مقالة منهجية

سير عمل محسن للعزل والثقافة طويلة الأمد لخلايا الورم الدبقي المشتق من المريض التي تحتفظ بخصائص الورم الأصلية

DOI:

10.3791/68566

⸱

يوليو 8, 2025

 , 
1Beijing Institute for Brain Research, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Chinese Institute for Brain Research

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا موحدا لإنشاء خطوط خلايا الورم الدبقي المشتق من المريض (PDGCs) ، مما يضمن إخلاصها الجيني والظاهري. يعزز نظام الثقافة الملتصقة بمساعدة مستخلص الغشاء القاعدي نمو الخلايا وتجانسها ، مما يجعل هذه النماذج ذات قيمة لفحص الأدوية وأبحاث GBM.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الورم الأرومي الدبقي (GBM) هو أكثر أورام المخ الأولية عدوانية ، ويتميز بعدم تجانس عالي ومقاومة للعلاجات القياسية. غالبا ما تفشل خطوط خلايا الورم الدبقي التقليدية في الاحتفاظ بالخصائص الجينية والظاهرية الخاصة بالمريض ، مما يحد من أهميتها الانتقالية. لمعالجة هذا الأمر ، أنشأنا 50 خطا من خلايا الورم الدبقي المشتق من المريض (PDGCs) باستخدام نظام زراعة الخلايا الجذعية العصبية الخالي من المصل. يحدد هذا البروتوكول جمع عينات الورم التي تم الحصول عليها من مرضى GBM ومعالجتها واستزراعها على المدى الطويل ، مما يضمن الحفاظ على السمات الجزيئية الرئيسية. تتضمن منهجيتنا تفكك الأنسجة الأنزيمية ، وتحلل خلايا الدم الحمراء ، والثقافة الملتصقة بمساعدة مستخلص الغشاء القاعدي ، مما يحسن صلاحية الخلية ويسهل فحص الأدوية عالي الإنتاجية. يؤكد توصيف PDGCs عبر تسلسل الجينوم الكامل والنسخ وتلوين التألق المناعي احتفاظها بالتغيرات الجينية الشائعة GBM والخلايا الجذعية العصبية وعلامات السلف. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر هذه الخلايا إمكانات ورمية في نماذج الطعم الغريب. من خلال تحسين ظروف الاستزراع ، يوفر هذا البروتوكول إطارا موحدا لإنشاء نماذج GBM ذات صلة بيولوجيا لدعم الاكتشاف العلاجي والدراسات الميكانيكية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينشأ الورم الدبقي ، وهو الورم الأولي الأكثر شيوعا داخل الجمجمة ، من الخلايا الجذعية العصبية أو الخلايا السلفية التي خضعت للطفرات الجينية1. تصنف منظمة الصحة العالمية الأورام الدبقية إلى الدرجات 1-4 بناء على الخصائص المرضية والجزيئية ، والتي تتراوح من الدرجة المنخفضة إلى الدرجةالعالية 2. يمثل الورم الأرومي الدبقي (GBM) ، وهو ورم دبقي من الدرجة 4 ، حوالي 57٪ من جميع الأورام الدبقية و 48٪ من جميع أورام الجهاز العصبي المركزي الخبيثةالأولية 3. يواجه مرضى GBM تشخيصا سيئا ، حيث يبلغ متوسط وقت البقاء على قيد الحياة أقل من عامين ومعدل بقاء لمدة 5 سنوات يبلغ 5.4٪ فقط4. يتضمن العلاج القياسي أقصى قدر من الاستئصال الآمن متبوعا بالعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي تيموزولوميد5. على الرغم من هذه التدخلات ، لا يزال GBM غير قابل للشفاء بسبب طبيعته الارتشاحية ومقاومته المتأصلة للعلاجات ، مما يخلق حاجة ملحة لأساليب علاجية جديدة.

يستخدم الباحثون عادة خطوط الخلايا السرطانية المشتقة من الإنسان كنماذج لدراسة تطور السرطان والآليات العلاجية. ومع ذلك ، فإن خطوط خلايا الورم الدبقي الكلاسيكية التي يتم الاحتفاظ بها في وسط يحتوي على مصل ويتم تمريرها على نطاق واسع في المختبر تظهر تغييرات كبيرة في خصائص النمط الظاهري والملامح الجينية مقارنة بأورام المرضى6،7،8. وبالتالي ، غالبا ما تفشل نماذج الفحص قبل السريرية القائمة على خطوط الخلايا هذه في تحديد الأهداف والجزيئات العلاجية التي تترجم بشكل فعال إلى الإعدادات السريرية. يزداد نجاح علاج GBM تعقيدا بسبب عدم تجانس الورم واللدونة9. يتجلى هذا عدم التجانس ليس فقط في الأنواع الفرعية النسخية (على سبيل المثال ، الوسيطة ، اللحمة المتوسطة) ولكن أيضا في الحالات التنموية المتنوعة للخلايا المكونة10. يستخدم GBM آليات النمو العصبي ويحتوي على مجموعات سكانية فرعية للخلايا الجذعية للورم الأرومي الدبقي (GSC) التي تدفع تكاثر الورم وتظهر مقاومة معززة للعلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي11،12. إن زراعة خلايا الورم الدبقي المشتق من المريض في وسط الخلايا الجذعية العصبية الخالية من المصل يحافظ بشكل فعال على طيف الطفرات وأنماط التعبير الجيني للورم الأصلي مع الحفاظ على خصائص GSC الجزئية8.

بالمقارنة مع نماذج ثقافة الغلاف العصبي ، فإن الثقافة الملتصقة بمساعدة مستخلص الغشاء القاعدي تعزز نمو الخلايا الأكثر استقرارا وسرعة ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للفحص الكيميائي والجيني13. باستخدام هذا النهج ، أنشأنا 50 خطا من خلايا GBM مشتقة من المريض وقمنا بتمييزها من خلال تسلسل الجينوم الكامل ، والتسلسل النسخي ، وفحص مكتبة الأدوية FDA لاستكشاف الاستراتيجيات العلاجية المحتملة. يعمل هذا المورد على تطوير أبحاث الورم الدبقي ، مع نشر النتائج التفصيلية في دراساتنا السابقة14. هنا ، نصف المنهجية المستخدمة لتطوير خطوط خلايا الورم الدبقي المشتق من المريض (PDGCs).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول أنسجة الورم الدبقي المشتق من المريض وعينات الدم التي تم الحصول عليها من خلال التعاون مع المستشفى. حصلت جميع إجراءات أخذ العينات والبروتوكولات التجريبية على موافقة لجنة الأخلاقيات في مستشفى بكين تيانتان ، جامعة العاصمة الطبية (KY 2020-093-02 و KY 2014-021-02). يقدم المرضى موافقة مستنيرة موقعة قبل الجراحة ، وتخضع جميع معلومات الهوية لإخفاء الهوية قبل نقل العينات إلى المختبر. يجب على الباحثين الحصول على موافقة من لجنة الأخلاقيات المؤسسية الخاصة بهم والحصول على موافقة المريض قبل تنفيذ هذا البروتوكول.

1. التحضير قبل معالجة العينة

  1. تعقيم المقص والملاقط والأدوات الأخرى عن طريق التعقيم.
  2. تحضير وسط استزراع PDGC عن طريق الجمع بين 47.5 مل من DMEM / F12 ، 500 ميكرولتر من N2 ، 1 مل من B27 ، 500 ميكرولتر من 100x البنسلين / الستربتومايسين ، 250 ميكرولتر من بديل الجلوتامين 100x ، 100 ميكرولتر من 2.5 M HEPES ، 100 ميكرولتر من 30٪ جلوكوز ، 50 ميكرولتر من 50 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول ، 1.5 مل من 1 ميكروغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) ، و 1.5 مل من 1 ميكروغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF).
  3. قم بإعداد 1x Blood Cell Lysis Buffer (ACK) عن طريق إذابة 8.29 جم من كلوريد الأمونيوم ، و 1 جم من بيكربونات البوتاسيوم ، و 37 مجم من EDTA في الماء ، ثم تخفيفه إلى 1 لتر.
  4. ضع الأدوات المعقمة ، والمخزن المؤقت PBS ، وحاويات النفايات ، وأنابيب الطرد المركزي ، وغيرها من المستلزمات في خزانة السلامة الحيوية وقم بإجراء التطهير بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
  5. ضع النيتروجين السائل في وعاء معزول.

