مقالة منهجية

في المختبر إعادة تكوين شبكات الهيكل الخلوي داخل الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة المنفصلة عن الطور (GUVs)

2.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68530

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة إعادة تشكيل بسيطة من وعاء واحد لشبكات الهيكل الخلوي داخل حويصلات عملاقة مفصولة عن الطور. يمكن تعميم الطريقة وتطبيقها على تغليف أو حبس مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية.

الملخص

تستخدم الأغشية الدهنية المقلدة الحيوية على شكل حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) بشكل شائع لتقليد سلوك الغشاء الخلوي بسبب سهولة إعادة تكوين البروتين داخل GUVs ، والتصور ، بالإضافة إلى فهم ديناميكيات بروتين الغشاء الخلوي. ومع ذلك ، فإن أغشية الخلايا تتكون من طوافات دهنية (أو مجالات) تنشأ عن وجود دهون مختلفة في الغشاء الخلوي. يمكن دمج هذا التعقيد المتزايد في أنظمة النماذج لينتج عنه GUVs منفصلة عن الطور ، حيث يمكن ضبط تكوين الدهون بدقة. في حين أن طرق التغليف لتوليد GUVs المتجانسة معروفة على نطاق واسع ، فإن طرق تغليف البروتينات داخل GUVs المنفصلة عن الطور محدودة. هنا ، يقدم هذا البروتوكول إنتاجا مبسطا من وعاء واحد من GUVs المنفصلة عن الطور ، والتي تتألف من مجالات سائلة مضطربة (Ld) وسوائل مرتبة (Lo) ، وتغليف بروتينات الهيكل الخلوي المختلفة بكفاءة ، مثل FtsZ والأكتين ، مما يجعل الطريقة أداة متعددة الاستخدامات للحد الأدنى من إنتاج الخلايا. على وجه التحديد ، يستخدم هذا النهج بروتوكول نقل المستحلب لإنتاج GUVs ذات كفاءة تغليف عالية. في هذه الطريقة ، يتم إنشاء طبقة أحادية الدهون أولا عن طريق استحلاب محلول بروتيني في خليط دهني / زيت ، حيث يتم اختيار الدهون ذات درجات حرارة انتقال الطور المتغيرة لإنتاج فصل الطور في GUVs الناتجة. يتم نقل هذا المستحلب برفق فوق محلول دهني في الزيت في أنبوب آخر ، مما يؤدي إلى تكوين واجهة ماء وزيت. ثم يتم طرد المحلول في درجات حرارة مرتفعة (من الناحية المثالية عند 37 درجة مئوية للاحتفاظ بنشاط البروتين) ، وبعد ذلك يتم جمع GUVs للتصوير. تعمل هذه الطريقة على تبسيط إعادة التكوين في المختبر لبروتينات الهيكل الخلوي داخل GUVs المنفصلة عن الطور دون استخدام إعداد مختبر مرهق ، وبالتالي فهي بمثابة طريقة ملائمة لدراسة آليات تفاعلات الهيكل الخلوي والغشاء في الحبس.

المقدمة

تعمل الحويصلات العملاقة كأنظمة نموذجية لفهم الوظائف الخلوية1،2. إن سهولة إنتاجها ، وتصورها ، وقابليتها للضبط ، وإعادة تشكيل الجزيئات الحيوية في المختبر تجعل هذه النماذج الحيوية هي النظام المفضل للعديد من الدراسات البحثية3،4،5. هناك العديد من الطرق المعروفة لصنع GUVs ، مثل التشكيل الكهربائي6 ، cDICE7،8 ، نقل المستحلب ، وغيرها من الطرق القائمة على الموائعالدقيقة 9،10. تم الإبلاغ عن إنتاج GUV بهذه الأساليب في الأدبيات3،11. علاوة على ذلك ، في المختبر ، تم وصف إعادة تكوين شبكات الهيكل الخلوي داخل GUVs سابقا باستخدام طريقة نقل المستحلب نظرا لسهولة طريقة تكوين الوعاء الواحد هذه ، والتي لا تتطلب أي إعداد معقد12. ومع ذلك ، يتم الإبلاغ عن إعادة التكوين هذه بشكل شائع جدا في GUVs المتجانسة ، وهو نظام لا يحاكي تماما تعقيد الأغشية الخلوية.

يصف هذا البروتوكول إعادة التكوين في المختبر لشبكات الهيكل الخلوي داخل GUVs المنفصلة عن الطور ، مما يدل على تعقيد الغشاء الدهني. بينما تم الإبلاغ سابقا عن ارتباط هذه الشبكات على سطح الغشاء (خارج) ولكنها غير محصورة داخل الحويصلات العملاقة13،14 ، تركز تقنية نقل المستحلب الحالية على البروتوكول لإنتاج فصل الطور ، بالإضافة إلى الاحتفاظ بنشاط تكوين الشبكة للهيكل الخلوي. أحد التحديات الرئيسية في هذه التقنية هو درجة الحرارة. تتطلب طرق الإنتاج القياسية لتوليد GUVs منفصلة عن الطور استخدام درجات حرارة مرتفعة ، والتي تختلف اعتمادا على درجة حرارة انتقال الطور للدهون المكونة. ومع ذلك ، فإن بروتينات الهيكل الخلوي غير قادرة على البلمرة في هياكل ذات ترتيب أعلى عند درجات حرارة عالية15،16،17. وبالتالي ، لا يستخدم هذا البروتوكول تركيبة دهنية فقط لإنتاج فصل الطور في GUVs في درجة حرارة الغرفة ، ولكنه أيضا يحسن الظروف لإنتاج عائد جيد من GUVs في درجات حرارة فسيولوجية.

جانب آخر يجب مراعاته أثناء إنتاج أنظمة GUV المعاد تشكيلها هو حجم الجزيئات الحيوية المغلفة المطلوبة. بالنسبة لمعظم البروتينات ، يمكن أن يكون إنتاج كميات أكبر مكلفا ويستغرق وقتا طويلا ، ويتضمن عدة جولات تنقية. علاوة على ذلك ، تتطلب تجارب إعادة التكوين في المختبر عموما مرحلة استكشافية أولية حيث يتم اختبار تركيزات الجزيئات الحيوية ، وتركيبات العازلة ، وما إلى ذلك ، لأول مرة لتحقيق محتوى محلول داخلي محسن. وبالتالي ، يعمل هذا البروتوكول على تحسين بروتوكول إنتاج GUV لمقياسين مختلفين ، يتكيفان مع المباني المذكورة أعلاه. من ناحية أخرى ، يصف هذا البروتوكول فحصا واحدا يعمل على تحسين بروتوكول المستحلب المقلوب القياسي ، والذي يتضمن كميات أكبر نسبيا من البروتينات ويولد إنتاجا عالي الإنتاجية من GUV في أنابيب ، والتي يتم نقلها لاحقا إلى لوحات تصوير 96 بئرا. من ناحية أخرى ، فإن النهج الموصوف هنا يعمل أيضا على تحسين بروتوكول إنتاج GUV مفصولة الطور مباشرة في ألواح آبار التصوير ، والتي تستخدم كميات أقل من الجزيئات الحيوية (~ 1/4 من الكميات المطلوبة للإنتاج في الأنابيب) وتمكن من توليد GUV في سلسلة ، مما يحقق العديد من الظروف المغلفة في خطوة طرد مركزي واحدة. وبالتالي ، يعرض البروتوكول المقدم هنا طريقة تغليف واحدة ولكنه يسمح للمستخدم باختيار أي من الإعدادين بناء على متطلباته.

علاوة على ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة للتغليف لشبكتين مختلفتين للهيكل الخلوي: FtsZ و actin. نظرا لأن هذين البروتينين يتطلبان ظروفا مختلفة للمخزن المؤقت والازدحام ، فإن البروتوكول يعالج التغييرات الضرورية اللاحقة لتحقيق إعادة تشكيل الشبكة المثلى. لذلك ، يمكن استخدام النهج المقدم هنا وتعميمها لتغليف أي جزيئات حيوية مطلوبة داخل GUVs منفصلة عن الطور.

البروتوكول

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير خليط الدهون

  1. خذ 0.5 مل من الكلوروفورم في قارورة زجاجية سعة 5 مل. أضف 17.5 ميكرولتر DOPC ، و 7.4 ميكرولتر DOPG ، و 29.6 ميكرولتر DPPC (كلها من مخزونات دهنية 25 جم / لتر محضرة في الكلوروفورم) ، و 32.2 ميكرولتر من 10 جم / لتر DPPG و 20.6 ميكرولتر من 18 جم / لتر من الكوليسترول. أضف 1.2 ميكرولتر من صبغة 1 جم / لتر Atto655-DOPE. دوامة بلطف مزيج الدهون ، وتبخر الكلوروفورم تحت تدفق النيتروجين وإعادة تعليق الطبقة الرقيقة في ما مجموعه 400 ميكرولتر من الكلوروفورم.
  2. لتغليف FtsZ ، يكون مزيج الدهون النهائي المحضر بنسبة DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: CHOL (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 مول) المسمى ب 0.001 mol٪ Atto655-DOPE. لإنتاج GUVs مع الأكتين المجمعة المغلفة ، يحتوي مزيج الدهون على دهون بيوتينيل ، ويتم تحضيره بنسبة DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1) المسمى ب 0.001 mol٪ Atto655-DOPE.
  3. قم بإذابة مزيج الدهون (32 ملي مولار ، 50 ميكرولتر) في الكلوروفورم وجففها في قارورة زجاجية تحت تدفق غاز N2 لمدة ~ 15 دقيقة.
  4. ثم يتم تخزين القارورة الزجاجية تحت الفراغ في مجفف لمدة ~ 30 دقيقة للتخلص من أي آثار للكلوروفورم المتبقي.
  5. تفريق الفيلم المجفف في خليط من ديكان (20 ميكرولتر) والزيت المعدني (500 ميكرولتر) في القارورة الزجاجية لإنتاج التركيز النهائي من 3.2 ملي مولار والصوتنة في درجات حرارة مرتفعة (~ 50 درجة مئوية) لمدة ~ 30 دقيقة باستخدام سونيكاتير الحمام.
  6. انقل مزيج الدهون في الزيت إلى أنبوب واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 10 دقائق قبل الانتقال إلى الخطوات التالية.
  7. تحضير مزيج التغليف الداخلي للبروتينات.

2. تحضير الحلول الداخلية للتغليف

  1. خليط خيوط FtsZ
    1. تحضير خليط البروتين FtsZ بحجم إجمالي 10 ميكرولتر في أنبوب دقيق. بالنسبة للشبكة الخيطية FtsZ ، أضف 0.87 ميكرولتر من 23 ميكرومتر FtsZ-YFP-mts ، و 1.31 ميكرولتر من 381 جم / لتر Ficoll70 ، و 1.11 ميكرولتر من 271 جم / لتر BSA ، و 1 ميكرولتر من 25 ملي مولار GTP إلى 5.71 ميكرولتر من محلول تفاعل FtsZ (RB). الحجم الإجمالي للمحلول هو 10 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكرومتر FtsZ-YFP-mts ، و 50 جم / لتر Ficoll70 ، و 30 جم / لتر BSA ، و 2.5 ملي مولار GTP في المحلول النهائي. احتفظ بها على الجليد قبل استخدامها للتغليف داخل GUVs.
      ملاحظة: يحتوي المخزن المؤقت للتفاعل FtsZ (RB) على 50 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي مولار GluK ، 5 ملي مولار GluMg.
  2. خليط حزمة الأكتين
    1. لتغليف حزم الأكتين ، قم أولا بإعداد مزيج رئيسي من 10 ميكرولتر من الأكتين (A-Mix) يحتوي على 86٪ G-actin و 10٪ Atto488-actin و 4٪ أكتين بيوتينيل في الماء. في هذه الخطوة ، قم بإعداد محاليل مخزون البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 35.42 ميكرومتر من A-Mix ، أضف 6.39 μ لتر من 2 جم / لتر G-actin ، و 1.48 ميكرولتر من 1 جم / لتر Atto488-actin ، و 1.19 ميكرولتر من 0.5 جم / لتر من الأكتين البيوتينيل ، و 0.9 ميكرولتر H2O. استمر في وضع الثلج وقم بتغطيته من الضوء.
    2. لمنع البلمرة المسبقة وتجميع الأكتين خارج GUVs ، قم بإعداد محلول الأكتين النهائي قبل دقائق من التغليف. يتكون المحلول النهائي من 7٪ Iodixanol ، و 0.01 جم / لتر Neutravidin ، و 2.4 ميكرومتر A-Mix ، و 0.6 ميكرومتر Fascin ، و 10 جم / لتر BSA ، و 20 جم / لتر Ficoll70 ، و 5 ملي مولار ATP في مخزن بلمرة الأكتين.
      1. لتحضير هذا المحلول النهائي ، الذي يجب الاحتفاظ به على الجليد في جميع الأوقات ، أضف بالترتيب التالي: 2.92 ميكرولتر من 60٪ يوديكسانول ، 10.25 ميكرولتر H2O ، 2.5 ميكرولتر من 0.1 جم / لتر نيوترافيدين ، 0.92 ميكرولتر من 271 جم / لتر BSA ، 1.31 ميكرولتر من 381 جم / لتر Ficoll70 ، 2.5 ميكرولتر من 10x عازلة بلمرة الأكتين ، 1.69 ميكرولتر من 35.42 ميكرومتر A-Mix ، و 1.65 ميكرولتر من 9 ميكرومتر Fascin ، و 1.25 ميكرولتر من 100 mM ATP. تخلط جيدا وتأخذ بسرعة 5 ميكرولتر اللازمة للتغليف.
        ملاحظة: قم بقياس الأسمولية لهذا المحلول الداخلي باستخدام مقياس التناضح (~ 430 مللي أسم / كجم). يجب تحضير مزيج محلول خارجي مطابق بنفس الأسمولية عن طريق تخفيف الجلوكوز في الماء حتى الوصول إلى نفس قيمة الأسمولية (انظر الخطوة 3.2). يحتوي المخزن المؤقت لبلمرة الأكتين 10x على 100 ملي مولار Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 500 ملي مولار KCl ، و 50 ملي مولار MgCl2.

3. إنتاج GUV والتغليف في المختبر

  1. إنتاج GUV في الأنابيب: تغليف FtsZ
    1. لتغليف FtsZ ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل FtsZ (RB) في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل وأضف برفق 200 ميكرولتر من مزيج الدهون في الزيت (المحضر في الخطوة 1.6 أعلاه) للسماح بتكوين واجهة الزيت والماء وترسب طبقة أحادية الدهون في هذه الواجهة.
    2. لتشكيل المستحلب ، خذ أولا أنبوبا آخر سعة 1.5 مل وأضف 200 ميكرولتر من الدهون في الزيت. احتضان هذا الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 10 دقائق قبل تشكيل المستحلب.
    3. بمجرد التحضين ، أضف 5 ميكرولتر من مزيج البروتين FtsZ (المحضر في 2.1.1) إلى هذا الأنبوب. يغرق البروتين سعة 5 ميكرولتر في الوسط المائي في قاع الأنبوب على شكل قطرة.
    4. اصنع مستحلبا عن طريق النقر برفق على قاع الأنبوب 5-6 مرات حتى يصبح المحلول عكرا بشكل واضح.
    5. قم بتثبيت هذا المستحلب برفق وضعه فوق واجهة الزيت والماء (المحضرة في الخطوة 3.1.1 أعلاه).
    6. جهاز طرد مركزي هذا عند 6000 × جم لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة مسخنة مسبقا تبلغ 37 درجة مئوية وحافظ على درجة الحرارة هذه حتى نهاية إنتاج الحويصلة.
    7. اترك العينة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل التصوير.
    8. قم بإزالة الطبقة العليا من الزيت عن طريق سحب العينة برفق من أعلى الأنبوب ، مع ترك ما يقرب من 100-200 ميكرولتر محلول للتصوير.
    9. قم بقص طرف الماصة بزاوية مائلة بالمقص والتقط برفق 50-100 ميكرولتر من محلول GUV من أسفل الأنبوب. سيتم استخدام هذا الحل للتصوير.
  2. إنتاج GUV مباشرة في ألواح 96 بئرا: تغليف الأكتين
    1. لتغليف الأكتين ، قم أولا بإعداد مزيج محلول خارجي (الجلوكوز في الماء) بنفس الأسمولية مثل مزيج الأكتين الداخلي. لمطابقة ~ 430 mOsm / Kg من المزيج الداخلي ، قم بعمل مزيج محلول خارجي عن طريق إضافة 198 ميكرولتر من 2 M جلوكوز في 802 ميكرولتر H2O.
    2. لعمل الحويصلات مباشرة على صفيحة بئر ، قم أولا بتخميل بئر واحد من صفيحة 96 بئر. أضف 100 ميكرولتر من 10 جم / لتر BSA في البئر واحتضنه لمدة 10-15 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل البئر بمحلول خارجي سعة 100 ميكرولتر خمس مرات مع الحرص على عدم لمس قاع الزجاج المخمل بطرف الماصة. اترك 100 ميكرولتر من مزيج المحلول الخارجي في البئر بعد الانتهاء من الغسيل.
    3. أضف برفق 50 ميكرولتر من مزيج الدهون في الزيت إلى البئر لتحضير طبقة أحادية الدهون فوق المحلول الخارجي. لضمان الترسب الصحيح للزيت فوق الطور المائي ، ضع طرف الماصة على جانب واحد من البئر واترك الزيت ينزلق من جدار البئر.
    4. لتشكيل المستحلب ، خذ أولا أنبوبا سعة 1.5 مل وأضف 100 ميكرولتر من الدهون في الزيت. احتضان هذا الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 10 دقائق قبل تشكيل المستحلب.
    5. أضف 2.5 ميكرولتر من محلول الأكتين النهائي (من الخطوة 2.2.2) إلى الأنبوب الذي يحتوي على 100 ميكرولتر من مزيج الدهون في الزيت (الخطوة 1.6 أعلاه). يغرق البروتين 2.5 ميكرولتر في الوسط المائي في قاع الأنبوب كقطرة.
    6. اصنع مستحلبا عن طريق النقر برفق على قاع الأنبوب 10-20 مرة حتى يصبح المحلول عكرا بشكل واضح.
    7. قم بسحب هذا المستحلب برفق وضعه فوق واجهة الزيت والماء (المحضرة في الخطوة 3.2.3 أعلاه). اغمر طرف الماصة بعناية في منتصف طبقة الزيت الأحادية وقم بإيداع المستحلب. يشكل المستحلب سحابة عكرة محصورة في مرحلة الزيت أحادي الطبقة.
    8. قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 200 × جم لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة مسخنة مسبقا تبلغ 37 درجة مئوية وحافظ على درجة الحرارة هذه حتى نهاية إنتاج الحويصلة.
      ملاحظة: جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق لتقصير وقت إنتاج الحويصلة. ومع ذلك ، التزم بمعلمات الطرد المركزي هذه للحصول على أفضل النتائج. ينتج عن الطرد المركزي الذي يزيد عن 400 × جم حويصلات مضغوطة مع تراكم مجاميع دهنية في الجزء السفلي من لوحة التصوير.
    9. اترك العينة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل التصوير.
      ملاحظة: يمكن إجراء التصوير المباشر على بئر دون الحاجة إلى إزالة الطبقة العليا من الزيت أو نقل الحويصلات إلى غرفة / بئر أخرى.

4. التصوير وإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد

  1. خذ لوحة بئر تصوير 96 وقم بتخميلها باستخدام BSA لمدة ~ 10 دقائق قبل نقل العينة إلى لوحة بئر التصوير (انظر الخطوة 3.2.2).
  2. انقل محلول GUV إلى لوحة البئر المخملة.
  3. قم بإعداد لوحة البئر على مسرح المجهر متحد البؤر المقلوب على هدف مائي 40x.
  4. ركز على أي منطقة اهتمام (ROI) وخذ تسلسل صور z-stack من عائد الاستثمار المختار بفواصل زمنية ثابتة للخطوة. ينتج عن البروتوكول GUVs بحجم 5-30 ميكرومتر ، لذلك يمكن تثبيت الفاصل الزمني على 0.5-1 ميكرومتر ، حسب الحاجة.
  5. احفظ كل تسلسل صور z-stack بتنسيق .tiff.
  6. افتح تسلسل صور يثير اهتمامه في برنامج معالجة الصور (ImageJ/Fiji). حدد الصورة بأعلى كثافة. اضغط مع الاستمرار على ctrl+shift+c لفتح نافذة السطوع والتباين وانقر فوق تلقائي.
  7. من قائمة ImageJ / Fiji ، انتقل إلى تحليل > تعيين مقياس وأدخل المسافة المادية المعروفة ووحدتها لكل بكسل صورة.
  8. من قائمة ImageJ / Fiji ، انتقل إلى مشروع Image > Stacks > Z لإعادة بناء صورة ثلاثية الأبعاد من z-stack. قم بتعيين نوع الإسقاط على أنه انحراف معياري. يمكن استخدام الخيارات الافتراضية لبقية الإعدادات (شريحة البدء وإيقاف الشريحة).
    ملاحظة: احذر من القطع الأثرية لإسقاط الانحراف المعياري الناشئة عن تداخل مداخن z في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد. للتأكد من عدم وجود قطع أثرية ، قم بإزالة مداخن z في نصف الكرة السفلي من الكرة لمراقبة إسقاط النصف العلوي فقط.

5. التحليل الإحصائي لتردد GUV على أساس الحجم

  1. احصل على صور Z-stack لمركبات GUV ذات الأهمية، كما هو موضح في الخطوتين 4.4 و4.5. لتصوير أكبر عدد ممكن من GUVs في مجال رؤية واسع ، احصل على مكدسات متحد البؤر عند تكبير 1x أو 2x.
  2. افتح تسلسلات Z-stack في برنامج معالجة الصور (في هذه الحالة ، ImageJ / Fiji) ، كما هو موضح في 4.6.
  3. حدد قناة العرض حيث تم الحصول على إشارة مضان الغشاء بالنقر فوق الشريط المسمى c أسفل الصورة. اضبط سطوع الصورة وتباينها كما هو موضح في 4.6.
  4. تنقل عبر المستويات المختلفة المكتسبة من خلال النقر على شريط z أسفل الصورة المفتوحة. حدد المستوى الذي يكون فيه قطر الحويصلة المراد تحليلها هو الأكبر.
  5. افتح مدير عائد الاستثمار في ImageJ / Fiji بالنقر فوق تحليل أدوات > > مدير عائد الاستثمار.
  6. من الأدوات المتوفرة في لوحة ImageJ / Fiji الرئيسية ، انقر فوق التحديد البيضاوي.
  7. ارسم دائرة تناسب GUV باتباع شدة التألق لغشاء GUV. لرسم تحديد دائرة، اضغط على مفتاح shift واسحب الماوس لتوسيع الدائرة حتى حجم الحويصلة. يمكن تحريك تحديد الدائرة عن طريق النقر في نفس الوقت على زر الماوس الأيسر في وسط الحويصلة وسحب الماوس إلى الموقع المطلوب.
  8. قم بتخزين تحديد الدائرة المرسومة في مدير العائد على الاستثمار بالنقر فوق إضافة [t]، الموجود في لوحة الخيارات في مدير عائد الاستثمار.
  9. للحصول على حجم الحويصلة بالميكرون ، انقر فوق قياس موجود على لوحة مدير عائد الاستثمار. ستظهر نافذة جديدة. خذ القيمة المعروضة في العمود الرئيسي أو الثانوي (يجب أن يكون لكلا العمودين نفس القيمة التي يشيران إليها إلى محاور القطع الناقص) كقياس لقطر الحويصلة.
  10. استخدم برنامج التخطيط (Excel و Origin و Prism) لإنشاء رسم بياني شريطي حيث يتم تحديد جزء من GUVs لنطاقات أحجام مختلفة.

النتائج

كخطوة أولى ، تم إنتاج GUVs مع فصل طور الغشاء باتباع نهج مستحلب مقلوب معدل (الشكل 1 أ). ينتج عن هذا إنتاجية عالية من GUVs ، والتي تظهر غشاء مختلط إلى مجالات Ld و Lo ، كما يمثله ملصق Atto 655-DOPE على مجال Ld والمناطق المظلمة المقابلة لمجالات Lo غير المسماة (الشكل 1 ب). تنتج هذه الطريقة GUVs مفصولة عن الطور بأحجام تتراوح من 5-30 ميكرومتر (الشكل 1C) في درجات حرارة مرتفعة (جميع الخطوات التي يتم إجراؤها عند 37 درجة مئوية وتم تصويرها عند RT). علاوة على ذلك ، تم تعديل سرعات الطرد المركزي لضمان دمج الدهون المكونة الأصلية في GUVs وكذلك لتجنب الاكتظاظ السكاني المفرط.

علاوة على ذلك ، لإثبات التغليف الناجح للجزيئات الحيوية باستخدام طريقة المستحلب الموضحة في البروتوكول الحالي ، تم إعادة تشكيل كل من شبكات FtsZ والأكتين في تجارب فردية. يتم تلخيص شبكات FtsZ داخل GUVs ، والتي تظهر على شكل خيوط مرتبطة بشكل تفضيلي بمجالات L d عبر تسلسل استهداف الغشاء (MTS) في وجود 2.5 ملي مولار GTP و 50 جم / لتر Ficoll70 (كما هو موضح في الشكل 2). لوحظت الشبكات بعد حوالي ساعة واحدة من خطوة التغليف. ومع ذلك ، تظهر شبكات actomyosin كحزم رفيعة (على عكس الشبكات السميكة ل FtsZ) بعد إعادة التكوين داخل GUVs (الشكل 3). وتجدر الإشارة إلى أن الدهون الحيوية تلعب دورا مهما في ربط شبكات الأكتوميوسين بغشاء GUVs. بدون دهون بيوتينيل ، لا يمكن لحزم أكتوميوسين أن تتبنى تكوينا منحنيا وتبقى كحزم مستقيمة وقصيرة وقاسية عند التجويف بدلا من الالتصاق بالغشاء كشبكة متشابكة من الحزم الطويلة (الشكل 4).

في بروتوكول المستحلب المعدل ، يتم ضبط سرعة الطرد المركزي للحصول على GUVs منفصلة عن الطور ، كما ذكرنا سابقا. في الواقع ، تؤدي سرعات الطرد المركزي الأعلى مع العينات التي تحتوي على شبكات actomyosin (600 × g لمدة 15 دقيقة) إلى تجميع الحويصلات في تكوين يشبه الأنسجة داخل بئر الإنتاج. وهكذا ، في جميع تجارب إعادة التكوين القياسية لشبكات actomyosin ، تم ضبط سرعة الطرد المركزي المثلى على 200 × g للحصول على GUVs غير مجمعة (الشكل 5).

figure-results-1
الشكل 1: توليد وعاء واحد من المركبات الكهروضوئية المفصولة عن الطور باستخدام طريقة نقل المستحلب المزدوج. (أ) مخطط تجريبي للخطوات الرئيسية في إنتاج وعاء واحد للحويصلات المنفصلة عن طريق نقل المستحلب المزدوج. (ب) صورة الإسقاط Z متحد البؤر ل GUVs الناتجة التي تم إنشاؤها باتباع الطريقة الموضحة في A. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر. (ج) الرسم البياني الشريطي مع جزء من GUVs المنفصلة عن الطور المتولد وفقا لقطرها. التجارب التي أجريت ن = 3 ، العدد الإجمالي ل GUVs التي تم تحليلها لكل تجربة = 100. البيانات المعروضة كقيم متوسطة ، نقاط البيانات الفردية هي التجارب الثلاث المستقلة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري للتجارب الثلاث. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: حويصلات مفصولة عن الطور مع شبكات FtsZ مغلفة. (أ) صور إسقاط ثلاثية الأبعاد متحدة البؤر يتم إجراؤها على مكدس z مكتسبة بالكامل من GUV منفصل عن الطور يحتوي على شبكة FtsZ. (ب) صور الإسقاط Z متحد البؤر التي يتم إجراؤها على النصف العلوي فقط من الحويصلة. نظرا للتكوين غير المتجانس للمجالات على سطح GUV ، فإن إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للشرائح متحد البؤر المكتسبة تظهر تداخل المجالات الدهنية من المناطق العلوية والسفلية من الحويصلة. لمنع التداخل وتسهيل الفحص البصري للمجالات ، تتم إزالة النصف السفلي من مكدسات z التي تم الحصول عليها من الملف. ثم يتم استخدام النصف العلوي الناتج لإسقاطه ثلاثي الأبعاد عبر الانحراف المعياري. أشرطة المقياس كلاهما 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: حويصلات مفصولة عن الطور مع شبكات أكتوميوسين مغلفة. (أ) صور إسقاط Z متحدة البؤر لكومة كاملة مكتسبة مع عرض تصغير للبئر بعد إنتاج الحويصلة. يسمح العائد المرتفع للحويصلات التي تم الحصول عليها بدراسة هياكل actomyosin المختلفة داخل الحويصلات. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر. (ب) صور إسقاط Z متحدة البؤر يتم إجراؤها على النصف العلوي من الحويصلة. لتسهيل التحليل البصري لمجالات الدهون ، يتم استخدام النصف العلوي فقط من شرائح الصورة لإجراء عرض ثلاثي الأبعاد. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: أهمية الدهون الحيوية لتوليد شبكات أكتوميوسين مرتبطة بالغشاء داخل حويصلات مفصولة الطور. إسقاطات ثلاثية الأبعاد متحدة البؤر تصور حويصلات منفصلة عن الطور مع شبكات أكتوميوسين غير متصلة. إذا لم يتم دمج الدهون الحيوية في المزيج ، تتشكل هياكل أكتوميوسين عند التجويف ولا تكتسب تكوينا منحنيا على النشرة الداخلية للحويصلات (اللوحة اليمنى ، الأكتين المسمى ب Atto488). شريط المقياس هو 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تأثير سرعة الطرد المركزي على إنتاج حويصلات مفصولة عن طريق نقل المستحلب. صور ثنائية الأبعاد متحدة البؤر تظهر عينة GUV تم إنشاؤها عن طريق استخدام قوة طرد مركزي تبلغ 600 × جم لمدة 15 دقيقة. تؤدي سرعة الطرد المركزي المستخدمة ، أعلى من 200 × جم المحسنة ، إلى تجميع الحويصلات في تكوين يشبه الأنسجة داخل البئر. شريط المقياس هو 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يتمثل أحد التحديات الرئيسية لإعادة التشكيل في المختبر لأنظمة النماذج القائمة على الغشاء في تغليف البروتينات داخل GUVs مفصولة بشكل طور بسبب تحضيرها في درجات حرارة عالية. في الواقع ، يمكن أن يؤدي توليد هذا النوع من الحويصلات المنفصلة عن طريق التخليق في وعاء واحد إلى صعوبات تنشأ عن تدهور البروتينات في درجات حرارة مرتفعة. وبالتالي ، يصف هذا البروتوكول الظروف المثلى لمراقبة فصل طور الغشاء باتباع طريقة المستحلب المزدوج لإنتاج GUV في درجات حرارة فسيولوجية ، مع الحفاظ في نفس الوقت على نشاط البروتينات المغلفة. يقدم هذا النهج شحنة سالبة لكلا المجالين لتسهيل ارتباط أي بروتينات مرغوبة عندما تكون التفاعلات الكهروستاتيكية شرطا أساسيا. في حالة تغليف FtsZ ، على الرغم من وجود شحنة سالبة في كلا المجالين ، فإن شبكات الهيكل الخلوي تتطور وترتبط بشكل تفضيلي بمجالات Ld ، مما يشير إلى أنه إلى جانب الشحنة السالبة ، تعد سيولة الغشاء مطلبا أساسيا لربط البروتين18. علاوة على ذلك ، في حالة تغليف الأكتين ، تتطور الشبكات عبر مناطق الغشاء حيث يتم دمج الدهون البيوتينيل19.

على الرغم من أن مقايسة نقل المستحلب تستخدم على نطاق واسع في الأدبيات ، إلا أنها لم يتم تطبيقها إلا على إنتاج GUVs متجانسة. لذلك ، يتكون هذا البروتوكول من عدة جوانب معدلة من الفحص ، والتي تسمح بمراقبة تكوين المجال في الغشاء. أحد الجوانب الرئيسية في هذا الصدد هو درجة الحرارة. لمراقبة المجالات ، وكذلك للحفاظ على وظائف البروتينات (على وجه التحديد تكوين شبكة الهيكل الخلوي) ، يستخدم هذا البروتوكول 37 درجة مئوية لإنتاج GUVs. من ناحية أخرى ، عندما يتم إنتاج GUVs عند درجة حرارة أعلى ، تفقد البروتينات المغلفة وظائفها ، وتقيم في التجويف ولا تتبلمر في هياكل عالية المستوى. من ناحية أخرى ، إذا تم إنتاج GUVs عند درجة حرارة منخفضة ، فلن يلاحظ فصل الطور في الغشاء. وبالتالي ، تصبح 37 درجة مئوية درجة الحرارة المثلى لإنتاج GUV في التجارب.

من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يوفر نظامين محتملين للفحص لإنتاج GUVs باتباع نفس مبدأ نقل المستحلب: داخل الأنابيب وألواح الآبار. كلاهما يقدم مزايا وعيوبا ، والتي قد يحتاج المستخدم إلى أخذها في الاعتبار أثناء مرحلة التخطيط التجريبي لتحديد النظام الذي يناسب احتياجاته. في الواقع ، لا تتطلب الأنابيب البلاستيكية جهاز طرد مركزي مزود بدوار لألواح الآبار ، فهي أسهل في التعامل معها ، وتسمح بالتحكم في عامل تخفيف الحويصلات بعد الإنتاج وقبل التصوير. ومع ذلك ، فإنها تتطلب كميات أكبر (لكل من المراحل الزيتية والمائية) وإزالة طبقة الزيت بعد الإنتاج لاستخراج GUV ، مما قد يترك بقايا الزيت في بئر التصوير إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بعناية. بدلا من ذلك ، تتطلب ألواح الآبار استخدام حجم عينة أقل ، وتسمح بتغليف الظروف الداخلية المختلفة في سلسلة وفي وقت واحد ، ولا تتطلب استخراج GUV ، حيث يمكن تصوير الحويصلات مباشرة بعد الإنتاج في نفس بئر الإنتاج. العيب الرئيسي لألواح الآبار هو تجميع الحويصلات والحاجة إلى ضبط معلمات الطرد المركزي للوصول إلى عائد إنتاج حويصلة مماثل لتلك التي لوحظت في الأنابيب.

بغض النظر عن نظام التغليف المستخدم (الأنابيب أو ألواح الآبار) ، يوضح هذا النهج أن ظروف الازدحام المثلى مطلوبة لإنتاج GUVs ، وكذلك لتسهيل بلمرة البروتينات المغلفة. على وجه الخصوص ، باتباع هذا البروتوكول ، لوحظ أفضل حالة ل GUVs مع FtsZ مغلف مع 30 جم / لتر BSA و 50 جم / لتر Ficoll7018. بينما بالنسبة للأكتين ، كان هناك حاجة إلى خليط من 10 جم / لتر BSA و 7٪ يوديكسانول و 20 جم / لتر Ficoll7019.

جانب آخر مهم لإنتاج GUV هو سرعة الطرد المركزي والوقت. لتشكيل شبكات FtsZ تحت تركيزات الازدحام المذكورة أعلاه ، فإن الطرد المركزي عند 6000 × غرام لمدة 30 دقيقة يجعل مجموعة من GUVs موزعة بشكل جيد ومفصولة فوق لوحة بئر التصوير. على العكس من ذلك ، بالنسبة للأكتين ، يتيح 200 × جم لمدة 20 دقيقة توليد إنتاجية عالية من GUV. إذا انخفضت سرعة الطرد المركزي أو الوقت ، فإن عائد GUVs يتأثر ، بينما تؤدي زيادته فوق القيم المذكورة إلى تجميع GUVs. في ظل الظروف المذكورة ، يولد هذا البروتوكول GUVs بأقصى قدر من كفاءة التغليف بالإضافة إلى GUVs الفردية التي لا تلتصق ببعضها البعض.

في حين يمكن تعميم هذا البروتوكول على أي دهون وجزيئات حيوية مغلفة ، فإن تكوين الغشاء المطلوب ومحتويات الحويصلات تملي معلمات الطرد المركزي ، والتي تسمح بتوليد حويصلات مفصولة عن الطور. لذلك ، يعمل هذا البروتوكول كمبدأ توجيهي لتمكين إنتاج حويصلات متنوعة مع مجالات الغشاء.

تعد منهجيات إعادة التكوين في المختبر داخل GUVs المنفصلة عن الطور ضرورية لفهم ديناميكيات غشاء البروتين المعقدة بوساطة مجالات الدهون ، مع مراعاة تعقيد أغشية الخلايا14. إن الحجم الصغير والطبيعة الديناميكية للغاية لهذه المجالات الدهنية تجعل توصيف التفاعلات البينية أمرا صعبا في الجسم الحي. ومن ثم ، تعمل GUVs كأداة حيوية نظرا لسهولة تحضيرها النسبية وتعديلها الفيزيائي الكيميائي ، فضلا عن ملاءمتها للتحليل بواسطة المجهرالضوئي 20.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن تغليف الجزيئات الوظيفية داخل الواجهات الحيوية غير المتجانسة يقدم تطبيقات واعدة في مجال الطب النانوي. على وجه الخصوص ، تطوير أنظمة توصيل الأدوية الوظيفية ذات الخصائص المختلفة الناشئة عن التوزيع غير المتماثل وتقسيم الجزيئات الحيوية إلى مناطق محصورة على سطحها21. تلعب تفاعلات الأدوية والدهون دورا مهما في خصائص الحرائك الدوائية للأدوية ، مثل نقلها وتوزيعها وتراكمها ، مما يؤثر في النهاية على فعالية الأدوية المستخدمة22. لذلك ، فإن فهم دور هذه التفاعلات على خصائص الحركية الدوائية للأدوية أمر بالغ الأهمية في تطوير أدوية فعالة. يمكن استكشاف الأغشية الدهنية النموذجية لفهم آليات تفاعلها مع الببتيدات والبوليمرات والناقلات النانوية23. وبالتالي ، فإن التغييرات في التركيب الدهني للخلايا والأنسجة في بعض الحالات المرضية قد تغير التفاعلات الفيزيائية الحيوية ، والتي يمكن استكشافها لتطوير أدوية محددة الهدف وأنظمة توصيل الأدوية24.

في الختام ، يوفر البروتوكول الموصوف هنا استراتيجية سهلة لتوليد GUVs منفصلة عن الطور مع بروتينات مغلفة مثبتة على نشرة الدهون الداخلية. إن توليد هذه الأنظمة الحويصلية له استخدام واعد في مجالات مثل التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية ، حيث قد تجلب التجميعات متعددة المكونات ذات الوظائف المعقدة لتقليد الوظائف الشبيهة بالخلايا حلولا مبتكرة وتطبيقات جديدة.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يشكروا مرفق MPIB الأساسي للمساعدة في تنقية البروتين ، وميكايلا شابر لاستنساخ البلازميد ، وكيرستين رورل لتنقية البروتين ، وساندرا أورتماير لمستحضرات الدهون. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا Adrián Merino-Salomón و Shunshi Kohyama على المناقشات المفيدة حول ظروف الزحام وتغليف البروتين. م. ر. ل. هو جزء من IMPRS-ML ومشروع ONE MUNICH الذي تدعمه الوزارة الفيدرالية للتعليم والبحث (BMBF) بالإضافة إلى ولاية بافاريا الحرة في إطار استراتيجية التميز للحكومة الفيدرالية والولايات. يود المؤلفون أيضا أن يقدروا دعم مركز علوم النانو (CeNS) في ميونيخ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (ملح الصوديوم) (DOPG)دهون Avanti Polar840475في الكلوروفورم
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)AvantiPolar Lipids850375في الكلوروفورم
1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (غطاء البيوتينيل) (ملح الصوديوم) (18: 1 غطاء البيوتينيل PE)دهونأفانتي القطبية870273في الكلوروفورم
1،2-ديبالميتويل-SN-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (ملح الصوديوم) (DPPG)دهون أفانتي القطبية840455في الكلوروفورم
1،2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids850355في الكلوروفورم
96-بئر صفيحة مسطحة القاع (SensoPlate) أكتين
(عضلة هيكلية ألفا أكتين ، أرنب)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (عضلة هيكلية ألفا أكتين ، أرنب)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16مسحوق
حمام سونيكاتوربرانسون & nbsp ؛1510R-MTHمنظف بالموجات فوق الصوتية برانسونيك
بيوتين أكتين (عضلة هيكلية ألفا أكتين ، أرنب)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
جهاز طرد مركزيEppendorf5424R
طرد مركزيEppendorf5804 R
كلوروفورمسيجما ألدريتش67-66-3
الكوليسترول (الأغنام)Avanti Polar Lipids700000في الكلوروفورم
DecaneTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (إنسان ، مؤتلف)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)سيجما ألدريتشD1556
LSM800 ليزر متحد البؤر مجهر المسحكارل زايسC-Apochromat 40 & thinsp ؛ & مرات; &thinsp ؛ / 1.2 هدف الغمر في الماء. ليزر الحالة الصلبة الذي يتم ضخه بصمام ثنائي: 488 & thinsp ؛ نانومتر و 640 & thinsp; نانومتر.
الزيوت المعدنيةسيجما ألدريتش8042-47-5
الميوسين الثاني (عضلة الهيكل العظمي للأرانب) شركةالهيكل الخلوي (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
مقياس التناضحFiske AssociatesFiske Micro-Osmometer نموذج 120
Greiner Bio-One  جي إمإتش 07-000-109
جهاز بي

المراجع

  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FtsZ

مقالات ذات صلة