توهين الحديدي العصبي عن طريق تثبيط RKIP بعد النزيف التلقائي داخل المخ عبر تنشيط مسار NRF2 / HO-1

النزيف التلقائي داخل المخ (ICH) هو حالة دماغية ووعائية تتميز بالنزيف بسبب تلف الأوعية الدموية داخل الجمجمة والنخر وتمزق الأوعية الدموية ، وعادة ما تؤثر على العقد القاعدية وتمثل نوعا فرعيا رئيسيا من السكتة الدماغية النزفية¹. ويبلغ معدل الوفيات بين المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بالتراث الثقافي غير المادي حوالي 50٪، وتعاني نسبة كبيرة من الناجين من فقدان شديد للاستقلالية². وخيارات العلاج الحالية للتراث الثقافي غير المادي التلقائي محدودة، حيث لا تظهر أي علاجات حالية أنها تقلل بشكل كبير من الوفيات أو تعزز بشكل ملحوظ النتائج العصبية بعد التراث الثقافي غير المادي.

يتم تعريف Ferroptosis ، وهو شكل يعتمد على الحديد لموت الخلايا المبرمج ، عن طريق بيروكسيد الدهون ، وتراكم أيونات الحديدوز ، واستنفاد الجلوتاثيون ، مما يميزه عن الأشكال الأخرى لموت الخلايا المبرمج من الناحية الوراثية والمورفولوجية والبيولوجية³. تسلط الأدلة المتزايدة الضوء على دور داء الحديدية العصبي في أمراض التراث الثقافي غير المادي. يشارك بروتين مثبط Raf kinase (RKIP) ، المعروف أيضا باسم البروتين المرتبط بالفوسفاتيديل إيثانول أمين 1 (PEBP1) ، في التطور العصبي ويشكل مركب 15LOX / PEBP1 من خلال ارتباطه ب 15-lipoxygenase (15LOX) ، وهو منظم رئيسي للفيروپتوس⁴. ومع ذلك، فإن الدور والآليات المحددة ل RKIP في داء الحديد المرتبطة بتطور التراث الثقافي غير المادي التلقائي لا تزال غير مستقصفة.

فحصت هذه الدراسة التأثيرات المضادة لداء الحديد لتثبيط RKIP على الخلايا العصبية ، مما يدل على أن تثبيط تعبير RKIP يمكن أن يثبط داء الحديد العصبي بعد التراث الثقافي غير المادي ، ربما من خلال تنشيط مسار العامل النووي E2 المرتبط بالعامل النووي 2 / هيم أكسجيناز -1 (NRF2 / HO-1). هذه النتائج مهمة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف التسبب في التراث الثقافي غير المادي.

ثقافة خلايا PC12
تم نشر خط خلايا PC12 في وسط النمو الذي يحتوي على 10٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، مع الصيانة الروتينية في ظل ظروف الاستزراع القياسية (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ جو مرطب). بالنسبة للإجراءات التجريبية ، تم طلاء الخلايا الملتصقة على أوعية الاستزراع وسمح لها بالتكاثر حتى تحقيق طبقات أحادية شبه ملتقاء (حوالي 90٪ تغطية سطحية). تم تحقيق التفكك الخلوي من خلال المعالجة الأنزيمية باستخدام محلول التربسين-EDTA بنسبة 0.25٪ ، تليها ثلاث دورات ثقافة فرعية متتالية لضمان الاستقرار السكاني. تم تخصيص الخلايا المعالجة لاحقا للتطبيقات التجريبية النهائية والتقييمات التحليلية.

فحوصات بقاء الخلية
تم تقييم صلاحية الخلية لتقييم السمية الخلوية للهيمين واللوكوستاتين على خلايا PC12 ، باتباع التعليمات المقدمة من الشركة المصنعة لمجموعة الفحص. تم زرع خلايا PC12 بشكل موحد في صفيحة من 96 بئرا وزرعتها بالهيمين أو لوكوستاتين لمدة 24 ساعة. بعد الغسيل بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، تم تحضين الخلايا في وسط RPMI-1640 يحتوي على محلول ملح رباعي الأوليوم بنسبة 10٪ لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية. ثم تم قياس قيم الكثافة الضوئية (OD) عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (RT-qPCR)
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا PC12 باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي. أولا ، تم تجانس العينة في كاشف الاستخراج ، مما يضمن تحلل شامل. تمت إضافة الكلوروفورم إلى الخليط ، ورجها بقوة ، وطرد مركزي لفصل المراحل (12,000 × جم ، 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية). تم جمع المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي ، وتم ترسيب الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة الأيزوبروبانول (المرحلة المائية: iPrOH = 1: 1) والاحتضان في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء الطرد المركزي لحبيبات الحمض النووي الريبي (12,000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية) ، تمت إضافة 1 مل من 70٪ إيثانول لإزالة الشوائب ، وأخيرا ، تم إذابة حبيبات الحمض النووي الريبي في ماء خال من RNase للتخزين عند -80 درجة مئوية. تم إنشاء قوالب الحمض النووي التكميلي (cDNA) عن طريق النسخ العكسي باستخدام RT Master Mix. ثم تم تخفيف القوالب الناتجة بنسبة 1: 5 وإخضاعها لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي على أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. تم تضخيم كل عينة ثلاث مرات ، وتم حساب متوسط الكمية النسبية لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم سرد البادئات المستخدمة في الجدول 1 ، حيث يعمل β الأكتين كجين للتدبير المنزلي. تم تحديد تركيز mRNA النسبي باستخدام الصيغة E = 2^−ΔΔCt ، وتم تسجيل قيمة دورة العتبة الحرجة (CT) لكل تفاعل.

أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا (ROS) ومقايسات هيدروبيروكسيد الدهون (LPO)
تم قياس مستويات ROS و LPO باستخدام قياس التدفق الخلوي. تمت معالجة خلايا PC12 بالهيمين (80 ميكرومتر) ، واللوكوستاتين (5 ميكرومتر) ، و ML385 (5 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة وغسلها 3 مرات مع PBS في الأطباق. ثم تم تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 40 دقيقة في وجود 2'،7'-ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسين ثنائي أسيتات (DCFH-DA) ، مسبار ROS ، و BODIPY 581/591 C11 ، مسبار LPO. بعد غسول PBS لإزالة المجسات الزائدة ، تم قياس شدة التألق عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم تطبيق استراتيجية بوابات متسقة عبر جميع العينات: أولا ، تم إغلاق الخلايا على FSC-A مقابل SSC-A لاستبعاد الحطام ، ثم تم اختيار الخلايا المفردة بواسطة FSC-A مقابل FSC-H gateing. تم استخدام الخلايا والخلايا غير الملطخة المعالجة بالهيمين وحده كضوابط سلبية وإيجابية لتحديد تعويض التألق والبوابات. تم تحليل البيانات باستخدام البرنامج المرتبط.

استخراج البروتين واللطخة الغربية
استخراج البروتين الكلي
تم التخلص من المادة الطافية لخلايا PC12 المعالجة ، متبوعة بثلاث غسلات باستخدام PBS المثلجة. تم حصاد الخلايا باستخدام التربسين وطرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. بعد إزالة المادة الطافية ، تم تجانس حبيبات الخلية في محلول تحلل مقايسة الترسيب المناعي الراديوي البارد (RIPA) الذي يحتوي على 10٪ مثبط للبروتياز و 10٪ مثبط فوسفاتاز. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة على الجليد ، تم طرد محللة عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تم خلط المادة الطافية الصافية مع Loading Buffer (4: 1) وتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه البروتينات. تم تخزين عينات البروتين عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

