نجح القطب الكهربائي الدائري والدبوس في توصيل بلازميد الحمض النووي الذي يشفر بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في أنسجة الكولاجين ثلاثية الأبعاد التي تحاكي خلايا HEK293. تم تحقيق القياس الكمي الناجح لعتبة الطاقة المتجددة عن طريق قياس نصف القطر الخارجي للمنطقة المنقولة واستخلاص شدة المجال المقابلة من النموذج الحسابي للإعداد التجريبي ، كما هو موضح في الشكل 2. تم قياس عتبة IRE بالمثل عن طريق قياس نصف القطر الداخلي للمنطقة المنقولة. يسلط الشكل

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحديد عتبات التثقيب الكهربائي القابلة للانعكاس والتي لا رجعة فيها دون الحاجة إلى اختبار عينات متعددة بجهد منفصل. يتيح استخدام مجال كهربائي غير منتظم القياس الكمي بناء على التوزيع المكاني للخلايا المنقولة في النموذج. ومع ذلك ، هناك قيود مرتبطة بهذا التوزيع غير الموحد. قبل كل شيء ، عتبات RE و IRE الموضحة هنا هي عتبات التعدي الناجح وموت الخلايا ، على التوالي ، والتي قد لا تكون قياسات مباشرة لمدى التثقيب الكهربائي. على سبيل المثال ، من الممكن أن تكون بعض الخلايا م.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يكشف المؤلفان عن أي إفصاح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ هذا العمل في جامعة ولاية كارولينا الشمالية وبتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R01CA272550).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25٪ التربسين EDTA	جيبكو	25200056
أطراف ماصة سعة 1000 ميكرولتر	فيشر العلمية	13-811-164
أنبوب مخروطي 15 مل	فيشر العلمية	14-959-70 درجة مئوية
أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر	فيشر العلمية	13-811-139
304 إبر حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ	ماكماستر كار	75165A753
316 أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ	ماكماستر كار	89785 كيلو 319
اكريليك	ماكماستر كار	8505 ك 754
خزانة السلامة الحيوية	فيشر العلمية	13-261-312
برنامج CAD	أنظمة داسو	سوليد ووركس
الطرد المركزي	نوير	NU-C200R
مثقوب كهربائي	إتش بيو	45-0662	تم استخدام جهاز مصمم خصيصا ونظام BTX ECM 830 في هذه الدراسة
EMEM	فيشر العلمية	MT10009CV	قد يختلف هذا في حالة استخدام خط خلوي آخر غير HEK293
Falcon 12-well صافي مسطح القاع المعالج TC لوحة زراعة الخلايا متعددة الآبار ، مع غطاء	كورنينج	353043	يمكن استخدام أي لوحة 12 بئر ، فقط تأكد من أن أبعاد البئر تؤخذ في الاعتبار عند تصنيع حامل القطب.
FBS	فيشر العلمية	A5670701
مسبار درجة حرارة الألياف البصرية	شركة Micronor	TS5-20MM-02
GFP-البلازميد	ألديفرون	gWiz-GFP
خلايا HEK293	ATCC	CRL-1573	يمكن استخدام خطوط خلوية أخرى ، فقط تأكد من استخدام وسيط الاستزراع الصحيح
لوح ساخن	شركة التبريد الكهروحراراري الأمريكية	AHP-301CPV
حمام ثلج أو حبة مبردة	فيشر العلمية	10-876-001
برنامج تحليل الصور	لايكا	لاس إكس
حاضنه	فيشر العلمية	15-015-2633
مجهر مضان مقلوب	لايكا	دي إم آي 8
قاطع الليزر	ماكماستر كار	7344N11
البنسلين الستربتومايسين	فيشر العلمية	15140122
طقم الماصة	فيشر العلمية	14-388-100
برامج المحاكاة	كومسول	كومسول الفيزياء المتعددة 6.2
قارورة T75	فيشر العلمية	156499
النوع الأول محلول الكولاجين البقري	المصفوفة الحيوية المتقدمة	5005	3 مجم / مل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sano, M. B., Fan, R. E., Xing, L. Asymmetric waveforms decrease lethal thresholds in high frequency irreversible electroporation therapies. Sci Rep. 7 (1), 40747(2017).
Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

نموذج الأنسجة ثلاثي الأبعاد عالي الإنتاجية لقياس عتبات التثقيب الكهربائي

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles