مقالة منهجية

توصيف التصوير الحي لحركات السنترومير أثناء الطور الانتصافي الذكري في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا

DOI:

10.3791/68569

⸱

أكتوبر 24, 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حركة الكروموسوم أثناء الطور الانتصافي هي ظاهرة غير مفهومة جيدا وهي أساسية لتكوين الأبواغ. يصف هذا البروتوكول طريقة لاكتساب حركات السنترومير وتحليلها وقياسها أثناء الطور الانتصافي في الخلايا الاختزازية الذكرية نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانقسام الاختزالي هو انقسام خلوي ضروري للتكاثر الجنسي. أثناء الطور الانتصافي ، تتعرف الكروموسومات المتجانسة من أصل الأم والأب على بعضها البعض وترتبط ، وهي عملية يتم تسهيلها من خلال حركاتها السريعة في النيوكليوبلازم. تعتمد حركات الطور الانتصافي على ربط الكروموسومات بالغلاف النووي وعلى القوى السيتوبلازمية المنقولة إلى الكروموسومات من خلال الغلاف النووي. في النباتات ، تجعل إمكانية الوصول المحدودة وهشاشة الخلايا الاختزازية الذكور داخل الأنثرات مناهج التصوير الحي وتحليل حركة الكروموسوم صعبة من الناحية الفنية. في الواقع ، هذه الحركات سريعة للغاية ، ويتطلب تحليلها إيجاد ظروف الاستحواذ المثلى. هنا ، يتم وصف طريقة فعالة لالتقاط حركات الكروموسوم السريعة أثناء الطور الانتصافي الذكري في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا ، في أفلام الفاصل الزمني ، باتباع حركات السنتروميرات ذات العلامات الفلورية. يعتمد على تشريح الطرف الآخر والحصول على الصور باستخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) ، في 3D وبمرور الوقت. يتيح الحصول على مكدسات z الانتصافية كل 7 ثوان دقة كافية لإعادة بناء وتحليل مسارات السنتروميرات الموسومة. تتم معالجة البيانات المستخرجة لاحقا ، مما يتيح التحليل الكمي لهذه الحركات الكروموسوماتية. يعد تطوير النماذج من هذه البيانات أمرا ضروريا لفهم آلية الحركة السريعة للكروموسوم ، بما في ذلك طبيعة وشدة القوى التي تقود هذه العملية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الانقسام الاختزالي هو عملية بيولوجية أساسية تضمن النقل المخلص للمادة الوراثية من جيل إلى آخر. تنقسم عملية الانقسام الاختزالي إلى جولتين متتاليتين من انقسام الخلايا ، الانقسام الاختزالي الأول والانقسام الاختزالي الثاني. يسبق الانقسام الاختزالي الأول طور طويل تتعرف خلاله الكروموسومات المتجانسة على بعضها البعض وتقترن. خلال هذا الطور الممتد ، تحدث العديد من العمليات البيولوجية. إلى جانب إقران الكروموسومات المتجانسة ، تخضع هذه الكروموسومات أيضا لعملية تسمى المشبك. يتضمن المشبك تكوين مركب بروتيني يعرف باسم المركب المشبكي ، والذي يربط الكروموسومات المتجانسة بطولها. يعزز المركب المشبكي إعادة التركيب المتماثل ، يليه تبادل المادة الوراثية بين الكروموسومات المتجانسة وتشكيل عمليات التقاطع. هذه تقيم اتصالا ماديا بين الكروموسومات المتجانسة ، مما يسهل محاذاة مناسبة وفصلها المتوازن1،2.

أثناء التعرف على الكروموسوم المتماثل ، من المعروف أن حركات الكروموسوم الطور السريع (RPM) تلعب دورا حاسما. أظهرت الدراسات التي أجريت في العديد من الأنواع النموذجية أنه أثناء اللبتوتين ، تلتصق الكروموسومات بالغلاف النووي (NE). وهي متصلة بالهيكل الخلوي السيتوبلازمي من خلال NE ، عبر مركب البروتين LINC (رابط الهيكل النووي والهيكل الخلوي)3. تنتقل القوى المتولدة في السيتوبلازم إلى الكروموسومات من خلال مركب LINC ، مما يتيح حركة الكروموسوم.

تعد دراسة RPMs ضرورية لفهم الآليات الأساسية للانقسام الاختزالي ، لا سيما تلك التي تشارك في التعرف على الكروموسومات المتجانسة. ومع ذلك ، فإن دراسة هذه الحركات تتطلب تجارب تصوير حية محددة. تركز معظم دراسات التصوير الحي في A. thaliana على الأنسجة الجسدية والأعضاء الخضرية. أجريت هذه الدراسات لتحديد كيفية قيام الخلايا بظهور الأعضاء4. أجريت مثل هذه الدراسات على النسيج الإنشائي5والجذور6. في الآونة الأخيرة ، طورت بعض الفرق تقنيات لمراقبة نمو الأزهار ، بما في ذلك الانقسام الاختزالي ، في الوقت الفعلي في A. thaliana على مدى عدة أيام7،8. ومع ذلك ، يمكن أن تكون هذه البروتوكولات أيضا صعبة ويصعب إعدادها لأعداد كبيرة من العينات.

تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتصوير الخلايا الحية وتحليل ديناميكيات الكروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي في A. thaliana. من خلال استخدام الفحص المجهري متحد البؤر ، وهي تقنية بسيطة لتحضير العينة ، جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الفلورية للكروموسومات ، تم التقاط حركة الكروموسوم بدقة مكانية وزمانية عالية خلال فترات زمنية قصيرة. يحدد البروتوكول تحضير الأنسجة النباتية للتصوير ، وتحسين معلمات التصوير لتقليل السمية الضوئية وزيادة جودة الصورة إلى أقصى حد ، بالإضافة إلى معالجة الصور وتحليل البيانات. تتيح هذه الطريقة القياس الكمي الدقيق لديناميكيات السنترومير أثناء الانقسام الاختزالي ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم سلوك الكروموسوم الكامن وراء تكوين الأمشاج الناجح. هذه المعرفة لها آثار مباشرة على الزراعة ، لا سيما في تحسين برامج تربية المحاصيل من خلال تسهيل دراسة عمليات إقران الكروموسومات وإعادة التركيب التي تؤثر على الخصوبة والتنوع الجيني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم هذا البروتوكول A . thaliana المعدلة وراثيا النباتات التي تعبر عن GFP-CENH3 و NUP54-RFP الجيناتالمعدلة وراثيا 9،10. تسمح علامة CENH3 بتتبع حركة السنتروميرات. تصنف علامة NUP54 المسام النووية وبالتالي تساعد على تمييز النواة. يمكن استخدام علامات أخرى ، ولكن يجب أن تكون مقاومة للتبييض الضوئي حيث تضيء العينة باستمرار. للتأكد من أن العلامة لا تخضع للتبييض الضوئي ، قم بإجراء التجربة في ظل نفس ظروف الليزر ومعلمات الاستحواذ ، وتأكد من أن الإشارة تظل مستقرة طوال مدة الحصول على الصورة. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. نمو النبات وثقافته

  1. زرع البذور مباشرة في الأواني في الدفيئة.
  2. ضع الأواني في دفيئة في ظل الظروف التالية: 16 ساعة في النهار / 8 ساعات ليلا ، 20 درجة مئوية ، 70٪ رطوبة.
  3. اسمح للنباتات بالنمو في الدفيئة لمدة 4 أسابيع تقريبا. يجب أن تصل النباتات إلى مرحلة يكون فيها 5/6 سيقان زهرة (انظر الشكل 1 أ).

2. تشريح الأنثرات وإعداد الشرائح

  1. قم بإعداد شريحة زجاجية ، ضع فاصلا (مادة لاصقة على الوجهين مع ثقب بقطر 9 مم ، وعمق 0.12 مم) في وسطها ، مع الحرص على إزالة الأغشية الواقية من كل جانب. سيحتفظ هذا الفاصل بالعينة ويخلق مسافة بين الشريحة والغطاء.
  2. قم بإيداع 8 ميكرولتر من ماء الصنبور في وسط الفاصل.
  3. باستخدام الملقط ، اختر إزهارا من أحد السيقان الرئيسية (انظر الشكل 1 ب) (لا تستخدم النورات الصغيرة من السيقان الناشئة).
  4. ضع الإزهار على شريحة جديدة تحت مجهر مجسم مزود بمسطرة. حدد براعم الزهور التي يبلغ طولها حوالي 0.5 مم (الشكل 1 ج).
  5. باستخدام الإبر الحادة ، افتح البراعم برفق ، وقم بتفكيك الكؤوس والبتلات للحفاظ على الأنثرات فقط. احرص على عدم إتلاف الأنثرات أو تركها تجف.
  6. انقل عناقيد العضو الآخر برفق إلى الماء في تجويف الفاصل. لتجنب الجفاف ، افعل ذلك مباشرة بعد إزالة الكؤوس والبتلات.
  7. قم بإيداع عدة عناقيد أخرى داخل تجويف الفاصل.
  8. قم بتغطية الشريحة بغطاء ، وتجنب فقاعات الهواء. للقيام بذلك ، أضف 8 ميكرولتر من الماء إلى غطاء واقلب الغطاء بعناية مع قطرة ماء على تجويف الفاصل. تأكد من غمر عناقيد الطرف الآخر في إجمالي 16 ميكرولتر من الماء وأن الغطاء ملصق جيدا على الفاصل (انظر الشكل 1D ؛ الشكل 2).

3. الفحص المجهري متحد البؤر - إعداد التصوير

ملاحظة: تعتمد طريقة إعداد معلمات التصوير على النظام متحد البؤر المستخدم. لمزيد من الدراسة في معلمات التصوير، راجع قسم المناقشة . تم الحصول على الصور باستخدام CLSM وعدسة غمر في الماء 20x. يوفر استخدام هدف الغمر في الماء تطابقا أفضل لمعامل الانكسار ، حيث يتم تركيب العينة البيولوجية في الماء.

  1. قم بإعداد المجهر عن طريق إثارة GFP عند 488 نانومتر واكتشافه باستخدام كاشف هجين بين 494 نانومتر و 547 نانومتر.
    ملاحظة: تم تعيين كسب إزاحة الكاشف الهجين على 100. RFP متحمس عند 561 نانومتر ويتم اكتشافه باستخدام كاشف هجين بين 584 و 629 نانومتر. تم ضبط كسب إزاحة الكاشف الهجين على 130. سرعة المسح 400 هرتز ، والمسح ثنائي الاتجاه. يتم تطبيق متوسط خط 2. تم الحصول على القناتين في وقت واحد لتقليل وقت الاستحواذ. تم ضبط طاقة الليزر على 15٪ لليزر 488 نانومتر و 30٪ لليزر 561 نانومتر.
  2. توطين العضو الآخر باستخدام إضاءة المجال الساطع.
  3. باستخدام قناة الحقل الساطع ، حدد المرحلة الانتصافية بناء على شكل الخلايا.
    ملاحظة: مراحل Zygotene أو pachytene مطلوبة لمراقبة عدد الدورات في الدقيقة. يتيح اختلاف التركيز على طول المحور Z تقدير الشكل ثلاثي الأبعاد للخلية. في مرحلة اللبتوتين ، تظهر الخلايا الاختزالي شكلا مربعا واضحا ، ويتم وضع النواة في مركز النواة ، مما يسهل التعرف عليها. خلال مرحلتي البيضة الملقحة والباكيتين ، تبدأ الخلايا الاختزالي في تبني شكل شبه منحرف ، وتهاجر النواة نحو الغلاف النووي. بحلول مرحلة الديبلوتين ، تعرض الخلايا الاختزالي مورفولوجيا مستديرة بالكامل10.
  4. تصور العضو الآخر على البرنامج. تعد إشارة RFP أيضا مؤشرا جيدا للمرحلة الانتصافية للخلايا.
    ملاحظة: تظهر الخلايا الانقسامية في مرحلة zygotene / pachytene وضع علامة NUP54 على شكل هلال ، يتوافق مع تجمع المسام النووية في منطقة محظورة من NE في هذه المراحل (الشكل 3 أ). إذا لزم الأمر ، قم بتدوير العضو الآخر بحيث يكون في وضع أفقي (انظر الشكل 3).
  5. حدد حجم صورة 400 بكسل × 150 بكسل ، مع تقريب رقمي 4 ، مع توسيط العضو الآخر في الصورة.
  6. حدد سمك العينة المراد تصويرها للحصول على أكبر عدد ممكن من الخلايا الاختزالية السليمة. ومع ذلك ، من المهم الحد من عدد شرائح z لتقليل وقت الاستحواذ. بسمك 15 ميكرومتر ، يتم عمل 16 شريحة z. تم الحصول على مكدسات Z بحجم خطوة 1.04 ميكرومتر.
  7. لإجراء عمليات اكتساب مستمرة، قم بتعيين الفاصل الزمني إلى صفر في القسم الزمني . باستخدام المجهر والمعلمات الموضحة أعلاه ، يكون وقت الحصول على 16 شريحة حوالي 6-8 ثوان. الحد الأدنى لمدة الاستحواذ هو 2 دقيقة ، ولكن يمكن أن يصل إلى 20 دقيقة.
  8. ابدأ الاستحواذ.

4. تحليل الصور - تتبع حركة السنترومير

ملاحظة: تتطلب إعادة بناء حركات السنترومير برنامج تحليل الصور القادر على تتبع الحركة ثلاثية الأبعاد. سيقوم البرنامج بتعيين كائن لإشارة فلورية ، بناء على المعلمات المحددة ، في كل وقت اقتناء. بعد ذلك ، تقوم أداة التتبع تلقائيا بتحليل الكائنات المتحركة وإنشاء مخطط نسب.