تحليل اللطخة الغربية
تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE باستخدام هلام التراص وهلام الحل ، مع تحميل العينات في الآبار. تم إجراء الرحلان الكهربائي عند 80 فولت لهلام التراص و 120 فولت لهلام الحل. تم نقل البروتينات إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) (منشط مسبقا في الميثانول لمدة دقيقة واحدة) باستخدام نظام نقل بتيار ثابت يبلغ 300 مللي أمبير لمدة 1-2 ساعة. تم حظر الغشاء بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في TBST لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد. بعد ثلاث غسلات باستخدام TBST (10 دقائق لكل منهما) ، تم تحضين الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية التالية في TBST: أرنب مضاد ACSL4 (1: 1،000) ، أرنب مضاد ل GPX4 (1: 1،000) ، أرنب مضاد ل HO-1 (1: 2،000) ، أرنب مضاد ل NRF2 (1: 1،000) ، أرنب مضاد ل RKIP (1: 1،500) ، وفأر مضاد للأكتين β (1: 5،000). تم غسل الغشاء لمدة 3 × 10 دقائق باستخدام TBST واحتضانه بأجسام مضادة ثانوية مترافقة ب HRP لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة: الماعز المضاد للفأر IgG المسمى HRP (1: 1,000) ، الماعز المضاد للأرانب IgG المسمى HRP (1: 1,000). بعد غسلات TBST إضافية لمدة 3 × 5 دقائق ، تم تصور إشارات البروتين باستخدام مجموعة ECL Western Blot وتحديدها باستخدام برنامج ImageJ.

تلطيخ التألق المناعي
تم زرع الخلايا على أغطية موضوعة مسبقا في ألواح الاستزراع وسمح لها بالالتصاق. بعد العلاجات التجريبية ، تم التخلص من المادة الطافية ، وتم غسل الخلايا 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. تم تثبيت الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها ثلاث غسلات PBS. بعد ذلك ، تم اختراق الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وغسلها 3x باستخدام PBS. تم حظر الارتباط غير المحدد عن طريق الاحتضان بألبومين مصل البقر بنسبة 3٪ (BSA) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تم تطبيق الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية: أرنب مضاد ل HO-1 (1: 500) ، أرنب مضاد NRF2 (1: 500). بعد ثلاث عمليات غسيل PBS في اليوم التالي ، تم تحضين الخلايا بأجسام مضادة ثانوية فلورية في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة: Alexa Fluor 488-label Goat Anti-Rabbit IgG (1: 500). بعد الغسيل النهائي ، تم تركيب العينات بوسط تركيب يحتوي على 4'،6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI) للتلوين النووي. تم التقاط الصور باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر.

التحليل الإحصائي
تم التعبير عن بيانات القياس كمتوسط ± الانحراف المعياري (S.D). تم أخذ البيانات الكمية التي تمثل نتائج من ثلاثة فحوصات مكررة مستقلة للتحليل. للمقارنات بين مجموعتين ، تم تطبيق اختبار t ، بينما تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) للمقارنات بين مجموعات متعددة ، متبوعا باختبار Tukey اللاحق للمقارنات المتعددة. واعتبرت القيمة الف < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

يمكن أن يؤدي Hemin إلى تلف غشاء البلازما ، وبالتالي يتم استخدامه بشكل متكرر لبناء نماذج الخلايا في المختبر ل ICH. بحثت هذه الدراسة في تأثيرات معالجة الهيمين بتركيزات وفترات متفاوتة على بقاء خلية PC12 ، مع تحليل ديناميكيات تعبير بروتين RKIP في نفس الوقت في ظل الظروف التجريبية المقابلة من خلال تحليل اللطخة الغربية (الشكل 1 أ). انخفضت صلاحية الخلية بشكل ملحوظ عند تركيزات الهيمين البالغة 60 ميكرومتر أو أعلى (الشكل 1 ب) ، وحدث هذا الانخفاض بطريقة تعتمد على الجرعة مع زيادة التركيزات. علاوة على ذلك ، كانت السمية الخلوية للهيمين تعتمد على الوقت ، وبلغت ذروتها خلال أول 24 ساعة من التعرض قبل أن تنخفض تدريجيا (الشكل 1 ج). أشار تحليل اللطخة الغربية إلى أن تعبير بروتين RKIP كان مرتفعا بشكل ملحوظ عند 80 ميكرومتر من الهيمين (الشكل 1D ، E) ووصل إلى ذروته في 24 ساعة بعد التحفيز (الشكل 1F ، G). بناء على هذه النتائج ، اخترنا 80 ميكرومتر من الهيمين وفترة علاج 24 ساعة للتجارب اللاحقة لتوضيح الآليات الأساسية ومسارات الإشارات المعنية.

للتحقيق في دور RKIP في التهاب الحديد العصبي بعد التراث الثقافي غير المادي ، استخدمنا Locostatin لتثبيط تعبير RKIP (الشكل 2 أ). يرتبط Locostatin ب RKIP ، ويعطل التفاعلات بين RKIP وكل من Raf-1 kinase و GRK2 ، وبالتالي يخفف من التأثيرات الوظيفية ل RKIP لتحقيق الغرض المثبط. في هذه الدراسة ، استخدمنا Locostatin كمثبط RKIP للتحقيق في الآليات الجزيئية المرتبطة5،6. تم تقييم السمية الخلوية ل Locostatin لأول مرة عبر نطاق تركيز من 0-40 ميكرومتر باستخدام مقايسة الجدوى. أظهرت النتائج عدم وجود سمية خلوية كبيرة عند ≤5 ميكرومتر ، مما أدى إلى إنشاء نطاق تركيز آمن للتجارب اللاحقة (الشكل 2 ب). أكدنا كذلك التأثير المثبط ل 5 ميكرومتر Locostatin على تعبير RKIP باستخدام تحليلات النشاف الغربي و RT-qPCR. كشفت اللطخة الغربية عن انخفاض كبير في مستويات بروتين RKIP (الشكل 2C ، D) ، بينما أظهر RT-qPCR انخفاضا في مستويات RKIP mRNA (الشكل 2E). توضح هذه النتائج فعالية 5 ميكرومتر لوكوستاتين في تثبيط تعبير RKIP.

في هذه الدراسة ، تم تطوير نموذج خلية PC12 الناجم عن الهيمين للنزيف داخل المخ (ICH) لتحديد الوظيفة التنظيمية ل RKIP في داء الحديد. أشارت نتائجنا إلى أن تحفيز الهيمين زاد بشكل كبير من تعبير RKIP مع تقليل بقاء الخلية. بناء على الدراسات الحالية ، توقعنا أن موت الخلايا الناجم عن الهيمين قد يكون مرتبطا ارتباطا وثيقا بداء الحديد ، وهي عملية بيروكسيد الدهون المحفز بالحديد تتميز بترسب الحديد المرضي داخل المقصورات الخلوية ومستويات مرتفعة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS).

لمزيد من استكشاف العلاقة بين RKIP و ferroptosis ، عالجنا خلايا PC12 المحفزة بالهيمين باستخدام Locostatin. كشف تحليل اللطخة الغربية أن التعبير عن عائلة acyl-CoA synthetase طويلة السلسلة 4 (ACSL4) ، وهو محرك رئيسي لداء الحديديات ، قد زاد بشكل كبير في المجموعة المعالجة بالهيمين (الشكل 3 أ ، ب). ACSL4 هو جين مهم مؤيد للموت في داء الحديدية ، مما يعزز أسترة الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs) وبالتالي يزيد من الحساسية الخلوية لداء الحديد. بالإضافة إلى ذلك ، انخفض التعبير عن الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 (GPX4) ، وهو مثبط للداء الحديدي ، بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة بالهيمين (الشكل 3 أ ، ج). GPX4 هو منظم رئيسي للإصابة الحديدية التي تثبط بيروكسيد الدهون عن طريق مسح بيروكسيدات الدهون ، وبالتالي حماية الخلايا من التلف التأكسدي. تشير هذه النتائج إلى أن تحفيز الهيمين يزيد من داء الحديد في خلايا PC12. ومع ذلك ، بالمقارنة مع مجموعة الهيمين ، فإن التثبيط الدوائي ل RKIP مع Locostatin عكس هذه التعديلات ، مما يشير إلى أن قمع تعبير RKIP يثبط داء الحديد في خلايا PC12. كما لوحظت نتائج متسقة على مستوى mRNA (الشكل 3 F ، G).

قمنا أيضا بالتحقيق في التعبير عن جزيئات المسار المرتبطة بداء الحديد. ثبت أن مسار NRF2 / HO-1 يلعب دورا رئيسيا في داء الحديد. بناء على ذلك ، افترضنا أن تثبيط RKIP قد يثبط داء الحديدية العصبي عن طريق تنشيط مسار NRF2 / HO-1. لاختبار هذه الفرضية ، قمنا أولا بتحفيز خلايا PC12 بالهيمين ووجدنا أن التعبير عن بروتين NRF2 قد زاد بشكل ملحوظ (الشكل 3 أ ، د) ، إلى جانب زيادة كبيرة في منتجه النهائي HO-1 (الشكل 3 أ ، ه). تشير هذه النتائج إلى أن داء الحديد الناجم عن الهيمين ينشط مسار NRF2 / HO-1 ، والذي يمارس تأثيرا وقائيا على الخلايا. كمنظم رئيسي للاستجابات الخلوية المضادة للأكسدة ، يعزز NRF2 القدرة الخلوية المضادة للأكسدة عن طريق تنظيم التعبير عن الجينات المستهدفة النهائية مثل HO-1 ، وبالتالي تثبيط داء الحديد. بعد ذلك ، أدى علاج Locostatin إلى زيادة التعبير عن HO-1 و NRF2 مقارنة بالمجموعة المعالجة بالهيمين (الشكل 3 أ ، د). كما لوحظت نتائج متسقة على مستوى mRNA (الشكل 3I ، J) ، مما يؤكد أيضا أن تثبيط RKIP يثبط داء الحديد في خلايا PC12 المحفزة بالهيمين عن طريق تعديل NRF2 وجزيء المصب HO-1.

والجدير بالذكر أن مثبطا آخر للفيروپت ، وهو سلسلة الفيريتين الثقيلة 1 (FTH1) ، أظهر زيادة في التعبير عند تحفيز الهيمين ، وارتفع تعبيره بشكل أكبر عندما تم تثبيط RKIP (الشكل 3H). FTH1 هو مكون رئيسي للفيريتين ، وهو مسؤول عن تخزين الحديد والأكسدة. يحول أيونات الحديد إلى شكل أكثر استقرارا ، مما يقلل من الإجهاد التأكسدي الناجم عن الحديد الحر. قد يمثل تنظيم FTH1 عند تحفيز الهيمين استجابة تعويضية للحمل الزائد للحديد ، حيث تحاول الخلايا تخزين الحديد الزائد لتجنب الضرر التأكسدي. تشير الزيادة الإضافية في تعبير FTH1 عند علاج Locostatin إلى انخفاض مستويات الحديد الحر وتعزيز القدرة المضادة للأكسدة ، مما يعزز الاستنتاج القائل بأن تثبيط RKIP يثبط التهاب الحديدية الناجم عن الهيمين في خلايا PC12.

تم تقييم مستويات ROS وهيدروبيروكسيد الدهون (LPO) في خلايا PC12 عن طريق قياس التدفق الخلوي. أدى علاج الهيمين إلى زيادة كبيرة في مستويات ROS و LPO ، والتي تم عكسها بعد إعطاء Locostatin. تشير هذه النتيجة إلى أن تثبيط RKIP قد يساعد في قمع داء الحديد في الخلايا العصبية (الشكل 4A-D).

باختصار ، الجرعة الناجمة عن الهيمين والتخفيضات المعتمدة على الوقت في بقاء خلايا PC12 ، بالتزامن مع زيادة ملحوظة في مستويات بروتين RKIP . ارتبطت هذه العملية بمستويات مرتفعة من ACSL4 والتعبير المكبوت عن GPX4. في الوقت نفسه ، لوحظ تراكم كبير لعلامات الضرر التأكسدي (ROS و LPO) ، حيث يعمل كلاهما كمحركات أساسية للإصابة الحديدية عن طريق التوسط في الإجهاد التأكسدي واضطراب الغشاء الدهني. علاوة على ذلك ، اقترح تنظيم بروتين تخزين الحديد FTH1 استجابة خلوية تعويضية للحمل الزائد للحديد. بشكل حاسم ، أدى التثبيط الدوائي ل RKIP بواسطة Locostatin إلى عكس هذه التعديلات وألغى داء الحديدية الناجم عن الهيمين (الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 ، والشكل 4).

أشارت نتائج المقايسات إلى أن تثبيط RKIP قمع بشكل فعال التهاب الحديدية العصبي وتنظيم تعبير NRF2 / HO-1. بالنظر إلى أن مسار NRF2 / HO-1 يلعب دورا رئيسيا في داء الحديد ، فقد تم الافتراض بأن قمع الإصابة بالحديدات العصبية التي لوحظت مع تثبيط RKIP يمكن التوسط فيها من خلال تحفيز هذا المسار. لاختبار هذه الفرضية ، تم إجراء المزيد من التجارب (الشكل 5 أ).

ML385 ، مثبط انتقائي ل NRF2 ، وأكدت النتائج أن تعبير NRF2 قد تم تقليله بشكل فعال عند كل من مستويات البروتين (الشكل 5 ب ، ج) و mRNA (الشكل 5 ه). بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم التعبير عن HO-1 ، وهو جزيء مجرى النهر من NRF2. أشارت النتائج إلى أنه في حين أن تثبيط RKIP زاد في البداية من تعبير HO-1 ، فقد انعكس هذا التأثير بعد تثبيط NRF2 (الشكل 5 ب ، د ، و). تشير هذه النتائج إلى أن تثبيط RKIP قد يخفف من حدة الحديدية العصبية عن طريق تنشيط مسار NRF2 / HO-1. دعم تلطيخ التألق المناعي هذه النتائج بشكل أكبر ، حيث لوحظ النقل النووي ل NRF2 بعد تثبيط RKIP (الشكل 5G-J).

بعد ذلك ، قمنا بتقييم مستويات ROS و LPO في خلايا PC12 باستخدام قياس التدفق الخلوي. وجدنا أن تثبيط NRF2 مع ML385 عكس الانخفاض الناجم عن Locostatin في مستويات ROS و LPO. تشير هذه النتائج إلى أن قمع RKIP قد يثبط داء الحديد العصبي عن طريق تنشيط مسار NRF2 / HO-1 (الشكل 6A-D).

توافر البيانات:
يتم تضمين مجموعات البيانات التي تم إنشاؤها خلال الدراسة الحالية في الملف التكميلي 1.

الشكل 1: بناء نموذج مرض في المختبر بواسطة خلايا PC12 المحفزة بالهيمين. (أ) رسم تخطيطي لبناء نموذج خلية PC12 المحفز بالهيمين. (ب) تحديد تركيز الهيمين الأمثل لإنشاء نموذج النزيف داخل المخ في المختبر باستخدام مقايسة بقاء الخلية لتقييم الجدوى الخلوية. (ج) مقايسة بقاء الخلية مع خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر) لنقاط زمنية مختلفة. (د، ه) تحليل اللطخة الغربية التمثيلية والتقييم الكمي لمستويات تعبير RKIP في خلايا PC12 المعالجة بتركيزات مختلفة من الهيمين (24 ساعة). (F ، G) تحليل اللطخة الغربية التمثيلية والتقييم الكمي لمستويات تعبير RKIP في خلايا PC12 المعرضة للهيمين (80 ميكرومتر) لفترات متفاوتة. يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. الاختصارات: CCK8 = طقم عد الخلايا -8 ؛ WB = لطخة غربية ؛ RKIP = بروتين مثبط كيناز راف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تأثير Locostatin على تعبير RKIP في خلايا PC12 المحفزة بالهيمين. (أ) رسم تخطيطي للإجراء التجريبي لعلاج Locostatin في خلايا PC12. (ب) تم تقييم صلاحية الخلايا لخلايا PC12 المعالجة بتركيزات مختلفة من Locostatin باستخدام مقايسة بقاء الخلية. (ج ، د) تم تحليل التعبير عن RKIP في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو اللوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) بواسطة اللطخة الغربية ، مع ظهور بقع تمثيلية وتحليل إحصائي. (ه) تم قياس تعبير RKIP mRNA في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) باستخدام RT-qPCR. يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. الاختصارات: CCK8 = طقم عد الخلايا -8 ؛ WB = لطخة غربية ؛ RT-qPCR = تفاعل متسلسل للنسخ العكسي الكمي ؛ ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. LPO = بيروكسيد الدهون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تأثير تثبيط RKIP على داء الحديد في خلايا PC12 بعد تحفيز الهيمين. (A-E) تحليل اللطخة الغربية لتغيرات تعبير البروتين في ACSL4 و GPX4 و NRF2 و HO-1 في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو Locostatin (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). (إف جي) تحليل RT-qPCR لمستويات تعبير mRNA ل ACSL4 و GPX4 و NRF2 و HO-1 و FTH1 في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. الاختصارات: WB = لطخة غربية ؛ RT-qPCR = تفاعل متسلسل للنسخ العكسي الكمي ؛ RKIP = بروتين مثبط كيناز راف ؛ ACSL4 = عائلة Acyl-CoA synthetase طويلة السلسلة 4 ؛ جي بي إكس 4 = الجلوتاثيون بيروكسيداز 4 ؛ NRF2 = العامل النووي المرتبط بالعامل E2 2 ؛ HO-1 = هيم أكسجيناز -1 ؛ FTH1 = سلسلة الفيريتين الثقيلة 1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تأثير تثبيط RKIP على الإجهاد التأكسدي في خلايا PC12 بعد تحفيز الهيمين. (أ ، ج) تحليل قياس التدفق الخلوي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في خلايا PC12 المعالجة بالكيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). (ب ، د) تحليل قياس التدفق الخلوي لبيروكسيد الدهون في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. الاختصارات: ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. LPO = بيروكسيد الدهون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: دور NRF2 في التأثيرات المضادة للحديدية بوساطة تثبيط RKIP. (أ) رسم تخطيطي للإجراء التجريبي لمعالجة خلايا PC12 في ظل ظروف مختلفة. (ب د) تحليل اللطخة الغربية لتغيرات تعبير البروتين في NRF2 و HO-1 في ظل ظروف معالجة مختلفة في خلايا PC12 مع الهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو ML385 (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). (E ، F) تحليل RT-qPCR لمستويات تعبير mRNA ل NRF2 و HO-1 في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو Locostatin (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو ML385 (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). (جي جي) تحليل التألق المناعي للتعبير NRF2 و HO-1 وتقدير متوسط شدة التألق في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو ML385 (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. الاختصارات: WB = لطخة غربية ؛ RT-qPCR = تفاعل متسلسل للنسخ العكسي الكمي ؛ إذا تلطيخ = تلطيخ التألق المناعي; NRF2 = العامل النووي المرتبط بالعامل E2 2 ؛ HO-1 = هيم أكسجيناز -1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: دور NRF2 في قمع الإجهاد التأكسدي بوساطة تثبيط RKIP.(أ ، ج) تحليل قياس التدفق الخلوي لإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في خلايا PC12 مع الهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو ML385 (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). (ب ، د) تحليل قياس التدفق الخلوي لبيروكسيد الدهون في خلايا PC12 المعالجة بالهيمين (80 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو لوكوستاتين (5 ميكرومتر ، 24 ساعة) و / أو ML385 (5 ميكرومتر ، 24 ساعة). يتم تقديم جميع البيانات كمتوسط ± SD (ن = 3). * P < 0.05 ، ** P < 0.01 ، *** P < 0.001. الاختصارات: ROS = أنواع الأكسجين التفاعلية. LPO = بيروكسيد الدهون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: التمثيل التخطيطي لتثبيط RKIP الذي يخفف من داء الحديد العصبي بعد التراث الثقافي غير المادي التلقائي عن طريق تنشيط مسار NRF2 / HO-1. توضح النتائج التي توصلنا إليها أن تثبيط RKIP يعزز بشكل فعال الانتقال النووي ل NRF2 ، ويمنع تراكم الدهون ROS ، وبالتالي يحمي من التهاب الحديدية الناجم عن الهيمين والإجهاد التأكسدي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الاشعال للنسخ العكسي الكمي - تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الملف التكميلي 1: البيانات الكمية الأولية والمعالجة التي تدعم الأرقام الستة الأولى ، بما في ذلك فحوصات CCK-8 ، واللطخة الغربية ، و RT-qPCR ، وتحليلات قياس التدفق الخلوي. يتم تنظيم البيانات حسب اللوحات الفرعية للأشكال وتتضمن جميع قيم النسخ المتماثلة المستخدمة في التحليلات الإحصائية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية يمكن أن يبدو أنها تؤثر على العمل المبلغ عنه في هذه الورقة.