يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عضويات القرنية المشتقة من iPSC الخاصة بالمريض للتحقيق في اضطرابات القرنية المرتبطة بالأنيريديا

141 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68556

⸱

يوليو 28, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

في هذه المقالة

ملخص

نحن نصف بروتوكولا لتوليد عضويات القرنية من iPSCs المستمدة من مرضى الأنيريديا، مما ينشئ نموذجا خاصا بالمريض لدراسة اضطرابات القرنية. تحاكي هذه العضويات الميزات البنيوية والوظيفية الرئيسية، مما يوفر منصة موثوقة في المختبر للتحقيق في آليات الأمراض، واختبار العلاجات المحتملة، وتطوير أساليب تجديدية شخصية لأمراض العين الأمامية.

الملخص

الأنيريديا هو اضطراب نادر خلقي في العين يتميز بغياب جزئي أو كامل للقزحية، وغالبا ما يرتبط بتعتيم القرنية ونقص الخلايا الجذعية في اللينبل. الطفرات الجينية الأساسية، التي تؤثر بشكل أساسي على جين PAX6، تعطل تطور ووظيفة القرنية. أكثر السمات العينية شيوعا إلى جانب عيوب القزحية هي الرأرأة، نقص التنسج الحجري، الماء الأبعيد، الزرق واعتلال القرنية المرتبط بالأنيريديا (AAK). على الرغم من أن النماذج في الجسم الحي تقدم رؤى قيمة حول أمراض الأنيريديا، إلا أن النماذج المختبرية المشتقة من المريض ضرورية لدراسة آليات المرض وتقييم العلاجات المحتملة. في هذه الدراسة، نقدم نموذج AAK في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة المشتقة من المريض. يتضمن بروتوكولنا التمايز التدريجي لخلايا iPSC إلى خلايا تشبه الظهارة القرنية داخل كائنات عضوية ثلاثية الأبعاد ذاتية التجميع، والتي تحاكي البيئة الدقيقة الأصلية للقرنية. من خلال تحسين ظروف زراعة التمايز، نجحنا في توليد عضويات قرنية تحتوي مجموعات خلايا قرنية مميزة، مما يعكس السمات الهيكلية والوظيفية الرئيسية للقرنية البشرية.

المقدمة

القرنية هي نسيج شفاف وعائي يشكل الطبقة الخارجية من العين، ويتكون أساسا من ثلاث طبقات: طبقة خارجية ظهارية، وطبقة بيضية تحتوي على مصفوفة خارجية غنية بالكولاجين تملؤها الخلايا القرنية، وطبقة الخلية البطانية1. تلعب القرنية دورا أساسيا في الرؤية من خلال حماية البنية الداخلية للعين وكسر الضوء.

أنيريديا هو اضطراب نادر خلقي في العينين العميق يسببه بشكل أساسي طفرات متغاير الزيجوت في جين الصندوق المزدوج 6 (PAX6)، وهو منظم رئيسي لتطور العين، ويتميز بغياب جزئي أو تام للقزحية2. بالإضافة إلى نقص تنسج القزحية أو غيابها، يصاب معظم المرضى باضطرابات تدريجية في القرنية تعرف مجتمعة باسم اعتلال القرنية المرتبط بالأنيريديا (AAK)، والذي يشمل عيوبا في الظهارة، وخلل في وظائف الخلايا الجذعية الليمية، وتغيرات في السماح، وتعتيم القرنية التدريجي، مما يؤدي في النهاية إلى ضعف الرؤية. يؤثر AAK على حوالي 78٪–90٪ من مرضى الأنيريديا، مع زيادة شدته مع مرور الوقت3. هدفنا إلى إنشاء بروتوكول مفصل وقابل للتكرار لتوليد عضويات القرنية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من مرضى الأنيريديا لنمذجة التغيرات القرنية ذات الصلة بالأمراض في المختبر. على الرغم من أن نماذج الحيوانات ودراسات خارج الجسم الحي قدمت رؤى قيمة حول مسببات الأنيريديا، إلا أن الاختلافات الخاصة بالنوع والوصول المحدود إلى أنسجة المريض تحد من أهميتها الانتقالية.

ظهرت العضويات المشتقة من iPSC البشرية كأنظمة قوية في المختبر لنمذجة تطور الإنسان والأمراض 4,5. تمكن الأعضاء القرنية، على وجه الخصوص، من توليد هياكل ثلاثية الأبعاد تشبه الأنسجة التي تشبه إلى حد كبير بنية القرنية الأصلية، بما في ذلك التنظيم الطلائي الطبقي، والتفاعلات البثقية – الظهارية، والترسيب المصفوفي خارج الخلية، مقارنة بزراعة الطبقات الأحادية التقليدية ثنائية الأبعاد التي تفتقر إلى التنظيم المكاني، والتفاعلات الفسيولوجية بين الخلايا والخلية، والتعقيد البيئي الدقيق 4,5. تم الإبلاغ عن عدة استراتيجيات تمايز، بما في ذلك الطرق القائمة على SEAM والنهج المعتمد على السلف العيني، لتوليد أنسجة شبيهة بالقرنية منiPSCs 6. عادة ما تتضمن هذه الأساليب مرحلة أولية من استحث السلالة العينية، تليها تحديد واختيار الأنسجة التدريجي من مجموعات العين السلفية غير المتجانسة. إنشاء عضويات القرنية يوفر فرصة لدراسة أنواع الخلايا المختلفة الموجودة في نسيج القرنية 7,8. علاوة على ذلك، تمكن عضويات القرنية المشتقة من iPSC لدى مرضى الأنيريديا من دراسة الخلفية الجينية للمرض وتوفر فرصة فريدة لدراسة الأنيريديا.

في البروتوكول الحالي، تخضع كل من خطوط iPSC من النوع البري والمستمدة من الأنيريديا لاستراتيجية تمايز متعددة المراحل متطابقة تشمل التعرض المتسلسل للتمايز (DM)، وتمايز الشبكية (RDM)، ووسط تمايز القرنية (CDM) على مدى فترة زراعة طويلة تمتد لأسابيع. خطوة تجريبية حاسمة هي الانتقال من الزراعة الملتصقة إلى ظروف التعليق، حيث يتم الحفاظ على مناطق مختارة تشبه القرنية لتعزيز التنظيم الذاتي للظهارة.

بينما يدعم هذا النهج توليد قابل للتكرار لهياكل ظهارية شبيهة بالقرنية مناسبة لنذجة الأمراض المقارنة، إلا أنه لا يعيد بشكل كامل خصائص معقدة في الجسم مثل التعصيب العصبي أو تنظيم المجال الحوفي الكامل، وهو ما يجب أخذه في الاعتبار عند تقييم مدى تطبيق الطريقة.

وفي هذا السياق، نصف بروتوكولا موحيدا لتوليد عضويات القرنية من خلايا iPSC المشتقة من المرضى وتحمل طفرات PAX6 المرتبطة بالأنيريديا. ومن المهم أن استراتيجية التمايز نفسها لا تعدل بين الخطوط البرية والمشتقة من الأنيريديا؛ بدلا من ذلك، تظهر الأنماط الظاهرية الخاصة بالأمراض من الخلفية الجينية الخاصة بالمريض ضمن إطار تجريبي موحد إلى حد ما.

بشكل عام، توفر هذه الطريقة منصة قوية وقابلة للتكرار لدراسة تطور القرنية وآليات الأمراض المرتبطة بالأنيريديا، وقد تكون أساسا للدراسات الميكانيكية والانتقالية المستقبلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإرشادات لجنة الأخلاقيات. تم تسجيل الدراسة في قاعدة بيانات سجل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCreg)، وتم توثيق الموافقات الأخلاقية بموجب وزارة فرنسا للعمل العالي والبحث والابتكار (MESRI؛ IE-2018-967)9. تسمى iPSCs بالرموز AAKIPSi001-A (AAK1)، AAKIPSi002-A (AAK2)، AAKIPSi003-A (AAK3)، وWT (من المتبرعين الصحيين). علاوة على ذلك، وافقت لجنة الأخلاقيات في جامعة حاجت تبه على استخدام هذا البحث، كما هو موضح في رقم المرجع 16969557-1213. كانت خطوط الخلايا البشرية المستخدمة في هذه الدراسة تتطلب تفويضا تنظيميا وطنيا وقت الاستحواذ. تم منح الموافقة ضمن إطار اتحاد شارك فيه أحد المؤلفين. على الرغم من أن المخطوطة الحالية ليست مرتبطة مباشرة بذلك المشروع الاتحادي، إلا أن المواد البيولوجية المستخدمة تم الحصول عليها واعتمادها ضمن هذا الإطار الأخلاقي. لذلك، تم الاستشهاد بالموافقة من هذه الجامعة بشكل مناسب لضمان الشفافية التنظيمية الكاملة. جميع التفاصيل المتعلقة بالمواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد. تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية داخل خزانة تدفق طبقية (BSL-2) للحفاظ على بيئة معقمة. يضمن هذا الإعداد تعقيم جميع المواد والمعدات المستخدمة في الدراسة بشكل كاف، مما يقلل من خطر التلوث ويضمن سلامة نتائج التجارب.

1. توليد عضويات القرنية المستخرجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC) المستحثة من الإنسان

  1. صيانة وزراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من مرضى الأنيريديا (AAK1، AAK2، AAK3) تحت وسط مشروط خال من المغذي (الشكل 1)
    1. جهز ما يلي مسبقا: غط بئر واحد في صفيحة ذات 6 آبار بمحلول 1 مل من محلول مصفوفة خارج الخلية البارد (ECM) بتركيز 0.1 ملغ/مل. يجب التعامل مع هذه العملية على الثلج وليس لتصلب ECM، ويجب تركها لتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة، مع الالتزام بتعليمات الشركة المصنعة لضمان تحضير الركيزة بشكل صحيح.
    2. إذابة الكتلة المحفوظة بالتجميد بحجم 1 × 106 hiPSC (WT، AAK1، AAK2، AAK3). لا تذيب الخلايا المجمدة بالكامل؛ بدلا من ذلك، دع تعليق الخلية المجمدة في التجميد يذوب حتى يبقى حوالي نصف الحجم متجمدا.
    3. انقل التعليق المذاب جزئيا فورا إلى 1 مل من وسط الصيانة الكامل عند درجة حرارة الغرفة (RT) يحتوي على مثبط بروتين كيناز مرتبط ب Rho (ROCK) بمقدار 10 ميكرومولار، مدمج مسبقا في أنبوب بسعة 15 مل. لا تستخدم أي ماصة أثناء النقل.
    4. استخدم الطرد المركزي بقوة 300 × g لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت.
    5. ثم أعد تعليق الخلايا في 1 مل من وسط صيانة كامل يحتوي على مثبط ROCK بقوة 10 ميكرومول.
    6. حدد كثافة الخلايا مع استبعاد اللون الأزرق التريباني. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم الخلوي بعد تلوين قابلية الاستخدام بتقنية تريبان بلو. باختصار، امزج 20 ميكرولتر من تعليق الخلية بنسبة 1:1 مع 20 ميكرولتر من 0.4٪ تريبان بلو، تليها إضافة 60 ميكرولتر من PBS، مما يؤدي إلى تخفيف نهائي بنسبة 1:5 لتعليق الخلية الأصلي. من هذا الخليط، تحمل 10 ميكرولتر إلى غرفة مقياس الهيموسيتوميتر. عد الخلايا الصالحة (الزرقاء السالبة للتربان السالب) في أربعة مربعات كبيرة. احسب متوسط عدد الخلايا في كل مربع واضرب في 5 (عامل تخفيف تعليق الخلية) و10,000 لتحديد التركيز النهائي للخلية (الخلايا/مل).
      الخلايا/مل = (متوسط عدد الخلايا لكل مربع) × 5 × 104
    7. زرع الخلايا في بئر ECM مطلي مسبقا في صفيحة مكونة من 6 آبار، مما يضمن كثافة خلايا 2 × 104 خلايا/سم2 لكل بئر.
    8. راقب شكل الخلية والتصاقها باستخدام مجهر التباين الطوري بتكبير 10 أضعاف. ثم حضانة صفائح الستة آبار عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لضمان ظروف نمو مثالية.
      ملاحظة: يجب استخدام مثبط الصخور فقط طوال الليل أثناء مرور الخلايا أو إذابتها. خلال التغييرات اليومية للوسط، أضف الوسيط بلطف على طول جدار البئر. تجنب تسخين وسط الصيانة الكاملة في حمام ماء؛ بدلا من ذلك، أضبط الوسط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. مرحلة التمايز التلقائي (اليوم 0 – 2)
    1. جهز وسط التمايز (DM) بخلط ما يلي: 8٪ من استبدال المصل (KSR)، 1x أحماض أمينية غير ضرورية (NEAA)، 1x جلوتامكس، 1x بنسلين-ستريبتومايسين، وخليط Modified Eagle's Modified Eagle's Medium / Nutrient Ham (DMEM/F-12).
    2. بمجرد وصول زراعات hiPSC إلى حوالي 70٪–80٪ من التقاء البعض، لتحفيز التمايز التلقائي8، قم بسحب الوسط بلطف وتخلص منه بالكامل، ثم استبداله يوميا ب 1 مل من DM طازج لكل بئر حتى اليوم الثالث، حيث يبدأ مرحلة التمايز الشبكية وفقا للجدول الزمني التجريبي.
  3. مرحلة تمايز الشبكية (اليوم 3 – 47)
    ملاحظة: يستخدم وسط تمايز الشبكية لفترات طويلة للسماح بتكوين مجموعات غير متجانسة من العين السلفية.
    1. جهز وسط التمايز الشبكي (RDM) بخلط المواد التالية: 8٪ KSR، 1x NEAA، 1x جلوتامكس، 2٪ B27، 1 نقطة بنسلين-ستريبتومايسين، وDMEM/F-12.
    2. بعد يومين من التمايز التلقائي، قم بتحديث وسط الزراعة يوميا عن طريق استنشاق وسط DM بعناية واستبداله ب 1 مل من وسط RDM الطازج لكل بئر. استمر في هذا لمدة 30 يوما إجمالا.
      ملاحظة: من المتوقع زيادة كبيرة في كثافة الخلايا خلال هذه الفترة التي تمتد 30 يوما. من الضروري إجراء ملاحظات مجهرية لكثافة الخلايا في مناطق مختلفة من كل بئر. لمنع رفع الخلايا، يجب تجنب الغسيل، ويجب توخي الحذر أثناء تغيير الوسط. أضف الوسائط عبر جدار البئر. أضبط الوسط عند RT لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
    3. بحلول اليوم 32، تصل الخلايا إلى حالة ظاهرية من التقاء وتشكل تجمعات متعددة الطبقات من 2.5D. في هذه المرحلة، ابدأ الانتقال إلى زراعة التعليق عن طريق كشط البئر بالكامل بلطف باستخدام طرف ماصة بسعة 1000 ميكرولتر. خلال هذه العملية، قم بتقسيم طبقة الخلية إلى مجموعات صغيرة.
      ملاحظة: على الرغم من إطلاق جميع الخلايا من سطح الزرعة، إلا أن التجمعات متعددة الطبقات 2.5D تجمع بشكل تفضيلي ونقلها إلى الزراعة المعلقة (الشكل التكميلي 1)، حيث أن تخصيبها يعزز التجميع الذاتي بشكل أسرع وتكوين عضويات أكبر مقارنة بالخلايا المفردة أو شظايا أحادية الطبقة.
    4. مباشرة بعد الكشط، اجمع عناقيد الخلايا الناتجة وانقلها إلى ألواح زراعة منخفضة التثبيت بستة آبار تحتوي على RDM لتحديد ظروف الزراعة المعلقة.
    5. حافظ على الخلايا في مزرعة معلقة لمدة 15 يوما إضافية، مع استبدال الوسط يوميا باستخدام 2 مل من RDM طازج لكل بئر. خلال أول يومين من زراعة التعليق، تجنب تغيير الوسط لمنع فقدان تجمعات الخلايا الصغيرة. خلال الزراعة المعلقة، تنظم الخلايا نفسها تدريجيا وتنتج هياكل ثلاثية الأبعاد شفافة تشبه القرنية، تراقب بانتظام بواسطة مجهر التباين الطوري بتكبير 4x و10x.
  4. مرحلة التمايز القرني (اليوم 48 – 90)
    1. تحضير وسط التمايز القرني (CDM) عن طريق خلط المواد التالية: 8٪ KOSR، 1x NEAA، 1x جلوتامكس، 1x N2-MAX، 1x إنسولين-ترانسفريرين-سيلينيوم، 5 نانوغرام/ملتر FGF2، 10 نانوغرام/مل EGF، وDMEM/F-12.
    2. بعد ال 15 يوما الأولية (من اليوم 32 إلى اليوم 47) من زراعة التعليق في ألواح منخفضة التثبيت (37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون)، استبدل RDM ب CDM مع الحفاظ على الرجام تحت ظروف التعليق في اليوم 47. قم بتحديث CDM كل يومين ببئر 2 مل لكل بئر، لضمان أن تكون الأعضاء مغمورة بالكامل في وسط الزراعة. خلال هذه الفترة، تظهر تدريجيا هياكل أولية شفافة تشبه الفقاعات (CP).
    3. استمر في الزراعة المعلقة في CDM حتى اليوم 90، مما يسمح بنضج إضافي وفصل مكاني لمناطق CP الشفافة عن حجرات الأنسجة المعتمة.
    4. في اليوم 90، يتم فصل مناطق النظافة الشفافة من الخلايا الدماغية الدماغية عن حجرات الأنسجة المعتمة باستخدام ملقط وملاقط معقمة عندما يقصد إجراء تحليلات خاصة بمرحلة الأسفل الخاصة بالشلل الدماغي.
      ملاحظة: يتم إجراء العزل الميكانيكي لمناطق CP عندما تتطلب التحليلات تحديدا هياكل غنية بالCP. إذا كانت أقسام الأنسجة الأخرى أو البنية العضوية العامة محل اهتمام، فقد يتم الحفاظ على العضوية سليمة للحفاظ على التباين الهيكلي.
    5. استمر في زراعة التعليق في CDM إما لهياكل CP المعزولة أو للعضويات السليمة، حسب الهدف التجريبي.

2. توصيف عضويات القرنية

  1. التقييم المورفولوجي والهيكلي للعضويات
    1. راقب عضويات القرنية بانتظام باستخدام مجهر برايتفيلد بتكبير 4x و10x. قيم الحجم والشفافية والشكل العام في نقاط زمنية محددة ووثق التغيرات الهيكلية من خلال التقاط الصور.
  2. توصيف قائم على التألق المناعي
    1. تثبيت عضوي القرنية
      1. حضر محاليل 4٪ من PFA و30٪ سكروز قبل التثبيت. خذ عضوية القرنية من الزراعة باستخدام مغرفة معقمة. انقل العضوي إلى 4٪ PFA في أنبوب بسعة 1.5 مل وحضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      2. بعد الحضانة، تخلص من PFA من الأنبوب بحذر دون إتلاف عضوية القرنية. أضف 1 مل من محلول السكروز بنسبة 30٪ إلى الأنبوب وضعه على درجة حرارة 4 درجات مئوية. بعد 24 ساعة، جهز ووضع علامة على أنابيب 5 مل والنيتروجين السائل لتثبيت OCT.
      3. تخلص من محلول السكروز من الأنبوب بحذر. انقل العضوي إلى الملعقة المعقمة. باستخدام ماصة بسعة 20 ميكرولتر، أزل محلول السكروز الزائد من العضو بعناية.
      4. صب OCT في غطاء الأنبوب بحجم 5 مل، وضع العضوي داخل OCT. استخدم مغرفة معقمة أخرى لنقل العضو إلى غطاء OCT.
      5. أضف OCT لتغطية سطح عضوية القرنية. افتح البالونات في OCT بإبرة للحصول على أجزاء واضحة من الأورغنويد.
      6. أغلق غطاء أنابيب ال5 مل واستخدم الملقط للغمر في النيتروجين السائل. احتفظ بالعينات في -20 درجة مئوية حتى يتم تقسيمها.
      7. قسمها بسماكة 5 ميكرومتر باستخدام جهاز تجميد واحتزنها عند -20 درجة مئوية حتى يتم صبغها. حافظ على سمك المقطع واتجاه الأنسجة ثابتا لضمان التلوين القابل للتكرار.
    2. صبغة الصيام الصيام
      1. لتحضير أقسام القرنية العضوية لصبغ الصيام الصامت، اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS-T (0.3٪ Triton X-100) عند RT لمدة 10 دقائق.
      2. نظف الشريحة بورق مناديل واصنع إطلاقا باستخدام قلم PAP. أضف كمية مناسبة من محلول الانسداد لتغطية قسم الأنسجة بالكامل (عادة 100 – 200 ميكرولتر لكل شريحة حسب حدود قلم PAP) وحضنه عند RT لمدة ساعة واحدة.
      3. استنشق محلول الانسداد وصنع إطار مع قلم PAP. أضف 150 ميكرولتر من حلول Ab الأولية (PAX6، p63، OCT3/4، NANOG، Na+/K+-ATPase، AQP1، CK3، CK5، CK14، CK19، N-CAD، KERA، COLIV، معدلات التخفيف مدرجة في جدول المواد) على الشريحة وحضنها عند RT لمدة ساعة واحدة.
      4. اغسل مرتين باستخدام PBS-T (0.3٪ ترايتون X-100) على RT لمدة 10 دقائق. أعد وضع الحدود باستخدام قلم PAP.
      5. أضف 150 ميكرولتر من محلول Ab الثانوي (Anti Rabbit-488، Anti Mouse-594، معدلات التخفيف مذكورة في جدول المواد) إلى الشريحة وحضنها في RT تحت ظروف مظلمة لمدة ساعتين. اغسله مرتين باستخدام PBS-T (0.3٪ ترايتون-X) عند RT لمدة 10 دقائق. نظف الشرائح وركبها باستخدام حل DAPI.
      6. بالنسبة لقطع iPSC غير المميزة، قم بإجراء الحجب والنفاذية بعد التثبيت ومتابعة التلوين باستخدام نفس البروتوكول. تصور العينات الملونة باستخدام المجهر الفلوري أو الكونفوكال بتكبير 4x و10x.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

جذع الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بواسطة الإنسان (hiPSCs)

لتقييم جذور ال iPSCs البشرية المستخدمة في التجارب، أجرينا تصوير برايت فيلد، وصبغ المناعة، وتحليل qRT-PCR. قمنا بتقييم تعبير علامات تعددية القدرات الرئيسية، بما في ذلك OCT3/4، SOX2، وNANOG، وهي عوامل نسخ أساسية ضرورية للحفاظ على تعددية القدرات والتجديد الذاتي في الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات11.

كشف تصوير براي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يكشف التحليل المقارن بين الأعضاء الضابطة وتلك المشتقة من مرضى الأنيريديا عن عيوب في الطبقات الظهارية، وترسيب مصفوفة خارج الخلية غير طبيعي، وتعبير غير منظم لجين PAX6 9.

معدل نمو الخلايا النفسية النفسية المستمدة من عينات مرضى الأنيريديا المختلفة، وتحديدا خطوط AAK1 وAAK2 وAAK3، يظهر تباينا، مما قد يعكس التنوع الجيني الأساسي، الذي ينجم أساسا عن طفرات في جين PAX6 ، مما قد يؤدي إلى اختلافات في كفاءة إعادة برمجة الخلايا وسلوك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يفصح المؤلفون عن ذلك.

شكر وتقدير

تمول هذه الدراسة من قبل TÜBİTAK 121N276 والبرنامج الأوروبي المشترك للأمراض النادرة، وتحظى بدعم جزئي من الاتحاد الأوروبي (برنامج كرسي ERA لعام Horizon 2020، منحة مشروع RareBoost رقم: 952346). تحظى A.C.K. بدعم من منحة YÖK 100/2000 للدكتوراه وزمالات TÜBİTAK-BİDEB 2211A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 mL serological pipettesZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serological pipettesLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serological pipettesCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serological pipettesBIOFILLGSP020050
Anti Mouse 594Jackson Immuno715-585-150المدى المخفف: 1:100 - 1:800
Anti Rabbit 488 Jackson Immuno711-545-152المدى المخفف: 1:100 - 1:800
Autoclave VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010مع فيتامين A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscope DMI1OlympusCKX41
Biological Safety Cabinets Class IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Coverslips 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390.5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol dilutions
Extracellular Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtome RM2235LeicaRM2235
Mounting mediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Culture Plates (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Non-essential amino acids (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 and P1000 pipettesGilsonF167350
ParaffinVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antibody Aquaporin mAbabcamab9566المدى المخفف: 1:50-1:200
Primer Antibody CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253المدى المخفف: 1:50-1:500
Primer Antibody CK19ProteinTech14965-1-APالمدى المخفف: 1:150-1:600
Primer Antibody CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLالمدى المخفف: 1:50-1:200
Primer Antibody CK5Thermo MA517057المدى المخفف: 1:200-1:1000
Primer Antibody Collagen Type IVabcamab6586المدى المخفف: 1:100-1:500
Primer Antibody KeratocanBiossbs-11054Rالمدى المخفف: 1:50-1:200
Primer Antibody Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712المدى المخفف: 1:50-1:500
Primer Antibody N-Cadherinabcamab76011المدى المخفف: 1:50-1:500
Primer Antibody p63SANTACRUZ   sc-25268المدى المخفف: 1:50-1:500
Primer Antibody Pax6NovusNBP2-44576المدى المخفف: 1:50-1:200
RNA isolation kitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inihibitor (Y-27632)TOCRIS1254
SlidesStarFrostMBB-0302-55AAdhesive, ground
Stainless steel forceps no:5Sigma F6521-1EA
Stainless Stell Scalpel Sterile N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthesis Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagentThermo15596026
Trypan blueGIBCO15250061
Ultra low attachment (ULA) 6-well  plate Corning3471
Water bathNüveNb9

المراجع

  1. Hassell, J. R., Birk, D. E. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 91 (3), 326-335 (2010).
  2. Daruich, A., et al. Congenital aniridia beyond black eyes: From phenotype and novel genetic mechanisms to innovative therapeutic approaches. Prog Retin Eye Res. 95, 101133(2023).
  3. Eden, U., Riise, R., Tornqvist, K. Corneal involvement in congenital aniridia. Cornea. 29 (10), 1096-1102 (2010).
  4. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  7. Foster, J. W., et al. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 7, 41286(2017).
  8. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
  9. Koc, A. C., et al. Patient-derived cornea organoid model to study metabolomic characterization of rare disease: aniridia-associated keratopathy. BMC Ophthalmol. 25 (1), 14(2025).
  10. Ilmarinen, T., et al. Production and Limbal Lineage Commitment of Aniridia Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 41 (12), 1133-1141 (2023).
  11. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  12. Okur, F. V., Cevher, I., Ozdemir, C., Kocaefe, C., Cetinkaya, D. U. Osteopetrotic induced pluripotent stem cells derived from patients with different disease-associated mutations by non-integrating reprogramming methods. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 211(2019).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Lima Cunha, D., Arno, G., Corton, M., Moosajee, M. The Spectrum of PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye. Genes (Basel). 10 (12), 1050(2019).
  15. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  16. Gonzalez, G., Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (2), (2018).
  17. Ji, H. P., et al. MicroRNA-28 potentially regulates the photoreceptor lineage commitment of Muller glia-derived progenitors. Sci Rep. 7 (1), 11374(2017).
  18. Hatou, S., et al. Role of insulin in regulation of Na+-/K+-dependent ATPase activity and pump function in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (8), 3935-3942 (2010).
  19. Higa, K., et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-cadherin-positive clusters in the basal limbal epithelium. Stem Cell Res. 10 (2), 147-155 (2013).
  20. Chen, Q., et al. Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes. Sci Rep. 6, 27462(2016).
  21. Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., Chakravarti, S. Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. Open Ophthalmol J. 11, 252-261 (2017).
  22. Lima Cunha, D., et al. Restoration of functional PAX6 in aniridia patient iPSC-derived ocular tissue models using repurposed nonsense suppression drugs. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 240-253 (2023).
  23. Harding, P., et al. Variant-specific disruption to notch signalling in PAX6 microphthalmia and aniridia patient-derived hiPSC optic cup-like organoids. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (6), 167869(2025).
  24. Cunha, D. L., Smits, J., Zhou, H. Q., Moosajee, M. Transcriptomic analysis of aniridia iPSC-derived limbal epithelial stem cells reveals early changes linked to the limbal niche. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2821(2023).
  25. Harding, P., et al. Generation of human iPSC line (UCLi013-A) from a patient with microphthalmia and aniridia, carrying a heterozygous missense mutation c.372C>A p.(Asn124Lys) in. Stem Cell Res. 51, (2021).
  26. Theerakittayakorn, K., et al. Differentiation Induction of Human Stem Cells for Corneal Epithelial Regeneration. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  27. Bar-Nur, O., et al. Small molecules facilitate rapid and synchronous iPSC generation. Nat Methods. 11 (11), 1170-1176 (2014).
  28. Maiti, G., et al. Single cell RNA-seq of human cornea organoids identifies cell fates of a developing immature cornea. PNAS Nexus. 1 (5), pgac246(2022).
  29. Dorot, O., et al. The antipsychotropic drug Duloxetine rescues PAX6 haploinsufficiency of mutant limbal stem cells through inhibition of the MEK/ERK signaling pathway. Ocul Surf. 23, 140-142 (2022).
  30. van Velthoven, A. J. H., et al. Future directions in managing aniridia-associated keratopathy. Surv Ophthalmol. 68 (5), 940-956 (2023).
  31. Kocak, G., et al. Generation of Anterior Segment of the Eye Cells from hiPSCs in Microfluidic Platforms. Adv Biol (Weinh). 8 (5), e2400018(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

JoVE

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.