  1. المعالجة المسبقة للصور
    1. لتسهيل تحليل الحركات ، قم بإجراء معالجة الصور بعد الاستحواذ. على سبيل المثال ، يمكن استخدام عملية استخراج المعلومات التكيفية (خوارزمية deconvolution) للكشف عن الهياكل والتفاصيل الدقيقة وتحسين جودة الصورة.
  2. تتبع السنترومير العالمي
    1. تتبع جميع السنتروميرات في الصورة: استخدم وحدة موضعية لتتبع النقاط تلقائيا (بمرور الوقت).
    2. اختر القناة المصدر ، باللون الأخضر في هذه الحالة. حدد قطر XY ، 1 ميكرومتر ، للسنترومير الذي يحمل علامة GFP-CENH3. يحدد اكتشاف الكائن جميع الكائنات في الصورة (الشكل 3 ب).
    3. قم بتعديل جودة الكشف بناء على شدة الإشارة باستخدام الرسم البياني الموجود أسفل نافذة التحكم.
    4. استخدم خوارزمية تتبع الحركة الانحدارية التلقائية لتتبع المسارات (الشكل 3 ج). إن تصور جميع المسارات يجعل من السهل التعرف على الخلايا الاختزالية من الأنسجة الجسدية (فيديو 1).
  3. تتبع السنتروميرات في خلية اختزازية واحدة
    ملاحظة: باستخدام برنامج تصور ثلاثي الأبعاد ، تحقق من النوى والمسارات ، وقم بتحليل النوى السليمة فقط والتي لم يتم اقتصاصها في أي وقت أثناء الاستحواذ. ينتج عن تحليل الخلية الاختزالية المقطوعة بيانات خاطئة.
    1. تتبع السنترومير التلقائي
      ملاحظة: عند تحليل نواة واحدة ، تتم إعادة تشغيل العملية من البداية.
      1. استخدم الوحدة الموضعية لتتبع النقاط (بمرور الوقت) على النواة المحددة ، وتحديد منطقة الاهتمام (ROI) المقابلة باستخدام الخيار تقسيم منطقة الاهتمام فقط وتتبع المواقع (بمرور الوقت).
      2. حدد عائد استثمار يتضمن النواة بشكل صحيح في جميع الأبعاد الثلاثة وبمرور الوقت. (الشكل 4 أ).
      3. استخدم نفس المعلمات الخاصة بالعضو الآخر بأكمله للكشف عن السنترومير (الشكل 4 ب) والتتبع (الشكل 4 ج).
      4. في مخطط النسب (الشكل 4F) ، يشار إلى جميع المسارات. يمكن إزالة المسارات خارج الخلية الاختزائية التي تم تحليلها (الشكل 4 ج). حدد المسارات واحذفها باستخدام مفتاح Delete على لوحة المفاتيح. يمكن التعرف عليها بسهولة باستخدام عارض 3D الخاص بالبرنامج.
    2. تصحيح تتبع السنترومير اليدوي
      ملاحظة: في معظم الحالات ، يجب تصحيح المسارات يدويا لأن برنامج التتبع لا يمكنه التفريق بين السنتروميرات القريبة جدا من بعضها البعض.
      1. استخدم وضع التحرير لحذف كائن أو إضافته. تأكد من إضافة الكائن في المستوى الصحيح.
      2. قم بتوصيل الكائنات الجديدة يدويا في وضع تحرير المسارات باستخدام مخطط النسب ، بعد تحليل شخصي دقيق وشامل للخلية في 3D. يوضح الشكل 4E ، G المسارات المصححة على صورة الخلية الاختزالي وعلى المؤامرة الخطية ، على التوالي. يوضح الفيديو 2 مسارات خلية اختزازية واحدة بعد التصحيح.
      3. تصدير البيانات
        1. قم بتصدير بيانات التتبع إلى تنسيق برنامج جدول بيانات لتسهيل المزيد من معالجة البيانات وتحليلها. تحتوي هذه الملفات على جداول قياس ناتجة عن التتبع الذي تم إجراؤه باستخدام البرنامج.
        2. تأكد من أن ملف جدول البيانات الذي تم تصديره يحتوي على المتغيرات التالية: الوقت، الذي يسجل النقطة الزمنية لكل قياس؛ معرف المسار ، الذي يحدد كل مسار بشكل فريد ؛ الإزاحة دلتا X ، Y ، Z ، والتي تمثل التغيير في الموضع في ثلاثة أبعاد في كل نقطة زمنية ؛ والموضع X ، Y ، Z ، الذي يخزن الموضع المطلق لكل جسم في الفضاء.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: يصف هذا الجزء سير عمل تحليل البيانات باستخدام البرامج النصية R11 المنفذة في RStudio12. يمكن استرجاعها من مستودع Data INRAE على: 10.57745 / V1NNFI. يتم إنشاء جميع الأرقام باستخدام ggplot213 لتصور المقاييس المحسوبة. تقوم البرامج النصية بتنفيذ الخطوات التالية بالتتابع: التكوين الفرعي meiomove. يتم تنفيذ البرنامج النصي R أولا لتهيئة بيئة R وتحميل المكتبات المطلوبة وتحديد المتغيرات العامة. رابط البرنامج النصي هو: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. قراءة البيانات واختيارها
    ملاحظة: يتم تخزين البرنامج النصي المراد استخدامه على النحو التالي: meiomove-sub-loader.R."
    1. اجمع جميع ملفات Excel الفردية التي تحتوي على بيانات التتبع ودمجها في ملف موحد واحد.
    2. احفظ الملف المدمج بتنسيق TSV (قيم مفصولة بعلامات جدولة) لضمان التوافق مع خطوات معالجة البيانات الإضافية.
    3. احسب مواضع x و y و z عن طريق تجميع قيم الإزاحة بمرور الوقت ، مما يضمن إعادة بناء المسار المكاني لكل كائن مجنزرة بدقة. تم ذلك للتعويض عن خطأ في البرنامج الذي قام بتصدير مواضع XYZ غير صحيحة.
  2. تنظيف البيانات
    ملاحظة: يتم تخزين البرنامج النصي المراد استخدامه على النحو التالي: meiomove-sub-clean.R."
    1. قم بإزالة المسارات القصيرة، التي تعرف بأنها تلك التي لا تقل مدتها عن 50 ثانية. لا تحتوي هذه المسارات على نقاط بيانات كافية لتحليل هادف ، لأنها قد تسبب ضوضاء أو عدم دقة.
    2. حدد وحذف المسارات التي يظل فيها الموضع (X ، Y ، Z) ثابتا بمرور الوقت ، حيث تشير هذه إلى القطع الأثرية أو الهياكل الثابتة غير ذات الصلة بالتحليل.
    3. قم بتصفية قيم الإزاحة المفقودة (إدخالات NA) لضمان سلامة البيانات وتجنب الأخطاء الحسابية في الخطوات اللاحقة.
    4. اكتشف وحذف المسارات التي تختلف فيها قيم الإزاحة التي تم الحصول عليها من برنامج تحليل الصور اختلافا كبيرا عن تلك التي أعيد حسابها ، مما يضمن الاتساق والموثوقية في تتبع البيانات.
  3. تصحيح انجراف الخلايا الانتصافية
    ملاحظة: يتم تخزين البرنامج النصي المراد استخدامه أيضا على النحو التالي: meiomove-sub-clean.R."
    1. في الاعتبار الانجراف المحتمل أثناء الاستحواذ من خلال التمييز بين السنتروميرات الانتصافية والجسدية. تضمن هذه الخطوة أن الحركات المرصودة تتوافق مع العمليات البيولوجية بدلا من القطع الأثرية التجريبية.
    2. قم بتطبيق تصحيح الانجراف عن طريق ضبط مواضع الخلايا الانتصافية بالنسبة للخلايا الجسدية ، والتي تعمل كمرجع مستقر.
  4. توليد الإخراج
    ملاحظة: يتم تخزين البرنامج النصي المراد استخدامه على النحو التالي: meiomove-sub-metrics.R."
    1. احسب السرعة اللحظية في كل خطوة زمنية لتتبع الاختلافات في سرعة الحركة بمرور الوقت.
    2. احسب زاوية الدوران ، والتي تمثل التغيير في اتجاه الحركة بين الخطوات الزمنية المتتالية ، مما يوفر رؤى حول أنماط المسار. يتم تخزين النتيجة على النحو التالي: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (الإخراج 1).
    3. احسب نسبة التوعية باستخدام celltrackR14 ، والذي يحدد مدى تحرك الكائن المتعقب بالنسبة لموضع البداية ، مما يعطي مؤشرا على السلوك الاستكشافي. يتم تخزين النتيجة على النحو التالي: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (الإخراج 2).
    4. احسب متوسط السرعة لكل مسار فردي لتلخيص خصائص الحركة خلال فترة المراقبة بأكملها. احسب متوسط زاوية الدوران لكل مسار لتحليل اتجاه الحركة الكلي والأنماط السلوكية. يتم تخزين النتيجة على النحو التالي: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (الإخراج 3).
    5. حدد موضع النقطة الوسطى في كل خطوة زمنية لكل مسار خلية. النقطة الوسطى هو متوسط مواضع السنترومير في خلية اختزازية معينة.
    6. احسب حجم النقطة الوسطى في كل خطوة زمنية ، مما يوفر مقياسا للتشتت المكاني للسنتروميرات حول متوسط موقعها. تعطي الاختلافات في حجم النقطة الوسطى بمرور الوقت معلومات عن الاتساق العالمي عبر مسارات السنترومير. يتم تخزين النتيجة على النحو التالي: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (الإخراج 4).
    7. حساب الارتباط المتبادل للسرعة لتحليل العلاقات بين ديناميكيات الحركة للكائنات المتعقبة المختلفة ، والكشف عن السلوكيات المنسقة المحتملة. يتم تخزين النتيجة على النحو التالي: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (الإخراج 5).
    8. احسب متوسط الإزاحة التربيعية (MSD) لكل مسار ، وهو مقياس رئيسي يحدد متوسط المسافة التربيعية التي تقطعها السنتروميرات خلال فترات زمنية معينة (فواصل زمنية) لتوصيف نوع الحركة.
      ملاحظة: من خلال فحص كيفية تطور MSD مع زيادة الفجوة الزمنية ، يمكن للمرء أن يستنتج ما إذا كانت الحركة منتشرة أو محصورة في الغالب ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة للسلوك الديناميكي الأساسي. يتم تخزين النتيجة على النحو التالي: results/dataframes/metrics-msd.tsv (الإخراج 6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير بروتوكول سريع لتصور حركات الكروموسوم أثناء الطور الأولي للانقسام الاختزالي في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا ، مما يسمح بعمليات اكتساب متعددة بفاصل زمني ، وبالتالي تحليل مجموعة بيانات كبيرة. يتم تصوير الخلايا الاختزالية التي تعبر عن علامة GFP ، مما يسمح بتصور السنتروميرات ، وعلامة RFP ، مما يسمح بتصور النواة ، لمدة 4 دقائق باتباع البروتوكول الموصوف.

تم تحسين معلمات الاستحواذ المستخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح البروتوكول الحالي التصوير في الجسم الحي وتحليل حركة السنترومير أثناء الطور الانتصافي في نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. يمكن تنفيذ هذا البروتوكول إما باستخدام مجهر متحد البؤر عمودي أو مقلوب ، مما يجعله في متناول معظم المختبرات المجهزة بتقنية متحد البؤر. على الرغم من أن الأنظمة متحد البؤر تختلف في سرعة المسح والحساسية وأجهزة الكشف والقدرة على فصل الأطوال الموجية ، إلا أنه من الممكن ضبط معلمات الاستحواذ للحصول على صور بدقة زمنية ومكانية جيدة. يمكن أن يختلف اختيار بروتينا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استفاد هذا العمل من دعم المنصات التكنولوجية لمرصد النباتات التابع لمعهد جان بيير بورجين PO-Plants و PO-Cyto. تم تمويل هذا البحث من قبل ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042: M.G.، P.A.، L.C.، S.L.، و DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02، M.G.، L.C.). يستفيد معهد جان بيير بورجين من دعم علوم نبات ساكلاي (ANR-17-EUR0007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بيئة التكاثرتريف (جيفي)101820/02227861
المجهر الكونفوكاللايكامقسم الشعاع الصوتية البصرية TCS SP8 AOBS
برمجيات الكونفوكاللايكابرنامج LAS X 3.5.0.18371
الغطاء المغلقبول مارينفيلد GmbH10705222x22 رقم 1,5H
الملقطإيديال-تيك4.SA.0ملقط عالي الدقة
GFP:CENH3رافي وآخرون 2010بذور الأرابيدوبسيس ثاليانا المستخدمة هنا
ggplot2  ggplot2: رسومات أنيقة لتحليل البيانات   المرجع13https://ggplot2.tidyverse.org
مقبض الإبرهاماخرمقبض الحلقة، الطول 170 مم
إيماريسآلات أكسفوردإيماريس 9.7.2تحليل الصورة - وحدة "سبوت"
العدسةلايكاHC PL APO CS2 20× ;/0.75 IMM
البرقلايكافك الالتفاف التكيفياستخراج المعلومات الذكي الآلي من بيانات الكونفوكال
الأضواءفيغيلدأبولو LL252-Gen2
إبرواتكينز & دونكاستردبابيس E3 بقياس .0124" (.31مم) × 25مم
NUP54:RFPكرومر وآخرون 2024بذور الأرابيدوبسيس ثاليانا المستخدمة هنا
الأوانيتيكو (بوبلمان)VDF 7x7x6.5 سم
Rفريق RCoreR: لغة وبيئة للإحصائيات وغير المعلوماتية؛   الحوسبة. مؤسسة R للحوسبة الإحصائية، فيينا، النمسا. Reference11https://www.R-project.org/  ؛
Rstudioفريق الوضع  RStudio: بيئة تطوير متكاملة لشركة R. Posit Software، PBC، بوسطن، ماساتشوستس. Reference12http://www.posit.co/
الشرائحزجاج الحياكة10000326x76x1.0مم
الفواصلصيد الحراريمقطع آبير، 8 آبار، قطر 9 مم، عمق 0.12 مماقطع كل فاصل بشكل منفصل
المجاهر المجسمةنيكونSMZ800

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: Integrating structure and function. Annu Rev Genet. 33 (1), 603-754 (1999).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances between homologs. Annu Rev Genet. 57 (1), 1-63 (2023).
  3. Kim, H. J., Liu, C., Dernburg, A. F. How and why chromosomes interact with the cytoskeleton during meiosis. Genes (Basel). 13 (5), 901(2022).
  4. Harline, K., Roeder, A. H. K. An optimized pipeline for live imaging whole Arabidopsis leaves at cellular resolution. Plant Methods. 19 (1), 10(2023).
  5. Prunet, N. Live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers. J Vis Exp. (122), e55156(2017).
  6. Peng, Z., Jiao, Y., Wang, Y. Live imaging of Arabidopsis shoot primordia via a confocal laser scanning microscope. STAR Protoc. 4 (2), 102217(2023).
  7. Prusicki, M. A., et al. Live cell imaging of meiosis in Arabidopsis thaliana. eLife. 8, e42834(2019).
  8. Valuchova, S., et al. Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy. ELife. 9, e52546(2020).
  9. Ravi, M., Chan, S. W. L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature. 464 (7288), 615-618 (2010).
  10. Cromer, L., et al. Rapid meiotic prophase chromosome movements in Arabidopsis thaliana are linked to essential reorganization at the nuclear envelope. Nat Commun. 15 (1), 5964(2024).
  11. R: A language and environment for statistical computing. , at https://www.R-project.org/ (2021).
  12. RStudio: Integrated development environment for R. , at http://www.posit.co/ (2025).
  13. Wickham, H. Data Analysis. ggplot2. , 189-201 (2016).
  14. Wortel, I. M. N., et al. CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data. Immunoinformatics. 1 - 2, 100003(2021).
  15. Lee, C. -Y., et al. Mechanism and regulation of rapid telomere prophase movements in mouse meiotic chromosomes. Cell Rep. 11 (4), 551-563 (2015).
  16. Nozaki, T., Weiner, B., Kleckner, N. Rapid homologue juxtaposition during meiotic chromosome pairing. Nature. 634 (8036), 1221-1228 (2024).
  17. Fang, Y., Spector, D. L. Centromere positioning and dynamics in living Arabidopsis plants. Mol Biol Cell. 16 (12), 5710-5718 (2005).
  18. Arpòn, J., Gaudin, V., Andrey, P. A method for testing random spatial models on nuclear object distributions. Plant Chromatin Dynamics: Methods and Protocols. 1675, 493-507 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة