تحليل تخصيب فيتامين أ بمقدار 13درجة مئوية في العينات البيولوجية بواسطة قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز والاحتراق ونسبة النظائر

Bryan  M. Gannon; Christopher R. Davis; Hailey Chen; Sherry A. Tanumihardjo

doi:10.3791/68571

مقالة منهجية

تحليل تخصيب فيتامين أ ^{بمقدار 13}درجة مئوية في العينات البيولوجية بواسطة قياس الطيف الكتلي لكروماتوغرافيا الغاز والاحتراق ونسبة النظائر

491 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

نوفمبر 14, 2025

Bryan M. Gannon¹ , Christopher R. Davis¹ , Hailey Chen¹ , Sherry A. Tanumihardjo¹

¹Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه الورقة تحليل عينات المصل وحليب الثدي والكبد ل ¹³تخصيب C لإسترات الريتينول والريتينيل لتطبيقات التتبع. يتم استخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء لتنقية تركيزات الريتينول وقياسها كميا ، ويستخدم قياس الطيف الكتلي لنسبة كروماتوغرافيا الغاز - الاحتراق - نظائر (GC-C-IRMS) لتحليل المستخلصات المنقاة.

الملخص

فيتامين أ ضروري للصحة ، لكن تقييم حالة فيتامين أ يمثل تحديا. يتم التحكم في فيتامين أ المتداول في الدم بشكل متماثل وغالبا لا يعكس نقص فيتامين أ أو فائضه. يسمح استخدام ¹³فيتامين C A بتتبع وقياس إجمالي مخازن فيتامين A في الجسم ومعلومات إضافية عن الدوائية والتمثيل الغذائي. يصف هذا البروتوكول استخراج وتنقية وتحديد ¹³إثراء نظيري C لفيتامين أ في عينات المصل وحليب الثدي والأنسجة باستخدام قياس الطيف الكتلي لنسبة كروماتوغرافيا الغاز والاحتراق والنظائر (GC-C-IRMS). يوفر التحليل باستخدام GC-C-IRMS قيم تخصيب حساسة ودقيقة ، خاصة للعينات التي تحتوي على تخصيب ¹³درجة مئوية بالقرب من مستويات الوفرة الطبيعية. يتيح ذلك المرونة في تصميمات الدراسة لاستخدام جرعات تتبع أصغر وأخذ عينات من الحرائك الدوائية على المدى الطويل. باختصار ، إلى 0.4 إلى 1 مل من المصل ، يضاف الإيثانول لترسيب البروتينات ، ويضاف C-23 β-apo-carotenol كمعيار داخلي ، ويستخدم الهكسان لاستخراج الريتينويدات. يتم تعليق المستخلص لاحقا في الميثانول وتنقيته باستخدام HPLC. ثم يتم تعليق جزء الريتينول في الهكسان وحقنه في نظام GC-C-IRMS. يتم حساب الذرة٪ (At٪) مباشرة بالإشارة إلى ثاني أكسيد الكربون ، والذي تتم معايرته وفقا لمعيار السكروز باستخدام محلل عنصري. تشمل أنواع الأنسجة الأخرى التي تم تحليلها بواسطة GC-C-IRMS حليب الثدي والكبد بعد التصبن. يمكن استخدام تقنيات استخراج الطور الصلب للمساعدة في تنقية هذه المصفوفات المعقدة أو غيرها. علاوة على ذلك ، يمكن إرفاق محلل عنصري بنظام IRMS لتحليل عينات الطعام لإجمالي ^{محتوى 13}درجة مئوية.

المقدمة

فيتامين أ (VA) هو مغذيات دقيقة أساسية مطلوبة للرؤية ووظيفة المناعة والتمايز الخلوي وتنظيم التمثيل الغذائي. لا يزال تحسين حالة VA يمثل تحديا صحيا عالميا ، حيث يمكن أن يؤدي النقص أو الفائض إلى إضعاف النتائج الصحية. يعد التقييم الدقيق لحالة VA أمرا بالغ الأهمية للدراسات السريرية أو السكانية التي توجه التدخلات المناسبة. ومع ذلك ، فإن تركيز الريتينول في الدم وحده هو مؤشر حيوي ضعيف وأداة تشخيصية لأنه يتم تنظيمه بشكل متماثل عبر مجموعة واسعة من مخازن الجسم الكلي (TBSs) ويتأثر بالالتهاب ونقص المغذيات الأخرى¹^،².

لقد غيرت أدوات التتبع المصنفة نظائريا بشكل كبير أبحاث VA من خلال تمكين التقييم الكمي ل TBSs باستخدام اختبار تخفيف نظائر الريتينول (RID)³^،⁴^،⁵. بالنسبة ل RID ، يتم إعطاء متتبع VA المخصب إما ^{ب 13}درجة مئوية أو ²ساعة ، ويتوازن مع مخازن الجسم ، ويتم قياس نسبة تتبع الريتينول إلى تتبع المصل (أو البلازما) باستخدام مرض التصلب العصبي المتعدد. يتم تطبيق معادلة تخفيف النظائر مع افتراضات محددة تتعلق بعملية التمثيل الغذائي VA لحساب TBSs⁵^،⁶.

يمكن استخدام العديد من مجموعات الكروماتوغرافيا والتصلب العصبي المتعدد لتحديد TTR الريتينول في المصل (على سبيل المثال ، GC-MS و LC-MS و LC-MS / MS). تعد الدقة التحليلية أمرا بالغ الأهمية لتقديرات RID الدقيقة لأن TBSs تتناسب عكسيا مع TTR. يعد LC-MS / MS مناسبا تماما للتطبيقات عالية الإنتاجية عند استخدام أدوات التتبع ذات العلامات العالية وجرعات التتبع العالية نسبيا. تشير طرق LC-MS / MS النموذجية إلى الانحرافات المعيارية النسبية للريتينول (RSDs) بنسبة 3-6٪ للمقايسة الداخلية و <8٪ للمقايسة^{البينية 7} ، ولكن هناك بيانات محدودة حول دقة ودقة TTRs. في المقابل ، يوفر مطياف الكتلة بنسبة كروماتوغرافيا الغاز والاحتراق والنظائر (GCCIRMS) دقة استثنائية لتخصيب ¹³C-retinol ، مع وفرة نموذجية من نظائر ¹³C / ¹²C RSDs ~ 0.02-0.05⁸^،⁹. يسمح هذا بالتحديد الدقيق لتركيزات التتبع في العينات التي تكون فيها التخصيب منخفضة. يسمح استخدام IRMS لتطبيقات RID بإشارة تحليلية كافية باستخدام كتلة أقل للتتبع وعدد أقل من الذرات المسماة في جهاز التتبع ، وكلاهما يوفر التكاليف المرتبطة بجرعات التتبع.

