هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا للكشف عن الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة سرطان الخلايا الكبدية باستخدام تصوير القطع بالتبريد القائم على MTT. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للكشف عن الخلايا النشطة في الموقع في الأنسجة أو الأعضاء الأخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
* These authors contributed equally
هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا للكشف عن الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة سرطان الخلايا الكبدية باستخدام تصوير القطع بالتبريد القائم على MTT. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للكشف عن الخلايا النشطة في الموقع في الأنسجة أو الأعضاء الأخرى.
تسلط الأدلة الناشئة ، بما في ذلك الدراسات السابقة ، الضوء على مجموعة سكانية فرعية من الخلايا داخل أنسجة سرطان الخلايا الكبدية (HCC) التي تظهر نشاطا أيضيا فائقا ومقاومة للإجهاد. هذه الخلايا هي المحركات الرئيسية لتطور الورم ومقاومة العلاج. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية للكشف عن الخلايا القابلة للحياة في الموقع غالبا ما تضر بسلامة الأنسجة ، أو تغير قابلية الخلايا ، أو تتطلب الكثير من الناحية الفنية. تقدم هذه الدراسة نهجا جديدا وبسيطا وغير مدمر للكشف في الموقع عن الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة سرطان الكبد من خلال الاختزال المعتمد على الميتوكوندريا ل 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل رباعي ترازوليوم بروميد (MTT) إلى بلورات فورمازان غير قابلة للذوبان. من خلال تحسين حجم شظية الأنسجة (1 × 1 × 0.2 سم3) ، وظروف الاستزراع (20٪ FBS ، و 1 مجم / مل MTT ، و 3 ساعات حضانة مع دوامة متقطعة) ، ومعلمات القطع بالتبريد (سمك 20 ميكرومتر ، وتثبيت PFA 4٪ ، وتلوين DAPI) ، تم تحقيق رسم الخرائط المكانية لخلايا HCC القابلة للحياة في غضون 5 ساعات. لا يتطلب هذا البروتوكول الفعال من حيث التكلفة أي معدات متخصصة ويحافظ على بنية الأنسجة ، مما يتيح التحديد المكاني لمجموعات الخلايا عالية الجدوى والمقاومة للإجهاد في المناطق السطحية. تشمل القيود فقدان الجدوى التدريجي لأكثر من 6 ساعات وإزاحة البلورات أثناء التقسيم، والتي يمكن تخفيفها من خلال مكملات FBS والتجميد المتحكم فيه. توفر هذه الطريقة منصة عملية لعزل الخلية الواحدة للمجموعات السكانية الفرعية المقاومة للعلاج ، مما يعزز أبحاث البيئة الدقيقة ل HCC.
يتميز سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، وهو السبب الرئيسي الثالث للوفيات المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم ، بعدم التجانس العالي ومعدلات التكرار1. هذا التباين المكاني والزماني يجعل بعض مجموعات الخلايا داخل أنسجة الورم أكثر نشاطا من غيرها في عملية التمثيل الغذائي والتكاثر والتقدم وتحمل الإجهاد ومقاومة الأدوية. إن الكشف عن الخلايا القابلة للحياة في الموقع داخل أنسجة سرطان الكبد له أهمية سريرية وبيولوجية عميقة ، حيث تشمل هذه الخلايا المستنسخة الفرعية المتكاثرة ، والمجموعات السكانية المقاومة للعلاج ، والخلايا التي تبدأ الورم الخبيث. يمكن أن تكون هذه الخلايا القابلة للحياة بمثابة محركات حاسمة لتكرار الورم ، وا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إجراء جميع التجارب وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع في تشيوانتشو (رقم. FJMU IACUC2021257). تمت إزالة أنسجة سرطان الكبد جراحيا وجمعها في مستشفى تشيوانتشو الأول ، التابع لجامعة فوجيان الطبية ، بموافقة مستنيرة من المرضى. تتطلب هذه التجربة تدابير وقائية قياسية ، بما في ذلك ارتداء معطف مختبر وقناع يمكن التخلص منه وقفازات.
1. تحضير الأنسجة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
نجحت هذه الدراسة في اكتشاف الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة HCC دون تعطيل بنية الأنسجة. أولا ، أظهرت صور المجال الساطع (الشكل 1 أ) أن سطح الأنسجة أظهر تغطية خلوية كثيفة وتكديس متعدد الطبقات للخلايا عبر الشريحة ، مما يؤكد السلامة المعمارية المحفوظة لأنسجة HCC طوال فترة الزراعة والمعالجة. والجدير بالذكر أن مجموعات الخلايا داخل المناطق السطحية أظهرت رواسب فورمازان أرجوانية حمراء مميزة ، مما يدل على نشاط الميتوكوندريا في مجموعات الخلايا القابلة للحياة. ثانيا ، يمكن للتلطيخ النووي المضاد ل DAPI تحدي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
لا تزال المنهجيات الحالية للكشف عن الخلايا القابلة للحياة في الموقع تواجه قيودا متعددة الأوجه. يعاني IHC والتألق المناعي (IF) ، اللذان يستخدمان على نطاق واسع لتحديد علامات الانتشار أو البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج ، من اضطراب سلامة الغشاء الناجم عن تثبيت الفورمالديهايد7. علاوة على ذلك ، فإن تغلغل الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة السميكة دون المستوى الأمثل8. مجسات الجدوى الفلورية مثل Calcein-AM ، على الرغم من فعاليتها في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.
تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (رقم 3502Z20227197) ، صندوق بدء التشغيل للبحث العلمي التابع لجامعة فوجيان الطبية (2021QH1240). نشكر Xianying Zhang و Jingjing Zhou و Shaocong Weng (جامعة Huaqiao) على مساعدتهم الفنية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| -80 & درجة؛ فريزر C (عمودي) | ثيرمو فيشر العلمي | TSX60086V | |
| الطاولة النظيفة (تدفق طبقي عمودي) | إيرتك | SW-CJ-1FD | |
| حاضنة CO2 (165 لتر) | ثيرمو فيشر العلمي | هيراسيل فيوس 160i (مثل 51030400 / 51033559) | |
| كوفرسليب (24&000؛ 50 مم، #1.5) | سيتوغلاس (سيتوتست) | 0341-3610 | |
| طبق بتيري الثقافي (90 مم) | عش | 752001 (مثال) | |
| وسيط التركيب المحتوي على DAPI | بيوتايم | P0131 (5 مل/25 مل) | |
| DMEM (ارتفاع الجلوكوز، مع بيروفات) | إنفيتروجين (Gibco) | 11995-065 | |
| FBS (مؤهل، أصل أمريكي) | إنفيتروجين (Gibco) | A3160501 | |
| المجهر الفلوري | نيكون | سلسلة إكليبس Ti2 | |
| الميكروتوم المجمد (التجميد المغناطيسي) | لايكا | CM1950 | |
| شرائح المجهر (بسيطة، 25&00؛ 75 مم) | سيتوغلاس (سيتوتست) | 0317-0001 | |
| كاشف MTT (مسحوق) | بيوتايم | ST316 | |
| طلاء الأظافر (شفاف) | بيوتايم | — | |
| NBF (الفورمالين المحايد المخزن) | بيوتايم | — | |
| مركب OCT | ساكورا (ساكورا فينتيك) | 4583 | |
| المجهر البصري (عمودي) | نيكون | سلسلة إكليبس سي (مثل Ci-L) | |
| PBS (500 مل) | بيوتايم | C0221A | |
| PFA، 4٪ في PBS (المثبت) | بيوتايم | P0099 | |
| رأس البيبت (1 مل، منخفض التماس) | كيرغن | KG1313-L | |
| رأس البيبيت (200 وميكرو؛ L) | أكسجين (كورنينغ) | T-200-Y (بكميات كبيرة) / T-200-Y-R-S (مصفف، معقم) | |
| الماصة (أحادية القناة) | ثيرمو فيشر العلمي | فينبايبت F2 (قط خاص بالنطاق#) | |
| مشرط | هيستيك | يختلف النموذج (مثلا، مرجع المورد 100022208326) | |
| الملقط | هيستيك | يختلف النموذج |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.