2. جمع عينة المريض

ملاحظة: قم بإجراء جميع إجراءات جمع الأنسجة في ظل ظروف معقمة صارمة لمنع التلوث البكتيري لمزارع الخلايا اللاحقة. حافظ على تقنية التعقيم طوال سير العمل بأكمله.

  1. جمع عينات الدم قبل الجراحة واستئصال أنسجة الورم من دماغ المريض. بالنسبة للأورام الكبيرة شديدة الارتشاح حيث يصعب تمييز الورم عن الأنسجة الطبيعية المحيطة ، قم بزيادة استئصال الأنسجة المحيطة بالورم مع الحفاظ على مناطق الدماغ الوظيفية الحرجة. افصل ما يقرب من 500-2,000 مم3 من الأنسجة الأساسية للورم وضعها في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تحتوي على 10 مل من وسط الحفظ المنخفض للحرارة.
  2. أغلق أنابيب العينة ، وضعها في صندوق ثلج ، وانقلها بسرعة إلى المختبر للمعالجة.
    ملاحظة: تأكد من أن الفاصل الزمني بين جمع العينات ومعالجتها لا يتجاوز 6 ساعات عند 4 درجات مئوية. أثناء جمع العينات، استبعد بعناية الأنسجة المحترقة ومناطق نخر الورم. غالبا ما يتم حرق سطح شقوق الأنسجة بواسطة السكين الكهربائي المستخدم أثناء الجراحة ، مما قد يضر بصلاحية الخلية في المزرعة.

3. معالجة عينة الدم

  1. أنابيب عينة الدم بأجهزة الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من طبقة البلازما العليا.
  2. انقل طبقة خلايا الدم البيضاء وخلايا الدم الحمراء المتبقية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. أضف 10 مل من 1x ACK واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتحلل خلايا الدم الحمراء.
  3. أضف 40 مل من PBS لإنهاء التحلل ، واخلطها برفق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق.
  4. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 3 مل من 1x ACK ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لخطوة ثانية لتحلل خلايا الدم الحمراء.
  5. أضف 12 مل من PBS لإنهاء التحلل ، واخلطها برفق ، وأجهزة الطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة 10 دقائق.
  6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية أحادية النواة للدم المحيطية (PBMC) في 1 مل من PBS ، وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 510 × جم لمدة 10 دقائق.
  7. تخلص من المادة الطافية ، وقم بتجميد حبيبات PBMC في النيتروجين السائل ، وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

4. معالجة أنسجة الورم

  1. قم بإزالة محلول حفظ الأنسجة من أنبوب العينة واغسل الأنسجة في PBS لإزالة جلطات الدم المرئية والأنسجة النخرية. قم بإجراء غسل PBS ثان على الأنسجة المتبقية.
  2. اقطع الجزء الأكثر سلامة من الأنسجة وثبته طوال الليل في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: حجم الأنسجة الثابتة حوالي 10 مم. تخطي هذه الخطوة إذا كانت العينة صغيرة.
  3. قم بقص 2-4 قطع صغيرة من المناديل ، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، وقم بتجميدها في النيتروجين السائل ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتراوح حجم قطع الأنسجة الصغيرة عادة من 5 إلى 10 مم ، اعتمادا على كمية الحمض النووي والحمض النووي الريبي المطلوبة للتسلسل.
  4. ضع أنسجة الورم المتبقية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وافرمه في عجينة ناعمة باستخدام المقص مع الحفاظ على الثلج.
  5. أضف 1-3 مل من محلول انفصال الخلايا وانقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب الهضم. هضم الأنسجة باستخدام جهاز فصل الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 دقيقة.
  6. أضف 3x حجم من PBS لوقف الهضم ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي بمصفاة خلية 70 ميكرومتر. قم بطحن الأنسجة برفق من خلال المصفاة بقضيب صغير لزيادة تجمع الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 510 × جم لمدة 10 دقائق وإزالة المادة الطافية.
  7. أضف 1-3 مل من 1x ACK واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتحلل خلايا الدم الحمراء. أضف 4 أضعاف حجم PBS لإيقاف التحلل ، واخلطه برفق ، وجهاز الطرد المركزي عند 510 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة المادة الطافية.
  8. أعد تعليق الخلايا في وسط PDGC وجزء البذور من تعليق الخلية في ألواح الاستزراع. ضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية نقص الأكسجين. تجميد الخلايا المتبقية في وسط مزرعة يحتوي على 10٪ DMSO.
    ملاحظة: عادة ، بالنسبة لعينات الأنسجة التي يبلغ قياسها حوالي 10-20 مم ، نقوم بزرع حوالي 1/3 إلى 1/10 من معلق الخلية في طبق 6 سم مع 3 مل من وسط الثقافة ، ويتم حفظ الخلايا المتبقية بالتبريد في 2-4 قوارير ، اعتمادا على إنتاجية الخلية.
  9. قم بتغطية الألواح عن طريق إضافة مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي إلى PBS المثلج بنسبة 1: 100 واحتضان الألواح في درجة حرارة الغرفة على حاضنة اهتزاز لمدة ساعتين. تجاهل PBS قبل إضافة وسيط ثقافة PDGC.
    ملاحظة: قم بإجراء جميع ممرات الخلية اللاحقة وثقافتها باستخدام ألواح مطلية بمستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي.
  10. بعد يومين ، انقل الخلايا المستنبتة إلى ألواح مغلفة بمستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي لتمكين التصاق الخلايا ونموها.

5. ثقافة الخلايا والمرور

  1. بمجرد أن تلتصق الخلايا بألواح الثقافة ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة واستبدل أو استكمل وسط الثقافة كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: تختلف قدرة الالتصاق بين الخلايا المختلفة. حتى في حالة وجود مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي ، قد يظل جزء صغير من الخلايا غير ملتصق ، مثل BNI7-11 ، والذي يتطلب ثقافة تعليق مستمرة. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر بعض الخلايا نمط نمو شبه ملتصق ، مثل BNI20. لذلك ، من الضروري المراقبة الدقيقة لحالة الخلية. بالنسبة للخلايا غير الملتصقة ، يمكن ملاحظة زيادة في الخلايا العالقة. إذا ظهرت مجاميع الخلايا كهياكل داكنة تشبه القطن ولم تظهر أي تغييرات كبيرة بمرور الوقت ، فإنها عادة ما تكون غير قادرة على التوسع على المدى الطويل.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء ، أضف محلول تفكك الخلايا لفصل الخلايا. قم بإنهاء التفكك باستخدام 3x PBS وجهاز الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 3 دقائق. قم بتمرير الخلايا بنسبة 1: 2 إلى 1: 4. تجميد الخلايا المتبقية في وسط مزرعة يحتوي على 10٪ DMSO.
  3. استمر في المرور لمدة 10-20 جيلا على الأقل لإنشاء خط خلوي مستقر.
    1. قم بتوثيق مورفولوجيا الخلية بالصور أثناء كل مقطع وسجل أرقام المقطع. قم بتسمية تجميد الخلية الأولية بوضوح بمعلومات مفصلة (مثل أرقام المقاطعات).
    2. بمجرد استقرار خط الخلية ، اجمع 2-3 أنابيب من كريات الخلية (300,000-1,000,000 خلية / أنبوب) وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.

6. العمليات التجريبية اللاحقة

  1. بالنسبة للعينات الثابتة PFA ، بعد التثبيت طوال الليل ، قم بتجفيف العينات من خلال سلسلة متدرجة من محاليل الإيثانول عن طريق الغمر المتسلسل في 60٪ إيثانول ، 70٪ إيثانول ، 80٪ إيثانول ، 90٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، وتغييرين بنسبة 100٪ إيثانول ، كل منهما لمدة 40 دقيقة. بعد ذلك ، قم بمسح العينات في تغييرين من الزيلين ، كل منهما لمدة 40 دقيقة ، ثم تسلل بتغييرين في محلول البارافين ، كل منهما لمدة 40 دقيقة. أخيرا ، قم بتضمين العينات المجففة والمتسللة في كتل البارافين للتقسيم والتلوين اللاحق15.
  2. بالنسبة لحبيبات PBMC أو الأنسجة الورمية أو عينات الخلايا السرطانية المخزنة عند -80 درجة مئوية ، استخرج الحمض النووي والحمض النووي الريبي لدراسات omics المختلفة ، بما في ذلك تسلسل الجينوم الكامل ، وتسلسل الإكسوم ، وتسلسل الحمض النووي الريبي السائب ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية حسب الحاجة.
  3. استخدم خطوط خلايا PDGC المستقرة لإنشاء نموذج الطعم الطبيعي للفأر ، وفحص الأدوية عالي الإنتاجية ، وأبحاث الآلية ، والتجارب الأخرى ذات الصلة.
    1. لإنشاء نموذج الطعم الغريب داخل الجمجمة من PDGCs ، قم بفصل الخلايا وعدها ، ثم أعد تعليقها في خليط 1: 1 من مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي و PBS المثلج البارد إلى تركيز نهائي يبلغ 100,000 خلية / ميكرولتر. قم بحقن 5 ميكرولتر من تعليق الخلية بشكل تجسيمي في المخطط الأيسر للفئران التي تعاني من نقص المناعة البالغة من العمر 6-8 أسابيع باستخدام حقنة دقيقة وأداة تجسيمية قياسية. ضبط إحداثيات الحقن بالنسبة إلى بريغما على النحو التالي: +0.5 مم الأمامي الخلفي (AP), -1.9 مم الإنسي الجانبي (ML), و -3.6 مم الظهرية البطنية (DV).
    2. توليد PDGCs التي تعبر عن لوسيفيراز وإنشاء طعوم غريبة داخل الجمجمة للتصوير التلألؤ البيولوجي لنمو الورم.
      1. قم بتعبئة جين مراسل luciferase-tdTomato في جزيئات عدسية ، ثم قم بإصابة PDGCs بفيروس العدسات المعبأ لإنشاء تعبير مستقر16.
      2. بعد الإصابة ، قم بفرز الخلايا الإيجابية tdTomatoعن طريق قياس التدفق الخلوي للحصول على مجموعة خلايا مستقرة تعبر عن لوسيفيراز.
      3. قبل التصوير ، قم بحقن D-luciferin داخل الصفاق بجرعة 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم باستخدام محلول 15 مجم / مل D-luciferin. قم بتخدير الفئران بالأيزوفلوران وانتظر لمدة 10 دقائق بعد حقن D-luciferin. ضع الفئران في نظام التصوير الحيوي. اضبط وقت التعريض الضوئي على الوضع التلقائي أثناء التصوير17.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر الشكل 1 نظرة عامة شاملة على سير العمل للبروتوكول. تشمل عينات المرضى الدم المحيطي والأنسجة الأساسية للورم. تخضع عينات الدم لعملية الطرد المركزي لإزالة البلازما متبوعة بجولتين من تحلل ACK للحصول على PBMCs التي تعمل كعناصر تحكم لتحليلات التسلسل. يتم غسل عينات الورم بواسطة PBS لإزالة الجلطات الدموية والمناطق النخرية قبل معالجتها إلى أجزاء صغيرة. يتم حفظ شظايا الأنسجة المتعددة بالتبريد لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتسلسله في المستقبل ، في حين أن القطعة السليمة ثابتة ب PFA ومدم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل عدم تجانس GBM تحديات علاجية كبيرة. غالبا ما تطور خطوط خلايا GBM التقليدية خلفيات وراثية متجانسة وتفقد خصائص ورم المريض بعد الزراعة الممتدة في وسط يحتوي على المصل ، مما يحد من قيمتها الانتقالية. يعد تحسين ظروف ثقافة GBM وتوحيد سير عمل معالجة عينات المرضى أمرا ضروريا لتعظيم الموارد السريرية المحدودة في البحث. سيعزز نظام نموذج خلية GBM الشامل فهمنا لعدم تجانس GBM ويحسن الاستراتيجيات العلاجية.

يوضح هذا البروتوكول تفاصيل سير عمل المعالجة لعينات مرضى GBM ومنهجي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (#2022YFA1103900 إلى J.C.) ومختبر Changping وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (CIFMS) (# 2024-I2M-3-022 إلى J.C.). الأموال الإضافية ل JC هي من المعهد الصيني لأبحاث الدماغ. تم إنشاء الشكل 1 في عام https://BioRender.com.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
70 & مو مصفاة الخلية mFalcon352350
محلول انفصال خلية AccutaseBioLegend423201
كلوريد الأمونيومعلاء الدين60-92-4
الجسم المضاد للسوكس 2MerckmilliporeAB5603
وسيط تركيب مضاد للبهتان مع DAPIBeyotimeP0131
جسم مضاد مضاد للنستينNOVUSNB100-1604
B27 بدون فيتامين مغطىGibco12587010
BD FACSAria Fusion Flow CellularCellular BD Biosciences/
طبق ثقافة الخليةNEST705001
D-Luciferin ، ملح البوتاسيومInvitrogenL2916
DMEM / F12GibcoC11330500BT
DMSOSinopharm30072418
EDTABBI Life SciencesA600107-0500
GlucoseSangon BiotechA50991-0500
GlutaMAXGibco35050-061بديل الجلوتامين
طقم تلطيخ الهيماتوكسيلين إيوسينSolarbioG1120
HEPESBeyotimeST090
Human bFGFOrigeneTP750002
الإنسان EGFNovoproteinC029-500 & mu ؛ ز
HypoThermosol FRSBiolife Solutions101104وسط الحفاظ على حرارة منخفض
IsofluraneRWD Life ScienceR510-22-10
IVIS Lumina XR III & nbsp ؛نظام تصوير PerkinElmer/biolitescence
MatrigelCorning356231مستخلص مصفوفة الغشاء القاعدي
MicrosyringeHamilton80300
N2 SupplementGibco17502048
Nunclon Sphera 6-Well PlateThermo Scientific174932لوحات مرفقة منخفضة للغاية
Paraformaldehydeسانجون للتكنولوجيا الحيويةA500684-0500
PBS عازلةSolarbioP1010-100 * 2L
Penicillin / StreptomycinSolarbioP8420 / S8290
بيكربونات البوتاسيومSangon BiotechA501195-0500
RWD مفكك الأنسجةRWD Life ScienceDSC-410
أداة تجسيمية قياسيةRWD علوم الحياة68801
أنبوب معالجة عينة الأنسجةRWD علوم الحياةSCT-100
& بيتا ؛ -mercaptoethanolSigmaM3148-100mL

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weller, M., et al. Glioma. Nat Rev Dis Primers. 10 (1), 33(2024).
  2. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  3. Miller, K. D., et al. Brain and other central nervous system tumor statistics, 2021. CA Cancer J Clin. 71 (5), 381-406 (2021).
  4. Ostrom, Q. T., Cote, D. J., Ascha, M., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. Adult glioma incidence and survival by race or ethnicity in the United States from 2000 to 2014. JAMA Oncol. 4 (9), 1254-1262 (2018).
  5. Horbinski, C., Berger, T., Packer, R. J., Wen, P. Y. Clinical implications of the 2021 edition of the WHO classification of central nervous system tumours. Nat Rev Neurol. 18 (9), 515-529 (2022).
  6. Pardal, R., Clarke, M. F., Morrison, S. J. Applying the principles of stem-cell biology to cancer. Nat Rev Cancer. 3 (12), 895-902 (2003).
  7. Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosom Cancer. 39 (1), 29-36 (2004).
  8. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  9. Yabo, Y. A., Niclou, S. P., Golebiewska, A. Cancer cell heterogeneity and plasticity: A paradigm shift in glioblastoma. Neuro-Oncol. 24 (5), 669-682 (2021).
  10. Neftel, C., et al. An integrative model of cellular states, plasticity, and genetics for glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849.e21 (2019).
  11. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  12. Chen, J., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  13. Pollard, S. M., et al. Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens. Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).
  14. Wu, M., et al. Multi-omics and pharmacological characterization of patient-derived glioma cell lines. Nat Commun. 15 (1), 6740(2024).
  15. Zhanmu, O., Yang, X., Gong, H., Li, X. Paraffin-embedding for large volume bio-tissue. Sci Rep. 10 (1), 12639(2020).
  16. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), e1499(2009).
  17. Sun, A., et al. Firefly luciferase-based dynamic bioluminescence imaging: A noninvasive technique to assess tumor angiogenesis. Neurosurgery. 66 (4), 751-757 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة