مجهر رامان متعدد الوسائط واسع المجال بتحويل فورييه

ملخص

يسمح مجهر تحويل فورييه واسع المجال، المبني على مقياس تداخل ثنائي الانكسار ومضغوط ومستقر للغاية، بالاكتساب المتوازي للأطياف لجميع بكسلات الكاشف ثنائي الأبعاد. يتيح نهج المجال الزمني فك تشابك الإضاءة الضوئية وإشارات رامان، ويسمح برسم خرائط رامان السريعة (~5 مللي ثانية/بكسل) بدقة مكانية ~1 ميكرومتر ودقة طيفية 23 ^سم-1 .

الملخص

يعد مجهر رامان تقنية قوية لتحديد التركيب الكيميائي للعينة. التحدي الرئيسي في مجاهر رامان العفوية المتطورة، المبنية على اكتشاف تردد المسح النقطي، هو الحصول على خرائط رامان لمناطق واسعة بسبب أوقات البكسل الطويلة عادة (0.1-1 ثانية). يسمح المجهر التحويلي الفورييه واسع المجال (FT) المعروض هنا بقياس سريع للعينات الممتدة بدقة مكانية ~1-ميكرومتر ودقة طيفية ~23 ^سم-1 . يعتمد على مقياس تداخل ثنائي الانكسار مزدوج المسار متعدد الاستقرار والمضغوط، أضيف على طول مسار الكشف في المجهر التجاري، مما يتيح اكتساب الأطياف بشكل متوازي لجميع بكسلات الكاشف ثنائي الأبعاد، مما يقلل بشكل كبير من وقت القياس (أسرع بمقدار 10-100 مرة). يعالج نهج المجال الزمني بفعالية قيدا آخر في تقنية مجال التردد، وهو فك تشابك إشارة رامان عن خلفية التلألؤ الضوئي، حيث قد تدفن إشارة رامان. يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء قياسات الطيفية فائقة باستخدام مجهر تجاري مطور: محاذاة نظام الإضاءة، معايير اختيار معلمات القياس، وتحليل البيانات لاسترجاع ودراسة الأطياف.

المقدمة

التصوير الطيفي هو تقنية توفر معلومات طيفية ومكانية وتم تطبيقها في مجالات مختلفة، من المجهر¹ إلى الاستشعار عن بعد². يتم التمييز بين التصوير متعدد الأطياف والتصوير الفائق الطيف بناء على ما إذا كانت هناك بعض النطاقات الطيفية المنفصلة أو طيف مستمر يتم تسجيلها لكل بكسل من حساس ثنائي الأبعاد. تصوير رامان هو تطبيق خاص للتصوير الطيفي.

مجهر رامان للتشتت هو تقنية قوية لقياس الترددات الاهتزازية ν_R للنظام. ترتبط أنماط الاهتزاز بالروابط الكيميائية، وبالتالي يمكن مطيافية رامان³ من دراسة التركيب الكيميائي للعينات في علوم البيولوجيا⁴ وعلوم المواد⁵. في مطيافية رامان التلقائية، يتم إضاءة العينة بإشعاع أحادي اللون عند تردد ν₀، ويسمى المضخة. جزء من ضوء المضخة، الذي يتفاعل مع أوضاع الاهتزاز، قد يخضع لتشتت غير مرن، مما يؤدي إلى فوتونات عند ترددات ν_S (ν_AS)=ν₀-(+)_{ν R}، حيث ν_R هو التردد الاهتزازي الجزيئي داخل العينة. الضوء المتناثر ذو الطاقة المنخفضة (ν_S) يسمى إشعاع ستوكس، بينما الضوء الأعلى الطاقة (ν_AS) يسمى إشعاع مضاد ستوكس. عند التوازن الحراري، تحتل معظم الجزيئات حالات طاقة أقل، ولهذا تكون مكونات مضاد ستوكس أضعف بكثير من مكونات ستوكس. لهذا السبب، عادة ما يكتشف المجهر التشتت رامان فوتونات ستوكس. نظرا لأن الجزيئات والمواد الصلبة لها أنماط اهتزازية متعددة، فإن طيف رامان يتميز بأشرطة مميزة تشكل معا توقيعا كيميائيا فريدا، مما يمكن من تحديد المادة وتحليلها. التحدي الرئيسي في هذا النهج هو المقطع العرضي المنخفض جدا لتشتت رامان التلقائي، حيث يخضع فوتون واحد فقط من بين أكثر من¹⁰ 9-12 فوتونا لهذه العملية.

في تكوين قياسي لمجهر رامان للتشتت، يركز ضوء الإثارة بإحكام على نقطة واحدة من العينة. بعد رفض فوتونات المضخة المتناثرة مرنة (عادة باستخدام مرشحات طيفية)، يتم جمع الضوء المتبقي وتوصيفه بمطياف مجال التردد (مثل الشبكة التشتتية); يمكن أن تصل دقة طيفية هذه الأجهزة إلى ~0.5-1 ^سم-1. يتم تكرار القياس لكل نقطة (x,y) في مجال الرؤية (FOV) للعينة بطريقة تسمى المسح النقطي أو المسح النقطي⁶. هناك قضيتان رئيسيتان في هذا النهج: (1) المقطع العرضي المنخفض لتشتت رامان التلقائي عادة ما يتطلب أوقات تكامل طويلة (0.1-1 ثانية) لجمع فوتونات كافية لكل بكسل من مطياف، لذا قد تتطلب خريطة رامان لعينة موسعة أوقات قياس طويلة؛ (2) الإثارة الناتجة عن ضوء المضخة تؤدي أيضا إلى تلألؤ ضوئي (PL)، الذي يتداخل مع إشارة رامان العفوية وغالبا ما يتغلب عليها.

لزيادة سرعة الاستحواذ، يمكن اعتماد نهج المسح الخطي⁷ ، حيث تركز المضخة على خط مجال الرؤية (مثل الإحداثي x) وتشتت الإشارة المجمعة (PL أو تشتت رامان) بواسطة مطياف مزود بحساس ثنائي الأبعاد، مما ينتج للإحداثي المعطى x مجموعة بيانات ثنائية الأبعاد حيث يقابل أحد المحاور الطيف والآخر إحداثيا مكانيا y. ومع ذلك، لا يزال هذا التطبيق يعاني من الخسائر الكبيرة التي يسببها شق المدخل في المطياف، الذي يوفر عرضه الضيق دقة طيفية أفضل، لكنه يحد أيضا من كمية الضوء المجمع.

يمكن أن يكون تكوين المجال الواسع أكثر ملاءمة لتقليل وقت القياس: بهذه الطريقة، يتم إضاءة مساحة كبيرة من العينة ويتم اكتساب الطيف لجميع بكسلات المستشعر ثنائي الأبعاد في نفس الوقت. في هذه الحالة، يمكن جمع المعلومات الطيفية باستخدام مجموعة من مرشحات تمرير النطاق⁸ أو مرشح طيفي قابل للضبط⁹ أمام كاميرا تصوير أحادية اللون. أيضا، تعتمد هذه الطريقة على نهج مجال التردد، وتكتسب عددا متقطعا فقط من النطاقات الطيفية.

طريقة بديلة لقياس الطيف هي طريقة تحويل فورييه (FT). إنها تقنية في مجال الزمن تعتمد على مبرهنة وينر-كينتشين^{رقم 10}، التي تنص على أن كثافة الطيف الطاقي للإشارة هي تحويل فورييه لارتباطها الزمني الذاتي. في البصريات، يتم الحصول على ذلك عمليا عن طريق توليد نسختين مؤجلتين من الموجة باستخدام مقياس تداخل. يتم قياس تداخلها بواسطة الكاشف كدالة للتأخير النسبي، مما يؤدي إلى ما يسمى بالتداخل¹¹. يستخدم نهج FT على نطاق واسع لقياس الأطياف في المنطقة الطيفية تحت الحمراء، حيث يسمى مطيافية الأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR)¹². يستخدم FTIR بشكل روتيني لقياس طيف الامتصاص للانتقالات الاهتزازية في النطاق الطيفي للأشعة تحت الحمراء المتوسطة (~2.5−25 ميكرومتر).

يقدم نهج FT في المجال الزمني بعض الفوائد مقارنة بمطيافيات التشتت التقليدية: فهو يحقق إنتاجية أكبر بسبب غياب الشقوق (ميزة جاكينو في etendue¹²); يوفر دقة طيفية مرنة، تعتمد فقط على نطاق المسح. علاوة على ذلك، فهي مناسبة جدا لتكوينات المجال الواسع: في الواقع، عند استخدام كاشف ثنائي الأبعاد، تقيس الطريقة تداخلية واحدة لكل بكسل بشكل متوازي، مما يتيح تسجيل الأطياف المستمرة عبر جميع البكسلات في نفس الوقت. من ناحية أخرى، يجب أن يفي نظام التصوير بتقنية FT متطلبين صعبين: (1) يجب التحكم في التأخير النسبي بين نسختي الضوء إلى جزء صغير من الدورة البصرية؛ (2) يجب تحديد انزياح الطور بين الأشعة التي تتداخل في بكسل واحد لضمان تماسك جيد وبالتالي تباين عالي. تم اقتراح بعض الحلول بناء على مقياس تداخل^{13 أو 14} أو ما يقارب¹⁵ مقياس تداخل في المسار المشترك، لكنها معقدة إلى حد ما أو ذات دقة طيفية أكبر من 100 ^سم-1.

في هذا العمل، تم وصف مجهر واسع المجال مبتكر، يتيح الحصول على صور التلألؤ الضوئي وتشتت رامان. الكتلة المبتكرة لهذا النظام هي مقياس تداخل ثنائي الانكسار المشترك المسار متعدد الدمج ومستقر للغاية، يسمى نظام ترميز النبضات المتطابقة المعتمد على الإسفين (TWINS)¹⁶. يوفر مسح تأخير لمئات الدورات البصرية بدقة طور جزء صغير من الدورة البصرية نفسها واستقرار عالي. النسختان الضوئيتان لهما استقطابات متعامدة وتسيران معا عبر نفس المسار المشترك، لذلك لا تتأثران بتقلبات طول المسار، وهو أمر نموذجي لمقياس التداخل ذو الشعاعين. يتكون المخطط، الموضح في إدخال الشكل 1، من كتلتين من البلورات ثنائية الانكسار بمحاور بصرية متعامدة: واحدة (B₂) ذات طول ثابت والأخرى (B₁) مقسمة إلى إسفين يمكن تحريكهما على طول اتجاه الوتر المشترك. يتم استقطاب الضوء الساقط بواسطة P₁ عند زاوية 45° بالنسبة للمحور البصري للبلورة ثنائية الانكسار، بحيث يكون نصف الطاقة على طول الاستقطاب العادي، والنصف الآخر على طول الاستقطاب الاستثنائي. أثناء السفر على طول الكتل ثنائية الانكسار، يتراكم المكونان المتعامدان تأخير نسبي يتم تعديله بدقة عن طريق تغيير السمك الكلي للكتلة_{B 1} عن طريق تغيير إدخال الإسفين. المستقطب الثاني P₂ يسقط مكونات المجال إلى استقطاب خطي مشترك لجعلها تتداخل. يعتمد التأخير τ بين النسخ على إزاحة الإسفين x على طول الوتر المشترك كما في (المعادلة 1)، مع c سرعة الضوء، α زاوية القمة للأوتد، Δn = n_{e-n o} فرق في معاملات الانكسار العادية والاستثنائية (الانكسار الثنائي). نظرا لأن الدقة الطيفية Δv تتناسب عكسيا مع نطاق المسح T=|T_{2-T 1}|، مع تأخير التداخل الأولي والنهائي T₁ وT₂، فإن الدقة الطيفية العالية المطلوبة في مطيافية رامان تتطلب انكسارا ثنائي عالي وترجمات إسفينية طويلة. من بين أكثر البلورات ثنائية الانكسار شيوعا، يناسب YVO₄ (إيتريوم أورثوفاناديت) بشكل خاص لارتفاع Δn ونطاق الشفافية في الأشعة تحت الحمراء المرئية القريبة. تم تصميم الأوتاد بزاوية قمة 10°، وبذلك، بطول مسح 15.3 مم، يمكن للمداخل أن يمنح تأخيرا قدره 2500 قدم في الثانية عند 600 نانومتر، مما يحصل على دقة طيفية تبلغ 23 ^سم-1، على كامل النطاق الطيفي المطلوب (حساسية كاميرا السيليكون تحدد الحد الأعلى للحد). سيقدم هذا العمل استراتيجية لإعداد مناسب لأخذ عينات التداخل (أي مدى الخطوة والمسح) لتحقيق الدقة الطيفية المطلوبة والتعامل مع خلفية النطاق العريض، مما يفك إشارة رامان عن الإضاءة الضوئية.

كما وصف كانديو وآخرون^{، يمكن} دمج هذا المطياف ثنائي الانكسار مع مجهر بصري تجاري لإجراء قياسات فائقة طيفية. المتطلبات هي كما يلي: جسم مجهر بصري قابل لإعادة التكوين، مقياس تداخل ثنائي الانكسار TWINS، كاميرا أحادية اللون منخفضة الضوضاء (مثل CCD أو sCMOS)، ومصدر ليزر ضيق النطاق. بالنسبة للأخير، فإن أطوال موجات الإثارة النموذجية لرامان والتحليل الطيفي الفلوري هي 355 نانومتر، 488 نانومتر، 514 نانومتر، 532 نانومتر، 633 نانومتر، و785 نانومتر. على الرغم من أن الليزر عالي النقاء الطيفيا، مثل الذي هو مذكور في جدول المواد، هو الخيار الأفضل، إلا أنه يمكن استخدام ليزر بعرض خط أوسع، مثل ~0.1 نانومتر، نظرا للدقة الطيفية المحدودة للجهاز. يتم ترقية المجهر عن طريق وضع TWINS في مسار الكشف، بين عدسة الأنبوب والكاشف أحادي اللون. يوفر هذا التكوين تأخير مسار موحد عبر مجال الرؤية ومتوسط تباين يبلغ 55٪. تم تصميم مسار الإثارة للحصول على إضاءة منتظمة للعينة: في الواقع، يتم تصوير رأس خرج ليف متعدد الأنماط كبير النواة على مستوى العينة. باستخدام جهاز تشويش ميكانيكي، تكون الأوضاع مترابطة بقوة في نواة الألياف، مما ينتج ملف مسطح على مستوى العينة. بالإضافة إلى ذلك، يقوم ملف الصوت المهتز بمتوسط نمط البقع النموذجي للإشعاع أحادي اللون. يظهر وصف هذا الإضاءة ذات القبعة العلوية في الشكل التكميلي 1. يركز الشعاع على العينة بواسطة هدف مصحح لللانهاية يجمع أيضا ضوء رامان المتناثر والإضاءة نحو مسار الكشف. سيتم تفصيل المرشحات اللازمة لرفض الإضاءة.

لإظهار كيفية قياس الميزات الطيفية واسعة النطاق والضيق النطاق باستخدام هذا المجهر الفائق الطيفي، يتم قياس كل من التلميع وتشتت رامان لعينة اختبار مختارة خصيصا لأغراض توضيحية. تتكون العينة من خليط من ثلاث أصباغ مسحوق مع أطياف رامان معروفة: نوعان متعدد أشكال من الأبيض التيتانيوم (TiO₂)، وهما روتيل وأناتاز، وأصفر كبريتيد الكادميوم (CdS). ومع ذلك، يمكن استخدام نفس الإجراء في مجموعة أوسع من التطبيقات، من علوم المواد إلى علم الأحياء.

نطاق هذه المقالة هو توضيح الخطوات اللازمة لإجراء قياس فائق طيفي، بينما يتم تفصيل تجميع ومحاذاة مقياس التداخل TWINS بواسطة كانديو ^{وآخرون.} لذلك، يجب على المجرب المهتم أن يبدأ من مقياس تداخل مجمع مسبقا يعتمد على هذه التقنية.

يبدأ البروتوكول بتحضير العينة وكيفية إعداد المجهر لتحفيز وجمع فوتونات تشتت رامان وPL. ثم يتم تعيين معلمات المسح (طول المسح، خطوة العينة) ومعايير الاكتساب (زمن التعرض، تثبيت الأجهزة) وفقا لمتطلبات الإشارة قيد البحث. وأخيرا، سيتم عرض خط معالجة ما بعد المعالجة، الذي يوضح إجراءات استرجاع الطيف عند كل بكسل (المكعب الطيفي الفائق، الشكل 2B) من مجموعة البيانات الزمنية المكتسبة (المكعب الفائق الزمني، الشكل 2A)، وتوضيح خوارزميات تقليل الضوضاء والتحليل الطيفي المتقدم. يظهر سير العمل بالكامل في الشكل 3.

البروتوكول

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير العينة

تحذير: ارتد قفازات لاتكس أثناء هذا التحضير لأن صبغة CdS سامة، خاصة عند استنشاقها.

1. استخدم مكشطة لوضع 20 ملغ من كل مسحوق صبغة على توازن دقيق، مما يحصل على نسبة وزن 1:1:1.
   ملاحظة: نظف رأس الكاشطة بعناية لكل عينة لتجنب التلوث المتبادل.
2. اخلط المباريق مع هاون لإزالة الكتل.
3. صب الخليط الناتج على شريحة مجهرية؛ استخدم طرف الكاشطة للضغط بلطف والحصول على سمك شبه منتظم للطبقة.
4. ضع طلاء الأظافر على حواف غطاء المجهر. ضعه على الخليط، مع وضع طلاء الأظافر مقلوب، واضغط كمية كافية لإغلاقه. اتركه يجف لبضع ثوان ليتصلب الطلاء الصناعي.

2. إعداد المجهر

تحذير: ارتد نظارات أمان عند تشغيل الليزر، لأن أقصى قدرة ممكنة على مستوى العينة هي 300 ميلي واط.

ملاحظة: يبقى أداء ليزر المضخة غير متأثر بتغيرات درجة الحرارة، طالما تم تشغيله ضمن نطاق درجة الحرارة المحددة في ورقة البيانات (مثلا، 10-40 درجة مئوية للليزر المذكور في جدول المواد).

1. قم بمحاذاة مقياس التداخل TWINS على طول مسار الكشف في المجهر.
   ملاحظة: كما أوضح كانديو ^{وآخرون،} يجب إضافة وحدة التداخل بين عدسة الأنبوب والكاشف، لضمان وجود مسافة مناسبة بينهما. بالنسبة للمجهر المستخدم في هذا العمل، يضمن ذلك فقط عند إزالة وحدة العدسة العينية.
2. لتكييف نظام إضاءة كوهلر مع الإثارة الليزرية، قم بإزالة مصباح الإثارة المدمج في المجهر واستخدم هدف المجهر لجمع الضوء عند خرج ألياف متعددة الأنماط ذات النواة الكبيرة.
   ملاحظة: التكبير الموضوعي يحدد حجم نمط الإضاءة عندما يكون طرف الألياف مترافقا مع مستوى العينة. خيار محتمل هو هدف 10x/0.25-0.30.
3. اختر طول موجة الإثارة وركز ليزر الإثارة عند مدخل الألياف متعددة الأنماط ذات النواة الكبيرة. شغل الكاميرا وشغل برنامج تصوير.
   1. قم بتثبيت جزء وسط من الألياف على الغشاء المهتز لملف صوتي، مما سيزيل البقعة. قم بخلط الألياف ميكانيكيا عن طريق ثنيها بإحكام لدمج جميع أوضاعها المكانية. شغل الليزر.
   2. جهز عينة اختبار للمحاذاة، مثل خطوط العلامة الحمراء الفلورية على غطاء المجهر.
   3. ضبط موضع طرف الألياف بالنسبة لنظام الإضاءة البصري عن طريق تحريك الألياف بمرحلة ترجمة دقيقة للحصول على نقطة ذات شدة موحدة وحواف محددة جيدا على مستوى العينة.
      ملاحظة: يستخدم ليزر 532 نانومتر لجميع القياسات المبلغ عنها. مع ألياف بحجم قلب 400 ميكرومتر، يغطي قطر النقطة 82٪ من عرض مجال رؤية الكاميرا.
4. استخدم مجموعة مرشحات لمسارات الإثارة والكشف، معتمدة على المعايير التالية (الشكل التكميلي 2):
   1. استخدم مرشح تمرير نطاق ضيق عند 532 نانومتر (عرض نطاق 2.0 نانومتر) لتنظيف خط الليزر ورفض أي نطاقات جانبية للمضخة ناتجة عن التوسع غير الخطي بسبب الانتشار في الألياف.
   2. استخدم مرآة ثنائية اللون (DM في الشكل 1) لعكس ضوء الليزر نحو العينة ونقل الإشعاع المتناثر الذي يجمعه الهدف باتجاه التحول الأحمر إلى الخلف.
   3. استخدم مرشح تمرير طويل (LPF في الشكل 1) عند 532 نانومتر لرفض ضوء الإضاءة المتبقي.
   4. أثناء قياس تشتت رامان، استخدم مرشح تمرير قصير (SPF في الشكل 1) عند 600 نانومتر لقمع التألق الخلفي.
5. قس القدرة على مستوى العينة باستخدام عداد الطاقة. قم بتخفيف شعاع المضخة للحصول على شدة في العينة لا تؤدي إلى ضرر (بحدود 2 واط/سم^مربع، كما هو موضح في الجدول 1). استخدم الغالق للليزر أثناء ضبط معايير القياس الأخرى.
   ملاحظة: بسبب انخفاض المقطع العرضي لتشتت رامان التلقائي، هناك حاجة إلى كثافة طاقة عالية لتعزيز جمع الإشارات. ومع ذلك، يجب أخذ عتبة ضرر العينة في الاعتبار. على عكس أنظمة المسح النقطي، يضيء نظام المجال الواسع مساحة كبيرة، مما يجعل تبديد الطاقة أقل كفاءة ويتطلب إدارة طاقة دقيقة لمنع تلف العينة.
6. ضع العينة على مرحلة المجهر وضبط التركيز.
   ملاحظة: لإيجاد التركيز بسهولة، أضاء العينة أولا بمصباح أبيض أثناء الإرسال أو الانعكاس. في الحالة الأخيرة، يمكن استخدام لمبة كهربائية موضوعة بجانب المجهر. سيتم تحسين تركيز العينة لاحقا باستخدام ضوء ليزر المضخة.

3. معايير القياس

1. شغل محرك المحرك الذي يقوم بترجمة الإسفين. التحكم في المكونات المادية (الكاميرا والمحرك) في نفس الوقت لإجراء قياسات فائقة الطيف (مثال على واجهة المستخدم الموضح في الشكل الإضافي 3).
2. اضبط معلمات اكتساب الكاميرا، ووقت التعريض، وتركيب الأجهزة لتحسين شدة الإشارة، مع اعتماد التعليمات التالية:
   1. نظرا لأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية في الإشارة الزمنية تؤدي إلى نسبة ضوضاء عالية في الأطياف المسترجعة، امنح وقت تعريض طويل يملأ النطاق الديناميكي للمستشعر بشكل أفضل.
      ملاحظة: بالنسبة للإشارات المنخفضة، كما هو الحال مع تشتت رامان، يجب إيجاد حل وسط بين مستوى الإشارة ووقت القياس الكلي: قد لا يكون أطول وقت تعرض ممكنا.
   2. اختر التخزين المادي لجمع الشحن من المزيد من البكسلات قبل القراءة.
      ملاحظة: جمع الشحن وعمل قراءة واحدة يعطي أداء ضوضاء أفضل من قراءة عدة بكسل ثم جمع إشارتها في المعالجة اللاحقة. اختيار التقسيم مدفوع أيضا بتقليل الدقة المكانية المقبول.
3. اختر معلمات المسح، وطول المسح الكلي، وخطوة العينة وفقا للمعايير التالية:
   1. لتحقيق دقة طيفية عالية لقمم رامان، اضبط تحويلا طويلا غير متماثل (-2526 fs→ -36 fs). من ناحية أخرى، قم بإجراء مسح متماثل حول موضع التأخير الصفري (-65 fs → 65 fs) لاسترجاع المزيد من الميزات الطيفية عريضة النطاق لإشارة PL.
   2. باستخدام المعادلة 1 للتأخير τ كدالة لترجمة الإسفين x، اختر خطوة العينة لتحقيق حد نيكويست لعرض النطاق الطيفي المطلوب.
      ملاحظة: بالنظر إلى الحد الأدنى لطول الموجة للطيف λ_دنيا، فرض (المعادلة 2).
      
      حيث أن الانكسار الثنائي Δn يعتمد على الطول الموجي (انظر معادلات سيلمير).
4. افتح الغالق لتسليط الليزر على العينة. إذا لوحظ انخفاض في شدة الإشارة، انتظر حتى تصل العينة إلى حالة ثابتة (عادة لبضع ثوان).
   ملاحظة: لتعويض انخفاض شدة الإشارة، قم بضبط وقت التقطيع والتعرض للحفاظ على معدل SNR جيد.
5. ابدأ في الحصول على صورة أحادية اللون لكل موقع إسفين، أي التأخير الزمني بين النسخ المقلدة من كل نقطة في المستشعر ثنائي الأبعاد.
   ملاحظة: يجب أن يحفظ برنامج الاقتناء متغيرين: المكعب الهائق الزمني (مجموعة الصور ثنائية الأبعاد) ومتجه مواقع المحرك المسجلة بواسطة المشفر أثناء المسح.
6. بعد الانتهاء من القياس، أطفئ الليزر وتابع تحليل البيانات.

4. معالجة مكعب البيانات المكتسب

1. قم بتوليد المكعب الفائق الطيفي من مجموعة البيانات المكتسبة، باتباع هذه التعليمات:
   1. قم بتحميل ملف تصحيح مواقع المحرك الخاص بمحرك التدرج المحدد (انظر النقاش).
   2. قم بتحميل ملف معايرة التردد الخاص بجهاز التداخل المحدد لربط الترددات المكانية المقاسة (الترددات الزائفة) بالترددات البصرية الحقيقية (انظر قسم النقاش).
   3. اختر نطاق التردد للأطياف التي سيتم حسابها بواسطة فورييه بتحويل التداخل البصري لجميع البكسلات.
   4. من بين دوال الأبوديزر^{المتاحة 12} لنافذة التداخل المقاس، اختر الدوال التي توفر مقايضة جيدة بين التوسيع الطيفي وتقليل الآثار في الأطياف المسترجعة، مثل نافذة هاب-جينزل (هامينغ).
   5. توليد المكعب الفائق الطيفي عن طريق تحويل فورييه للتداخلات الأبودية لجميع البكسلات. احتفظ به بقيم معقدة.
      ملاحظة: الطيف المركب من FT يحمل معلومات إضافية، والتي ستكون مفيدة لإزالة الضوضاء من مجموعة البيانات واستخراج الأطياف المتوسطة لمجموعة من البكسلات المختارة.
2. بمجرد حساب المكعب الطيفي الزائد، قم بإجراء تحقيقات مختلفة، مثل الحصول على الطيف المتوسط في مناطق محددة؛ توليد صورة RGB بلون زائف؛ خريطة القمم الطيفية؛ اطرح الخلفية.
3. لتقليل الضوضاء الطيفية التي قد تطغى على القمم المهمة، خاصة في أطياف رامان، نفذ تحليل القيمة المفردة (SVD)¹⁸ باتباع الخطوات التالية:
   1. أعد تشكيل المكعب الفائق الزمني إلى مصفوفة A مع تداخل على صفوفه.
   2. قم بإجراء SVD للمصفوفة، مع الحصول على مصفوفات U و S و V بحيث A = USV^T.
      ملاحظة: الأعمدة U هي التوزيعات المكانية لمتجهات V (الأعمدة)، بينما S هي مصفوفة قطرية ذات قيم مفرد (SVs) بترتيب تنازلي.
   3. أعد تشكيل كل عمود من U إلى مصفوفة من البكسلات وقم بتنفيذ FT ثنائي الأبعاد للحصول على تردداته المكانية.
   4. نظرا لأن الترددات العالية ترتبط بتغيرات مفاجئة جدا في الخريطة، اعتبرها ضوضاء؛ تعريف منطقة مربعة مركزة في فضاء فورييه المحسوب تفصل بين الترددات المنخفضة (خاصة الإشارة) والعالية (غالبا الضوضاء).
      ملاحظة: خيار محتمل لهذه المنطقة هو ضلع بقيمة 1/4 بالنسبة لحجم فضاء فورييه.
   5. احسب نسبة الإشارة المكانية (SSR) لكل SV عن طريق قسمة مجموع شدات البكسل (المعامل المركب) داخل الحدود على مجموع الشدة خارج الحدود. رسم SSR كدالة لعدد SV.
   6. حدد عتبة لمستوى SSR، أي عدد القيم المهمة التي يجب الاحتفاظ بها لتقليل مساهمة الضوضاء في مجموعة البيانات، وتجنب حدوث تشوهات.
      ملاحظة: عادة ما يظهر SSR اتجاها تنازليا يستقر ليصبح هضبة مع زيادة عدد القيم المفردة. قاعدة عامة هي الاحتفاظ بالقيم المفردة حتى النقطة التي يبدأ فيها الهضبة.
   7. اضبط جميع SVs السفلى على الصفر في المصفوفة القطرية S، للحصول على_{S غير ضوضاء،} وحساب مكعب زمني خال من الأضواء كU.S.
      ملاحظة: SVD هو تحليل مصفوفة يمكن تطبيقه أيضا على المكعب الطيفي المعاد تشكيله (مع صفوف تحتوي على أطياف بدلا من تداخلات).
4. كرر الخطوات 4.1-4.2 مع المكعب الزمني الخالي من الضوضاء لاسترجاع الطيف.
5. قم بتنزيل البرنامج من الرابط في المرجع¹⁹ لإجراء تحليل أعمق لمجموعة البيانات باستخدام خوارزمية MCR-ALS لدقة المنحنى متعدد المتغيرات (MCR-ALS).
   ملاحظة: يقدم مطورو البرمجيات وصفا مفصلا لخوارزمية²⁰. إنها طريقة تكرارية لحل مشكلة تحليل الخليط: حيث يعبر عن كل طيف كمزيج خطي من الأشكال الطيفية النقية. مع تمثيل مصفوفة: B = C R^T+E، حيث B هي مجموعة البيانات، C تحتوي على تركيزات لكل طيف، أعمدة R هي الأطياف المرجعية للمكونات، وE تعبر عن الخطأ.
   1. أعد تشكيل المكعب الفائق الطيفي إلى مصفوفة_{N بيكس} × N تردد، مع N_عدد بكسل إجمالي وطول متجه_تردد N.
   2. اختر عدد الأنواع المتوقعة في العينة وحمل أطياف المرجع الخاصة بها.
      ملاحظة: يمكن قياس أطياف المرجع لكل صبغة على حدة. وإلا، سيقوم البرنامج بعمل SVD لمجموعة البيانات ويستخدم عددا يعادل عدد المكونات الرئيسية التي تحدد المكونات المختارة للتخمينات الأولية.
   3. اختر القيود: يجب أن تكون الملفات الطيفية المسترجعة غير سالبة ومشابهة قدر الإمكان للأطياف المرجعية.
   4. رسم خريطة التركيز (أعمدة معاد تشكيلها من C) والأطياف (أعمدة R) لكل نوع.
   5. تصدير هذه الخرائط واستخدامها لإنتاج صورة بلون زائف (الشكل 4A)، وإنهاء التحليل.
      ملاحظة: البرامج المستخدمة للحصول على النتائج المعروضة هنا غير متاحة للجمهور، ولكن يمكن الحصول عليها من المؤلفين عند الطلب.

النتائج

يوضح الشكل 4A خريطة رامان لمنطقة مختارة من خليط المسحوق. وهو تمثيل بلون زائف لخرائط الوفرة التي تم استرجاعها باستخدام MCR-ALS، كما هو موضح في الخطوة 4.5. يوفر معلومات عن تركيب العينة، حيث يمكن تمييز الأنواع الثلاثة بوضوح ضمن مجال الرؤية. يوضح الشكل 4B متوسط الأطياف في المناطق المختارة من الخريطة، بدقة طيفية تبلغ 23 ^سم-1 محددة بطول المسح المختار. تسمح مجموعة المرشحات المختارة بقياس النطاق بين 105-2130 ^سم-1 (...

المناقشة

تم تقديم مجهر متعدد الوسائط واسع المجال FT لالتقاط صور تشتت رامان والتلميع التلقائية، وهو قابل للتطبيق في علوم المواد. وقد أظهر Candeo وآخرون ¹⁷ أن قابلية التطبيق على العينات البيولوجية، حيث قدموا صورة فلورية طيفية فائقة لخلايا بشرية مصبوغة. التحدي الرئيسي لقياسات تشتت رامان في هذا المجال هو منع تلف الضوئي الناتج عن تبديد الحرارة غير الفعال من منطقة مضاءة على نطاق واسع. حل محتمل هو تقليل امتصاص الطاقة باستخدام أطوال موجية إثارة أطول (مثل 785 نانومتر)، مع عيب خفض م...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أناتازي	كرونوس	1200	تعدد أشكال TiO2 الأبيض صبغة
مسحوق كبريتيد الكادميوم	كريمر بيغمنت GmbH & الشركة.	21060	أصفر كادميوم، مؤشر اللون داكن/PY35
الكاميرا	أندور	لوكا آر	كاميرا CCD مضاعفة للإلكترون بدقة 1004x1002 بكسل بدقة 8&ميكرو؛ M x 8µ m
فلتر التنظيف	سيمروك	LL01-532-12.5	&أوسلاش؛ 1/2" 2.0 نانومتر - فلتر خط ليزر FWHM عند 532 نانومتر
الغطاء المغلق	براند GmbH & الشركة	4700 55	أغطية المجهر الزجاجية البوروسيليكاتية بحجم 22x22x0.15 مم
المرآة ثنائية اللون	سيمروك	Di02-R532-25x36	مقسم شعاع ثنائي اللون أحادي الحافة بقطر 25.2x35.6 مم على عمق 532 نانومتر
الألياف	ثورلابز	M74L05	400&ميكرو؛ حجم النواة m، NA 0.39 ألياف متعددة الأنماط
الليزر	فوتونكس هوبنر	كوبولت سامبا 1000	ليزر مضخ بدايود CW عند 532 نانومتر، وأقصى قدرة 1000 ميلي واط
مرشح التمرير الطويل	سيمروك	LP03-532RU-25	مرشح حافة طويل شديد الانحدار عند 532 نانومتر
المجهر	لايكا	DMRBE	مجهر الأبحاث الثلاثي العيون
الهدف	لايكا	PL-FLUOTAR، 10x/0.30	هدف الإثارة والجمع بتكبير 10 أضعاف، 0.3 NA
الهدف	نيوبورت	إم-10X	عدسة موضوعية في مسار الإضاءة، بتكبير 10 أضعاف، 0.25 أم
روتيل	كرونوس	2900	تعدد أشكال TiO2 الأبيض صبغة
مرشح التمرير القصير	ثورلابز	FESH600	&أوسلاش؛ فلتر قصير التمرير بقطر 25.0 مم مع طول موجة قطع 600
الشرائح	مارينفيلد	1000612	شرائح المجهر 76x26x1 مم