مقالة منهجية

استخراج الهستونات من العينات السريرية للتحليل اللاجيني باستخدام مطيافية الكتلة

DOI:

10.3791/68584

⸱

نوفمبر 21, 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح هذا البروتوكول استخراج الهيستونات بكفاءة من عينات سريرية مختلفة لتحليل التعديل بعد الترجمة بواسطة LC-MS/MS. من خلال تسهيل الكشف القوي عن التعديلات الرئيسية على الهيستون، يعد أداة قيمة للتحليل الشامل للصفات اللاجينية في مجموعات سريرية كبيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تدعم الأدلة التجريبية الواسعة دور الآليات اللاجينية في بداية السرطان وتطوره وعودته. من بين هذه التعديلات، تنظم متغيرات الهيستون وتعديلاتها بعد الترجمة (PTMs) تنظيم وديناميكيات الكروماتين، وإمكانية الوصول إلى الجينوم، مما يؤثر على العمليات الرئيسية القائمة على الحمض النووي مثل النسخ والتكرار وإصلاح تلف الحمض النووي من خلال ما يسمى بشيفرة الهستون. غالبا ما تلاحظ أنماط PTM الهيستونية غير المنظمة في السرطانات، مع بعض العلامات التي ثبت أنها تعمل كمؤشرات حيوية تشخيصية وتنبؤية. لذا، فإن المنهجيات الجديدة التي تمكن من تحليل PTM الهيستوني بشكل غير متحيز وشامل في العينات السريرية ذات قيمة عالية لتوصيف المناظر اللاجينية للأورام. هنا، نقدم بروتوكولا لاستخراج الهيستونات بكفاءة من عينات سريرية، بما في ذلك الخزعات المجمدة بسرعة، ودرجة حرارة القطع المثلى (OCT) المجمدة، والخزعات المدمجة بالبارافين المثبتة في الفورمالين (FFPE). ينتج هذا النهج بروتينات هيستون ذات كمية وجودة كافية للتحليل اللاحق من الأسفل إلى الأعلى بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء مرتبطة بمطيافية الكتلة المتتالية (LC-MS/MS). يتيح هذا السير من الكشف القوي والقياس القوي لتعديلات الهيستون الرئيسية، وخاصة أسيتلات الليسين والميثيلات، عبر عينات الأورام الأولية، مما يوفر طبقة جزيئية إضافية لتوصيف السرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في نواة الخلايا حقيقية النواة، تتجمع الهيستونات مع الحمض النووي لتكوين النيوكليوسومات، وهي الوحدات الهيكلية الأساسية للكروماتين. يتكون كل نيوكليوسوم من حوالي 146 بيسا في القوة من الحمض النووي ملفوف حول أوكتامر مكون من نسختين من الهيستونات الأساسية H2A وH2B، بالإضافة إلى ديمرين من هيستونات H3 وH4. بالإضافة إلى ذلك، يوجد أيضا هيستون H1 الرابط الذي يسهل تنظيم الكروماتين من الدرجة العليا من خلال ارتباط كل من النيوكليوسوم وتمدد الحمض النووي الرابط بين النيوكليوسومات1. تزين الهستونات بمجموعة واسعة من التعديلات بعد الانتقال (PTMs) التي توجد بشكل رئيسي في ذيولها الطرفية N. تشمل هذه التعديلات المثيلة، وأنواع مختلفة من الأسيلة (الأسيتل، البروبيونيل، البيوتيريليشن، إلخ)، الفسفرة، السومويليشن، التعويذة في كل مكان، ADP-ريبوزيليشن، والكروتونيليشن، ومن بينها مثيلة الليسين والأرجينين وأسيتلة الليسين من أكثر الأنواعتميزا. الأنواع المحددة والمواقع والتركيبات من تعديلات الهستوني تخلق ما يعرف برمز الهستون. يتكون هذا الرمز من تعديلات ما بعد الترجمة المختلفة (PTMs) على ذيول الهيستونات ذات الطرف N، والتي تضاف وتزال بواسطة إنزيمات معينة معدلة للهيستون. يتم التعرف على هذه التعديلات بواسطة البروتينات المؤثرة، مما يؤدي إلى تغييرات في بنية الكروماتين مثل الضغط أو إزالة التكثف، مما يؤثر في النهاية على عدة عمليات بيولوجية، بما في ذلك إصلاح تلف الحمض النووي، والتكرار، وخاصة نسخ الجينات 3,4.

مثيلة الحمض النووي وPTMs الهيستونية من أكثر السمات اللاجينية دراسة في السرطان3. أظهرت الأدلة التجريبية الحديثة تغيرات في مستويات مختلف PTMs الهيستونية في عدة أنواع من السرطان. ومن الجدير بالذكر أن فقدان H4K20me3 و H4K16ac تم الإبلاغ عنه كعلامات مميزة للسرطان، حيث وجد أن مستواهما منخفض في جميع الأورام تقريبا مقارنة بالأنسجةالطبيعية. حددت مجموعتنا فقدان H3K14ac كعلامة محتملة للسرطان من خلال قياس تناقص السرطان في عدة أنواع من السرطان مقارنة بنظيراتها الطبيعية باستخدام طرق تعتمد على مطيافية الكتلة (MS)5. علاوة على ذلك، سلطت العديد من الدراسات الضوء على القيمة التنبؤية لنماذج PTM الهستونية، وأظهرت أن التغيرات في مستوياتها العالمية، والتي يتم تقييمها بشكل أساسي بواسطة الكيمياء المناعية في خزعات المرضى، ترتبط بتقدم السرطان، والتصنيف النسيجي، والاستجابة العلاجية 6,7,8. لذا، فإن تحليل PTM للهيستون في عينات السرطان مهم لتحديد مؤشرات حيوية تشخيصية وتنبؤية جديدة، بالإضافة إلى الأهداف المحتملة لما يسمى بأدويةالإبيني-دواء 8.

تعتمد الطرق الشائعة جدا لتحليل PTMs الهيستونية في خطوط الخلايا والعينات السريرية على تقنيات قائمة على الأجسام المضادة، مثل العزل المناعي، والكيمياء المناعية، واختبار التوربينت المناعي المرتبط بالإنزيمات (ELISA)9. ومع ذلك، تعاني الطرق القائمة على الأجسام المضادة من قيود متعددة، بما في ذلك التفاعل المتقاطع أو، على العكس، إخفاء الحوامات10. يحدث التفاعل المتقاطع عندما ترتبط الأجسام المضادة بأهداف غير مقصودة ذات حوابيت متشابهة، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة محتملة، بينما يشير تمويه الحواتم إلى فقدان اكتشاف الحوتمت المحددة (PTM أو متحور هيستوني في هذه الحالة) بسبب وجود تعديلات أخرى على البقايا المجاورة. علاوة على ذلك، فإن كمية الأنسجة المطلوبة لتحليل تعديل الهيستون باستخدام الأجسام المضادة غالبا ما تكون مرتفعة، حيث يمكن اكتشاف عدد محدود فقط من PTMs في نفس الوقت، لذا يجب معالجة عدة شرائح من الأنسجة للتحليلات متعددة الإرسال11. برز مطيافية الكتلة (MS) كطريقة مفضلة لتحليل نماذج PTM الهيستونية والمتحورات، متغلبة على قيود الأساليب القائمة على الأجسام المضادة 5,8. يعتمد التصلب المتعددين على اكتشاف فرق في الكتلة (Δm، كتلة دلتا) بين الكتل النظرية والقابلة للقياس التجريبي للببتيدات والبروتينات. إنه غير متحيز، شامل، وكمي، لأنه يسمح بتحديد وقياس نماذج PTM ومتنوعاتها دون الحاجة إلى معرفة مسبقة بموقعها. وهذا يجعل التصلب متعدد التصلب ذا قيمة خاصة في التحليل الحساس والدقيق لتغيرات PTMs في الهيستون في السرطان والحالات المرضية الأخرى8.

هنا نصف بروتوكولا محسنا لاستخراج الهيستون من العينات السريرية، مع التوصيف القائم على التصلب المتعدد لنماذج PTM الهيستونية، والذي يشار إليه لاحقا بسير عمل إبي-بروتيومكس. تخزن خزعات المرضى بشكل رئيسي كعينات مجمدة طازجة (FF)، وعينات مجمدة بدرجة حرارة القطع المثلى (OCT)، وعينات مدمجة بالبارافين (FFPE)مثبتة بالفورمالين 12. بينما يتم تجميد الخزعات الطازجة في النيتروجين السائل أو الأيزوبنتان المبرد مسبقا دون إضافة أي وسط حفظ13، تحتوي الخزعات المجمدة في OCT على وسط مثبت قابل للذوبان في الماء وتحمي بالبرودة، يتكون أساسا من كحول البولي فينيل والبولي إيثيلين جليكول، مما يسهل تقطيع الأنسجة14. أما عينات FFPE، المثبتة في الفورمالين والمدمجة في البارافين، فهي الطريقة الأكثر شيوعا للتخزين للعينات السريرية، حيث يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة سنوات، مما يتجنب الصيانة المكلفة عند درجات حرارة منخفضة أو منخفضة جدا15. وبما أنها خالية من إضافات الحفظ، يمكن معالجة الخزعات المجمدة مباشرة لاستخلاص الهيستون، بينما تتطلب خزعات OCT المجمدة وFFPE خطوات أولية لإزالة الوسط/المثبت. تحتاج عينات FFPE أيضا إلى فك الربط البروتيني واسع النطاق واسترجاع المستضدات.

يوضح هذا البروتوكول طرقا مفصلة لاستخراج الهيستونات من عينات سريرية متجمدة حديثا، ومدمجة في OCT، وعينات FFPE، مما يضمن كمية وجودة كافية لتحليل التصلب المتعدد لاحقا مع مراعاة التحديات المحددة المرتبطة بكل نوع من أنواع حفظ العينات (الخطوة 1). يتم فصل الهستونات المنقاة من العينات السريرية عبر الرحلان الكهربائي الهلامي البروتيني في ظروف التغيير (SDS-PAGE)، تليها خطوة اشتقاق، ثم تهضم إنزيميا لتوليد ببتيدات بطول مناسب (4-15 حمض أميني) لتحليل مطيافية الكتلة من الأسفلإلى الأعلى 16 (الخطوة 2). وبشكل أكثر تحديدا، تهضم الهيستونات باستخدام استراتيجية شبيهة ب ArgC، حيث يتم تحفيز التريبسين، الذي يقطع عادة عند الطرف C لليسينات غير المعدلة (K) والأرجينين (R)، على قطع فقط عند الطرف C للأرجينين، وذلك بسبب تصحيح كيميائي سابق لليسينات غير المعدلة وأحادية الميثيل مع أنهيدريد بروبيوني (PRO). بعد ذلك، يتم تحويل ببتيدات الهيستون المهضومة الشبيهة ب Arg-C إلى الأسيليات عند ذيولها الطرفية N بإضافة فينيل إيزوسيانات (PIC). يزيد هذا الاشتقاق الإضافي من كراهية الببتيدات للماء ويسمح بفصل أفضل للببتيدات الهيستونية القصيرة بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء العكسية (RP-HPLC)، مما يحسن تحديد وقياس أشكال الببتيدوفورم متساوية الضغط17,18 (الخطوة 3). بشكل عام، تبرز الطرق الموضحة هنا قوة التنميط الهيستوني القائم على التصلب المتعدد في دراسات علم التخلق فوق الوراثي للسرطان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على خزعات الأنسجة المجمدة الطازجة ومجمدة باستخدام OCT بموافقة مستنيرة من المرضى الذين يخضعون لجراحة في المعهد الأوروبي للأورام (ميلانو)، بينما تم الحصول على خزعات FFPE من المرضى الذين خضعوا لجراحة في معهد كارلو بيستا العصبي (ميلانو). تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية للمعهد الأوروبي للأورام (الدراسة UID 2550) ومعهد كارلو بيستا لعلم الأعصاب (دراسة CET 39/24).

1. استخراج الهيستون من الأنسجة المشتقة من المريض (الشكل 1A)

ملاحظة: لتحليل الهيستونات من مجموعات الخلايا الورمية الممثلة وتقليل التباين بين العينات، ينصح باستخدام خزعات سريرية ذات خلوية ورمية لا تقل عن 50٪ وخالية من المناطق النخرية و/أو تسرب مناعي واسع.

  1. إثراء الهيستون من الأنسجة المجمدة الطازجة (المدة المقدرة: 60 دقيقة)
    ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد.
    1. قم بإذابة الأنسجة على الجليد وقطع قطعة من حوالي 20-30 ملغ، عادة ما تعادل حوالي 2 مم3 من الأنسجة.
    2. انقل العينة إلى أنبوب بسعة 1.5 مل وقم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة باستخدام المقص (جدول المواد).
    3. أضف 1 مل من محلول عزل النوى (الجدول 1) مغطى حديثا بمثبطات البروتيز المدرجة في جدول المواد. اخلط جيدا بعد ذلك.
    4. نقل العينة إلى موحش Dounce (جدول المواد).
      ملاحظة: في وجود قطع نسيج كبيرة، استخدم رأس p1000 (عند قطع الرأس بالمقص) لجمع العينة بشكل أفضل.
    5. قم بتجانس النسيج باستخدام أولا المدقة المفككة ثم المدقة المشدودة (جدول المواد) حتى تصبح قطع النسيج غير مرئية للعين المجردة.
    6. قم بترشيح العينة المتجانسة عبر مصفاة خلوية بحجم 100 ميكرومتر (جدول المواد) لإزالة حطام الأنسجة.
    7. يقوم بعمل بيبيتي بقوة صعودا وهبوطا باستخدام p200 لإذابة غشاء البلازما ونقل العينة إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل.
    8. قم بعمل حبيبات في نوى الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 2,300 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة (جدول المواد).
    9. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات النووية في 50-100 ميكرولتر من مخزن عزل النوى، مع إضافة 0.1٪ SDS لإذابة الغشاء النووي (جدول المواد).
    10. أضف 250 وحدة وحدة من نيوكلياز بنزوناز لهضم الأحماض النووية، وامزج جيدا، وحضن لمدة دقيقتين عند 37°م (جدول المواد).
      ملاحظة: إذا كانت العينة لا تزال لزجة، يمكن أيضا إجراء الصوتية في حمام مائي (الإعدادات: 10 دقائق 30 ثانية تشغيل/30 ثانية إيقاف؛ الطاقة: العالية؛ درجة الحرارة: 4 درجات مئوية). بعد هذه الخطوة، يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية.
  2. تخصيب الهيستون من عينات OCT (المدة المقدرة: 90 دقيقة)
    ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لأربعة أو خمسة مقاطع OCT بسماكة 10 ميكرومتر، وهي ما يعادل 20-60 ملغ من الأنسجة. ومع ذلك، يعتمد عدد مقاطع الأنسجة على نوع الخزعة السريرية ومساحة الأنسجة الكلية. نظرا لندرة العينات السريرية، يمكن إجراء استخراج من كمية أقل من الأنسجة الأولية، رغم أن ذلك قد يؤدي إلى تقليل الكشف عن تعديلات الهستون.
    1. ضع أربع أو خمس أقسام أنسجة بسماكة 10 ميكرومتر، تمثل حوالي 20-60 ملغ من الأنسجة، في أنبوب بحجم 1.5 مل.
    2. اغسل الأقسام ب 1 مل من EtOH البارد جدا بنسبة 70٪ (الجدول 1) لمدة دقيقتين على عجلة دوارة (جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
    3. الطرد المركزي عند 16,000 × g لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
    4. كرر الخطوات 1.2.2 و1.2.3 بمجموع 3 مرات.
    5. أعد ترطيب العينات في 1 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) مع التدوير (جدول المواد) لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية.
    6. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي على طاولة (جدول المواد).
    7. كرر الخطوات 1.2.5 و1.2.6 مرتين باستخدام 1x PBS (جدول المواد).
    8. تابع إلى الخطوة 1.1.2 من بروتوكول الإثراء من العينات المجمدة حديثا.
  3. استخراج الهيستون من عينات FFPE (المدة المقدرة: 8 ساعات)
    ملاحظة: تم تطوير البروتوكول الموصوف لأربعة مقاطع FFPE بسماكة 10 ميكرومتر، تعادل تقريبا 20-60 ملغ من الأنسجة. بالنسبة لمعظم تحليلات التصلب المتعدد لتعديلات الهستون، تكون هذه الكمية زائدة وتمثل نقطة انطلاق آمنة عندما لا تكون المادة محدودة. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام كمية أقل من المواد الأولية، وهو أمر مهم بشكل خاص بالنظر إلى قلة كمية الأنسجة المتاحة غالبا عند تحليل العينات السريرية. استخدام مواد بداية أقل، رغم أنه ممكن، يقلل عادة من متانة القياس لتعديلات الهيستون منخفضة الوفرة (مثل H3K27ac، أو ببتيدات H3K27/K36 متعددة الميثيل)، ويمكن أن يختلف هذا التأثير حسب نوع النسيج، وكذلك من عينة لأخرى. ومع ذلك، أظهر مختبرنا سابقا أن تحليل PTM الهيستوني القائم على التصلب المتعدد يمكن أن يتم بنجاح من مناطق الأنسجة المشوهة بالليزر في عينات FFPE لسرطان الثدي التي تصل إلى 1000 خلية18.
    1. ضع أربعة أقسام FFPE بسماكة 10 ميكرومتر، تعادل حوالي 20-60 ملغ من الأنسجة، في أنبوب بحجم 1.5 مل.
    2. أضف 1 مل من عامل مذيب البارافين إلى العينة والدوامة (جدول المواد) بسرعة قصوى لمدة 30 ثانية، حتى يذوب البارافين تماما.
      تحذير: المواد المذيبة للبارافين مسببة للطفرات ومسرطنة وقابلة للاشتعال، لذا يجب استخدامها تحت غطاء كيميائي.
      ملاحظة: يتم تحقيق ذوبان البارافين عندما لا تكون قطع البارافين مرئية بالعين المجردة، ويكون لعامل إذابة البرافين لون أبيض متجانس.
    3. جهاز طرد مركزي 16,000 × g لمدة 3 دقائق في جهاز الطرد المركزي على طاولة وتخلص من السوبرناتانت. لتجنب شفط العينة غير المرغوب فيه أثناء إزالة المادة الفائقة، يمكن تغطية مضخة الفراغ/الماصات بطرف أصغر (مثل p200، p10).
    4. كرر الخطوة 1.3.2 و1.3.3 ثلاث مرات إضافية (4 مرات إجمالا) لضمان إزالة البارافين بالكامل. بدلا من ذلك، وزن العينة التي تم إزالة البارافين بالكامل للحصول على قراءة إرشادية لكمية الأنسجة المعالجة.
    5. أضف 1 مل من محلول EtOH بنسبة 95٪ (الجدول 1) والدوامة عند أقصى سرعة لمدة 30 ثانية، لضمان إعادة تعليق الأنسجة بالكامل.
    6. جهاز طرد مركزي 16,000 × g لمدة 3 دقائق في جهاز الطرد المركزي على طاولة وتخلص من السوبرناتانت. بدلا من ذلك، وزن العينة المجففة للحصول على قياس مؤشر لكمية الأنسجة الجافة المعالجة.
    7. كرر الخطوة 1.3.5 و1.3.6 مع 70٪، 50٪، و20٪ EtOH (الجدول 1) وddH2O لإعادة ترطيب العينة.
    8. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الاستخراج (الجدول 1).
      ملاحظة: إذا كانت هناك قطع نسيج أكبر، قم بقطعها إلى قطع أصغر بالمقص. اعتمادا على كمية الأنسجة، يمكن إضافة كميات أصغر أو أكبر من حاجز الاستخلاص لضمان تحلل العينة بشكل صحيح. بالنسبة للحبيبات الصغيرة جدا التي تعاد تعليقها في حجم مخزن استخراج أقل من 100 ميكرولتر، يمكن إجراء الصوتية باستخدام جهاز صوت (جدول المواد) (30 ثانية تشغيل/30 ثانية إيقاف الطاقة: عالية، 10 دورات).
    9. توحيد الأنسجة في مخزن الاستخلاص عن طريق السونيكيشن باستخدام سونيفر رقمي (جدول المواد) برأس ميكرو بقطر 3 مم (>15 دورة، 5 ثوان تشغيل/2 دقيقة إيقاف، الطاقة: 15-30٪).
      ملاحظة: يمكن اعتبار العينات متجانسة بشكل صحيح عندما لا تكون جزيئات نسيج مرئية مرئية في المحلول ويظهر عازل الاستخلاص لونا موحدا غير عكر. احتفظ بالعينات في RT أثناء دورات السونيكشن. قد يسبب الجليد ترسيب SDS في مخزن الاستخلاص، مما يعيق تجانس الأنسجة. السونيك الصحيح أمر بالغ الأهمية لتحقيق تحلل الأنسجة الكامل واستخراج البروتين. ضع رأس الميكرو على ارتفاع صحيح داخل أنبوب العينة (يجب ألا يلمس قاع الأنبوب، مما يطلق جزيئات بلاستيكية، ولا يجب أن يكون عند واجهة مخزن استخراج الهواء، مما يخلق رغوة وفقاعات).
    10. بعد التجانس، حضن العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة في خلط حراري. كل 15 دقيقة، افتح غطاء الأنابيب للسماح للفورمالديهايد بالتبخر.
    11. حضن العينات عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في خلاط حراري. افتح الغطاء كل 20-60 دقيقة للسماح للفورمالديهايد بالتبخر.
    12. قم بطرد المركزي 16,000 × g لمدة دقيقة واحدة في جهاز الطرد المركزي على طاولة ونقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية في هذه المرحلة.

الجدول 1: تركيب المخزن المؤقت. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

2. حل الهيستون من خلال SDS-PAGE والهضم داخل الهلام

  1. SDS-PAGE (الشكل 1B؛ المدة المقدرة: ساعتان)
    1. لتقييم نقاء الهيستون وتقدير كميته، قم بتحميل 1/10 من مستخلصات الهيستون على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 17٪ (SDS-PAGE؛ الجدول 1) إلى جانب كميات معروفة من الهيستونات المؤتلفة، كما هو موضح في الشكل 1B.
      ملاحظة: بدلا من تحميل 1/10 من مستخلصات الهيستون، يمكن تحميل 15-50 ميكروغرام من البروتينات، كما يقاس باختبارات تتحمل تركيزات عالية من المغسلات، مثل اختبار بروتين حمض البيسينكونينيك (BCA)19 . ومع ذلك، يرجى ملاحظة أن إثراء الهيستون على البروتينات الكلية يمكن أن يختلف بشكل كبير بين عينات المجمدة الطازجة، وOCT المجمدة، وFFPE، ويمكن قياس كمية الهيستون فقط بناء على SDS-PAGE. يمكن تحميل 1 و0.5 و0.25 ميكروغرام من هيستون H3.1 المؤتلف (جدول المواد) كمرجع لقياس كمية الهيستون بدقة أكبر.
    2. امزج العينات مع مخزن تحميل كبريتات الليثيوم الدوديسيل (LDS)، أو مع مخازن تحميل مكافئة ل SDS-PAGE (مثل مخزن لايملي) مع إضافة ديثيوثرايتول (DTT؛ جدول المواد) بتركيز نهائي 10 ملليمولار.
    3. قم بإزالة العينات عند 95°C لمدة 5 دقائق في خلاط حراري.
    4. بعد فصل البروتين على SDS-PAGE، صبغ الجل بصبغة Coomassie (جدول المواد).
    5. تقدير عائد الهيستون من خلال القياسالبصري أو البرمجي 20 لمجموعات الهيستون في العينات السريرية مقارنة بالهيستون المؤتلف H3 المحمل بكميات معروفة.
  2. هضم هيستون داخل الهلام (الشكل 2; المدة المقدرة: يومان)
    ملاحظة: يستخدم الهضم الشبيه بأرجسي لتحليل التصلب المتعدد لببتيدات الهيستون PTM لأن الهضم القياسي للتربسين يولد ببتيدات قصيرة جدا، بسبب التردد العالي للأحماض الأمينية من الليسين والأرجينين في تسلسلها، مما يعيق اكتشاف الببتيدات وتحديد PTM بواسطة LC-MS. من خلال تعديل الليسينات كيميائيا، يتم منع الانقسام التريبتي في هذه المواقع، مما يؤدي إلى انقسام عند الطرف C للأرجينين فقط، مما ينتج ببتيدات أطول (4-15 حمضا أمينيا) تحتوي على ليسينات معدلة ضمن التسلسل؛ بشكل عام، يسهل هذا البروتوكول اكتشاف وقياس الببتيدات الهستونية المعدلة للتصلب المتعدد، وقد تم وصفه بشكل مفصل في العديد من المنشورات8,17,21.
    اختياري: معيار داخلي (مثل الببتيدات ذات العلامات الثقيلة ذات العلامات الكثيفة ذات العلامات العليا، الببتيدات الموسومة صناعيا22) يمكن خلطه مع عينات الهيستون بنسبة 1:1 لتحقيق كمية ببتيدات أكثر دقة في MS (الشكل 2B).
    1. تحميل 3-5 ميكروغرام من عينة الهيستون على جل بولي أكريلاميد بنسبة 17٪، استنادا إلى القياس المقدر للهيستون الذي تم في الخطوة 2.1.5 (الشكل 2B).
    2. بعد SDS-PAGE، تصور البروتينات عن طريق صبغ الجل بصبغة Coomassie.
      ملاحظة: لمنع التلوث الذي قد يتداخل مع تحليل LC-MS/MS، ينصح بتنفيذ الخطوات التالية في بيئة خالية من الكيراتين، مثل غطاء المحرك المخصص، لأن الكيراتين ملوث قوي للمتلازمة.
    3. نطاقات هلام الاستئصال المقابلة للوزن الجزيئي لبروتينات الهيستون الأساسية (شريط الجل بين 10 و18 كيلو دالتون، مع الأخذ في الاعتبار الوزن الجزيئي التالي لكل هيستون نواة: H3 حوالي 17 كيلو دالتون، H2A-H2B حوالي 14 كيلو دالتون، H4 حوالي 11 كيلو دالتون) باستخدام مشرط (جدول المواد) وأحزمة مقطوعة في قطع تقارب 1 مم3 لكل منها.
    4. بمساعدة المشرط، انقل قطع الجل إلى أنبوب بسعة 1.5 مل.
      ملاحظة: لتغطية قطع الجل بالكامل، يمكن زيادة الأحجام الموضحة أدناه، مع الحفاظ على القياس الكيميائي الكاشف.
    5. قم بإزالة صبغ قطع الجل بإضافة محلول يحتوي على 50٪ أسيتونونتريل (ACN) في DDH2O (الجدول 1). ضعه في خلط حرارة مضبوط على 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق RT ثم تخلص من الفائق الشفاف بعد ذلك.
    6. كرر الخطوة 2.2.5 حتى تزيل قطع الجل تماما.
    7. جفف قطع الجل بإضافة 100٪ ACN (جدول المواد). قم بالاحتضان مع الخلط بسرعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق RT ثم تخلص من المادة الفائقة بعد ذلك.
    8. كرر الخطوة 2.2.7 حتى تظهر قطع الجل بيضاء وصلبة، وبالتالي مجففة تماما.
    9. جفف قطع الجل لمدة 5 دقائق عند RT في جهاز طرد مركزي مفرغ (جدول المواد).
      ملاحظة: الهستونات فقيرة في السيستين (يوجد فقط سيستين في هيستون H3 في المواقع 96 و110 (معرف UniprotKB P68431)، ويوجد سيستين واحد فقط في هيستون H2B في الموقع 154 (معرف UniprotKB B4DR52)). بالإضافة إلى ذلك، توجد هذه السيستين داخل الببتيدات التي لا يمكن اكتشافها عند الهضم المشابه ل ArgC في التصلب المتعدد من الأسفل إلى الأعلى، لذا فإن المضافات الكيميائية لمجموعات الثيول23 ليست مجرد أثر في تحليل التصلب المتعدد للهيستونات، ولا يتم تنفيذ أي خطوات لتقليل أو تقويم السيستين في البروتوكول المذكور.
    10. أضف 15 ميكرولتر من محلول الأنهيدريد البروبيوني (PRO) بوزن 7.7 متر (جدول المواد) و26 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم بوزن 1 متر (AmBic) (جدول المواد) إلى كل أنبوب وحضن عينات في خلاط حراري مضبوط على 350 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: بما أن الأنهيدريدات المذابة في المحلول التفاعلي تميل إلى التبخر، فلا تحضر مزيجا رئيسيا من PRO وAmBic، بل أضفهما بشكل فردي إلى كل عينة للحفاظ على تركيز PRO المناسب في كل أنبوب.
    11. غط قطع الجل بالكامل بإضافة 1 M AmBic (الحجم الموصى به: 80 ميكرولتر) وحضن العينات بالخلط بسرعة 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات عند 37°C في خلط حراري. أزل كل السائل بعد ذلك.
      ملاحظة: يضاف 1 M AmBic للحفاظ على درجة حموضة أساسية، وهو مثالي لتحفيز بروبيونيلة الليسينات غير المعدلة والممثيلة أحادية الميثيل بواسطة PRO.
    12. اغسل ثلاث مرات باستخدام ddH2O، مع حضن العينات بينهما عند RT لمدة 10 دقائق أثناء الخلط في خلط حراري عند 1400 دورة في الدقيقة. تخلص من السائل بعد كل غسل.
    13. أضف 50٪ ACN وحضن في خلط حرارة عند 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند RT. تخلص من السائل بعد ذلك.
    14. جفف قطع الجل تماما بإضافة 100٪ ACN وحضن الجل بسرعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة على RT في خلط حراري. تخلص من السائل بعد ذلك.
    15. كرر الخطوة 2.2.14 حتى تظهر قطع الجل بيضاء وجافة.
    16. قطع جل جافة لمدة 5 دقائق عند RT في جهاز طرد مركزي مفرغ.
    17. أضف إلى كل عينة 4 ميكرولتر من محلول التربسين (الجدول 1) و20 ميكرولتر من محلول الهضم (الجدول 1) وحضن 10 دقائق على الثلج للسماح بامتصاص التربسين إلى قطع هلامية.
      ملاحظة: هذه الحضانة - التي تجرى باستخدام محلول تربسين مركز ومخزن هضم (50 ملليمويل أمبيك في ddH2O، مما يخلق درجة حموضة أساسية مثالية لتقسيم التريبسين) - تسمح بامتصاص الإنزيم بواسطة قطع الجل قبل تفعيله عند 37 درجة مئوية.
    18. عندما يتم امتصاص التربسين المركز بالكامل، غط قطع الجل جيدا بحاجز هضم إضافي (الحجم الدالي: 80 ميكرولتر) وحضن الجل عند حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل في خلط حراري.
    19. لاستخراج الببتيدات المهضومة من قطع الجل، أضف 100 ميكرولتر من 100٪ ACN وحضن بسرعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند RT في خلط حراري.
    20. اجمع المادة الفائقة وانقلها إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 مل.
    21. أضف 80 ميكرولتر من 100٪ ACN إلى قطع الجل وحضن عند 1,400 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق RT في خلاط حراري.
    22. اجمع الببتيدات الفائقة وتجمعها مع تلك التي جمعت في الخطوة 2.2.20، ثم تركيز الببتيدات في جهاز طرد مركزي في فراغ إلى حجم يتراوح بين 1 و5 ميكرولتر.
      ملاحظة: يسمح استخدام جهاز الطرد المركزي بالفراغ بتبخر المذيب العضوي (ACN). ومع ذلك، ينصح بعدم تجفيف العينة بالكامل في هذه المرحلة، لأن ذلك قد يؤثر سلبا على خطوة الاشتقاق التالية. إذا جفت العينة، أعد تعليقها في ماء ddH2Oوقم بإلقاء الصوت في حمام ماء لمدة 5 دقائق.
    23. أضف ddH2O إلى كل عينة، إلى حجم نهائي 15 ميكرولتر، ثم أضف 2 ميكرولتر من بيكربونات ثلاثي الإيثيل أمونيوم بوزن 1 م (جدول المواد) و3 ميكرولتر من محلول إيزوسيانات الفينيل (PIC) (الجدول 1) وحضانة عند 350 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري.
      تحذير: PIC مسبب للطفرات ومسرطن، لذا ينصح بالتعامل معه تحت غطاء كيميائي. نظرا لأن PIC تفاعلي للغاية ومتطاير، ينصح بتجنب تحضير خليط رئيسي من بيكربونات ثلاثي الإيثيل أمونيوم وPIC، ولكن ينصح بإضافة كل مادة على حدة لضمان وجود تركيز PIC الدقيق.
    24. أضف إلى كل أنبوب 8 ميكرولتر من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 1٪ (TFA؛ جدول المواد) لإيقاف الاشتقاق باستخدام PIC.
    25. قم بتخفيف كل عينة ب 100 ميكرولتر من محلول التخزين A (الجدول 1) وتحميلها على أطراف مراحل C18 (محضرة كما هو موضح في24 أو تم شراؤها من مزودين مختلفين).
    26. قم بتدوير العينات عند 2,100 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دوار للسماح للببتيدات الهيستونية بالارتباط براتنج C18.
      ملاحظة: يمكن تخزين العينات على أطراف المسرح عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر.
    27. أضف 30 ميكرولتر من مخزن التسيح (الجدول 1) إلى أطراف مراحل C18 وضع الأطراف في أنبوب جديد بسعة 1.5 مل. قم بتدوير العينات بقوة 1000 × جرام لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي على طاولة عند 4 درجات مئوية لاستخراج ببتيدات الهيستون.
    28. تركز العينات إلى حجم يتراوح بين 1 و3 ميكرولتر باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ، ثم أضف 1٪ من TFA للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 6 ميكرولتر.
    29. تحميل 5 ميكرولتر من محلول الببتيد في صفيحة دقيقة بسعة 96 بئر لتحليل MS (جدول المواد) وإغلاقها بسجادة ختم (جدول المواد).

3. HPLC-MS/MS وتحليل البيانات (الشكل 3)

ملاحظة: المعلمات الموضحة هنا مناسبة لنظام كروماتوغرافيا سائل ESAY-nLC 1200 متصل عبر عمود رش EASY بمطياف كتلة Q Exactive Plus Orbitrap (جدول المواد)، ولكن يمكن أيضا استخدام أجهزة مشابهة أو مكافئة مع معاملات خاصة.

  1. HPLC-MS/MS (المدة المقدرة: 90 دقيقة لكل عينة)
    1. حقن 3 ميكرولتر من ببتيدات هيستون بسعة 5 ميكرولتر للخطوة 2.2.29 (تتوافق تقريبا بين 0.25-0.8 ميكروغرام، بناء على قياس كمية الهيستون بواسطة SDS-PAGE) على عمود نانوي من C18 (جدول المواد) بتدفق ثابت 500 نانولتر/دقيقة في المخزن A.
    2. تطبيق تدرج خطي لمدة 55 دقيقة بمقدار 10٪-45٪ من المخزن B بمعدل تدفق 250 نانولتر/دقيقة على الببتيدات المنفصلة.
    3. احصل على بيانات MS/MS في وضع البيانات المعتمد (DDA) للتبديل التلقائي بين MS1 و MS2 باستخدام حزم البرمجيات المخصصة (جدول المواد).
      ملاحظة: للاكتساب والإعدادات العامة، يرجى الرجوع إلى الجدول 2.
  2. تحليل بيانات MS الخام
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم قياس كميات PTMs الهيستونية باستخدام EpiProfile، وهو سكريبت مفتوح (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family)، سهل الاستخدام، ومناسب للتحليلات القياسية كما هو موصوف لميثالات وأسيتلات H3 وH4 ليسين. ومع ذلك، يمكن تخصيص EpiProfile لإجراء تحليلات لتعديلات أقل معايير وعلى بروتوكولات تحضير عينات مختلفة من قبل مستخدمين أكثر خبرة. يرجى ملاحظة أن EpiProfile يتطلب رخصة MATLAB ليكون يعمل25 دقيقة.
    1. تحليل بيانات RAW المكتسبة باستخدام برنامج EpiProfile 2.0 (إصدار PRO-PIC)25 (جدول المواد) وقياس ببتيدات الهيستون باختيار الخيارات histone_normal عند إجراء التحليل بدون علامات، و histone_SILAC عند استخدام سبايك IN. اضبط ndebug = 0.
    2. لكل ببتيد هيستون (مثلا H3_3-8)، احسب الوفرة النسبية (٪RA) لكل ببتيدوفورم معدل (مثلا، H3_3-8 غير معدل، me1، me2، me3) عن طريق قسمة كروماتوجرام الأيونات المستخرج (XIC) المحسوبة بواسطة EpiProfile على مجموع جميع XICs المحسوبة لذلك الببتيد.
      ملاحظة: اختياريا، يمكن التحقق من صحة XIC المحسوبة بواسطة EpiProfile من خلال فحص أطياف MS والقياس اليدوي لببتيدات الهيستون باستخدام تخطيط أطياف مخصص كما هو موضح في18,26.
    3. لكل ببتيدوفورم، احسب نسبة الخفيفة إلى الثقيلة (L/H) عن طريق قسمة نسبة الحمض النووي الروماتويدي لكل ببتيد خفيف أصلي على نسبة RA للببتيد الثقيل المقابل المستخرج من خليط SUPER-SILAC، المضيف إلى كل عينة.
    4. حول نسب L/H إلى مقياس لوغاريتمي. لتسليط الضوء على الفروق الكبيرة في وفرة الببتيدوفورم عبر العينات، يمكن إجراء تحليل إحصائي، ويمكن تمثيل نسب L/H عبر جميع العينات بصريا كخرائط حرارية ومخططات تشتت، كما في الشكل 4.

الجدول 2: قائمة بإعدادات الاستحواذ والإعداد العام المستخدم ل LC-MS/MS مع النظام المستخدم في هذا البروتوكول. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا باستخلاص الهيستون من عينات سرطان الثدي المجمدة حديثا وOCT المجمدة ومن عينات الورم السحاوي من FFPE وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه. كما هو موضح في الشكل 1A، بالنسبة للعينات المجمدة، أزلنا OCT عند وجوده، وقمنا بتجانس العينات في عازل النوى يحتوي على منظف خفيف (0.1٪ ترايتون الخطوة 1.1)، مما سمح بعزل النوى. بعد ذلك، استخرجنا الهستونات مع إضافة 0.1٪ SDS؛ بدلا من ذلك، بالنسبة لعينات FFPE، قمنا بإزالة البارافين، وإعادة ترطيب، وفك الربط المتقاطع من العينات، واستخر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الطريقة الموضحة هنا سير عمل بسيط وقوي لعزل الهيستونات بكفاءة من العينات السريرية المخزنة كخزعات مجمدة حديثة، ومجمدة OCT، وخزعات FFPE لتحديد مشاهد تعديلها بواسطة تحليل التصلب المتعدد. يضمن بروتوكول تحضير العينة اللاحق عبر فصل SDS-PAGE وهضم PRO-PIC داخل الهلام باستخدام التربسين إزالة فعالة للمنظفات والأملاح وملوثات التصلب المتعدد الأخرى33 ويحقق قياسا دقيقا وقويا لأسيتلات الليسين الهيستونية والميثلات. ومن المهم أن الاشتقاق الطرفي N باستخدام إيزوسيانات الفينيل (P...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الجراحين والأطباء من المعهد الأوروبي للأورام ومعهد الأعصاب كارلو بيستا لتقديمهم خزعات الأنسجة المجمدة ب FF، OCT، وFFPE. نشكر روبرتا نوبيريني على النقاش العلمي والمنهجي خلال إعداد المخطوطات وتمويلنا: PRIN2022 (CUPG53D23001530006)، AIRC (رقم المنحة IG-2023-28767)، ومؤسسة IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>كيميائيات
Histolemon RS لعلم الأنسجةكارلو إربا4549122.5 لتر
الأسيتونيتريل (ACN)كارلو إربا412341السنة الأولى
بيكربونات الأمونيوم (AmBic)سيغما ألدريتشA6141500 جرام
برسولفات الأمونيوم (APS)WDR1.012.010.500500 جرام
مثبط بروتياز أبروتينينسيغما ألدريتش  A11535 ملغ
نوكلياز بنزونازميركE101425 KU
بيساكريلاميد 30٪ 37.5 مAppliChemAPA362610001 لتر
العزل A بنسبة 0.1٪ حمض الفورميك في ddH2Oثيرمو فيشر العلمي10229884500 ملم 
العزل B 0.1٪ حمض الفورميك / 80٪ أسيتونيتريل في ddH2Oثيرمو فيشر العلمي15431423500 مل
راتنج C18ميرك66883-Uقطر 47 مم
كومسي إنستانت بلوأبكامab1192111 لتر
ديثيوتريتول (DTT) WDR441496P25 جرام
ايثانولكارلو إربا4146082.5 لتر
ليوبتين  مثبط البروتينسيغما-ألدريتش L85115 ملغ
N,N,N″,N′-تترا ميثيل إيثيلين ديومين (TEMED)سيغما ألدريتش1.107.320100100 مل
مخزن عينات NuPAGE LDSإنفيتروجينNP00074x
PBS - محلول ملحي مخزن بالفوسفات  مايكروجيمTL1006500 مل
فينيل إيزوسيانات (PIC)سيغما ألدريتش185353100 جرام
مثبط بروتياز فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)سيغما ألدريتش  P76261 ج
أنهيدريد البروبيوني (PRO)سيغما ألدريتش24031150 جرام
هيستون H3.1 المؤتلف البشريمختبرات نيو إنجلاند البيولوجيةM25031 & g/µ L
تريبسين بدرجة التسلسلبروميغاV5113100 ميكروغرام
مثبط إناز هيستون ديأستلياز، بيوتيرات الصوديوم (NaBut)ميركB58875 جرام
كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS)سيغما ألدريتشL3771100 جرام
بيكربونات ثلاثي الإيثيل أمونيومسيغما ألدريتشT7408100 مل
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)ثيرمو فيشر العلمي289041x10 مل
تريس-HClسيغما ألدريتشT3253100 جرام
مسحوق ترايتون X-100سيغما-ألدريتش X100RS5 جرام
<قوي>مجموعات/معدات/برمجيات
صفيحة دقيقة ببئر 96كورنينجPCR-96-FS-Cغير حرافي، خال من RNASE/DNASE
توازنكيرن19024
الطرد المركزي على سطح الطاولةمختبر هاريوس بيوفيوجبيكو، 23396
جهاز الصوتيات البيوربتوردياجونود
برانسون ديجيتال سونيفاير 250ايمرسون
مصفاة خلوية 100 وميكرو؛ mصقر352360
Concentratrator plusإبندورف5305000509
متجانس العود (مثلا  ؛ دونس، ويتون...)دونس، ويتونمطحنة أنسجة بسعة 1 مل
كروماتوغرافيا سائلة EASY-nLC 1200ثيرمو فيشر العلمي
عمود HPLC C18 EASY-Sprayثيرمو فيشر العلميES9022 & M, 100  Å, 75 µ متر × 25 سم
سكريبت EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
برمجيات فيجيhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
ماتلابhttps://www.mathworks.com
محرك بحث ماكس كوانتhttps://maxquant.net/maxquant/
البستيل A (طويل)دونس، ويتون
بيستل ب (ضيق)دونس، ويتون
Q نظام Orbitrap إكستيكتيف بلس LC-MS/MSثيرمو فيشر العلمي
العجلة الدوارةثيرمو فيشر العلمي11496548
مشرطكياتو13010
مقصثيرمو فيشر العلمي15207266
حصيرة الختمكورنينجAM-96-PCR-RDمتوافق مع الأتمتة
جهاز الطرد المركزي الدوار المتأرجحبيكمان كولترأليغرا X-15R
دمجة الثيرموميكسرإبندورف5350
دوارPBIفيبروميكس
برنامج إكسكاليبرثيرمو فيشر العلميOPTON-30965

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

FFPE

مقالات ذات صلة