توضح هذه المخطوطة تحليلا ل ¹³ريتينول C من الدم وحليب الثدي والأنسجة باستخدام GC-C-IRMS. اعتمادا على العينة البيولوجية التي يتم اختبارها ، يبدأ تحليل ¹³ريتينول مسمى C باستخدام GC-C-IRMS بواحدة من عدة طرق استخراج محتملة لعزل المركبات غير القطبية التي تشمل الريتينول المسمى. بالنسبة لعينات المصل ، يتضمن ذلك استخلاص سائل سائل عن طريق إضافة الإيثانول والهكسان وجمع جزء الهكسان. في حالة اختبار حليب الثدي ، يتم تصبن العينات أولا بهيدروكسيد البوتاسيوم ، متبوعا باستخراج سائل سائل مماثل للمصل. يتم أيضا تنقية عينات حليب الثدي هذه باستخدام خراطيش استخراج الطور الصلب لتقليل كمية الدهون الأخرى المتبقية. في حالة الاستخراج من الأنسجة (مثل الكبد) ، يتم طحن العينة بكبريتات الصوديوم اللامائية لإزالة الماء ، ويتم استخراجها باستخدام كلوريد الميثيلين ، وتصفيتها في قارورة حجمية أو مستديرة القاع للتبخر الدوار. يتم تجفيف aliquot ، وإعادة تعليقه في الإيثانول ، وتصبن ، واستخراجه باستخدام نفس طريقة حليب الثدي. يتم تجفيف هذه المحاليل غير القطبية من كل عينة تحت النيتروجين وإعادة تكوينها في الميثانول لتنقية وقياس الكروم السائل عالي الأداء (HPLC).

تسمح حساسية IRMS بتحديد التخصيب في العينات ذات التخصيب المنخفض للعينة ، مثل عينات الحركية الدوائية لتطبيقات النمذجة الرياضية طويلة الأجل أو عينات الأنسجة خارج الكبد للتتبع الدقيق لعملية التمثيل الغذائي لحمض الفيرجين. تم اقتراح اختبار RID المزدوج بجرعة واحدة لتقييم حالة VA قبل وبعد التدخل لتحديد الفعالية في الموضوعات النظرية¹⁰ ، والتي يمكن أن تكون نهجا واعدا إذا تم التحقق من صحتها في البشر. IRMS قادر على اكتشاف متتبعات VA بالقرب من قيم التخصيب الطبيعية ، مما يسمح بنوافذ متابعة طويلة ومرونة في بروتوكولات أخذ العينات.

لقد ثبت أن حليب الثدي هو نهج أخذ عينات بديل أقل توغلا لتقييم حالة VA¹. يمكن استخدام ريتينول حليب الثدي كمصدر لأخذ العينات لاختبار RID ، وقد أظهر ارتباطا قويا بقيم RID المشتقة من المصل في النساء في زامبيا اللواتي لديهن مخازن VA منخفضة¹¹. بالنسبة للأنسجة وعينات حليب الثدي ، يمكن أن تساعد تقنيات استخراج الطور الصلب في تنقية هذه العينات في مصفوفات معقدة. كما تم استخدام IRMS للتمييز بين مصادر الغذاء لفيرجينيا وتحديد المساهمات الغذائية النسبية باستخدام التغييرات في وفرة ^{طبيعية 13}درجة مئوية من الريتينول^{في الدم 9}^،¹²^،¹³. يمكن أيضا استخدام محلل العناصر مع IRMS لتحليل عينات الطعام لإجمالي ^{محتوى 13}درجة مئوية ومقارنتها بتخصيب VA.

عند استخدام ^{ملصقات 13}درجة مئوية ، من الأهمية بمكان فهم تخصيب الريتينول ¹³درجة مئوية ، بسبب حدوث ^{طبيعي 13}درجة مئوية (~ 1.1٪ من إجمالي الكربون) ، والتي يمكن أن تختلف باختلاف مصادر VA التي يستهلكها كل من الأفراد والسكان. لذلك ، للحصول على أفضل دقة على المستوى الفردي ، يوصى بعينة دم أساسية. بالنسبة للتقييمات السكانية، يمكن إنشاء تقدير قائم على السكان باستخدام مجموعة فرعية مختارة عشوائيا أو أفراد منفصلين من نفس المجموعة السكانية¹⁴.

البروتوكول

1. استخراج الريتينول من العينات البيولوجية

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع إجراءات مناولة العينات واستخراجها تحت الضوء الأصفر أو الأشعة فوق البنفسجية لتقليل التدهور.

استخراج من المصل
1. ماصة 1 مل من المصل (أو بقدر ما هو متاح) في أنبوب اختبار زجاجي مقاس 13 × 100 مم (أو حجم مشابه). سجل حجم المصل المستخدم.
  ملاحظة: يوصى باستخدام ماصة إزاحة موجبة.
2. أضف 1.5x حجم 200 إيثانول مقاوم.
3. أضف 25 ميكرولتر من المعيار الداخلي ، مثل C-23 β-apo-carotenol (مركب من شبكية العين العابرة بالكامل ، القيمة المطلقة = 0.9) ⁹. قم بتغطية العينة واخلطها بالدوامة لمدة 15 ثانية.
4. أضف 1 مل من الهكسان ، واخلطه بالدوامة لمدة 15 ثانية ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين (~ 1,300 × جم) في درجة حرارة الغرفة.
5. باستخدام ماصة باستور ، قم بماصة طبقة الهكسان العلوية بعناية في أنبوب اختبار زجاجي جديد (12 × 75 مم أو 13 × 100 مم).
6. كرر الخطوتين 1.1.4 و 1.1.5 2x ، مع تجميع مستخلصات الهكسان الثلاثة في الأنبوب الثاني. ضع مستخلص الهكسان المجمع تحت تيار لطيف من النيتروجين حتى يجف.
7. أضف 100 ميكرولتر من الميثانول إلى العينة المجففة وقم بتغطيتها على الفور. قم بتدوير المحلول لأعلى ولأسفل على جانبي الأنبوب ثم اخلط العينة بواسطة دوامة لمدة 15 ثانية.
8. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
  ملاحظة: يمكن تخزين العينات في هذه الخطوة عند -80 درجة مئوية حتى اليوم التالي.
استخراج عينات حليب الثدي
1. قم بإذابة عينات الحليب تماما وقلبها برفق عدة مرات لضمان توحيد العينات. في أنبوب طرد مركزي علوي لولبي زجاجي سعة 10 مل ، قم بقياس كمية الحليب من 0.5 إلى 1.5 مل (قياسي 1.0 مل) ، وسجل الحجم المستخدم.
2. أضف 1.5 ضعف حجم 200 إيثانول مقاوم (يحتوي على 0.1٪ هيدروكسي تولوين بوتيل (w: v)) ، واخلطه مع دوامة لمدة 15 ثانية.
3. أضف 25 ميكرولتر من المعيار الداخلي ، مثل C-23 β-apo-carotenol (مركب من شبكية العين العابرة بالكامل ، القيمة المطلقة = 0.9) ¹⁵. قم بتغطية العينة واخلطها بواسطة دوامة.
4. أضف 0.8 ضعف حجم عينة الحليب البالغ 50:50 هيدروكسيد البوتاسيوم في الماء (محضر على شكل w: v ، على سبيل المثال ، 50 جم من KOH مذاب في 50 مل من الماء) ، واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية.
  ملاحظة: KOH: يجب أن تتكون المياه في عبوات بلاستيكية (مثل HDPE).
5. قم بتصبن العينات لمدة ساعة واحدة في حمام مائي بدرجة حرارة 45 درجة مئوية ، واخلطها لفترة وجيزة مع دوامة كل 15 دقيقة.
6. أضف الماء البارد منزوع الأيونات أو التناضح العكسي بنفس حجم حجم الحليب الأولي.
7. أضف 1 مل من الهكسان ، واخلطه بالدوامة لمدة 15 ثانية ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين (~ 1,300 × جم) في درجة حرارة الغرفة.
8. باستخدام ماصة باستور ، قم بماصة طبقة الهكسان العلوية بعناية في أنبوب اختبار زجاجي جديد (12 × 75 مم أو 13 × 100 مم).
9. كرر الخطوتين 1.2.7 و 1.2.8 مرتين أخريين ، مع تجميع الهكسان في الأنبوب الثاني.
10. خذ كل عينة من خلال استخراج الطور الصلب (SPE) ؛ ابدأ بتوصيل خراطيش SPE المطلوبة (PE 500 مجم / 3 مل من -NH₂) بمشعب الفراغ.
11. قم بتكييف كل خرطوشة عن طريق تشغيل 3 × 2 مل من الهكسان من خلال كل خرطوشة ، مع عدم السماح لمستوى المذيب بالانخفاض إلى أسفل الجزء العلوي من مادة التعبئة. اجمع الهكسان في أنبوب زجاجي مقاس 16 × 75 مم وتخلص منه بشكل مناسب.
12. قم بتحميل العينات في خراطيش واسحبها بالفراغ حتى يصبح المذيب أعلى بقليل من مستوى مادة التعبئة. اشطف كل خرطوشة ب 3 × 2 مل من الهكسان بنفس الطريقة المتبعة بالخطوة 1.2.11. تخلص من مذيب النفايات واستبدل أنابيب التجميع الزجاجية بأخرى جديدة من نفس الحجم ، تحمل معرف العينة.
13. اغسل الريتينول ب 3 × 2 مل من كلوريد الميثيلين ، واجمع هذا الجزء.
14. جفف الشطف تحت النيتروجين وأعد تكوينه في 100 ميكرولتر من الميثانول (درجة MS). امزج العينة عن طريق الدوامة وقم بتدوير المذيب على جميع جوانب الأنبوب. جهاز طرد مركزي لمدة 20-30 ثانية.
15. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
  ملاحظة: يمكن تخزين العينات في هذه الخطوة عند -80 درجة مئوية حتى اليوم التالي.
استخراج عينات الكبد
1. في قمع زجاجي بقطر 8 سم ، قم بطي ووضع ورق ترشيح Whatman # 1 مقاس 15 سم في شكل مخروطي. ضع قارورة حجمية سعة 50 مل أسفل القمع.
2. قم بإذابة الأنسجة وتزن 0.5 جرام ، أو أكبر قدر ممكن من العينة. سجل وزن الأنسجة المستخدمة.
3. انقل العينات إلى الهاون والمدقة وطحنها بحوالي 5 جم من كبريتات الصوديوم.
4. أضف 250 ميكرولتر من معيار داخلي مثل C-23¹⁵.
  ملاحظة: لا ينبغي استخدام الأشكال المسترة من فيتامين أ (أي أسيتات الريتينيل ، زبدات الريتينيل) لأن العينة ستصبح تصبن في النهاية ، مما يجعل المعيار لا يمكن تمييزه عن الريتينول الداخلي.
5. في غطاء الدخان ، اسكب 10-15 مل من كلوريد الميثيلين في الهاون مع عينة الكبد المطحون واخلطه برفق باستخدام المدقة.
6. صب كلوريد الميثيلين من خلال ورق الترشيح في القارورة الحجمية.
7. كرر الخطوتين 1.3.5 و 1.3.6 مرتين أخريين ، مما يضمن بقاء المذيب الكلي في القارورة الحجمية أسفل الخط.
8. استخدم ماصة باستور لشطف المحتويات المتبقية من الملاط في القمع باستخدام كلوريد الميثيلين. استمر في إضافة كلوريد الميثيلين إلى القمع باستخدام ماصة باستور حتى يصل المذيب الموجود في القارورة الحجمية إلى الخط. قم بتغطية القارورة الحجمية ، وأثناء تثبيت الغطاء في مكانه ، اقلب القارورة عدة مرات.
9. صب ما يقرب من 10 مل من مستخلص كلوريد الميثيلين في قارورة إرلينماير سعة 25 مل. انقل 5 مل من المحلول إلى أنبوب طرد مركزي زجاجي سعة 10 مل مع غطاء علوي لولبي. جفف العينة تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.
10. أعد تكوين العينة في 2 مل من الإيثانول + 0.1٪ هيدروكسي تولوين بوتيل ودوامة لخلط العينة.
11. أضف 0.8 مل من هيدروكسيد البوتاسيوم 50:50 (w: v) في الماء ، واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية.
12. قم بتصبن العينات لمدة ساعة واحدة في حمام مائي بدرجة حرارة 45 درجة مئوية ، واخلطها لفترة وجيزة مع دوامة كل 15 دقيقة.
13. أضف 0.1 مل من الماء البارد منزوع الأيونات أو التناضح العكسي.
14. أضف 1 مل من الهكسان ، واخلطه عن طريق الدوامة لمدة 15 ثانية ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقتين (~ 1,300 × جم).
15. باستخدام ماصة باستور ، قم بماصة طبقة الهكسان العلوية بعناية في أنبوب اختبار زجاجي جديد (12 × 75 مم أو 13 × 100 مم).
16. كرر الخطوتين 1.3.14 و 1.3.15 مرتين أخريين ، مع تجميع الهكسان في الأنبوب الثاني.
17. جفف الهكسان المجمع تحت النيتروجين وأعد تكوينه في 100 ميكرولتر من الميثانول (درجة MS). امزج العينة عن طريق الدوامة ، وقم بتدوير المذيب على جميع جوانب الأنبوب. جهاز طرد مركزي لمدة 20-30 ثانية وضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
  ملاحظة: يمكن تخزين العينات في هذه الخطوة عند -80 درجة مئوية حتى اليوم التالي.

2. تنقية العينة وقياسها باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء

قم بإعداد نظام HPLC 1 بعمود C18 (5 ميكرومتر ، 4.6 × 250 مم) وكاشف UV-Vis مضبوطا على 325 نانومتر.
قم بإعداد المرحلة المتنقلة من 92: 8 أسيتونيتريل : الماء عن طريق قياس أحجام الأسيتونيتريل والماء بشكل منفصل ثم صب الماء في الأسيتونيتريل. قم بتصفية المحلول المختلط بالمكنسة الكهربائية لإزالة الغاز المذاب.
قم بتشغيل نظام HPLC 1 ، وقم بإجراء تطهير المذيبات على HPLC إذا لزم الأمر ، ثم اضبط معدل التدفق على 1 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة على الأقل لموازنة النظام بالكامل.
حقن المعايير في نظام HPLC.
1. لقياس تركيزات الريتينول ، قم بحقن 25 ميكرولتر من المحلول القياسي الداخلي C-23 وسجل النتيجة 3x للمقارنة مع العينات.
2. حقن معيار الريتينول لتحديد وقت الاحتفاظ الدقيق للنظام المستخدم لتوجيه جمع الكسور وقياس كمية الريتينول.
قم بإعداد نظام HPLC 2 (المكونات هي نفسها النظام 1). في حالة استخدام نظام HPLC واحد لكلتا الخطوتين ، فاستبدل العمود المستخدم للتنقية الأولية بعمود ثان متطابق لتقليل الترحيل المحتمل للمركبات من العينات.
بالنسبة للنظام 2 ، قم بتصفية الميثانول بالفراغ ، وقم بتطهير المرحلة المتنقلة HPLC ، ثم قم بتشغيل 0.7 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة لتحقيق التوازن.
قم بإزالة العينات واحدة تلو الأخرى من الفريزر -80 درجة مئوية ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,300 × جم لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
قم بحقن العينة الكاملة على HPLC ، وتجنب أي مادة محببة. ابدأ التسجيل في حالة قياس الريتينول.
اجمع ذروة الريتينول في أنبوب زجاجي صغير (12 × 75 مم أو 13 × 100 مم) أثناء مرور المذيب عبر الكاشف. اجمع الجزء الأوسط من الذروة لتحقيق أقصى قدر من النقاء ، وعادة ما تكون قيم الامتصاص أكبر من 0.1 وحدة امتصاص (الشكل 1) ، والتي يمكن تعديلها اعتمادا على تركيز الريتينول في العينة. انتظر حتى تنضج ذروة C-23 وتوقف عن التسجيل.
عينة جافة تحت تيار لطيف من النيتروجين.
أضف 100 ميكرولتر من الميثانول (درجة MS) إلى العينة المجففة وقم بتغطيتها على الفور. قم بتدوير المحلول لأعلى ولأسفل على جانبي الأنبوب ، ثم اخلط العينة بالدوامة لمدة 15 ثانية. ضع العينات في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
ملاحظة: يمكن تخزين العينات في هذه الخطوة عند -80 درجة مئوية حتى اليوم التالي.
قم بإزالة العينات واحدة تلو الأخرى من الفريزر -80 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي بسعة 1,300 × جم لمدة 30 ثانية.
قم بحقن العينة الكاملة على نظام HPLC 2 ، وتجنب أي مادة محببة.
عندما تنضج ذروة الريتينول ، اجمع المذيب أثناء مروره عبر الكاشف إلى قارورة زجاجية صغيرة (<1 مل) ذات قاع مخروطي الشكل ، وحرك قارورة العينة برفق في أنبوب اختبار مقاس 12 × 75 مم.
قم بتشغيل مكثف التفريغ واترك المكثف يبرد لمدة 20 دقيقة.
ضع العينات في شكل متوازن في دائري ، واضبط إعداد الحرارة على لا شيء والمكنسة الكهربائية على 05.1 ، وأغلق الغطاء ، واضغط على تشغيل.
ملاحظة: تستغرق العينات عادة من 10 إلى 20 دقيقة حتى تجف. من المهم بالنسبة لكروماتوجراف الغاز إزالة كل الميثانول من العينات.
بمجرد أن تجف ، انقل قارورة HPLC إلى قارورة كهرماني سعة 4 مل مع غطاء غطاء لولبي ، وأعد تكوين العينة ب 4-7 ميكرولتر من الهكسان.
ملاحظة: عادة ما يكون هذا 7 ميكرولتر ، ولكن يتم تقليله عندما يتم تحديد تركيز العينة على أنه منخفض التركيز أثناء التنقية. قد تكون عينات الكبد أكثر تركيزا ، لذا أعد تكوينها بحجم أكبر. استهدف ما بين 75 نانوغرام / ميكرولتر و 400 نانوغرام / ميكرولتر.
حقن 1-5 ميكرولتر على GC-C-IRMS لتحقيق إشارة كافية ، بناء على تركيز العينة المطلوبة لحقن حوالي 75 نانوغرام من الريتينول.

3. تحليل العينة باستخدام GC-C-IRMS

قم بإعداد GC بعمود (100٪ ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان ، غير قطبي ، 15 م ، 0.25 مم معرف ، فيلم 0.25 ميكرومتر) ، ومعدل تدفق الهيليوم 1.2 مل / دقيقة.
قم بإجراء فحوصات النظام للتأكد من عدم وجود تسريبات ، وأن مصدر IRMS يركز بشكل صحيح على الكتل 44 و 45 و 46.
حقن 2 ميكرولتر من معيار الريتينول المخصب ب C 75 نانوغرام / ميكرولتر ¹³كل يوم كحقنة أولى لتحديد وقت الاحتفاظ والتحقق من أداء النظام.
في برنامج الاستحواذ ، قم بتحميل طريقة الأداة ، واكتب اسم العينة ، واضغط على تشغيل العينة. سيقوم نظام GC-C-IRMS بإجراء روتين إعداد نظام ما قبل الحقن. بمجرد أن يضيء الضوء الأخضر الجاهز للحقن في الجزء الأمامي من GC ، قم بحقن حجم العينة المحدد مسبقا في حاقن PTV التبخير بدرجة الحرارة القابل للبرمجة ، وقم بإزالة المحقنة ، واضغط على زر البدء .
قم بتشغيل حاقن PTV في وضع PTV Splitless ، مع وضع عمود الحماية في الجزء العلوي من إدخال الحاقن لمحاكاة الحقن على العمود. اضبط برنامج الحاقن ليبدأ بدرجة حرارة أولية تبلغ 50 درجة مئوية ، واستمر لمدة 1.05 دقيقة ، وقم بزيادة درجة الحرارة إلى 200 درجة مئوية بمعدل 14.5 درجة مئوية / ثانية ، واستمر عند 200 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، وانتقل إلى 300 درجة مئوية عند 14.5 درجة مئوية / ثانية ، ثم استمر في تطهير الحاقن لمدة 4 دقائق مع تدفق انقسام الهيليوم البالغ 50 مل / دقيقة قبل العودة إلى 50 درجة مئوية للحقن التالي.
قم ببرمجة درجة حرارة فرن GC إلى درجة حرارة أولية تبلغ 50 درجة مئوية ، واحتفظ بها لمدة 1 دقيقة ، ومنحدر 30 درجة مئوية / دقيقة إلى 150 درجة مئوية ، ثم 15 درجة مئوية / دقيقة إلى 265 درجة مئوية ، ثم حتى 295 درجة مئوية عند 40 درجة مئوية / دقيقة ، ثم احتفظ لمدة 2.50 دقيقة قبل التبريد إلى 50 درجة مئوية للحقن التالي.
تأكد من أن كل رسم كروماتوجرامي يبدأ بثلاث نبضات من ثاني أكسيد الكربون₂ (نقاء 99.999٪) ، معايرة ضد السكروز (IAEA-CH-6). نتائج الوصول في برنامج الاستحواذ.
بعد كل حقنة ، افحص كل كروماتوجرام، للتحقق من وجود ذروة الريتينول، وأن التكامل مناسب. استخدم البرنامج لدمج قمم الريتينول تلقائيا قدر الإمكان لتقليل التحيز المحتمل من عمليات التكامل اليدوية. استخدم إعدادات الكشف عن منحدر البدء والنهاية القياسية البالغة 20 مللي فولت / ثانية.
ملاحظة: سعة الذروة البالغة 200 مللي فولت أو أقل صغيرة جدا بحيث لا توفر قياسا دقيقا بنسبة ¹³درجة مئوية.
تصدير بيانات الرسم الكلوماتوغرامي إلى برنامج جداول بيانات. قم بتضمين فئات البيانات الأساسية التالية: اسم العينة ووقت الذروة للاحتفاظ وذروة السعة عند الكتلة 45 وAT٪.
ملاحظة: يمكن تحديد البيانات التي يتم تصديرها باستخدام أسلوب تصدير محدد. قيمة δ مفيدة لسهولة التفسير ولكنها ليست مطلوبة للحسابات.

4. حساب مخازن الجسم الكلي وتركيزات الكبد من فيتامين أ

معادلات تخفيف نظائر الريتينول.
ملاحظة: تستند معادلة توازن النظائر المفضلة والترميز المقابل الذي يستخدمه بعض الباحثين إلى توصيات من الاتحاد الدولي للكيمياء البحتة والتطبيقية¹⁶. نلاحظ أن بعض المجموعات البحثية تستخدم التدوين الذي يحاول الحفاظ على الاستخدام التاريخي للعوامل المستخدمة في معادلات RID. نلاحظ أيضا أن العوامل والأدبيات الداعمة يمكن أن تختلف فيما إذا كانت تنطبق بشكل مباشر على حسابات TBSs أو تركيزات VA في الكبد ، اعتمادا على تصميم الدراسة والنموذج التجريبي والنتائج التحليلية.
1. تحديد الريتينول TTR في المصل باستخدام وفرة نظائر ¹³درجة مئوية من ثاني أكسيد الكربون₂ بعد الاحتراق وفقا للمعادلة التالية:
  
  حيث F هي وفرة النظائر (المعروفة أيضا باسم جزء كمية النظائر ، المختصرة "x") لجرعة التتبع (F_a) ، وريتينول المصل عند خط الأساس (F_b) ، وريتينول المصل بعد الجرعات والاختلاط مع تجمع الجسم (F_c). عادة ما تكون فترات الخلط المستخدمة حوالي 14-21 يوما للبشر ولكن يمكن أن تكون أقصر أو أطول اعتمادا على تصميم الدراسة المحدد.
2. استخدم معادلات RID لحساب VA TBS وفقا للمعادلة الأساسية التالية.
  
  أين
  
  ملاحظة: تشمل العوامل المستخدمة في الامتصاص والتخزين أ) تخزين الجرعة في وقت التوازن (امتصاص الجرعة) التي تقدر عادة بين 75٪ و 90٪ للأفراد الأصحاء. يمكن تقليل التقدير في حالة وجود التهاب. ثانيا) الاحتفاظ بالجرعة. ثابت: ^e-kt ؛ ك = ln (2) / نصف عمر الريتينول ؛ 32 إلى 136 يوما للأطفال. 140 يوما للبالغين) ؛ ر = أيام منذ الجرعات (عادة 14-21 يوما); تقسيم مصل / متتبع الكبد: TTRserum / TTRliver ؛ 0.65-0.9 مع تناول VA خلال فترة الخلط ؛ 0.9-.1 في حالة استخدام جرعة تتبع منخفضة ، وتناول VA خاضع للرقابة ، وأخذ عينات الصيام.
3. احسب تركيزات VA في الكبد مع افتراضات إضافية لوزن الكبد وجزء من VA TBS في الكبد.
  
  أين
  
  عادة ما تقدر نسبة الكبد إلى وزن الجسم على أنها ثابت خاص بالعمر: الرضع: 4-4.2٪. الأطفال: 3٪ ؛ البالغون: 2.4٪. يختلف جزء TBS في الكبد باختلاف حالة فيتامين أ. التقديرات المستخدمة سابقا هي حالة VA هامشية أو منخفضة: 0.5 ؛ حالة VA المناسبة: 0.8-0.9.

النتائج

يتم توفير مثال على كروماتوگرام عينة المصل الذي تمت مراقبته عند 325 نانومتر لقسم البروتوكول 2 (الشكل 1). اعتمادا على النظام والعمود المحدد المستخدم ، فإن وقت الاحتفاظ النموذجي للريتينول هو 4-6 دقائق و 6-8 دقائق للمعيار الداخلي. تظهر المنطقة المظللة باللون الأخضر نطاق التجميع المستهدف لجزء الريتينول لتقليل الشوائب. عادة ما تكون كفاءة استخراج الريتينول من المصل ≥ 85٪ ، بينما تميل عينات حليب الثدي والأنسجة المصبن إلى أن يكون لها كفاءة أقل ، بمتوسط ~ 70-80٪. يمكن ملاحظة كميات طفيفة من أيزومرات رابطة الدول المستقلة الريتينول تتسرب قبل وقت قصير أو بعد الذروة الرئيسية المتحولة بالكامل أثناء تنقية HPLC. لم يلاحظ أي أيزومر رابطة الدول المستقلة الملموس في العينة المعروضة في الشكل 1 ولكن يمكن رؤيته في الشكل التكميلي 1 من المرجع¹⁷. في كثير من الأحيان ، سيتم فصل أيزومر إضافي أثناء تنقية HPLC الثانية (غير معروض) أو أثناء فصل GC (الشكل 2).

مثال على الكروماتوغرامات GC-C-IRMS لعينة قياسية ومصل وفارغ لقسم البروتوكول 3 (الشكل 2) ⁹. وتشمل كل عينة قمم مرجعية لثاني أكسيد الكربون₂ مع تخصيب ¹³درجة مئوية تمت معايرته وفقا لمعيار السكروز التابع للوكالة الدولية للطاقة الذرية (IAEA-CH-6).

الدقة التجريبية IRMS (CV٪) لوفرة النظائر ^{البالغة 13}درجة مئوية / إجمالي C ل: 1) ثاني أكسيد الكربون المرجعي2 كانت 0.012 للاستقرار و 0.031 للخطية (ن = 10 لكل منهما). 2) كان معيار الريتينول 0.036 للاستقرار بين اليوم و 0.022 للخطية خلال اليوم (ن = 4 لكل منهما) ؛ و 3) كانت التجربة 0.073 ± 0.061 عبر خط الأساس وثماني مجموعات علاج غذائي في الجربوع (ن = 46 عبر 9 مجموعات) ⁹.

فيما يلي مثال على كيفية استخدام بيانات GC-C-IRMS الناتجة في المصل لحساب تركيزات TBS و VA للكبد المحددة بعد 14 يوما من إعطاء الجرعة باستخدام معادلة RID للطريقة 4:

خصائص المشاركين في الدراسة:

عمر:	4 سنوات
وزن الجسم:	16.0 كجم
فا (2 كربون مصنف بالإضافة إلى الوفرة الطبيعية):	0.11
الفيسبوك:	0.010757
نادي:	0.011057
جرعة التتبع المطبقة:	1.0 ميكرولتر
الوقت منذ الجرعات:	14 يوما
عمر نصف VA:	32 يوما
إمتصاص:	0.8
نسبة TTR في المصل / الكبد (النظام الغذائي غير خاضع للرقابة):	0.9
جزء TBS في الكبد:	0.8

حساب:

TTR = (F_c-F _b)/(F_a-F _ج)
TTR = (0.0110568 - 0.010757) / (0.11 - 0.0110568) = 0.0030300213
1/TTR = 1 / 0.0030300213 = 330.03

الاحتفاظ بالجرعة = ^e-kt مع عمر نصف 32 يوما ووقت أخذ العينات 14 يوما
ك = LN (2) / 36 = 0.693147181 / 36 = 0.021660849
ر = 14
^e-kt = ^{e-0.02166 × 14} = 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330.03 × 0.8 × 0.738413073 × 0.9 = 175 ميكرولتر

لحساب تركيزات VA في الكبد:
وزن الكبد (جم) = 1,000 × وزن الجسم (كجم) × 3٪ (تقدير للأطفال)
وزن الكبد = 1,000 × 16.0 × 0.03 = 480 جم
figure-results-2
تركيز VA للكبد = (175/480) × 0.8 = 0.29 ميكرولتر / جم

figure-results-3
الشكل 1: تصوير الكروماتوجرامية HPLC لعينة المصل البشري. نظام HPLC 1 مع المرحلة المتنقلة متساوية القراط 90:10 MeOH:H₂O والكشف عند 325 نانومتر. يتم جمع ذروة الريتينول للحصول على قيم امتصاص تزيد عن ~ 0.1 (منطقة مظللة خضراء). يستخدم المعيار الداخلي C-23 β-apo carotenol لتحديد تركيز الريتينول في الدم (إذا رغبت في ذلك) خلال هذه الخطوة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 2: كروماتوجرامات GC-C-IRMS توضح تحديد الريتينول ¹³ C / ¹² C. مخطط كروماتوجرام: GC-C-IRMS من (أ) معيار الريتينول ، (ب) الريتينول المنقى من المصل ، و (ج) الحقن الفارغ المقتبس من Gannon et ^al.9. ثلاثة آثار للكتلة 44 (المقابلة ^{ل 12}C¹⁶O₂) ، و 45 (المقابلة ل ¹³C¹⁶O₂ أو ¹²C¹⁶O¹⁷O) ، و 46 (المقابلة بشكل أساسي ^{ل 12}C¹⁶O¹⁸O ، والتي تستخدم لتصحيح الكتلة 45 مقابل ^{مساهمة 17}O). ثلاث قمم عريضة قبل 200 ثانية هي قمم مرجعية لثاني أكسيد الكربون₂ تمت معايرتها إلى مادة مرجعية من السكروز ¹³درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يمكن أن توفر الطرق الموصوفة لقياس ^{تخصيب الريتينول بمقدار 13}درجة مئوية باستخدام GC-C-IRMS بيانات قيمة لتقييم التدخلات الغذائية ،¹⁸ نمذجة حركية فيتامين أ ، ¹⁹^،²⁰^،²¹ البحوث السريرية ، أو الدراسات السكانية التي تتضمن RID لتحسين تقديرات حالة VA²².

في هذا الاختبار ، يتم نقل الريتينول المنقى من عينة بيولوجية عبر عمود GC بواسطة الهيليوم من الدرجة البحثية (>99.99999٪ نقاء) مع تدرج درجة حرارة ، وفصله عن الشوائب المتبقية في العينة. يتم حرق الريتينول لتكوين ثاني أكسيد الكربون₂ والماء ، ويتم إزالة الماء. يتم نقل ثاني أكسيد الكربون₂إلى IRMS ، حيث يتم قياس الكتل 44 و 45 و 46 ، ويتم تحديد δ و AT٪ بالنسبة إلى_{مرجع غاز ثاني} أكسيد الكربون 2 ، والذي يتم معايرته بالإضافة إلى معيار السكروز (IAEA-CH-6).

في تحضير الريتينول للحقن ، يجب أن يكون الريتينول المستخرج ذو نقاء قصوى لتحقيق نسب نظائر قابلة للتكرار ولزيادة عمر المنصة التحليلية بين عمليات التنظيف الشاملة. يجب أن تكون المذيبات المستخدمة في الاستخراج من أعلى درجة نقاء متاحة ، والتي عادة ما تكون درجة MS. يجب أن تكون جميع الأواني الزجاجية، مثل أنابيب الشفط وماصات باستور وقوارير حقن HPLC جديدة لأنه يصعب تنظيفها بشكل كاف لتحليل مرض التصلب المتعدد. من المهم استخدام الأنابيب الزجاجية والماصات بدلا من البلاستيك لتقليل الملدنات في المستخلصات التي تتراكم على أعمدة GC والاحتراق.

يمكن إجراء تعديلات على سير عمل تحليل العينة هذا اعتمادا على تصميم الدراسة المحددة ومصدر أخذ العينات. على سبيل المثال ، من المحتمل أن يتم تحسين نظام HPLC لتنقية الريتينول. من واقع خبرتنا ، سيتطلب هذا الماء في الطور المتحرك ، وإما يتطلب تدرجا للطور المتحرك ، أو زيادة وقت تجفيف العينة قبل الحقن على GC-C-IRMS. وجدنا أن استخدام نظامين HPLC بطرق متساوية قصيرة يوازن المتطلبات التحليلية مع الحصول على إشارات واضحة على GC-C-IRMS (الشكل 2). يمكن أن يوفر استخدام LC-MS/MS سير عمل تحليلي أكثر بساطة لعينات RID⁷. ومع ذلك ، فإن حساسية GC-C-IRMS لها مزايا مميزة تتمثل في القدرة على استخدام كميات أقل من الجرعات ووضع العلامات على النظائر ، وتحديد أدوات التتبع في نقاط زمنية أطول ، وتحليل العينات ذات التخصيب المنخفض للعينات.

تشمل قيود هذه الطريقة طلب أدوات متعددة ، ومعالجة فنية ماهرة ، وقيود إنتاجية العينة بسبب أوقات تحضير العينة الأطول. يمكن تحسين وقت الشخص المطلوب لإعداد كل عينة من خلال تنفيذ HPLC مع قدرات تجميع الكسور الآلية نظرا لأن خطوات تنقية HPLC تستخدم طرقا متساوية ، مما يؤدي إلى أوقات احتفاظ متسقة بالتحليل. يمكن تحسين الطريقة لاستخدام تنقية HPLC واحدة فقط. نستخدم نظامين بالتوازي لزيادة الإنتاجية وتسهيل تجفيف العينات قبل إعادة التكوين في الهكسان والحقن على GC-C-IRMS.

في حين أن GC-C-IRMS حساس للغاية لتحديد نسب النظائر ، إلا أنه يتطلب المزيد من كتلة الريتينول الإجمالية للعينة للحصول على إشارة الريتينول الكافية. تعتمد متطلبات العينة على كل من كمية العينة وتركيز العينة VA. عادة ، يتم استهداف 75 نانوغرام من الريتينول للحصول على ذروة قوية ، مما يسمح بالاختلافات في نقل GC وكفاءة الاحتراق. من الناحية العملية ، في ظل ظروف التشغيل المثلى ، حصلنا على إشارة كافية مع عينات نتج عنها حقن GC-C-IRMS منخفضة تصل إلى 25 نانوغرام. هذا يتوافق مع عينة مصل ذات حجم أقل (~ 0.4 مل) ، وتركيز منخفض من الريتينول (~ 0.5 ميكرولتر / لتر) ، وخسائر طفيفة في إجراءات الاستخراج والتنقية. في التطوير التحليلي لطريقة RID ، كان التحسن الرئيسي هو التحول إلى حاقن PTV. تمنع درجة حرارة البدء المنخفضة الهكسان الذي يحمل العينة من التمدد بسرعة كبيرة ، مما يسمح بمحاكاة حقن العينات على العمود. يؤدي الحقن مباشرة في العمود إلى زيادة إشارة الريتينول إلى أقصى حد مع عيب شكل الذروة الأسوأ إلى حد ما وصيانة أكثر استمرارا.

تم اقتراح حليب الثدي كبديل لعينات المصل في اختبار RID. تم التحقق من صحة ذلك في النساء المرضعات الزامبيات اللواتي لديهن إلى حد كبير مخازن منخفضة من VA¹¹. لم يتم التحقق من صحته بعد لدى النساء اللواتي لديهن مدخول أعلى من VA مسبقة التكوين ، مثل ما قد يجده المرء في البلدان ذات الدخل المرتفع أو في السكان الذين يستهلكون مصادر متعددة من VA ، بما في ذلك المدخول الغذائي ، وإغناء الطعام ، والمكملات.

تقييم VA لحليب الثدي له العديد من المزايا مقارنة بالمؤشرات الكيميائية الحيوية الأخرى لحالة VA. غالبا ما يكون جمع حليب الثدي أسهل من الدم لأنه لا توجد حاجة إلى أخصائيي الفصد ، وعادة ما يعتبر جمع حليب الثدي أقل توغلا بالنسبة للأشخاص²³. يعد استخدام عينات حليب الثدي غير الرسمية مناسبا ولا يتطلب سوى 5 مل من الحليب. علاوة على ذلك ، لا تحتاج العينات إلى المعالجة على الفور ، مما يقصر وقت معالجة العينة ، لا سيما في البيئات الميدانية. ومع ذلك ، فإن توحيد جمع العينات لعينات حليب الثدي الكاملة أمر بالغ الأهمية لأن تركيزات الدهون والريتينول أعلى في الحليب الخلفي من اللبن الأمامي ، وتميل تركيزات دهون الحليب والريتينول إلى الاختلاف باختلاف الوقت من اليوم والفاصل الزمني منذ آخر رضعة¹^،²⁴. بالنسبة للعينات العرضية ، من الأفضل التعبير عن تركيز الريتينول لكل غرام من دهون الحليب. يجب تحديد دهون الحليب بشكل مثالي بعد الجمع مباشرة باستخدام طريقة الكريماتوكريت²⁵. يجب حماية العينات من الضوء. يجب تحضير الاقتباسات (عادة من 1 إلى 5 مل) لتحليل HPLC في وقت التجميع لأن الحليب ليس متجانسا بعد التجميد والذوبان.

هناك نوعان من الظروف الأساسية التي قد يكون قياس ¹³C-تخصيب من VA في الكبد ممكنا وذات أهمية. الموقف الأكثر شيوعا هو عند استخدام ¹³ريتينول يحمل علامة C في الدراسات التي أجريت على عند جمع الكبد. ستتم مقارنة TBSs المحسوبة من VA بتركيز VA في الكبد على النحو المحدد بواسطة HPLC / UPLC ، ولكن ¹³تخصيب C لمخازن الكبد مفيدة أيضا لتحديد كيفية توزيع المتتبع في الدورة الدموية بالنسبة للمخازن طويلة الأجل. بالإضافة إلى ذلك ، في بعض الظروف الفريدة ، من الممكن الحصول على عينات خزعة الكبد من البشر الذين أعطوا موافقتهم وأخذوا أيضا جرعة مصنفة من فيتامين^{أ 26}^،²⁷. هذه العينات مفيدة أيضا للتحقق من صحة ^{واختبار 13}خلط C-retinol. تبدأ معالجة عينات الكبد بطحن عينة مقاسة بكبريتات الصوديوم اللامائية لحبس الماء وتكسير الأنسجة. ثم يتم استخراجه باستخدام 50 مل من كلوريد الميثيلين من خلال ورق الترشيح. يتم تجفيف جزء تحت النيتروجين وإعادة تكوينه في الإيثانول مع إضافة 0.1٪ هيدروكسي تولوين بوتيل كمادة حافظة. يتم تصبن العينة واستخراجها بنفس الإجراء المستخدم في حليب الثدي.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة - R01 DC019357 ومشروع البحوث المنسقة للوكالة الدولية للطاقة الذرية E43035.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المادة المرجعية 13C التي يمكن تتبعها إلى مقياس VPDB-LSVEC (Sucrose)	الوكالة الدولية للطاقة الذرية	IAEA-CH-6	اسم المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا: RM 8542
الأسيتونيتريل (درجة HPLC)	فيشر ساينتيفك	UN1648
الإيثانول (نقي 200 برهين، خالي الماء، وما إلى ذلك؛ 99.5%)	سيغما	459836
ماصات الباستور الزجاجية	أي
أنابيب الاختبار الزجاجية	أي
هيليوم (نقاء بحثي، >99.9995٪)	أي
الهكسانات	سيغما	178918
الميثانول (درجة MS)	VWR	MSPP-A-456
الملاط والمدقة، السيراميك	أي
الماصة ذات الإزاحة الموجبة 3-25 وميكرو؛ L	جيلسون	FD10002
ماصة ذات إزاحة موجبة 10-100 وميكرو؛ L	جيلسون	FD10004
الماصة ذات الإزاحة الموجبة 50-250 وميكرو؛ L	جيلسون	FD10005
ماصة ذات إزاحة موجبة 100-1000 وميكرو؛ L	جيلسون	FD10006
هيدروكسيد البوتاسيوم	فيشر ساينتيفك	UN1813
ورق فلتر نوعي #1 150 مم	واتمان	1001-150
المدخنات الفصلية	أي
كبريتات الصوديوم، لا مائي	فيشر ساينتيفك	S415-212
قوارير حجمية (50 مل)	أي

المراجع

Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

أبقِني على اطلاع: