يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في الموقع الكشف عن الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة سرطان الخلايا الكبدية باستخدام تصوير القطع بالتبريد القائم على MTT

323 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

أكتوبر 31, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا للكشف عن الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة سرطان الخلايا الكبدية باستخدام تصوير القطع بالتبريد القائم على MTT. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للكشف عن الخلايا النشطة في الموقع في الأنسجة أو الأعضاء الأخرى.

الملخص

تسلط الأدلة الناشئة ، بما في ذلك الدراسات السابقة ، الضوء على مجموعة سكانية فرعية من الخلايا داخل أنسجة سرطان الخلايا الكبدية (HCC) التي تظهر نشاطا أيضيا فائقا ومقاومة للإجهاد. هذه الخلايا هي المحركات الرئيسية لتطور الورم ومقاومة العلاج. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية للكشف عن الخلايا القابلة للحياة في الموقع غالبا ما تضر بسلامة الأنسجة ، أو تغير قابلية الخلايا ، أو تتطلب الكثير من الناحية الفنية. تقدم هذه الدراسة نهجا جديدا وبسيطا وغير مدمر للكشف في الموقع عن الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة سرطان الكبد من خلال الاختزال المعتمد على الميتوكوندريا ل 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل رباعي ترازوليوم بروميد (MTT) إلى بلورات فورمازان غير قابلة للذوبان. من خلال تحسين حجم شظية الأنسجة (1 × 1 × 0.2 سم3) ، وظروف الاستزراع (20٪ FBS ، و 1 مجم / مل MTT ، و 3 ساعات حضانة مع دوامة متقطعة) ، ومعلمات القطع بالتبريد (سمك 20 ميكرومتر ، وتثبيت PFA 4٪ ، وتلوين DAPI) ، تم تحقيق رسم الخرائط المكانية لخلايا HCC القابلة للحياة في غضون 5 ساعات. لا يتطلب هذا البروتوكول الفعال من حيث التكلفة أي معدات متخصصة ويحافظ على بنية الأنسجة ، مما يتيح التحديد المكاني لمجموعات الخلايا عالية الجدوى والمقاومة للإجهاد في المناطق السطحية. تشمل القيود فقدان الجدوى التدريجي لأكثر من 6 ساعات وإزاحة البلورات أثناء التقسيم، والتي يمكن تخفيفها من خلال مكملات FBS والتجميد المتحكم فيه. توفر هذه الطريقة منصة عملية لعزل الخلية الواحدة للمجموعات السكانية الفرعية المقاومة للعلاج ، مما يعزز أبحاث البيئة الدقيقة ل HCC.

المقدمة

يتميز سرطان الخلايا الكبدية (HCC) ، وهو السبب الرئيسي الثالث للوفيات المرتبطة بالسرطان على مستوى العالم ، بعدم التجانس العالي ومعدلات التكرار1. هذا التباين المكاني والزماني يجعل بعض مجموعات الخلايا داخل أنسجة الورم أكثر نشاطا من غيرها في عملية التمثيل الغذائي والتكاثر والتقدم وتحمل الإجهاد ومقاومة الأدوية. إن الكشف عن الخلايا القابلة للحياة في الموقع داخل أنسجة سرطان الكبد له أهمية سريرية وبيولوجية عميقة ، حيث تشمل هذه الخلايا المستنسخة الفرعية المتكاثرة ، والمجموعات السكانية المقاومة للعلاج ، والخلايا التي تبدأ الورم الخبيث. يمكن أن تكون هذه الخلايا القابلة للحياة بمثابة محركات حاسمة لتكرار الورم ، والتهرب المناعي ، والفشل العلاجي2.

ومع ذلك ، فإن تقنيات التنميط المكاني الحالية (على سبيل المثال ، علم النسخ المكاني) تتطلب أجهزة متخصصة وترتبط بتكاليف عالية ، في حين أن التحليلات الجماعية التقليدية غالبا ما تتجاهل عدم التجانس المكاني للخلايا القابلة للحياة وتفاعلاتها الديناميكية مع المكونات اللحمية3. على سبيل المثال ، تظهر خلايا HCC المتبقية القابلة للحياة بعد الاستئصال ملامح أيضية مميزة لا يمكن تلخيصها بأمانة في أنظمة الخلايا المنفصلة4. وبالتالي ، فإن تطوير تقنيات الكشف التي تم حلها مكانيا أمر حتمي لكشف الحديث المتبادل الوظيفي بين الخلايا السرطانية القابلة للحياة وبيئتها المكروية ، مما يؤدي في النهاية إلى إبلاغ الاستراتيجيات العلاجية الدقيقة. على الرغم من أن الطرق التقليدية مثل قياس التدفق الخلوي أو الكيمياء المناعية (IHC) قد استخدمت من قبل مجموعتنا للكشف عن الخلايا القابلة للحياة في سرطان الكبد ، إلا أنها تتطلب تفكك الأنسجة أو تثبيتها ، وبالتالي فقدان السياق المكاني وإعاقة تحليل تفاعلات الخليةوالخلية 5،6. وبالتالي ، فإن تطوير تقنيات غير مدمرة وعالية الدقة للكشف في الموقع عن الخلايا القابلة للحياة أمر بالغ الأهمية لتوضيح آليات مقاومة HCC وتوجيه العلاجات الدقيقة.

لاكتشاف وعرض الخلايا القابلة للحياة بسرعة في أنسجة سرطان الكبد في الموقع دون علاج مدمر ، تم تطوير طريقة زراعة الأنسجة البسيطة القائمة على 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تترازوليوم بروميد (MTT). باختصار ، تمت زراعة أنسجة HCC الرقيقة الطازجة (حوالي 1 × 1 × 0.2 سم3) لأول مرة في وسط DMEM لمدة 3 ساعات تحتوي على 20٪ مصل أبقار الجنين (FBS) و MTT (1 مجم / مل). بعد ذلك ، بعد تثبيت 4٪ من البارافورمالديهايد (PFA) والتركيب المحتوي على DAPI ، خضعت شرائح الأنسجة المجمدة المضمنة في OCT (سمك 20 ميكرومتر) للمراقبة المجهرية تحت الضوء الساطع أو الأشعة فوق البنفسجية. ستعرض الخلايا القابلة للحياة اللون الأرجواني أو الأرجواني والأحمر أو الأرجواني والأسود. باستخدام هذا البروتوكول ، اكتشفنا بنجاح الخلايا القابلة للحياة في أنسجة سرطان الكبد في غضون 5 ساعات. وفي الوقت نفسه ، تحافظ هذه الطريقة على الهندسة المعمارية الدقيقة ثلاثية الأبعاد ، وهي متوافقة مع تحليل omics المتعدد النهائي ، وهي بسيطة ، فضلا عن كونها صديقة للوقت والتكلفة. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة تظهر قيودا معينة. قد تؤدي عمليات الغسيل والتقسيم والزراعة متعددة الخطوات إلى حدوث تشوه هيكلي وموت الخلايا المبرمج في الأنسجة ، خاصة في العينات الأيضية العالية ، مثل أنسجة HCC في هذه الدراسة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن زيادة سمك شرائح القطع بالتبريد تضر بوضوح وتسطيح الملاحظات المجهرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع في تشيوانتشو (رقم. FJMU IACUC2021257). تمت إزالة أنسجة سرطان الكبد جراحيا وجمعها في مستشفى تشيوانتشو الأول ، التابع لجامعة فوجيان الطبية ، بموافقة مستنيرة من المرضى. تتطلب هذه التجربة تدابير وقائية قياسية ، بما في ذلك ارتداء معطف مختبر وقناع يمكن التخلص منه وقفازات.

1. تحضير الأنسجة

  1. ضع طبق بتري معقم 9 سم على الثلج. أضف 30 مل من محلول ملحي الفوسفات المثلج (PBS).
  2. انقل على الفور أنسجة سرطان الكبد البشرية التي تم استئصالها جراحيا إلى برنامج تلفزيوني.
  3. حرك الطبق برفق لمدة 5 ثوان لإزالة ملوثات الدم. شفط PBS باستخدام ماصة معقمة.
    ملاحظة: كرر ثلاث مرات.
  4. انقل الأنسجة إلى غطاء طبق بتري.
    ملاحظة: تلتصق المناديل بسهولة بغطاء طبق بتري غير المبلل للتعامل بشكل أفضل بعد ذلك.
  5. قم بقص الأنسجة إلى حوالي 1 × 1 × 0.2 سم3 شظايا باستخدام شفرة جراحية معقمة (رقم 11).
    ملاحظة: يمكن تغيير طول وعرض الشظايا ، ولكن يجب أن يكون العمق أقل من 0.2 سم.
  6. أعد الشظايا إلى طبق طازج مقاس 9 سم مليء ب 30 مل من PBS المثلج.
  7. حرك الطبق برفق لمدة 5 ثوان لإزالة ملوثات الدم. شفط PBS باستخدام ماصة معقمة.
    ملاحظة: كرر الخطوة 1.7 ثلاث مرات. تم تعيين جزء واحد من الأنسجة مغلي في PBS (95 درجة مئوية ، 10 دقائق) كعنصر تحكم سلبي. قم بتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمة.

2. زراعة الأنسجة

  1. أضف 1.8 مل من وسط الاستزراع الكامل DMEM (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) يحتوي على الجلوكوز (التركيز النهائي = 4.5 جم / لتر) و L-glutamine (التركيز النهائي = 2 ملم) في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار. ثم أضف 0.6 مل من FBS (التركيز النهائي = 20٪ حجم/حجم)، و 0.6 مل من مخزون MTT (التركيز النهائي = 1 ملغ/مل) في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار.
  2. نقل شظايا الأنسجة إلى الآبار باستخدام ملقط معقم.
  3. ضع اللوحة المكونة من 6 آبار في الحاضنة. احتضان لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: قم بتدوير اللوحة برفق لمدة 3 ثوان كل 30 دقيقة. يمكن إنهاء الحضانة بمجرد أن يتحول سطح شظايا الأنسجة إلى اللون الأرجواني أو الأرجواني والأسود.

3. الإنهاء والتثبيت

  1. استنشاق وسيط MTT. اغسل شظايا المناديل بمحلول ملحي مثلج.
    ملاحظة: كرر خمس مرات.
  2. أضف 2 مل من الفورمالين المحايد 4٪ (NBF) في كل بئر من صفيحة 6 آبار.
  3. ضع الطبق في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.

4. القطع بالتبريد

  1. امسح الشظايا برفق على ورق ماص نظيف.
  2. ضع الأنسجة في مادة تبريد مملوءة بمركب التصوير المقطعي المحوسب (OCT).
    ملاحظة: تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بمركب OCT.
  3. قم بتجميد المناديل في ثلاجة منخفضة الحرارة على درجة حرارة -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. قم بتركيب الكتلة المجمدة على ظرف التبريد عند -20 درجة مئوية.
  5. قطع أقسام 100 ميكرومتر عند -20 درجة مئوية حتى يتعرض سطح الأنسجة.
    ملاحظة: يعرض سطح الأنسجة لونا يشبه اللون الأرجواني.
  6. اجمع شرائح 20 ميكرومتر باستخدام شرائح مغلفة بمادة لاصقة.
    ملاحظة: يجب أن تظهر شرائح الأنسجة بظل أرجواني أو أرجواني أحمر أو أرجواني أسود.
  7. ثبت الشرائح في 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
  8. اشطف الشرائح برفق باستخدام PBS لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: كرر ثلاث مرات.

5. تصاعد

  1. ضع قطرة واحدة من وسط التركيب المحتوي على DAPI (التركيز النهائي: 1 ميكروغرام / مل).
  2. غطيها بغطاء.
  3. أغلق الحواف بطلاء الأظافر.
    ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح ذات الحواف محكمة الغلق عند 4 درجات مئوية في الظلام إذا لم يتم إجراء الفحص المجهري على الفور.

6. الفحص المجهري

  1. تصور رواسب الفورمازان الأرجواني أو الأرجواني والأحمر أو الأرجواني الداكن (الخلايا القابلة للحياة) عند تكبير 20× تحت المجال الساطع باستخدام المجهر الساطع.
  2. اكتشف DAPI الأزرق (النوى) تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
  3. دمج قنوات المجال الساطع والقناطة للارتباط المكاني.
    ملاحظة: البرنامج المستخدم هنا هو NIS Element F (الإصدار 4.00.06).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نجحت هذه الدراسة في اكتشاف الخلايا النشطة أيضيا في أنسجة HCC دون تعطيل بنية الأنسجة. أولا ، أظهرت صور المجال الساطع (الشكل 1 أ) أن سطح الأنسجة أظهر تغطية خلوية كثيفة وتكديس متعدد الطبقات للخلايا عبر الشريحة ، مما يؤكد السلامة المعمارية المحفوظة لأنسجة HCC طوال فترة الزراعة والمعالجة. والجدير بالذكر أن مجموعات الخلايا داخل المناطق السطحية أظهرت رواسب فورمازان أرجوانية حمراء مميزة ، مما يدل على نشاط الميتوكوندريا في مجموعات الخلايا القابلة للحياة. ثانيا ، يمكن للتلطيخ النووي المضاد ل DAPI تحدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لا تزال المنهجيات الحالية للكشف عن الخلايا القابلة للحياة في الموقع تواجه قيودا متعددة الأوجه. يعاني IHC والتألق المناعي (IF) ، اللذان يستخدمان على نطاق واسع لتحديد علامات الانتشار أو البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج ، من اضطراب سلامة الغشاء الناجم عن تثبيت الفورمالديهايد7. علاوة على ذلك ، فإن تغلغل الأجسام المضادة في أقسام الأنسجة السميكة دون المستوى الأمثل8. مجسات الجدوى الفلورية مثل Calcein-AM ، على الرغم من فعاليتها في ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا البحث من قبل مكتب العلوم والتكنولوجيا في مدينة شيامن (رقم 3502Z20227197) ، صندوق بدء التشغيل للبحث العلمي التابع لجامعة فوجيان الطبية (2021QH1240). نشكر Xianying Zhang و Jingjing Zhou و Shaocong Weng (جامعة Huaqiao) على مساعدتهم الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
-80 & درجة؛ فريزر C (عمودي)ثيرمو فيشر العلميTSX60086V
الطاولة النظيفة (تدفق طبقي عمودي)إيرتكSW-CJ-1FD
حاضنة CO2 (165 لتر)ثيرمو فيشر العلميهيراسيل فيوس 160i (مثل 51030400 / 51033559)
كوفرسليب (24&000؛ 50 مم، #1.5)سيتوغلاس (سيتوتست)0341-3610
طبق بتيري الثقافي (90 مم)عش752001 (مثال)
وسيط التركيب المحتوي على DAPIبيوتايمP0131 (5 مل/25 مل)
DMEM (ارتفاع الجلوكوز، مع بيروفات)إنفيتروجين (Gibco)11995-065
FBS (مؤهل، أصل أمريكي)إنفيتروجين (Gibco)A3160501
المجهر الفلورينيكونسلسلة إكليبس Ti2
الميكروتوم المجمد (التجميد المغناطيسي)لايكاCM1950
شرائح المجهر (بسيطة، 25&00؛ 75 مم)سيتوغلاس (سيتوتست)0317-0001
كاشف MTT (مسحوق)بيوتايمST316
طلاء الأظافر (شفاف)بيوتايم—
NBF (الفورمالين المحايد المخزن)بيوتايم—
مركب OCTساكورا (ساكورا فينتيك)4583
المجهر البصري (عمودي)نيكونسلسلة إكليبس سي (مثل Ci-L)
PBS (500 مل)بيوتايمC0221A
PFA، 4٪ في PBS (المثبت)بيوتايمP0099
رأس البيبت (1 مل، منخفض التماس)كيرغنKG1313-L
رأس البيبيت (200 وميكرو؛ L)أكسجين (كورنينغ)T-200-Y (بكميات كبيرة) / T-200-Y-R-S (مصفف، معقم)
الماصة (أحادية القناة)ثيرمو فيشر العلميفينبايبت F2 (قط خاص بالنطاق#)
مشرطهيستيكيختلف النموذج (مثلا، مرجع المورد 100022208326)
الملقطهيستيكيختلف النموذج

المراجع

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

MTT
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.