يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الإفراط في التعبير عن النويات السامة وتنقيتها من الإشريكية القولونية

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68577

⸱

أغسطس 29, 2025

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, College of Charleston

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة منهجية للإفراط في التعبير عن Nsp15 المؤتلف ، وهو نوكلياز سام ، في نظام تعبير C41 (DE3) ، متبوعا بتنقية البروتين الموسوم باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم. يمكن تكييف هذه البروتوكولات مع البروتينات السامة الأخرى الصعبة.

الملخص

تم استخدام الإشريكية القولونية على نطاق واسع كنظام تعبير لإنتاج البروتينات المؤتلفة. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب الإفراط في التعبير عن بعض أنواع البروتينات المؤتلفة ، مثل نوكليازات ، بشكل مؤتلف في بكتريا قولونية بسبب نشاطها الأنزيمي على الحمض النووي الخلوي أو الحمض النووي الريبي. يمكن أن تؤدي هذه التأثيرات السامة إلى بطء النمو وضعف غلة البروتين. أحد الأمثلة على ذلك هو endoribonuclease Nsp15 من فيروسات كورونا: غلة فيروس كورونا جاما من النوع البري (WT) Nsp15 أقل بكثير من Nsp15 غير النشط تحفيزيا. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدمنا استخدام خلايا C41 (DE3) ومزارع بداية مستعمرة واحدة في نفس اليوم للمساعدة في تقليل السمية. تم الإفراط في التعبير عن Nsp15 المؤتلف الذي يحتوي على علامة 6xHis-T الطرفية N وتنقيتها باستخدام كروماتوغرافيا التقارب القائمة على الكوبالت متبوعا بكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC). الإنتاجية الناتجة من البروتين المنقى كافية للمقايسات الكيميائية الحيوية والدراسات الهيكلية المجهرية الإلكترونية بالتبريد. أثبت هذا النهج فعاليته في التخفيف من الآثار السامة وتحقيق عوائد بروتين مرضية لمزيد من التحليل.

المقدمة

الإشريكية القولونية (الإشريكية القولونية) هي بكتيريا تستخدم على نطاق واسع لإنتاج البروتينات المؤتلفة. تم تطوير العديد من السلالات الطافرة ، بما في ذلك BL21 (DE3) ومشتقاتها ، للتعبير عن البروتينات المستهدفة1. عادة ما تكون العملية مدفوعة ببكتيريا مشفرة T7 RNA polymerase ويتم تحفيزها بواسطة الأيزوبروبيل ß-D1-thiopalactopyranoside (IPTG) ، وهو نظير من اللاكتوز ينشط مشغل lac عن طريق تحرير مثبط lac1،2،3. نظرا لأنه غير قابل للتحلل المائي ، فهناك تعبير مستمر عن mRNA وإنتاج بروتين أعلى3.

في حين أن هذا النوع من النظام مناسب ومتسق للعديد من البروتينات ، فإن بعض أنواع البروتينات المؤتلفة تحفز السمية في الإشريكية القولونية ، مما يؤدي إلى ضعف إنتاجية البروتين. قد تكون السمية الناتجة عن وجود بروتين مؤتلف يؤثر سلبا على البكتيريا بسبب التعبير المتسرب قبل الحث أو الإجهاد على البكتيريا عند الحث3،4. والنتيجة هي انخفاض في معدل نمو البكتيريا وقابليتها للحياة5. يمكن أن يلعب قمع التعبير المتسرب دورا مهما في التعبير الناجح عن البروتينات السامة. سلالات التعبير عن الإشريكية القولونية مع بلازميدات pLysS (على سبيل المثال ، BL21 (DE3) pLysS ، C41 (DE3) pLysS ، إلخ) تمنع التعبير المتسرب عن طريق التعبير عن ليزوزيم T7 الذي يثبط بوليميراز T7 قبل الحث6،7. تحتوي السلالات الأخرى ، مثل سلالات C41 (DE3) و C43 (DE3) ، على طفرات تقلل من نشاط بوليميراز T7 عن طريق تقليل مستويات mRNA ، وتزيل بروتياز lon و ompT1،4،8،9،10. يساعد قمع التعبير المتسرب أو تقليل معدل إنتاج البروتين المؤتلف (عن طريق تنظيم بوليميراز T7 أو انخفاض درجات الحرارة) على زيادة إنتاجية البروتينات السامة1،9.

غالبا ما تكون نوكليازات بروتينات سامة ويصعب التعبير عنها عند استخدام بكتريا قولونية بسبب نشاطها الأنزيمي تجاه الحمض النووي الخلوي أو الحمض النوويالريبي 1. على سبيل المثال ، فإن endoribonuclease Nsp15 الموجود في فيروسات كورونا وفيروسات النيدو الأخرى سام للبكتيريا ، مما يؤدي إلى معدل نمو أبطأ وانخفاض الغلة11،12،13،14،15،16،17. نظرا لدوره التحفيزي ، حيث يشق 3 بوصات من اليوريدين في الحمض النووي الريبي الفيروسي ، يعتقد أن Nsp15 يعمل على كل من mRNA الخاص به والخلوي عند التعبير عنه بشكل مؤتلف ، مما يؤدي إلى عدم تنظيم التمثيل الغذائي والتعبير عن البروتين المؤتلف11،14. بالنسبة ل Nsp15 ، يعد قلة القلة ضروريا للنشاط الأنزيمي. أظهرت الدراسات السابقة لفيروس بيتا التاجي (مثل SARS و SARS-CoV-2) Nsp15 أن الإنزيم يتحول بشكل أساسي إلى هكساسات متجانسة في محلول ، مع كون الشكل الأحادي غير نشط16،18،19،20. عندما تتحور لتشكل مونومرات فقط ، لوحظت زيادات كبيرة في المحصول14. بالإضافة إلى ذلك ، عند تحور أحد المخلفات التحفيزية داخل الثالوث التحفيزي إلى ألانين ، لوحظ تحسين التعبير في نفس الظروف مثل WT ، مما يدعم سمية Nsp15 للإشريكية القولونية مدفوعة بنشاط النوكلياز13،16،17. في هذا البروتوكول ، نظهر الفرق في العائد بين WT جاما - فيروس كورونا (فيروس التهاب الشعب الهوائية المعدي) Nsp15 والنسخة الحفازة الميتة التي تم تحقيقها عن طريق تحور إحدى بقايا الهيستيدين التحفيزي (H223A).

نصف هنا منهجية خطوة بخطوة للإفراط في التعبير عن Nsp15 المؤتلف في نظام تعبير C41 (DE3) ، متبوعا بتنقية البروتين من خلال كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم. يتم استخدام علامة His 6x Terminal مع كروماتوغرافيا التقارب المعدني الثابت القائمة على الكوبالت (IMAC) لعزل البروتين. يتم إجراء مزيد من التنقية عبر SEC لفصل Nsp15 عن طريق حالة القلة وعزل الأنواع السداسية النشطة. يقدم هذا النهج طريقة للإفراط في التعبير عن النوكليازات السامة وتنقيتها للدراسات البيوكيميائية والهيكلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. التحضير للمخزن المؤقت والكواشف

  1. الكواشف المفرطة للتعبير
    1. قم بإعداد 1 لتر من وسائط 2xTY عن طريق الجمع بين 16 جم من التربتون ، و 10 جم من مستخلص الخميرة ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 900 مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة محيرة سعة 2 لتر. قم بتعقيم القارورة لمدة 30 دقيقة على الأقل في دورة سائلة.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى 2 لتر على الأقل من وسائط 2xTY لكل تنقية.
    2. تحضير مخزون / مخزونات المضادات الحيوية المناسبة للبلازميد. بالنسبة ل Nsp15-pET-14b ، اصنع 15 مل من 100 مجم / مل أمبيسلين عن طريق إذابة 1.5 جم من الأمبيسلين بالماء منزوع الأيونات في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتخزين مخزون المضادات الحيوية في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
    3. قم بإعداد 250 مل من وسائط أجار Lysogeny Broth (LB) عن طريق الجمع بين 2.5 جم من التربتون ، و 1.25 جم من مستخلص الخميرة ، و 2.5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 3.75 جم من الاغاروز ، و 250 مل من الماء منزوع الأيونات في زجاجة زجاجية سعة 500 مل. قم بتعقيم المحلول عن طريق التعقيم لمدة 30 دقيقة على الأقل في دورة سائلة وتبرد حتى يصبح دافئا عند لمسه.
    4. قم بإعداد ألواح أجار LB المكملة بالأمبيسلين عن طريق نقل 25 مل من وسائط أجار LB الدافئة إلى قارورة Erlenmeyer معقمة سعة 250 مل (25 مل لكل لوحة يتم تصنيعها). أضف 25 ميكرولتر من 100 ملغم/مل أمبيسلين لكل 25 مل من الوسائط وقم بتحريكها لدمج المحتويات. باستخدام ماصة مصلية ، أضف 25 مل من مزيج الوسائط إلى طبق بتري بلاستيكي معقم ؛ تجنب إدخال أي فقاعات.
      1. امنع التلوث عن طريق مسح مقعد المختبر بنسبة 20٪ من الإيثانول وإضاءة موقد بنسن للحفاظ على العقم أثناء صب الألواح.
      2. اترك الأطباق لتبرد قبل تخزينها على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
    5. قم بإعداد 15 مل من 1 M IPTG عن طريق إذابة 3.574 جم من IPTG بالماء منزوع الأيونات في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة. تجنب دورات التجميد / الذوبان المتكررة عن طريق التقسيم إلى ثلاث حصص سعة 5 مل.
  2. كواشف التنقية
    ملاحظة: يجب تحضير جميع الكواشف قبل يوم واحد على الأقل من التنقية
    1. تحضير 250 مل من محلول التحلل (50 ملي مولار من الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 5 ملي إيميدازول) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    2. قم بإعداد 15 مل من محلول الشطف (50 ملي مولار من درجة الحموضة 8.0 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين ، 250 ملي إيميدازول) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
    3. قم بإعداد 250 مل من عازلة الانقسام (50 ملي مولار هيبس ، درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5٪ جلسرين) وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة.
    4. قم بإعداد 1 لتر من المخزن المؤقت SEC (20 ملي مولار HEPES درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 5 ملي مولار MnCl2) والتصفية من خلال مرشح PES 0.22 ميكرومتر باستخدام الترشيح الفراغي. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية مع FPLC.
    5. تحضير 15 مل من 1 م 4- (2-أمينوإيثيل) بنزين سلفونيل فلوريد هيدروكلوريد (AEBSF) عن طريق إذابة 3.595 جم من AEBSF بالماء منزوع الأيونات في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اصنع 1 مل من الحصص في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وخزنها في درجة حرارة -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
    6. اختياري: قم بإعداد مزيج عازل رئيسي لتحميل هلام كبريتات الصوديوم (SDS) عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من محلول المخزون (250 ملي مولار من الرقم الهيدروجيني Tris 6.8 ، 8٪ SDS ، 0.1٪ بروموفينول أزرق ، 40٪ جلسرين ، 100 ملي DTT) في 400 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
    7. قم بإعداد أنابيب عينة الجل لتتبع التنقية. انقل 30 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للتحميل إلى كل أنبوب.
    8. قم بإعداد 1 لتر من 10x Tris-Glycine المؤقت عن طريق إذابة 30 جم من قاعدة Tris و 144 جم من الجلايسين و 20 جم من SDS ، في 1000 مل من الماء منزوع الأيونات. للحصول على محلول 1x ، قم بتخفيف 100 مل من محلول 10x في 900 مل من الماء منزوع الأيونات في زجاجة سعة 1 لتر. قم بتخزين كلا الكواشف في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام الآخر.

2. الإفراط في التعبير Nsp15

ملاحظة: يجب أن تبقى جميع الكواشف والمواد معقمة قدر الإمكان لمنع خطر التلوث.

  1. التحول
    1. قم بإزالة خلايا الإشريكية القولونية C41 (DE3) من -80 درجة مئوية لتذوب لمدة 10 دقائق على الجليد. ماصة 1 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد في أنبوب يحتوي على خلايا C41. دعها تحتضن بالجلوس على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: في حين أن تركيزات البلازميدات قد تختلف ، بالنسبة للبيانات الموضحة هنا ، تمت إضافة 10-20 نانوغرام من الحمض النووي لكل تحويل. يوصي البروتوكول التجاري لخلايا C41 (DE3) ب 10-50 نانوغرام من الحمض النووي لكل تحويل. ينطبق هذا البروتوكول على أي بلازميد يستخدم نظام المروج T7 ؛ ومع ذلك ، هنا تم تعديل بلازميد pET14b المنشور سابقا لتشفير Nsp15 المحسن للكودون ، مع موقع TEV الذي يتبع موقع N-terminal 6xHis-tag وموقع انقسام الثرومبين ، عن طريق استبدال SARS-CoV-2 Nsp15 بتسلسل IBV Nsp15 (GENBANK: WIL95322.1 ، 5989-6324) 19.
    2. ضع الأنبوب في كتلة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية لصدمة الخلايا الحرارية لامتصاص البلازميدات. احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. ماصة 200 ميكرولتر من وسائط الاسترداد (SOC أو غيرها من الوسائط الغنية) في الأنبوب الذي يحتوي على خلايا C41 (DE3) والبلازميدات. رج العبوة عند 210 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة ألواح أجار LB المكملة بالأمبيسلين من 4 درجات مئوية وضعها في حاضنة غير مهتزة مضبوطة على 37 درجة مئوية.
    5. بكتيريا الماصة على لوحة أجار. باستخدام مفرشة معقمة ، انشر الخلايا على لوحة أجار. ضع اللوحة في حاضنة غير مهتزة مضبوطة على 37 درجة مئوية لتنمو لمدة 14-16 ساعة.

3. النمو

  1. قطف مستعمرة واحدة
    ملاحظة: تم استخدام بادئات مستعمرة واحدة في نفس اليوم بدلا من ثقافة البداية بين عشية وضحاها من أجل تلقيح الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي. بالنسبة للثقافات الليلية ، عادة ما تكون الخلايا في مرحلة الثبات أو الموت ، خاصة مع البروتينات السامة. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأوقات الاستزراع الأطول ، يمكن للملوثات أو الطفرات أن تتفوق على النوكلياز السام.
    1. استخدم قارورة Erlenmeyer معقمة سعة 50 مل لكل لتر من المزرعة بالإضافة إلى 2-3 مقبلات إضافية. قم بتسمية إحدى القوارير بنجمة لفحوصات الكثافة الضوئية (OD). سيمثل OD الذي تم جمعه من هذه القارورة النمو بأكمله ما لم يكن هناك فرق بصري بين القوارير.
      ملاحظة: تم العثور على قوارير Erlenmeyer لتوفير تهوية أفضل من أنابيب بدء التشغيل سعة 15 مل.
    2. قم بإنشاء مزيج رئيسي من 2xTY بالإضافة إلى المضادات الحيوية المناسبة باستخدام حجم 10 مل × عدد N من المقبلات. لنمو 4 لتر ، قم بعمل 6 ثقافات بادئة. سيكون المزيج الرئيسي 60 ميكرولتر من مخزون الأمبيسلين (مذاب من -20 درجة مئوية) و 60 مل من 2xTY (1: 1000 تخفيف). قم بتدوير الخلط وتناول 10 مل في كل إرلينماير.
    3. قم بإزالة اللوحة المحولة من الحاضنة. انتزع مستعمرة واحدة معزولة من اللوحة باستخدام عود أسنان معقم أو طرف ماصة. انقل عود الأسنان مع المستعمرة إلى قارورة مع الوسائط. كرر حتى تحتوي كل قارورة على عود أسنان.
    4. ضع قوارير البداية الملقحة في حاضنة الاهتزاز عند 210 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية. اسمح لقوارير البداية بالنمو لمدة ~ 5-7 ساعات.
  2. التطعيم الثقافي
    1. بعد 5 ساعات ، تحقق من OD عند 600 نانومتر (OD600) من القارورة المميزة بنجمة باستخدام ميكروكوفيت ومقياس الطيف. قم بإزالة ونقل 1 مل من المزرعة من القارورة إلى ميكروكوفيت. كرر القياسات بشكل دوري حتى يصل OD600 إلى 0.8-1.0.
    2. قبل التلقيح من 30 دقيقة إلى 1 ساعة (عندما يصل OD600 إلى 0.4) ، قم بتسخين قوارير 2 لتر 2xTY عند 37 درجة مئوية. تقلل الوسائط الدافئة من وقت التأخير بعد التلقيح بثقافة البادئ.
    3. قم بإذابة مخزون أمبيسلين 100 مجم / مل من -20 درجة مئوية. بمجرد الوصول إلى الهدفOD 600 ، قم بإعداد أربع قوارير سعة 2 لتر مع 1 لتر من وسائط 2xTY بإضافة 1 مل من 100 مجم / مل من الأمبيسلين (1: 1000 مخفف).
    4. للتلقيح ، اسكب محتويات قارورة بداية واحدة في قارورة واحدة سعة 2 لتر. كرر حتى يتم تلقيح كل قارورة سعة 2 لتر. تجنب صب عود الأسنان في القارورة لتسهيل حصاد الخلايا.
    5. ضع قوارير 2 لتر الملقحة في حاضنة الاهتزاز عند 210 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل فحص أول OD600.
  3. الحث مع IPTG
    1. افحص OD600 عن طريق إزالة 1 مل من الوسائط من قارورة بماصة مصلية. كرر حتى يصل OD600 إلى 0.8-1.0.
    2. بمجرد الوصول إلى الهدف OD600 ، أضف 1 مل من 1 M IPTG للحصول على تركيز نهائي قدره 1 ملي مولار (مذاب من -20 درجة مئوية) للحث على الإفراط في التعبير.
    3. انقل قوارير 2 لتر إلى حاضنة اهتزاز عند 210 دورة في الدقيقة ، 16 درجة مئوية للحث طوال الليل (14-16 ساعة).
      ملاحظة: ستؤدي درجة الحرارة الباردة إلى إبطاء نمو خلايا الإشريكية القولونية ، مما يقلل من السمية عن طريق إبطاء إنتاج البروتين ونشاط النوكلياز.
  4. حصاد
    1. قم بإزالة القوارير المستحثة من حاضنة الاهتزاز واسكب المحتويات في زجاجات طرد مركزي منفصلة سعة 1 لتر. قم بموازنة الزجاجات باستخدام الماء منزوع الأيونات. قم بتدوير الخلايا عند 4500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإزالة المادة الطافية وانقل الحبيبات إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل باستخدام ملعقة. اجمع الكريات في أنبوب مخروطي واحد. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

4. تنقية Nsp15

ملاحظة: يجب الاحتفاظ بجميع المخازن المؤقتة والأنابيب على الجليد. يجب تنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية. يفترض البروتوكول التالي وجود بروتين مميز به.

اختياري: بعد كل خطوة ، يمكن أخذ عينات هلامية لمتابعة تقدم التنقية.

  1. تحلل الخلايا وتوضيح المحللة
    1. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية عن طريق إضافة 2 مل من محلول التحلل لكل 1.2 غرام من الحبيبات. أضف 100 ميكرولتر من 1 M AEBSF لكل 10 مل من محلول التحلل كمثبط للبروتين. إذا كنت تستخدم حبيبات مدمجة من 4 لتر ، أضف 100 ميكرولتر من DNase I للحصول على تركيز نهائي قدره 200 U.
      ملاحظة: يمكن استبدال قرص كوكتيل واحد مثبط للبروتياز خال من EDTA لكل لتر كمثبط للبروتين.
    2. قم بدوامة محتويات الأنبوب لفترة وجيزة لمدة 30 ثانية للسماح للحبيبات والمخزن المؤقت بالاختلاط. انقل الحبيبات الدوامة إلى مطحنة مناديل Dounce. باستخدام مدقة فضفاضة ، قم بتجانس المحتويات (~ 10 ضربات).
    3. نقل العينة المتجانسة إلى دورق معدني للصوتنة.
      1. لضمان الحصول على الحد الأقصى للعينة ، اشطف الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات الأصلية ب 5 مل من محلول التحلل وقم بدوامة الأنبوب لفترة وجيزة. صب المحتويات في الخالط Dounce ، ضع ~ 5 ضربات ، ثم انقلها إلى دورق الصوتنة.
    4. إلى الدورق المعدني ، أضف 75 ميكرولتر من Triton X-100 للمساعدة في تحلل الغشاء وذوبانه. ضع الدورق المعدني في حمام جليدي لضمان بقاء العينة باردة أثناء الصوتنة.
    5. ضع مسبار الصوتنة في الدورق المعدني وصوتنة العينة لمدة 6 دقائق و 30 ثانية مع نبضات كل 2 ثانية والتضخيم بنسبة 70٪.
      تنبيه: استخدم حماية السمع إذا لم يكن مسبار الصوتنة مغلقا.
    6. باستخدام ماصة مصلية ، انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي. إلى نفس الأنبوب ، أضف 1 M AEBSF عند تخفيف 1: 100 كمثبط جديد للبروتياز قم بتوضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 26,915 × جم لمدة 50 دقيقة.
  2. كروماتوغرافيا التقارب عن طريق الترشيح بالجاذبية
    ملاحظة: يقلل راتنج الكوبالت بشكل كبير من المواد الرابطة المعدنية غير المحددة مقارنة براتنج النيكل21.
    1. أثناء الصوتنة ، احصل على 2 مل من ملاط راتنج الكوبالت وأعد تعليقه مع 25 مل من محلول التحلل في أنبوب مخروطي جديد. جهاز الطرد المركزي الراتنج المعلق لمدة 5 دقائق عند 500 × جم. بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية ، مع الحرص على عدم فقدان أي راتنج.
    2. كرر العملية مع غسلتين منفصلتين للتحلل سعة 25 مل متبوعة بالطرد المركزي. لا تصب المادة الطافية للغسلة الأخيرة حتى تصبح جاهزة للربط على دفعات. عندما تصبح جاهزا ، اسكب المخزن المؤقت للتحلل من آخر غسول من الراتنج وأعد تعليق الراتنج ب 10 مل من محلول التحلل الطازج (10 مل من المخزن المؤقت لكل 1 مل من الراتنج).
    3. أضف الجزء القابل للذوبان إلى الأنبوب واترك البروتين الذي تم وضع علامة عليه 6x بالارتباط دفعة واحدة بالراتنج على الروك لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: إذا تجاوز حجم ربط الدفعة 50 مل ، فقم بتنفيذ هذه الخطوة في دورق سعة 250 مل مع قضيب تقليب بسرعة بطيئة جدا عند 4 درجات مئوية. انقل كل الراتنج إلى الدورق عند تنفيذ هذه الخطوة باستخدام عازلة التحلل.
    4. بعد ربط الدفعات ، اسكب المحتويات أسفل عمود ترشيح الجاذبية واجمع التدفق من خلال قارورة Erlenmeyer سعة 125 مل. يجب أن تكون المحتويات الموجودة داخل القارورة أي بروتين لا يرتبط بالراتنج ؛ سيتم ربط Nsp15 الذي يحمل علامة بالراتنج. باستخدام قارورة منفصلة للتجميع ، اغسل الراتنج ب 8 × 25 مل من المخزن المؤقت ليصبح المجموع 200 مل على الأقل (~ 5 أضعاف الحجم الأصلي) باستخدام ماصة مصلية.
      ملاحظة: أضف المخزن المؤقت ببطء أسفل جانب العمود بدلا من المنتصف مباشرة لمنع إزعاج طبقة الراتنج ، مما قد يؤدي إلى غسيل غير فعال أو غير متساو.
  3. شطف البروتين
    1. قم بإزالة Nsp15 الذي تم وضع علامة عليه في ثلاثة عمليات مع المخزن المؤقت للشطف. الشطف 1 و 2 عبارة عن شطف 2 مل ، والشطف 3 هو شطف 1 مل.
    2. قم بإجراء اختبار برادفورد "سريع وقذر" عن طريق التخفيف بنسبة 1: 1 من كاشف برادفورد في الماء. انقل 10 ميكرولتر من كل شطف إلى أنابيب واقلبها للخلط. يجب أن يتحول المحلول إلى اللون الأزرق في وجود البروتين. قم بتقييم تغير اللون لتحديد كيفية الجمع بين الناخبات.
      ملاحظة: إذا كانت المسطحات 1 و 2 قوية وكان الشطف 3 ضعيفا ، فقم بدمج الشطفتين 1 و 2 والمضي قدما. إذا كانت جميعها ضعيفة ، فقم بدمج جميع الأنابيب الثلاثة.
  4. تركيز البروتين وانقسام العلامة
    1. انقل عينة الشطف المدمجة إلى مكثف MWCO 30 كيلو دالتون (أو الحجم المناسب للبروتين ذي الأهمية). ركز البروتين إلى ≤2 مل عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل العينة المركزة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل. ارفع حجم العينة النهائي إلى 2 مل مع مخزن مؤقت للانقسام إذا لزم الأمر.
    2. قم بإعداد عمود تحلية يمكن التخلص منه (على سبيل المثال ، عمود PD-10) وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. أضف عينة 2 مل إلى العمود. ضع العمود في أنبوب مخروطي نظيف سعة 50 مل وقم بإزالته بالطرد المركزي عند 1,000 × جم لمدة دقيقتين.
      ملاحظة: تزيل هذه الخطوة بسرعة الإيميدازول ، الذي يتداخل مع انقسام الثرومبين مع تجنب التراكم الناجم عن التركيز عند استخدام مكثفات MWCO للتخزين المؤقت للتبادل.
    3. إلى الشطف ، أضف β-Me و CaCl2 ، إلى تركيز نهائي يبلغ 2 ملي مولار لكل منهما. أضف 50 ميكرولتر من مخزون الثرومبين 1 U / μL. بعد إضافة جميع المكونات ، ضع الأنبوب على شاكر في وضع مستقيم واترك التفاعل يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات مع الاهتزاز اللطيف.
      ملاحظة: قد يعمل الانقسام بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع بعض البروتينات. لوحظ تحسن غلة Nsp15 مع انقسام لمدة 4 ساعات في RT مقارنة بانقسام 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
    4. أعد موازنة عمود ترشيح الجاذبية في المخزن المؤقت للانقسام (اغسل 3x مع 25 مل من الانقسام المؤقت). تأكد من إغلاق قضيب الإيقاف وأضف 5 مل من عازلة الانقسام لمنع الراتنج من الجفاف. قم بتخزين العمود عند 4 درجات مئوية خلال فترة الانقسام.
  5. فصل البروتين المشقوق عن البروتين المشقوق والبروتين غير المشقوق
    1. باستخدام ماصة مصلية ، قم بعمل ماصة تفاعل الانقسام بعناية مباشرة على الراتنج وجمع المصفاة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    2. اغسل الراتنج ب 2 مل من عازلة الانقسام واجمعها في نفس الأنبوب سعة 15 مل. كرر لمدة غسلتين إجمالا. عند الانتهاء ، أضف AEBSF إلى الأنبوب لإخماد الثرومبين للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ملي مولار.
    3. انقل عينة إعادة التمرير إلى مكثف MWCO جديد 30 كيلو دالتون. ركز البروتين حتى ≤500 ميكرولتر عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل العينة المركزة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل.
  6. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
    1. قم بتشغيل عمود تحليلي لزيادة S200 (أو عمود تحجيم مناسب آخر للبروتين محل الاهتمام) وفقا لمواصفات الشركة المصنعة. قم بالتوازن في المخزن المؤقت SEC واضبط حجم كسر FPLC على 500 ميكرولتر.
    2. انقل أنابيب الكسر المختارة من القمم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة سعة 1.5 مل وأضف 2.5 ميكرولتر من 1 M DTT (التركيز النهائي 5 ملليمتر) إلى كل جزء للحفاظ على تقليل Nsp15 المنقى.
    3. قم بقياس قيم A280 لكل جزء باستخدام مقياس الطيف الضوئي النانوي. قم بإفراغ الأداة باستخدام المخزن المؤقت SEC قبل تجميع القياسات. قم بتخزين عينات Nsp15 المنقاة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  7. اختياري: فحص التنقية
    1. قم بتسخين أنابيب عينة الجل على كتلة حرارية 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي للأنابيب لفترة وجيزة بعد التسخين لتدوير أي تكاثف. قم بتحميل العينات على 4-20٪ جل / ثوان Mini-Protean TGX خال من البقع وقم بتشغيله عند 300 فولت لمدة 17 دقيقة. قم بتصوير الجل / الجل للتحقق من النقاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

نظرا لسمية Nsp15 كنوكلاز ، كان هناك حاجة إلى ما مجموعه ~ 7 ساعات حتى تصل الثقافات البادئة إلى OD600 من 0.8-1.0. بمجرد التلقيح ، كان هناك حاجة إلى ما مجموعه ~ 3-5 ساعات لنفس ODالأمثل 600 من 0.8-1.0 للحث. في هذه الحالة ، يبدو أن وقت المضاعفة هو ~ 1 ساعة. عندما تم التعبير عن طفرة ميتة تحفيزية ل Nsp15 ، بدا مضاعفة الخلايا الإشريكية القولونية طبيعيا (~ 20 دقيقة) ، وهو دليل إضافي على أن نشاط النوكلياز مسؤول عن السمية (الشكل 1 أ).

بعد الحث ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد قدمنا بروتوكولا مفصلا ينتج عنه الإفراط في التعبير الناجح في الإشريكية القولونية من نوكلياز سام وتنقية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد التقارب والحجم. أدى تنفيذ 10 مل من مزارع المستعمرة الواحدة في نفس اليوم بدلا من المزارع البادئة بين عشية وضحاها إلى زيادة الاتساق في أوقات النمو وغلة البروتين عبر النمو. اخترنا استخدام خلايا C41 (DE3) ، التي تحتوي على طفرات تقلل من نشاط بوليميراز T7 ، للمساعدة في إدارة سمية البروتين المؤتلف1،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أفاد المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل تمويل بدء تشغيل كلية تشارلستون للعلوم الطبيعية والبيئية ، وأبحاث البكالوريوس والأنشطة الإبداعية في كلية تشارلستون البحثية الصيفية مع منحة أعضاء هيئة التدريس ، وجائزة SC INBRE DRP الفرعية من عام P20GM103499.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 & م PES ، تعقيم ، ربط منخفض البروتين ، نظام تصفية ، 1 لتركورنينج431098
مثبط البروتياز AEBSF سيرينجولدبيو30827-99-7
أجار ، بكتريولوجيأمريسكوJ637
Ä نظام تنقية KTA goسيتيفا29383015
Amicon Ultra 15 مل ، 30 كيلو دالتون MWCO مكثفميليبورUFC903024
أمبيسيلين الصوديومجولدبيوأ -301-25
قوارير اهتزاز محيرةNalgene إف 0527
جهاز طرد مركزي على الطاولةEppendorf 5920R
BioPhotometer plusإيبندورفطراز BP6132
ثرومبين البقربيوفارم91-030
كاشف صبغة برادفوردبوسطن بيو برودكتسبي بي إيه -200
بروموفينول أزرقسيجما ألدريتش114931
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشج 4901
حمام جاف رقميبيو راد1660562
موزعات يمكن التخلص منها ، على شكل حرف Lشركاء MedSupply62-1014-1
ديثيوثريتولجولدبيو27565-41-9
DNaseI من بنجيري الأبقارسيجما ألدريتشD4527
مطحنة مناديل دويس ، 40 ملويتون357546
أعمدة التصوير الكروماتوغرافي الاقتصاديةبيو راد737-1532
Enduro minimix خلاط الجوزلابنتس 0600
ايثانولسيجما ألدريتش459844
Excella E25R Inc / المرجع شاكرإيبندورفNB-E25R
فاست بيت V2لابنتص 2000
Fiberlite F10-4x1000 LEX زاوية ثابتة الدوارثيرمو فيشر العلمي096-041075
Fiberlite F21-8x50y دوار زاوية ثابتةثيرمو فيشر العلمي096-084275
تصوير جل دوك EZبيو راد1708270
الجلسرينسيجما ألريشجي 5516
الجلايسينبيو راد161-0718
HEPESسيجما ألدريتش[إتش3375]
محرك اللوح الساخنVWR12365-346
حمض الهيدروكلوريكVWRBDH3028
إيميدازولجولدبيوI-902-25
الأيزوبروبيل- ß ؛ -D-ثيوجالاكتيوسيد (IPTG)جولدبيو12481ج25
Lemo21 (DE3) الخلايا الإشريكية القولونية المختصةنيو إنجلاند بيولابسطراز C2528J
كلوريد المنغنيز (II) رباعي الهيدراتسيجما ألدريتشم3634
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، 0.5 ملVWR87003-290
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، 1.7 ملشركاء MedSupply15-1151
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة، 2 ملأكسيجنMCT-200-C
خلية الرحلان الكهربائي العمودي رباعي MINI-PROTEANبيو راد10025025
جل ميني بروتين تريس جلايسين ، 4-20٪بيو راد4568094
جهاز الطرد المركزي المصغر MyFugeشركاء MedSupplyC1008-B
زجاجة طرد مركزي فائقة السرعة 1 لتر من Nalgeneثيرمو فيشر العلمي3141-1006
أنبوب الطرد المركزي من البلوط Nalgeneثيرمو فيشر العلمي31139-0050
مقياس النانو الضوئيإمبلين3769
حاضنة غير مهتزةلابنتأنا 5110 
الخلايا المختصة كيميائيا C41 (DE3) المفرطةتقنيات البحث الحيوي60442-1
الخلايا المختصة كيميائيا C41 (DE3) المفرطةسيجما ألدريتشCMC0017توقف; تعد خلايا البحث الحيوي C41 (DE3) أو خلايا NEB Lemo21 بديلا
أطباق بتريشركاء MedSupply62-1077-3
البلازميدات (العمود الفقري pET-14b)Genscriptطلب مخصص
كوفيت بلاستيك صغيرفيشر العلمية14955127
مصدر طاقة PowerPacuniversalبيو راد1645070
إبرة انزلاق دقيقةبيكتون ديكسون305198
معايير الدقة بالإضافة إلى البروتين غير الملوثةبيو راد1610363
وسيط الاسترداد للتعبير   ؛سيجما ألدريتشCMR0001K
S-4x1000 دوار دلو يتأرجحإيبندورفEP-S4X1
ماصة مصلية ، 10 ملفاكلون357551
ماصة مصلية ، 25 ملفاكلون35725
ماصة مصلية ، 5 ملفاكلون35743
ماصة مصلية ، 50 ملPr1maبي آر سيرو 50
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتشس 9888
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما ألدريتشL3771
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش567530
سونيك dismembratorفيشر العلميةإف بي 505
جهاز طرد مركزي سورفال لينكس 4000ثيرمو فيشر العلمي75006580
عمود Spephadex G-25 M PD-10سيتيفا17085101
ß-Mercaptoethanolميليبور444203
دورق جريفين من الفولاذ المقاوم للصدأالقطار وير13977-010-EA
أنابيب فالكون المعقمة ، 15 ملصقر352097
أنابيب فالكون المعقمة ، 50 ملصقر352098
عمود Superdex 200 10/300 GLسيتيفا28990944
محاقن، 1 ملAir-Tite  أ 1
محاقن، 3 ملبيكتون ديكسون309657
راتنج التقارب المعدني TALONتاكارا635503
المسواكشارع الإبداعPAC3690-01
قاعدة تريسجولدبيوتي -400-1
تريتون X-100MP Biomedicals807423
التربتونمنتجات البحوث الدوليةتي 60065
فورنادوالمعيارBV101-G
مستخلص الخميرةمنتجات البحوث الدوليةسنة 20025

المراجع

  1. Francis, D. M., Page, R. Strategies to optimize protein expression in E. coli. Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).
  2. Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).
  3. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).
  4. Wagner, S., et al. Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).
  5. Kato, Y. Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production. Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).
  6. Dubendorf, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  7. Studier, F. W. Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system. J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).
  8. Miroux, B., Walker, J. E. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).
  9. Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields. Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).
  10. James, J., et al. Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance. Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).
  11. Shi, Y., et al. A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11. J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).
  12. Nedialkova, D. D., et al. Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease. J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).
  13. Zhao, J., et al. Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation. J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).
  14. Joseph, J. S., et al. Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch. J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).
  15. Xie, Y., et al. Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence. Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).
  16. Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation. J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).
  17. Xu, X., et al. New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15. J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).
  18. Bhardwaj, K., et al. Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15. J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).
  19. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics. Nat Commun. 12 (1), 636(2021).
  20. Kim, Y., et al. Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2. Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).
  21. Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle. Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).
  22. Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease. Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).
  23. Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification. Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).
  24. Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools. Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).
  25. Godoy, A. S., et al. Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease. Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).
  26. Otter, C. J., et al. SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).
  27. Wang, X., Zhu, B. SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity. Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).
  28. Zheng, A., et al. Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer. J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).
  29. Huang, T., et al. Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation. J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).
  30. Zhang, L., et al. Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).
  31. Jernigan, R. J., et al. Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser. Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).
  32. Ricagno, S., et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus. Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).
  33. Canal, B., et al. Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease. Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).
  34. Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor. J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).
  35. De Marco, A. Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

فرط تعبير البروتينكروماتوغرافيا الألفةكروماتوغرافيا الاستبعاد الحجميتنقية Nsp15تعبير البروتين المؤتلفالمجهر الإلكتروني المبردمقايسة شطر الحمض الريبي النووي RNAإزالة وسم الهيستيدين (His Tag)
الإفراط في التعبير عن النويات السامة وتنقيتها من الإشريكية القولونية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.