الكشف عن التمثيل الغذائي في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب 13درجة مئوية

Tomoto Ura; Keita Saito; Ryoma Kobayashi; Natsuko Miura; Yoichi Takakusagi

doi:10.3791/68539

مقالة منهجية

الكشف عن التمثيل الغذائي في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مفرط ^{الاستقطاب 13}درجة مئوية

DOI:

10.3791/68539

⸱

يوليو 8, 2025

Tomoto Ura¹^,² , Keita Saito¹ , Ryoma Kobayashi¹ , Natsuko Miura³ , Yoichi Takakusagi¹^,⁴

¹Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, ²Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, ³Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, ⁴Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يدمج هذا البروتوكول نظام مفاعل حيوي مصمم خصيصا مع التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب ¹³C لقياس استقلاب البيروفات في الوقت الفعلي في الخلايا الحية، مما يحسن قابلية التكاثر والدقة الحركية لدراسات التمثيل الغذائي وتطبيقات فحص الأدوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم البروتوكول طريقة لدمج نظام مفاعل حيوي مدمج داخليا مع التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ¹³درجة مئوية (NMR) مفرط الاستقطاب لقياس استقلاب البيروفات في الخلايا الحية في الوقت الفعلي. يحدد البروتوكول بناء نظام مفاعل حيوي يسمح بالتوقيت الدقيق لحقن الركيزة شديدة الاستقطاب واكتساب إشارة الرنين المغناطيسي النووي مع الحفاظ على بيئة مستقرة لزراعة الخلايا. تكتشف الطريقة بشكل موثوق التحويل الأيضي للبيروفات إلى اللاكتات خلال نافذة قياس 60 ثانية مع الحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء كافية طوال العملية. تعمل قدرة الخلط في الموقع للنظام على تسريع اكتشاف إشارة الرنين المغناطيسي النووي وتقليل خسائر الاسترخاء T₁. يتضمن البروتوكول أيضا تعليمات مفصلة لتحضير المواد الهلامية الجينات لتغليف الخلايا ووضعها داخل المفاعل الحيوي. تظهر الطريقة المقترحة قابلية استنساخ محسنة ودقة حركية مقارنة بالطرق التقليدية ، مما يشير إلى التطبيقات المحتملة في دراسات التمثيل الغذائي للسرطان وفحص الأدوية. قد تؤدي التحسينات الإضافية للنظام ، مثل اعتماد مصفوفات هلام بديلة ، إلى تحسين تعدد استخداماته في مختلف الدراسات البيولوجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعزز الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب ، لا سيما من خلال الاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) ، بشكل كبير شدة إشارة الرنين المغناطيسي^{النووي 1} ويتيح التتبع في الوقت الفعلي للتغيرات الأيضية مع حساسية محسنة^{بشكل كبير 2}^،³. تم تطبيق هذه التقنية بنجاح عبر أنظمة بيولوجية مختلفة ، بما في ذلك الخميرة⁴^،⁵ ، ونماذج الخلايا السرطانية⁶^،⁷^،⁸ ، والكائنات الحية الدقيقة⁹^،¹⁰. كما تم استخدامه لمراقبة مسارات التمثيل الغذائي الرئيسية مثل تحلل السكر¹¹^،¹² ، وتوازن الأكسدة والاختزال¹³^،¹⁴ ، وتنظيم الأس الهيدروجيني¹⁵^،¹⁶. بالإضافة إلى البحث الأساسي ، يتم الآن استخدام الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب في التصوير السريري من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي ، مما يسمح بتقييم التمثيل الغذائي من المقياس الخلوي إلى مقياس الجسم^{بالكامل 17}. تؤكد هذه التطورات الطلب المتزايد على بروتوكولات يمكن الوصول إليها تسهل الاستخدام الأوسع للرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب عبر سياقات بيولوجية متنوعة.

على الرغم من تعدد استخداماته ، إلا أن تنفيذ قياسات التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي في الخلايا الحية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب لا يزال يمثل تحديا تقنيا. غالبا ما تعتمد الأنظمة التقليدية على إعدادات معقدة خاصة بالمختبرات تفتقر إلى قابلية التكرار ويصعب تشغيلها بدون خبرة واسعة⁸^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰. يمثل هذا عائقا رئيسيا أمام الباحثين الذين يهدفون إلى اعتماد هذه التكنولوجيا للأبحاث البيولوجية أو الانتقالية. بالمقارنة مع الطرق البديلة مثل التصوير البصري أو قياس الطيف الكتلي ، يسمح الرنين المغناطيسي النووي مفرط ^{الاستقطاب 13}C بمراقبة غير جراحية وحلت بمرور الوقت لتفاعلات أيضية محددة دون أخذ عينات مدمرة. يوفر معلومات كيميائية حيوية مباشرة بدقة زمنية ، مما يجعله مناسبا تماما للدراسات الديناميكية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي.

لمعالجة هذه القيود ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا عمليا وقابلا للتكرار مصمما خصيصا لتمكين الباحثين من إجراء قياسات الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب لعملية التمثيل الغذائي للخلايا الحية مع الحد الأدنى من العقبات التقنية. يتم وصف طريقة شاملة للقياس الأساسي لعملية التمثيل الغذائي للبيروفات في الخلايا الحية. في حين أنه يمكن تطبيق هذا البروتوكول على ¹³مجسا آخر يحمل علامة C ، فإن البيروفات مناسب بشكل خاص بسبب امتصاصه الخلوي السريع ، ومسارات التمثيل الغذائي المميزة جيدا ، ودوره المركزي في التمثيل الغذائي الخلوي. يتكون الإجراء من: (أنا) تحضير عينات الخلايا ، (ثانيا) التغليف في المواد الهلامية الجينات ، (ثالثا) فرط الاستقطاب باستخدام مستقطب DNP ، و (رابعا) قياس الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الفعلي ¹³درجة مئوية في مطياف 400 ميجاهرتز (الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير المعلمات الرئيسية لبناء نظام المفاعل الحيوي لضمان قابلية التكرار والتوافق مع أجهزة الرنين المغناطيسي النووي القياسية. تم تحسين البروتوكول لسهولة التنفيذ باستخدام المكونات المتاحة تجاريا ويهدف إلى مساعدة الباحثين ، وخاصة أولئك الجدد في هذه التقنية ، على تحديد مدى ملاءمتها لاحتياجاتهم التجريبية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد المفاعل الحيوي (الشكل 2 أ - ب)

تجميع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي
1. استخدم أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ذو الغطاء اللولبي (قطره 10 مم ، الطول 178 مم) مع غطاء مفتوح لإدخال الأنابيب.
2. قم بإعداد حاجز قارورة سيليكون / PTFE (قطر 9 مم) وأدخل أنبوب PEEK من خلاله لإحكام الإغلاق (الشكل التكميلي 1).
3. أدخل الحاجز بأنبوب PEEK مقاوم كيميائيا (القطر الداخلي 1.0 مم ، القطر الخارجي 1.6 مم ، سمك الجدار 0.3 مم ، الطول 1 متر) في فتحة الغطاء المعدل.
4. ضع الحاجز بين أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وغطاءه المفتوح ، وثبته عن طريق إغلاق الغطاء بإحكام. يثبت هذا الإعداد الحاجز في مكانه ويوفر ختما كافيا لمنع التسرب أثناء التروية أو الحقن.
إعداد أنابيب توصيل متوسطة (الشكل 2C)
1. قم بتوصيل أنبوب PEEK بمنافذ مدخل ومخرج أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لتمكين التروية المستمرة. قم بتأمين التوصيلات باستخدام مجموعة تركيبات بدون حواف لمنع التسرب.
تركيب مكونات الاحترار المتوسط
1. قم بتوصيل أنبوب PEEK بمضخة تمعجية قابلة للتعديل بمعدل تدفق ثابت يبلغ حوالي 0.2 مل / دقيقة ، مما يضمن دورانا متوسطا مستمرا عبر مجموعة دوران خارجية. ضع الخزان المتوسط في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة الحرارة.
إضافة مكون منع تسرب الجل
1. قطع إسفنجة كثيفة لتناسب قطر أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. أدخل الإسفنجة في قاع الأنبوب لمنع تسرب هلام الألجينات مع السماح بالتدفق المتوسط.
تصنيع وإدخال مكون تثبيت الإسفنج المطبوع ثلاثي الأبعاد (الشكل 2D-F)
1. طباعة ثلاثية الأبعاد حامل أسطواني (القطر الخارجي 9.1 مم ، الطول 20 مم ، مع ثقب مركزي بقطر 1.5 مم) باستخدام راتنج فوتوبوليمر متوافق مع الطباعة ثلاثية الأبعاد الحجرية المجسمة وترد مواصفات التصميم في الملف التكميلي المرفق 1.
2. أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات (القطر الخارجي 1.5 مم ، القطر الداخلي حوالي 0.9 مم ، الطول 90 مم) من خلال الفتحة المشكلة مسبقا للحامل المطبوع ثلاثي الأبعاد.
3. قم بتوصيل الإسفنجة بالمنصة الموجودة على الحامل باستخدام راتينج قابل للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية مع خاصية مقاومة الماء. علاج لمدة 30 ثانية تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لضمان التصلب.
4. أدخل الحامل المجمع مع الإسفنجة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.

2. تحضير الخلية (ابدأ قبل أسبوعين من القياس)

قم بإذابة مخزون الخلايا المجمدة (SCCVII أو HeLa) بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. نقل ما يقرب من 1 × 10⁶ خلايا إلى 10 مل RPMI-1640 متوسط مكمل بمصل بقري جنيني 10٪ (حجم / حجم) و 1٪ (حجم / حجم) بنسلين ستربتومايسين.
زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ومرورها كل 2-3 أيام بمجرد الوصول إلى التقاء 70٪ -80٪. استمر في الاستزراع لمدة أسبوعين تقريبا للحصول على ~ 4 × 10⁷ خلايا ، تقدر بخمسة أطباق مقاس 10 سم نمت إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء (كل منها ينتج ~ 8 × 10⁶ خلايا).

3. تحضير جل الجينات

تحضير محلول الجينات
1. قم بإذابة مسحوق ألجينات الصوديوم من الدرجة البيولوجية في الماء منزوع الأيونات لتحضير محلول 2٪ (وزن / حجم). احتضن المحلول طوال الليل عند 25 درجة مئوية أو أعلى مع تقليب لطيف من طرف إلى آخر. استخدم مجموعة دوار الأنبوب عند حوالي 10-20 دورة في الدقيقة لمنع الفقاعات وضمان الذوبان المنتظم.
تغليف الخلايا في جل الجينات
1. أضف 2 مل من 0.25٪ (حجم / حجم) تريبسين-EDTA إلى الطبق مقاس 10 سم. قم بإمالة الطبق لتغطية السطح بالكامل وشفط التربسين EDTA الزائد.
2. احتضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
3. أضف 10 مل من وسط الثقافة إلى الطبق. مرر الماصة برفق لأعلى ولأسفل لفصل الخلايا. اجمع معلق الخلية بالكامل في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
4. خذ ما يقرب من 10 ميكرولتر من المعلق واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. عادة ما تكون هناك حاجة إلى حوالي 1 × 10⁷ خلايا للإجراءات اللاحقة ، ولكن يجب تأكيد العدد الفعلي عن طريق القياس.
5. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي عند 120 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من محلول الجينات 2٪ (وزن / حجم). الماصة ببطء لتقليل توليد الفقاعات.
تكوين الهلام عن طريق الربط المتقاطع للكالسيوم (الشكل 3)
1. أضف 10 مل من محلول CaCl₂ 50 ملي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل (الشكل 3 أ).
2. خذ 300 ميكرولتر من خليط الخلية والجينات في حقنة 0.5 مل مزودة بإبرة 30 جم و 10 مم ، وثبتها في غطاء أنبوب الطرد المركزي (الشكل 3 ب).
3. أغلق غطاء أنبوب الطرد المركزي بإحكام مع تثبيت المحقنة عليه وقم بالطرد المركزي للمجموعة بأكملها برفق عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المحلول الطافي بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الجل المحمل بالخلايا في الوسط (الشكل 3C-D).
تحميل الجل في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي
1. انقل الجل المغلف بالخلية إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي باستخدام ماصة باستور. أدخل تركيبات الإسفنج وتأكد من إحكام الإحكام.
2. قم بتسخين الخزان المتوسط مسبقا (يحتوي على 5٪ (حجم / حجم) D₂O) المحضر في الخطوة 1.3.2 في حمام مائي إلى 37 درجة مئوية وقم بتدويمه بمعدل 500 ميكرولتر / ساعة تقريبا لتحقيق الاستقرار في الظروف.
3. تأكد من عدم وجود تسرب قبل إدخال أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في المغناطيس. مع الحفاظ على أنبوب PEEK مستقيما ، أدخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في المغناطيس. اضبط حجم الجل ورقم الخرزة وسرعة سحب العينة وفقا لنوع الخلية والمتطلبات التجريبية.

4. تحضير مسبار مفرط الاستقطاب باستخدام مستقطب DNP (الشكل 4)

تحضير قارورة العينة
1. أضف 18 ميكرولتر من [^1-13درجة مئوية] حمض البيروفيك (14.2 م) مخدر ب 25 ملي مولار OX063 إلى قارورة عينة. قم بتوصيل القارورة بمسار السائل لنظام المستقطب DNP.
استقطاب العينة
1. أدخل القارورة في وحدة التجويف الخاصة بمستقطب DNP (6.7 طن ، 1.25 كلفن ، 1.2 ملي بار). استخدم تشعيع الميكروويف عند حوالي 188 جيجاهرتز (22 ميجاوات) لمدة 60-80 دقيقة.
إشارة المراقبة أثناء الاستقطاب
1. استخدم مطياف الرنين المغناطيسي النووي ذو الحالة الصلبة المدمج في نظام DNP لمراقبة شدة إشارة ¹³درجة مئوية. سجل بيانات الإشارة كل 5 دقائق باستخدام برنامج الرنين المغناطيسي النووي (SPINit).
قم بإذابة وتحضير المحلول المفرط الاستقطاب
1. قم بإذابة العينة المستقطبة بسرعة في 3.2 مل من محلول الذوبان المسخن مسبقا (40 ملي تريس ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 80 ملي هيدروكسيد الصوديوم ، 100 مجم / لتر EDTA). تأكد من وصول المحلول إلى درجة الحرارة البيولوجية (308-313 كلفن ، درجة الحموضة ~ 7) قبل نقله لقياس الرنين المغناطيسي النووي.
  ملاحظة: توخي الحذر عند التعامل مع مكونات الضغط العالي. قم بتسخين المخزن المؤقت للذوبان إلى ~ 461 كلفن لضمان النقل الفعال وسلامة العينة.

5. إعداد الرنين المغناطيسي النووي

تحضير مطياف الرنين المغناطيسي النووي
1. قم بتحميل العينة في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي وأدخلها في مقياس الطيف.
2. قم بإجراء القفل والضبط والمطابقة واللمعان على وحدة تحكم الرنين المغناطيسي النووي باستخدام الإجراء الآلي مع إدخال العينة ، لتحسين الدقة الطيفية واستقرار الإشارة.
إعداد معلمات الاستحواذ
1. قم بتحميل تسلسل اكتساب نبض ¹³درجة مئوية (على سبيل المثال ، zg2d) مع تمكين فصل البروتون (على سبيل المثال ، 13-CPD).
2. اضبط زاوية الوجه على 90 درجة باستخدام نبضة 1 ميكرو ثانية (P1). اضبط وقت الاستحواذ على 1.376 ثانية، والعرض الطيفي على 23,663 هرتز، وعدد نقاط الاقتناء (TD) على 65,536. اضبط تأخير الاسترخاء (D1) على 0 ثانية.
3. اضبط عدد الزيادات الزمنية (TD1) على 150 للحصول على 150 طيفا متسلسلا في الوضع ثنائي الأبعاد الزائف. اضبط كسب جهاز الاستقبال على قيمة منخفضة (على سبيل المثال ، ~ 1) لتجنب تشبع الإشارة من العينات شديدة الاستقطاب.
  ملاحظة: نظرا لكثافة الإشارة العالية للرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب ، اضبط كسب المستقبل على قيمة منخفضة (على سبيل المثال ، ~ 1) ، والتي تتوافق عادة مع أقل من 1٪ من الحد الأقصى للكسب المتاح. كسب المستقبل هو معلمة داخلية بدون وحدات تتحكم في تضخيم الإشارة. قد تؤدي القيم المرتفعة بشكل مفرط إلى تشبع الإشارة.

6. قياس الرنين المغناطيسي النووي

التحضير للقياس
1. املأ مسار أنبوب المدخل بالكامل من أنبوب المدخل إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي بمخزن الذوبان لتجنب انحباس الهواء (الشكل 2 ب). يتم استخدام أنبوب المدخل لكل من التروية المتوسطة وحقن المسبار شديد الاستقطاب.
2. تحقق بعناية من عدم وجود فقاعات هواء في أنبوب المدخل أو داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ، حيث يمكن أن تتداخل الفقاعات في هذه المنطقة مع اكتساب الإشارة أثناء قياسات الرنين المغناطيسي النووي.
التحضير لحقن محلول مفرط الاستقطاب
1. أوقف المضخة التمعجية لإيقاف الدورة الدموية المتوسطة مؤقتا قبل حقن المحلول مفرط الاستقطاب من خلال أنبوب المدخل.
2. ابدأ الاستحواذ الطيفي لمدة 10 ثوان تقريبا قبل إذابة الركيزة شديدة الاستقطاب لضمان التقاط الإشارة فور وصولها إلى موقع الكشف عن الرنين المغناطيسي النووي بعد الحقن.
3. ارسم 1 مل من المحلول بحقنة عند خروجه من مستقطب DNP.
حقن محلول مفرط الاستقطاب وتأكيد الإشارة
1. قم بتبديل الصمام ثلاثي الاتجاهات عند مدخل المفاعل الحيوي إلى الموضع B لحقن المحلول مفرط الاستقطاب في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي.
2. أعد الصمام إلى الوضع A بعد الحقن لاستئناف الدورة الدموية المتوسطة ومنع التدفق العكسي.
3. تأكد من نجاح الحقن ووصول الركيزة من خلال ملاحظة زيادة في إشارة الاضمحلال التعريفي الحر (FID) في برنامج الاستحواذ.

7. معالجة البيانات وتحليلها

معالجة البيانات الطيفية
1. قم بتحميل طيف الرنين المغناطيسي النووي الذي تم حله بمرور الوقت في برنامج معالجة البيانات. إذا تم تخزين البيانات بتنسيق ملف ser ، فحدد موقع الملف المناسب وقم بتحميله.
تحليل الأطياف
1. قم بإجراء تحويل فورييه (FT) لتحويل FID الخام إلى مجال التردد. قم بتطبيق تصحيح الطور إما يدويا أو تلقائيا. إجراء تصحيح خط الأساس لإزالة التشوهات.
تصور تحويل المستقلب
1. ارسم إشارات المسار الزمني للبيروفات C1 (~ 171 جزء في المليون) واللاكتات C1 (~ 183 جزء في المليون).
القياس الكمي للتحويل الأيضي
1. احسب المساحة الواقعة تحت المنحنى (AUC) لقمم البيروفات واللاكتات.
2. حدد نسبة [اللاكتات] / [البيروفات] بقسمة AUC للاكتات على نسبة البيروفات.
  ملاحظة: يتم إستخدام AUC بدلا من ذروة الارتفاع لتقليل تأثير القطع الأثرية الرنين الناجمة عن إشارة البيروفات الكبيرة شديدة الاستقطاب [1-¹¹³C]. يتم الحصول على قيم AUC عن طريق الجمع البسيط لشدة الإشارة ضمن نطاق التكامل المحدد لكل ذروة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة ، تم إقران نظام ملفق بالتحليل الطيفي المغناطيسي النووي ¹³درجة مئوية مفرط الاستقطاب لقياس استقلاب البيروفات في الخلايا الحية في الوقت الفعلي. تتوافق الإشارات الرئيسية المكتشفة في طيف الرنين المغناطيسي النووي 1D ¹³C مع البيروفات (حوالي 171 جزء في المليون) واللاكتات (حوالي 183 جزء في المليون) ²¹ ، مما يسمح لنا بتقييم التحويل الأيضي للبيروفات إلى لاكتات في ظل الظروف الفسيولوجية (الشكل 4).

الجودة الطيفية وديناميات الإشارة
تظهر النتائج التمثيلية من القياسات المتكررة على نفس العينة باستخدام خلايا SCCVII - خط سرطان الخلايا الحرشفية للفأر الذي يستخدم بشكل متكرر في دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي شديد الاستقطاب - في الشكل 5. أظهر القياس الأول زيادة واضحة في إشارة اللاكتات ، مما يشير إلى التحويل الأيضي النشط. ومع ذلك ، أظهرت القياسات اللاحقة التي تم إجراؤها على فترات 1.5 ساعة انخفاضا تدريجيا في نشاط التمثيل الغذائي. من المحتمل أن يعكس هذا الانخفاض المعتمد على الوقت الإجهاد البيولوجي أو التكيف الناجم عن حقن البيروفات الأولي. والجدير بالذكر أنه تم الإبلاغ عن تعديل استقلابي عابر مماثل في الجسم الحي باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مفرط الاستقطاب و EPRI ، حيث انخفض أكسجة الورم مؤقتا بعد إعطاء البيروفات²². توضح هذه النتائج أن تكرار هذه القياسات يتيح التتبع غير المدمر للتغيرات الأيضية الديناميكية - وهي ميزة يصعب تحقيقها بالطرق المدمرة²³.

لتقييم قابلية تطبيق هذا البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى ، تم إجراء قياسات إضافية باستخدام خلايا HeLa ، وهي سلالة خلايا سرطانية بشرية مستخدمة على نطاق واسع. كما هو موضح في الشكل 6 ، أظهرت خلايا HeLa أيضا تحويلا واضحا من البيروفات إلى اللاكتات. على الرغم من أن شدة الإشارة انخفضت تدريجيا بسبب استرخاء T₁ ، إلا أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ظلت كافية طوال فترة الاستحواذ 60 ثانية. تشير هذه النتائج إلى أن البروتوكول الحالي قابل للتطبيق على نطاق واسع ويمكن أن يكون بمثابة أداة متعددة الاستخدامات للتنميط الأيضي في الوقت الفعلي في أنواع مختلفة من الخلايا.

في حين أن اضمحلال الإشارة السريع هو قيد متأصل في الرنين النووي المستند إلى DNP ، فإن نظام الخلط في الموقع يقلل من التأخير بين الذوبان والقياس ، وبالتالي تعزيز حساسية الكشف. قد تؤدي التحسينات الإضافية ، مثل تحسين تكوين مصفوفة الهلام ، إلى توسيع قابلية تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من الأنظمة البيولوجية.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل الكلي من زراعة الخلايا إلى قياس الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب. تبدأ العملية بزراعة الخلايا (~ 2 أسابيع) ، متبوعا بتحضير جل الجينات (~ 60 دقيقة) لتغليف الخلايا لقياس مستقر. بعد ذلك ، يتم إجراء فرط الاستقطاب باستخدام نظام مستقطب DNP (~ 60 دقيقة) ، ويتم إجراء قياس الرنين المغناطيسي النووي باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي 400 ميجاهرتز (~ 5 دقائق). تظهر الصور الموجودة على اليمين الأدوات المقابلة المستخدمة في سير العمل هذا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إعداد المفاعل الحيوي لقياس الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب. (أ) رسم تخطيطي لإعداد المفاعل الحيوي. يتم إدخال وسط الاستزراع في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي من خلال المدخل A ثم يتم توجيهه لاحقا إلى النفايات. يتم وضع حبات الجينات التي تحتوي على خلايا حية داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. أثناء قياسات الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب ، يتم حقن المسبار مفرط الاستقطاب من خلال المدخل B ، المسمى على أنه مدخل المسبار شديد الاستقطاب. (ب) صورة لإعداد المفاعل الحيوي بأكمله ، مع وضع علامة واضحة على أنبوب المدخل والمخرج (ج) منظر عن قرب لمفتاح أنبوب المدخل ، يظهر المدخل A (التروية المتوسطة) والمدخل B (حقن المسبار مفرط الاستقطاب). (د) تصميم CAD و (ه) صورة تمثيلية لمكون تثبيت الإسفنج المطبوع ثلاثي الأبعاد الموجود داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. يشتمل المكون على ثقب لتوجيه الشعيرات الدموية الزجاجية التي توفر محلول الركيزة شديدة الاستقطاب ومنصة لحمل الإسفنجة. المكون نفسه لا يتناسب بإحكام مع الجدار الداخلي لأنبوب الرنين المغناطيسي النووي ؛ (F) بدلا من ذلك ، يتم إدخال إسفنجة حولها لملء الفجوة. يعمل هذا الهيكل على استقرار المكون ويسمح لوسط النفايات بالتدفق لأعلى عبر الإسفنج ، مما يلغي الحاجة إلى فتحة مخرج إضافية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تحضير جل الجينات. (أ) رسم تخطيطي و (ب) صورة فوتوغرافية لجهاز تشكيل كرة جل الجينات. تظهر الصورة اليسرى الإعداد بأكمله ، بما في ذلك أنبوب الطرد المركزي مع حقنة مثبتة على غطاءها المعدل. تظهر الصورة العلوية اليمنى غطاءا به فتحة صغيرة لطرف المحقنة، بينما تظهر الصورة السفلية اليمنى غطاءا بفتحة مربعة لوضع المحقنة بشكل ثابت. يتم ملء أنبوب الطرد المركزي مسبقا ب 10 مل من محلول كلوريد الكالسيوم ، مما يسمح لمحلول الجينات الخارج من طرف المحقنة بالخضوع للتبلور ، وتشكيل كرات هلام الجينات. (ج) صورة مجهرية تمثيلية توضح مورفولوجيا كرات هلام الجينات. (د) صورة مجهرية تمثيلية توضح مورفولوجيا كرات هلام الجينات التي تحتوي على خلايا هيلا. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التمثيل التخطيطي لخطوات التحضير لقياس الرنين المغناطيسي النووي وفرط الاستقطاب. أثناء عملية تراكم DNP ~ 60 دقيقة ، يتم إجراء إعداد الرنين المغناطيسي النووي بالتوازي لتقليل التأخير. يتضمن التحضير تحميل حبة الجينات في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ، متبوعا بتعديل قفل ¹H ، واللمعة ، وضبط المسبار للتأكد من أن النظام جاهز للقياس الفوري. بعد الذوبان والخلط في الموقع ، يكشف التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي ^{النووي 13}درجة مئوية الذي تم حله بمرور الوقت عن قمم البيروفات واللاكتات الواضحة. تتوافق القمم التي لوحظت عند حوالي 171 جزء في المليون و 179 جزء في المليون و 183 جزء في المليون مع البيروفات وهيدرات البيروفات واللاكتات على التوالي. تم استخدام ما يقرب من 4 × 10⁷ خلايا هيلا مغلفة في هلام الجينات لقياس الرنين المغناطيسي النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: الكشف عن إشارات البيروفات واللاكتات التي تم حلها بمرور الوقت في القياسات المتكررة. تم الحصول على أطياف الرنين المغناطيسي النووي ^{شديدة الاستقطاب 13}درجة مئوية من نفس العينة المغلفة بخلايا SCCVII على فترات 1.5 ساعة لتقييم جدوى القياسات المتكررة غير المدمرة. يتم رسم شدة الذروة Pyruvate (الدوائر المفتوحة) واللاكتات (الدوائر المملوءة ، بمقدار 1000×) بمرور الوقت لكل عملية استحواذ. (أ) القياس الأول. (ب) يكشف القياس الثاني ، بعد 1.5 ساعة ، عن انخفاض ملحوظ في إنتاج اللاكتات. (ج) أكد القياس الثالث ، بعد 1.5 ساعة أخرى ، نشاطا استقلابيا منخفضا مستمرا. أظهر التحليل الكمي المستند إلى المساحة تحت المنحنى (AUC) أن نسبة [اللاكتات] / [البيروفات] انخفضت من 0.00134 (القياس الأول) إلى 0.00019 (الثانية) و 0.00027 (الثالثة). كان تركيز الخلية النهائي في هلام الجينات حوالي 1.0 × 10⁷ خلايا / مل (4 × 10⁷ خلايا في 4 مل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: تحويل البيروفات إلى لاكتات في خلايا HeLa. تم قياس إشارات الرنين المغناطيسي النووي مفرطة ^{الاستقطاب 13}درجة مئوية التي تم حلها بمرور الوقت من البيروفات واللاكتات في خلايا HeLa الحية. يتم تطبيع شدة إشارة البيروفات إلى قيمتها القصوى في الوقت صفر. يتم قياس شدة إشارة اللاكتات بمعامل 10³ للرؤية. أظهر التحليل الكمي المستند إلى المنطقة تحت المنحنى (AUC) نسبة [اللاكتات] / [البيروفات] 0.00121. كان تركيز الخلية النهائي في هلام الجينات حوالي 7.5 × 10⁶ خلايا / مل (3 × 10⁷ خلايا في 4 مل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1. صور تمثيلية للحاجز القارورة المستخدم في نظام المفاعل الحيوي. (أ) الحاجز السيليكوني / PTFE (قطر 9 مم) قبل الاستخدام. (ب) نفس الحاجز في الاستخدام الفعلي ، مع إدخال أنبوب PEEK من خلال ثقوب مثقوبة. تسمح مرونة مادة الحاجز بإعادة الإغلاق حول الأنبوب ، والحفاظ على ظروف محكمة الإغلاق أثناء حقن الركيزة شديدة الاستقطاب. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الرقم

الشكل التكميلي 2: طيف الرنين المغناطيسي النووي المفرط ¹³درجة مئوية الذي تم حله بمرور الوقت بعد الخلط الخارجي. تم قياس الطيف التمثيلي الذي تم حله زمنيا لعملية التمثيل الغذائي للبيروفات [^1-13درجة مئوية] باستخدام نظام الرنين المغناطيسي النووي على الطاولة بعد الخلط الخارجي للبيروفات مفرط الاستقطاب والخلايا خارج أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الرقم

الملف التكميلي 1: تصميم CAD للحامل الأسطواني. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الحاسمة للبروتوكول
يعتمد نجاح هذا البروتوكول على عدة خطوات حاسمة. أولا ، من المهم ضمان الذوبان والنقل المناسبين للبيروفات شديدة ^{الاستقطاب 13}درجة مئوية للحفاظ على نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية. لالتقاط التحويل الأيضي المبكر للبيروفات إلى لاكتات ، يجب مزامنة توقيت حقن المسبار شديد الاستقطاب واكتساب الرنين المغناطيسي النووي. علاوة على ذلك ، من المهم الحفاظ على صلاحية الخلية طوال التجربة. قد تؤدي الانحرافات عن هذه المعلمات إلى انخفاض نشاط التمثيل الغذائي وفقدان الإشارة.

تعديلات الطريقة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
بينما يوفر هذا البروتوكول نهجا قويا لمراقبة التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي ، فإن بعض التعديلات قد تحسن قابليتها للتطبيق. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي ضبط زاوية الوجه لاكتساب الرنين المغناطيسي النووي إلى موازنة شدة الإشارة واضمحلال الاستقطاب لتحسين جمع البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، على الرغم من إدخال طريقة لإعداد المواد الهلامية الألجينات بثبات بحجم معين ، إلا أنه يمكن تعديل حجم المواد الهلامية المراد إنشاؤها بسهولة عن طريق اختيار حقنة أو إبرة. يمكن أن يساهم هذا في إعادة إنتاج بيئة نقص الأكسجين²⁴ بالإضافة إلى منع الخلايا من الهروب من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي. بالإضافة إلى ذلك ، يصبح جل الجينات كثيفا ولزجا داخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ، خاصة في منطقة قياس الرنين المغناطيسي النووي. إذا دخل الهواء عند حقن وسط الثقافة أو المسبار مفرط الاستقطاب من أنبوب PEEK ، فمن المحتمل أن يظل في موقع قياس الرنين المغناطيسي النووي ، مما سيؤدي إلى انخفاض في جودة الطيف.

قيود الطريقة
على الرغم من أن القياسات مفرطة الاستقطاب لها ميزة الحساسية العالية لإشارات الرنين المغناطيسي النووي ، إلا أن لها قيودا متأصلة. نظرا لاسترخاء T₁ للبيروفات ¹³درجة مئوية مفرط الاستقطاب ، تقتصر مدة قياسات التمثيل الغذائي على حوالي 1 دقيقة ، مما يحد من ملاحظة التحولات الأيضية طويلة المدى. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب قياس عينة الخلية بعد عدة ساعات من قياسها مرة واحدة ، والتي قد تكون مرتبطة بتقطير كمية كبيرة من البيروفات في قياس واحد. هذا هو نفس حقيقة أن المجموعات ذات الصلة قد قامت بقياس الأطياف بعد يوم^{واحد 18} ، ويجب أن يكون فاصل القياس طويلا.

أهمية الطريقة مقارنة بالتقنيات الحالية
بالمقارنة مع فحوصات التمثيل الغذائي التقليدية ، تتمتع طريقتنا بميزة على قياسات نقطة النهاية مثل قياس الطيف الكتلي والمقايسات الكيميائية الحيوية من حيث أنها توفر نظرة ثاقبة في الوقت الفعلي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي. على الرغم من أنه يمكن الحصول على أطياف الرنين المغناطيسي النووي المماثلة شديدة الاستقطاب دون استخدام مفاعل حيوي ، إلا أن القدرة على بدء القياسات على الفور مع الخلط في الموقع مفيدة ، نظرا لسرعة الاسترخاء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ضبط الخلايا مسبقا في بيئة مستقرة قبل الحقن ، مما يحسن قابلية التكاثر والدقة الحركية لتحليل التمثيل الغذائي. يتم دعم هذه الميزة من خلال تجربة تكميلية (الشكل التكميلي 2) ، حيث تم الحصول على الأطياف التي تم حلها بمرور الوقت باستخدام نظام الرنين المغناطيسي النووي على الطاولة بعد الخلط الخارجي. في هذا الإعداد ، أدى تأخير حوالي 30 ثانية بين الخلط واكتساب الإشارة إلى فقدان كبير في الاستقطاب ، مما أثر بشكل خاص على اكتشاف اللاكتات. هذا يؤكد أن الخلط في الموقع يحسن دقة القياسات الحركية في ظل ظروف اضمحلال T₁ السريع. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن شدة الإشارة في هذا الإعداد في الموقع كانت أقل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى التخفيف الناجم عن التروية المتوسطة - وهي مشكلة لا يزال يتعين تحسينها.

الأهمية والتطبيقات المحتملة
قد تمهد هذه الطريقة الطريق لتطبيقات في فهم الخصائص الأيضية لأشكال الحياة المتنوعة. يمكن القياس في الوقت الفعلي للتدفقات الأيضية للباحثين من تقييم تأثيرات مثبطات التمثيل الغذائي ديناميكيا. قد يؤدي دمج هذا النهج مع تقنيات القياس الأخرى إلى زيادة تعزيز دقة تحليل التمثيل الغذائي داخل الخلايا.

نحن نتصور سير عمل تجريبيا عمليا يتم فيه استخدام التمثيل الغذائي المدمر عالي الإنتاجية لتحديد المسارات المرشحة ، متبوعا بالتحقق في الوقت الفعلي باستخدام الرنين المغناطيسي ^{النووي 13}C مفرط الاستقطاب لتقييم وظيفة الإنزيم وديناميكيات التدفق في الخلايا الحية. يتيح هذا النهج الكشف المباشر عن الاستجابات الأيضية العابرة في ظل الظروف الفسيولوجية - وهو أمر يصعب تحقيقه باستخدام المقايسات المناعية أو مستشعرات التألق ، والتي تقيس عادة مستويات مستقلبات الأيض الساكنة أو تتطلب مجسات خارجية. في حين أن التصوير الفلوري والمقايسات المناعية لا غنى عنهما للتوطين المكاني والفحص عالي الإنتاجية ، على التوالي ، فإن الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب يوفر قراءة وظيفية تكميلية تلتقط حركية التفاعل بطريقة غير مدمرة. لا تسهل هذه الإستراتيجية الرؤى الميكانيكية على المستوى الخلوي فحسب ، بل تعمل أيضا كجسر نحو التطبيقات التشخيصية على نطاق الأنسجة أو الكائن الحي. على وجه الخصوص ، قد تدعم القدرة على التقاط التحولات الأيضية الوظيفية في الوقت الفعلي الكشف المبكر عن اضطرابات التمثيل الغذائي والاستجابات العلاجية في الأنظمة البيولوجية المعقدة.

كما تم إحراز تقدم في تطوير مجسات التمثيل الغذائي التي تستهدف مسارات التمثيل الغذائي المتنوعة والركائز الاصطناعية المصممة لإنزيمات معينة ، مما يوسع إمكانيات أبحاث التمثيل الغذائي²⁵^،²⁶. علاوة على ذلك ، فإن التطورات في تقنيات فرط الاستقطاب ، مثل توصيل ركائز مفرطة الاستقطاب مباشرة من المستقطب إلى الرنين المغناطيسي النووي عبر نفق مغناطيسي²⁷ - قد تحسن الاحتفاظ بالإشارة وتوسع التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة في البحوث الطبية الحيوية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI Grant Number 23KJ2179 و 24K17833 (إلى T.U.) ، 23K27561 (إلى YT) ؛ MEXT Q-LEAP [JPMXS0120330644 (إلى YT)]؛ و MEXT تعزيز تطوير مشروع مشترك للاستخدام / نظام البحث: تحالف الجامعات من أجل برنامج التميز البحثي (CURE) منحة رقم JPMXP1323015488 (برنامج Spin-L رقم spin24XQ007).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
[1-¹³C] حمض البيروفيك	كامبريدج إيسوت أوبي لابراتز ، إنك	CLM-8077
طابعة ثلاثية الأبعاد	إليجو	زحل 2
كلوريد الكالسيوم	شركة Nacalai Tesque، Inc.	06729-55
D₂O	سيجما ألدريتش	151882
طقم الدوران الخارجي للمضخة	كواحد	1-4141-02
مصل الأبقار الجنينية	جيبكو	10270106
طقم تركيب Flangeless	GL Sciences Inc.	6010-46390
الشعيرات الدموية الزجاجية مع النواة	ناريشيجي	GDC-1.5	القطر الداخلي ~ 0.9 مم ، الطول 90 مم
مضخة التعميم المغناطيسية	كواحد	1-4141-01
ميس رينوفا	أبحاث Mestrelab		برنامج المعالجة والتحليل الطيفي للرنين المغناطيسي النووي
حقنة اللقطة الخاصة بي	شركة نيبرو	8277	0.5 مل / 100 وحدة ، 30 جرام × 10 مم ، 140 قطعة
أوكس 063	شركة أكسفورد إنسترومنتس المحدودة و Polarize IVS Co. Ltd.	-
أنبوب نظرة خاطفة	كواحد	3-780-05
البنسلين - الستربتومايسين	شركة Nacalai Tesque، Inc.	26252-94
مضخة بيزيو ميني تمعجتيكية	أتو	1221200	دقة عالية ، نوع معدل تدفق واسع لتدفق متوسط مستقر
راتينج	سرايا تك	أسود مدخن
RPMI-1640 متوسط	شركة Nacalai Tesque، Inc.	30264-85
سيليكون / PTFE قارورة الحاجز	GL Sciences Inc.	1030-50009
ألجينات الصوديوم 80-120	شركة فوجي فيلم واكو بيور كيماويات	194-13321
برنامج SPINit	RS^{2< / sup>D}		برنامج الرنين المغناطيسي النووي في مستقطب DNP
إسفنج	-	-	إسفنجة متوفرة تجاريا مقطوعة حسب الحجم لتثبيت الجل
محبس ثلاثي الاتجاهات	كواحد	3-6247-04
توب سبين	بروكر		برنامج الحصول على بيانات الرنين المغناطيسي النووي ومعالجتها
التربسين-EDTA (0.25٪)	ثيرمو فيشر العلمي	07086-74
راتنج قابل للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية	بونديك	BD-SKCJ
حمام مائي	كواحد	1-5832-41	الروبوت الحراري TR سلسلة TR-1 &alpha ؛ للحفاظ على 37 ° درجة حرارة C
أنبوب الرنين المغناطيسي النووي Wilmad ذو الغطاء اللولبي	سيغما	Z271977	التردد 400 ميجاهرتز ، القطر 10 مم ، الطول 178 ملم.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).
Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function. Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).
Balzan, R., et al. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J Vis Exp. (108), e53548(2016).
Liu, M., Hilty, C. Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR. Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).
Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast. Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).
Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).
Rao, Y., et al. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).
Mathiassen, T. B. W., et al. Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system. J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).
Meier, S., et al. Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life. Molecules. 29 (17), 4133(2024).
Sriram, R., et al. Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate. ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).
Park, J. M., et al. Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo. J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).
Singh, J., et al. Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules. NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).
Bohndiek, S. E., et al. Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo. J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).
Yamamoto, K., et al. Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine. Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).
Düwel, S., et al. Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid. Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).
Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester. Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).
Eills, J., et al. Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance. Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).
Keshari, K. R., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism. Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).
Sriram, R., et al. Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor. NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).
Mangas-Florencio, L., et al. A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy. Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).
Hill, D. K., et al. Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data. PLoS One. 8 (9), e71996(2013).
Saito, K., et al. 13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors. Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).
Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI. Mol Cancer. 15, 43(2016).
Read, G. H., et al. Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).
Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. Hyperpolarized NMR probes for biological assays. Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).
Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging. Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).
Milani, J., et al. A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids. Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الكشف عن التمثيل الغذائي في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي مفرط ^{الاستقطاب 13}درجة مئوية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة