استخدام أدوات علم الوراثة البصرية LEXY و LINuS وتحليل الصور الآلي لتحديد ديناميكيات النقل النووي للسيتوبلازمات في الخلايا الحية

Axelle Donjon; Charlene Boumendil

doi:10.3791/68585

مقالة منهجية

استخدام أدوات علم الوراثة البصرية LEXY و LINuS وتحليل الصور الآلي لتحديد ديناميكيات النقل النووي للسيتوبلازمات في الخلايا الحية

DOI:

10.3791/68585

⸱

يوليو 22, 2025

Axelle Donjon¹ , Charlene Boumendil¹

¹Institut de Génétique Humaine (IGH), Université de Montpellier, CNRS, UMR9002

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفية إعداد وإجراء التحليلات الآلية بكفاءة لبيانات تصوير الخلايا الحية التي تم الحصول عليها من تتبع النقل النووي للخلايا عبر أدوات البصريات الوراثية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد النقل النووي للخلايا (NCT) ضروريا للحفاظ على التوازن الخلوي ، ويشارك اضطرابه في أمراض مختلفة ، بما في ذلك الاضطرابات التنكسية العصبية والتصلب الجانبي الضموري. وهذا يؤكد الحاجة إلى استحداث أدوات لرصد وتحديد التصنيف الكمي. من بين هذه الأدوات ، تسمح مجسات البصريات الوراثية السريعة والقابلة للانعكاس ، LEXY (نظام التصدير النووي المحفز للضوء) و LINuS (إشارة التوطين النووي المحفز للضوء) ، بقياس ديناميكيات NCT في الخلايا الحية.

تصف المنشورات الأصلية التجزئة اليدوية والقياس الكمي لإشارة مسبار الفلورسنت في النواة والعزلة الخلوية عند تعداء تركيبات LEXY و LINuS في تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك ، فإن كل من التعدي والتجزئة اليدوية يحدان من عدد الخلايا التي يمكن تحليلها وتخضع لعدم الدقة بسبب الأخطاء المحتملة التي تعتمد على المستخدم. في حين أن السرعة العالية وقابلية الانعكاس التي توفرها البصريات الوراثية يجب أن تسمح ، من حيث المبدأ ، بحساسية عالية في اكتشاف التغيرات في ديناميكيات NCT ، إلا أنها تعتمد على معلمات الاستحواذ وتحليل عدد كاف من الخلايا.

لذلك أنشأنا نواقل الفيروسات العدسية التي تعبر عن LEXY و LINuS لإنشاء خطوط خلوية مستقرة ، واختبار علامات التصوير الحي وظروف التحكم ، ونفذنا خط أنابيب تحليل الصور شبه الآلي الذي يسمح بتحليل مئات الخلايا. تستخدم طريقة التحليل هذه برنامج الوصول المفتوح FIJI ، وهي متاحة للمبتدئين في المعلوماتية الحيوية ، ولا تتطلب إعدادات حاسوبية متقدمة. نقدم هنا بروتوكولا خطوة بخطوة لإعداد LEXY كمثال على هذه الأدوات البصرية الوراثية لمراقبة الصادرات النووية ، من تحضير العينات إلى الحصول على تصوير الخلايا الحية والتحليل الآلي ، مع توضيح كيفية تكييف البروتوكول مع الظروف أو الضوابط أو النماذج الأخرى في أي مختبر. سيتم توفير جميع البلازميدات وخطوط الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول للمجتمع العلمي ، وبالتالي زيادة إمكانية الوصول إلى الطريقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت دراسة أهمية النقل النووي للخلايا (NCT) لتنظيم المسارات الخلوية الرئيسية والحفاظ على التوازن الخلوي جيدا على مدار السنوات الماضية¹. نتيجة لذلك ، تم إنشاء العديد من الأدوات لدراسة ديناميكيات NCT²^،³^،⁴. من بين هذه الأدوات ، توفر مجسات البصريات الوراثية LINuS⁵ و LEXY⁶ ، التي نشرت على التوالي في عامي 2014 و 2016 ، طريقة قوية لمراقبة NCT في الخلايا الحية. هذه الأدوات ، المصممة لمتابعة التصدير المحفز (LEXY) أو الاستيراد (LINuS) لمراسل الفلورسنت ، يمكن تحريضها عن طريق التعرض للضوء الأزرق وقابلة للعكس.

باختصار ، يستخدم هذان المجسان الصغيران خصائص مجال LOV2 من بروتين الضوئي -1 للنبات Avena sativa⁷. في حالة عدم وجود ضوء أزرق ، يتم وضع حلزون Jα من مجال LOV2 في قفص ضوئي وتضمينه في قلب البروتين. نظرا لأن حلزون Jα يمكن أن يستجيب لتحفيز الضوء ، فإن الإضاءة بالضوء الأزرق تؤدي إلى تغيير توافقي وفك الترسو اللاحق لحلزون Jα من مجال LOV2. استخدم مؤلفو LEXY و LINuS حساسية الضوء هذه لدمج إشارة التوطين النووي (NLS) أو إشارة التصدير النووي (NES) إلى حلزون Jα ، ل LINuS و LEXY ، على التوالي (الشكل 1). الأداة الناتجة عبارة عن مسبار ينتقل إلى النواة (LINuS) أو العصارة الخلوية (LEXY) عند إضاءة الضوء الأزرق.

لتتبع المجسات بالتصوير الفلوري ، تمت إضافة مراسل الفلورسنت mCherry أيضا إلى البنيات. أخيرا ، تمت إضافة NES ضعيف (ل LINuS) أو NLS (ل LEXY) إلى النظام للتأكد من أن المجسات لم تكن في توطينها النهائي قبل إضاءة الضوء الأزرق ، مما يمنع مراقبة انتقال LEXY أو LINuS بين النواة والعصارة الخلوية.

figure-introduction-1
الشكل 1: تمثيل مجسات LEXY و LINuS. يتكون كلا المجالسين من بروتين mCherry مدمج في مجال LOV2 الحساس للضوء. يكمن الاختلاف بين الأداتين في تسلسل الإشارات المخفي بواسطة Jα-helix: NES ل LEXY و NLS ل LINuS. يمتلك كلا المجبارين أيضا تسلسل إشارة ضعيف للتحكم في توطينهما الأولي: NLS ضعيف ل LEXY و NES ضعيف ل LINuS. وبالتالي فإن تنشيط الأنظمة بإضاءة الضوء الأزرق يحفز إما تصديرها لنظام LEXY أو استيرادها لشبكة LINuS، مما يسمح للمستخدمين بمراقبة التصدير أو الاستيراد النووي. المختصرات: LEXY = نظام تصدير نووي محفز للضوء؛ LINuS = إشارة توطين نووية محفزة للضوء. NLS = إشارة التوطين النووي ؛ NES = إشارة التصدير النووي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يشير توطين مضان mCherry إلى مكوك مجسات LEXY و LINuS بين النوى والعزلة الخلوية ، وبالتالي يمكن اتباعها في تصوير الخلايا الحية ، مما يسمح للمستخدمين بمراقبة NCT. بالإضافة إلى استخدامها كمجسات بسيطة ، يمكن أيضا تصميم LEXY و LINuS للتحكم في التوطين ودراسة البروتينات ذات الأهمية ، في المختبر⁵^،⁶^،⁸^،⁹ أو في الجسم الحي¹⁰^،¹¹.

تظهر طريقة القياس الكمي المقترحة في منشورات LEXY و LINuS الكثافة النووية النسبية للمجسات. يتم إجراء التحليل المقترح يدويا ويعتمد على قياس منطقة الاهتمام (ROI) في النواة والعزلة الخلوية. على الرغم من أن هذه الطريقة تعطي تمثيلا جيدا لإشارة المسبار بمرور الوقت ، إلا أنها طويلة جدا ومملة ، خاصة عند تكرار التجارب والظروف. من المهم أن هذه الطريقة تفتقر أيضا إلى الدقة حيث يتم تمثيل جزء صغير فقط من المقصورة المصممة.

نقترح هنا بروتوكولا جديدا لقياس إشارة الفلورسنت LEXY و LINuS. قمنا بتنفيذ تقنيات آلية تسهل التحليلات وتوفر دقة أكبر. سيؤدي ذلك إلى تسهيل العملية للمستخدمين الجدد لهذه الأدوات ويساعد على زيادة الإنتاجية. يستخدم بروتوكول القياس الكمي الخاص بنا واجهة واحدة فقط ، وهو المكون الإضافي TrackMate¹² مفتوح المصدر من FIJI. والجدير بالذكر أنه لتحسين موثوقية التقديرات الكمي ، استخدمنا علامة حمض نووي حمراء بعيدة متوافقة مع التصوير المباشر لإجراء تجزئة كاملة للنواة باستخدام StarDist¹³ ، وهي شبكة عصبية تلافيفية مدربة ، جنبا إلى جنب مع تتبع وقياس إشارة الفلورسنت للمسبار باستخدام TrackMate¹².

يمكن بعد ذلك تصدير البيانات التي تم الحصول عليها بسهولة إلى جدول البيانات المقدم والجاهز للاستخدام (الجدول التكميلي S1) للحصول على الكثافة النووية النسبية لكل نواة محددة. يشرح هذا البروتوكول أيضا كيفية تجميع القيم التي تم الحصول عليها في رسم بياني عن طريق ملاءمة منحنى المسار الزمني الذي تم الحصول عليه على نموذج أحادي الأس ، كما هو الحال في Yoo and Mitchison¹⁴ وكيفية حساب معدل النقل للظروف المختلفة التي تم اختبارها. باستخدام هذا البروتوكول وجدول البيانات المقدم للتحليل ، سيتمكن المستخدمون من تحديد بيانات تصوير الخلايا الحية بسهولة ، حتى مع مهارات المعلوماتية الحيوية المحدودة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم وصف البروتوكول التالي لمراقبة الصادرات النووية باستخدام مسبار LEXY. يتم عرض التفاصيل المتعلقة بالإعدادات المراد ضبطها ل LINuS في القسم 5.

1. زراعة الخلايا

ملاحظة: يجب تنفيذ الإجراء الوارد في هذا القسم في غطاء من درجة زراعة الأنسجة. تم تحسين الخطوات الموضحة أدناه لخط الخلايا الليفية للفأر NIH / 3T3^، باستخدام DMEM (أو DMEM الخالي من الفينول عند الإشارة إليه) ، مع استكمال 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين ستربتومايسين كوسيط (انظر جدول المواد). ومع ذلك ، يمكن للمستخدمين تكييف الإجراء مع أنواع الخلايا الأخرى. البروتوكول مناسب للخلايا المنقولة أو خطوط الخلايا المستقرة. ومع ذلك ، نوصي بإنشاء خطوط خلوية ثابتة ، كما هو مذكور في قسم المناقشة.

تحضير محلول الطلاء ب 23 ميكروغرام / مل من الكولاجين و 2 ميكروغرام / مل من الفيبرونيكتين في 1x PBS المعقم. أضف 800 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل طبق تصوير مباشر (انظر جدول المواد) واحتفظ به في الحاضنة لمدة 90 دقيقة.
اغسل مزيج الطلاء ب 1x PBS معقم وبذرة 60,000 خلية على أطباق التصوير المباشر في الوسائط ، للحصول على الاستحواذ في اليوم التالي.
إذا لزم الأمر ، قم بنقل الخلايا باستخدام بلازميد LEXY وفقا لطريقة التعداء التي تناسب نوع الخلية المستخدمة. لاتباع هذا البروتوكول ، قم بإجراء نقل مشترك للمسبار باستخدام متجه فارغ لزيادة الكفاءة ، بنسبة 1: 5 ل LEXY: متجه فارغ. احم الخلايا من الضوء في صندوق مظلم أو بورق الألمنيوم واتركها تنمو ليوم واحد.
قبل الاستحواذ ، قم بتلطيخ الخلايا بعلامة حمض نووي حمراء بعيدة متوافقة مع تصوير الخلايا الحية ، في وسط خال من الفينول الأحمر ، وتأكد من أنها محمية تماما من الضوء حتى الاستحواذ.
ملاحظة: في حالتنا ، نستخدم SiR-DNA¹⁶ عند 1 ميكرومتر ، محتضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل عمليات الاستحواذ.
للتحكم في التصدير ، استخدم مثبط التصدير النووي Leptomycin B¹⁷ عند 0.5 نانومتر (تثبيط التصدير الخفيف) و 1 نانومتر (تثبيط التصدير القوي) ، المطبق على الخلايا قبل ساعة واحدة من عمليات الاستحواذ.

2. التصوير

ملاحظة: يمكن إجراء عمليات الاستحواذ باستخدام مجهر متحد البؤر متوافق مع التصوير المباشر ، والذي لديه القدرة على إنشاء نمط من عمليات الاستحواذ المختارة وإضاءة ليزر نابضة 458 نانومتر. تم إجراء التصوير في الظلام في غرفة 37 درجة مئوية (مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) من مجهر متحد البؤر مع المسح بالرنين. تم تحسين الإعداد بهدف 20x ، مما يسمح بالتصوير المتزامن لخلايا متعددة في نفس مجال الرؤية. يتكون تسلسل التصوير من ثلاث مراحل ، كما في الشكل 2.

مرحلة مستقرة
1. قم بإجراء عملية استحواذ واحدة على إشارات mCherry (LEXY ، ليزر 561 نانومتر) والأحمر البعيد (SiR-DNA ، ليزر 633 نانومتر) كل 15 ثانية ، وكررها 10x ، لمدة إجمالية تبلغ 150 ثانية. تأكد من عدم ملاحظة التبييض أو نقل LEXY إلى العصارة الخلوية في هذه المرحلة.
  تنبيه: ستؤدي إضاءة النظام بالضوء الأزرق في هذه المرحلة إلى تنشيط LEXY ، مما يؤدي على الفور إلى تصديره إلى العصارة الخلوية.
مرحلة الإضاءة
ملاحظة: تتكون هذه المرحلة من ثلاث خطوات ، تتكرر 15 مرة.
1. قم بإجراء إضاءة نابضة بالضوء الأزرق (ليزر 458 نانومتر) ، مع نبضات 36 مللي ثانية متكررة 150x ، لمدة إجمالية تبلغ ~ 5 ثوان.
2. قم بإجراء عملية استحواذ واحدة على إشارات الفلورسنت mCherry (LEXY ، ليزر 561 نانومتر) والأحمر البعيد (SiR-DNA ، ليزر 633 نانومتر).
3. توقف لمدة 15 ثانية.
مرحلة التعافي
1. قم بإجراء عملية استحواذ واحدة على إشارات mCherry (LEXY ، ليزر 561 نانومتر) والأحمر البعيد (SiR-DNA ، ليزر 633 نانومتر) كل 15 ثانية ، كرر 25x ، لمدة إجمالية تبلغ 375 ثانية.
  ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ويمكن إزالتها إذا أراد المستخدمون فقط مراقبة تصدير المسبار وليس الاسترداد.

figure-protocol-1
الشكل 2: تكوين المراحل الثلاث ل LEXY. لمراقبة الصادرات النووية باستخدام LEXY ، يجب إعداد ثلاث مراحل على برنامج المجهر. يشير الجزء العلوي إلى التكوين المراد استخدامه في عمليات الاستحواذ على تصوير الخلايا الحية من LEXY. يتكون هذا التكوين من مرحلة مستقرة ، لضمان استقرار الإشارة في النواة ، ومرحلة الإضاءة ، للحث على انتقال LEXY من النواة إلى العصارة الخلوية ، ومرحلة الاسترداد ، لمراقبة عودة LEXY إلى النواة. يشير الجزء السفلي من الشكل إلى النتائج المتوقعة مع تصوير الخلايا الحية. باللون الأحمر ، يشير mCherry إلى توطين LEXY. باللون الرمادي ، يلطخ SiR-DNA نواة الخلايا. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحليل LEXY

ملاحظة: يتم إجراء تحليل التجزئة والتتبع بالكامل باستخدام FIJI ، مع TrackMate¹² ، وهو مكون إضافي مفتوح المصدر في فيجي (الإصدار المطلوب مفصل في جدول المواد).

قم بتثبيت FIJI ثم قم بتنزيل المكونات الإضافية StarDist¹³ و TrackMate. لتثبيت المكونات الإضافية، انتقل إلى التعليمات | تحديث ... | إدارة تحديث المواقع وحدد CSBDeep و StarDist و Trackmate-StarDist ، ثم انقر فوق تطبيق التغييرات. أعد تشغيل فيجي.
في حين أن بعض المجاهر يمكن أن تأخذ كل مرحلة اكتساب (الإضاءة المستقرة والاسترداد) معا ، فإن البعض الآخر (على سبيل المثال ، المجهر متحد البؤر المشار إليه) يحفظها بشكل منفصل. لذلك ، فإن الخطوة الإضافية ، في حالة استخدام هذا التكوين ، هي تسلسل المراحل معا: افتح صور التسلسلات الثلاثة ، وقم بتشغيل وظيفة التسلسل لتجميع مراحل الفاصل الزمني الثلاث في ملف واحد: انقر فوق صورة | مكدسات | أدوات | تسلسل ....
حدد المرحلة المستقرة ك Image1، ومرحلة الإضاءة على أنها Image2، ومرحلة الاسترداد على أنها Image3. الصورة الناتجة هي صورة واحدة للفاصل الزمني للمراحل الثلاث ، مع دمج قنوات mCherry (القناة 1) و SiR-DNA (القناة 2).
احتفظ بالصورة التي تم الحصول عليها لخطوة التجزئة اللاحقة واحفظها: انتقل إلى ملف | حفظ باسم | تيف....
قم بتقسيم قناة mCherry وحدها للتحليلات التالية: انتقل إلى الصورة | اللون | تقسيم القنوات وحفظها: انتقل إلى ملف | حفظ باسم | تيف....
للتحقق من التبييض النهائي أثناء الاستحواذ ، قم بتشغيل الأمر Plot Z-axis Profile على قناة mChery: انتقل إلى صورة | مكدسات | مؤامرة المحور Z الملف الشخصي. في الجدول الذي تم إنشاؤه ، انقر فوق البيانات | انسخ مجموعة البيانات 1 st والصقها في جدول البيانات الجاهز للاستخدام المتوفر مع هذا البروتوكول (الجدول التكميلي S1) ، أسفل خلية ملف تعريف المحور Z.
ارسم منطقة اهتمام دائرية (ROI) بمتوسط حجم النواة واحفظها: انتقل إلى تحليل | أدوات | مدير العائد على الاستثمار .... أضف عائد الاستثمار واحفظه: انتقل إلى المزيد | أنقذ...
ملاحظة: يجب استخدام نفس عائد الاستثمار لقياس الخلفية لجميع الظروف التي تم تحليلها.
ضع عائد الاستثمار المحفوظ في منطقة بدون خلايا أثناء الفاصل الزمني بأكمله وقم بقياس متوسط الكثافة داخل عائد الاستثمار هذا باستخدام وظيفة واجهة عائد الاستثمار. أولا ، تأكد من تحديد متوسط القيمة الرمادية بالنقر فوق تحليل | تعيين القياسات. ثم انقر فوق المزيد | متعدد القياسات. ضع علامة قم بقياس جميع الشرائح ال 50 وشريحة واحدة نيئة لكل شريحة ، وانقر فوق موافق.
انسخ والصق جميع القيم المعروضة في جدول البيانات المتوفر (الجدول التكميلي S1)، أسفل خلية "خلفية عائد الاستثمار".
في فيجي، أغلق الصورة باستخدام قناة mCherry فقط وحدد الصورة المحفوظة مسبقا باستخدام قنوات mCherry وSiR-DNA المدمجة.
افتح المكون الإضافي TrackMate: انتقل إلى الإضافات | التتبع | TrackMate.
تحقق من صحة عدد النقاط الزمنية (من 0 إلى 49 إذا تم اتباع المراحل المقترحة) وانقر فوق التالي.
حدد كاشف StarDist وانقر فوق التالي.
حدد القناة 2 (SiR-DNA) لتقسيم النوى وانقر فوق التالي. انتظر بضع ثوان حتى تنتهي عملية التجزئة. افحص بصريا أن التجزئة التي تم الحصول عليها تتوافق مع حدود النوى وانقر فوق التالي (الشكل 3). في حالة التجزئة غير الدقيقة ، لاحظ معرف النواة المقابل (SpotID) لاستبعاده من مزيد من التحليل في الخطوة 3.26.
اترك المعلمات الافتراضية وانقر فوق التالي في نافذة إعداد العتبة الأولية . توضح هذه النافذة عدد النقاط المجزأة (النوى) من بين 50 نقطة زمنية.
تعيين الفلاتر في الأماكن: إنشاء وتعيين الفلاتر:
1. قم بإنشاء مرشحين باستخدام متوسط الشدة ch1 كمعلمة لإزالة النوى ذات الإشارة المكثفة جدا أو الضعيفة جدا ، والتي يمكن أن تحرف التحليلات: مرشح واحد لتحديد القيم فوق العتبة المحددة والآخر لتحديد القيم الموجودة أسفل العتبة. حدد القيمة لإزالة الإشارة المنخفضة جدا أو المشبعة فقط.
  ملاحظة: قد لا تكون هناك حاجة إلى هذه المرشحات إذا تم استخدام خطوط خلوية مستقرة. لاحظ هذه القيم حيث يجب إعادة تطبيقها على جميع الشروط.
2. قم بإنشاء مرشحين منطقة لإزالة الكائنات غير المرغوب فيها (الحطام أو الخلايا المحتضرة أو المقسمة) من التحليلات: مرشح واحد لتحديد القيم أعلى من العتبة المحددة والآخر لتحديد القيم الموجودة أسفل العتبة. انقر فوق التالي.
  ملاحظة: أعد تطبيق هذه القيم على جميع الشروط.
حدد متتبعا: اختر Simple LAP tracker وانقر فوق التالي.
حدد معلمات التتبع. اضبط المسافة القصوى للربط (هنا ، 30 ميكرومتر) - المسافة القصوى التي سيسمح لها بالارتباط بالكائنات بين الإطارات. استخدم الحد الأقصى للمسافة لإغلاق الفجوة (هنا ، 15 ميكرومتر) والحد الأقصى لفجوة الإطار لإغلاق الفجوة (هنا ، 3) لتحديد عدد النقاط في مسار واحد التي يمكن حذفها دون استبعاد هذا المسار نفسه. انقر فوق التالي (الشكل 3).
ملاحظة: تم تحسين هذه المعلمات المقترحة للإعداد والنموذج الخلوي الخاص بنا باستخدام نهج التجربة والخطأ وقد تحتاج إلى تعديلها تجريبيا.
يجب تعديل المسافة القصوى لربط المسافة لمنع التتبع الخاطئ من نواة إلى أخرى ، خاصة إذا كانت الخلايا تتحرك كثيرا.
بعد العمليات الحسابية ، انقر فوق التالي وقم بتعيين عوامل التصفية على المسارات. لتحديد النوى التي تم تتبعها فقط خلال الدورة الزمنية بأكملها (50 نقطة زمنية مع التسلسل المقترح) ، حدد أكبر عدد من النقاط في المسار (ضع المؤشر على أكثر من 49 للتسلسل المقترح). انقر فوق التالي.
ملاحظة: سيسهل هذا التحليل ولكنه لا يمكن تحقيقه إلا إذا تم تتبع عدد كاف من النوى طوال الدورة الزمنية ، وإذا لم يكن الأمر كذلك: انظر المناقشة.
خيارات العرض: ضع علامة على عرض الأسماء الموضعية لتتمكن من تتبع كل نواة في مزيد من التحليلات. قم بتخصيص الميزات المعروضة وفقا لتفضيلات المستخدم.
في أسفل الصفحة، انقر فوق المسارات | قم بالتصدير إلى CSV لحفظ الجدول مع جميع القياسات. أغلق الجدول وانقر فوق التالي.
اختياريا، ارسم ميزات المسار باستخدام T (الوقت) كمحور X ومتوسط شدة ch1 للمحور Y. انقر فوق ميزات المؤامرة. أغلق الرسم البياني وانقر فوق التالي.
ملاحظة: سيعطي هذا المستخدمين فكرة عن الاتجاه العام للتصدير. في هذه المرحلة ، لا يتم تطبيعها في الخلفية والشدة الأولية.
انقر فوق التقاط تراكب كإجراء وتنفيذ | حسنا. سيتم استخدام الصورة التي تم إنشاؤها لتحديد النوى الكمية. حفظ: انتقل إلى ملف | حفظ باسم | تيف....
في ملف جدول بيانات، قم باستيراد ملف CSV الذي تم الحصول عليه باستخدام TrackMate: في علامة التبويب البيانات، في المجموعة الحصول على البيانات وتحويلها، انقر فوق From Text/CSV وImport.
حدد الأعمدة الأربعة التالية بأكملها من خلال النقر على الحرف المقابل لها وانسخها والصقها في الجزء العلوي من جدول البيانات المقدم (الجدول التكميلي S1) ، الأعمدة من A إلى D ، مع الخلفية: معرف البقعة (B) ، معرف المسار (C) ، الإطار (I) ، متوسط الكثافة ch1 (M).
ملاحظة: تأكد من أن بداية التدابير الملصقة تبدأ في الصف 6 من الجدول التكميلي S1. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقد يتم تحويل القياسات من خلية واحدة أو أكثر وبالتالي تكون غير صحيحة. ارجع إلى جدول بيانات الجدول التكميلي S2 للحصول على مثال على التصرف المتوقع.
قم بفرز النتائج أبجديا أولا حسب TrackID (نواة فردية) بالنقر فوق السهم في الخلية B5 و Frame (النقطة الزمنية) بالنقر فوق السهم في الخلية C5.
لإزالة ضوضاء الخلفية ، اطرح القيم التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.8 من كل قيمة تم الحصول عليها في متوسط الشدة ch1 (محسوبة مسبقا في جدول البيانات المقدم ، انظر الجدول التكميلي S1).
لتطبيع إشارة LEXY ، احسب متوسط شدة إشارة الفلورسنت mCherry في المرحلة المستقرة (الإطارات من 0 إلى 9). بعد ذلك ، قسم جميع النتائج التي تم الحصول عليها في متوسط الشدة ch1 على متوسط شدة المرحلة المستقرة (محسوبة مسبقا في جدول البيانات المقدم ، انظر الجدول التكميلي S1).
ملاحظة: الرقم الذي تم الحصول عليه هو متوسط شدة الفلورسنت النووية ل LEXY. يتم عرض جميع المقاييس بالفعل بواسطة النوى من العمود L ويمكن رسمها في رسم بياني.

figure-protocol-2
الشكل 3: تحليل TrackMate باستخدام FIJI. في الأعلى ، يحلل التمثيل التخطيطي ل TrackMate ، في الأسفل ، الصور التي تم الحصول عليها من تحليلات FIJI. يظهر التمثيل الأول على اليسار تلطيخ SiR-DNA غير المجزأ ، وهو علامة على النواة ، باللون الرمادي. تمثل اللوحة الثانية التجزئة التلقائية التي يتم إجراؤها باستخدام قناة SiR-DNA بواسطة Stardist. يتم تلوين النوى وفقا لشدة قناة mCherry ، لتسهيل التصور والخطوة النهائية. تظهر اللوحة الثالثة المسارات التي تم الحصول عليها عن طريق تتبع تلطيخ SiR-DNA في النقاط الزمنية لتسلسل تصوير الخلايا الحية بالكامل. تظهر اللوحة الأخيرة الموجودة على اليمين إشارة الفلورسنت الخاصة ب LEXY ، باللون الأحمر ، في المنطقة المحددة بواسطة التجزئة ، والتي سيتم قياسها لكل نقطة زمنية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. معدل النقل والإحصاءات والأرقام

ارسم الرسم البياني النسبي للكثافة النووية.
1. افتح GraphPadPrism وأنشئ ورقة: انقر فوق إدخال البيانات أو استيرادها إلى جدول جديد ، وفي الخيارات ، حدد الأوقات المنقضية ل X والحد الأقصى لعدد النوى المجزأة لقيم النسخ المتماثل في الأعمدة الفرعية جنبا إلى جنب ل Y. انقر فوق إنشاء ولصق البيانات التي تم الحصول عليها في الجدول.
2. بالنسبة إلى قيم X (الوقت)، إذا تم الاحتفاظ بمعلمات عمليات الاستحواذ على النحو المقترح، انسخ العمود ضمن "الوقت" في جدول البيانات المقدم. خلاف ذلك ، اضبط القيم وفقا للمعلمات المستخدمة.
3. لإنشاء الرسم البياني للكثافة النووية النسبية ، انتقل إلى قسم الرسوم البيانية. حدد XY كعائلة الرسم البياني ، و Points & ربط line مع أشرطة الخطأ كنوع الرسم البياني.
4. في قسم المؤامرة ، حدد المتوسط والخطأ والتسويق عبر محرك البحث وانقر فوق موافق لرؤية الرسوم البيانية. قم بتغيير المقاييس والمرئيات وفقا للمعلمات المختارة.
قم بملاءمة الكثافة النووية النسبية لنموذج أحادي الأس.
1. في قسم جدول البيانات ، انقر فوق جدول بيانات جديد.
  1. حدد أدخل قيم X ك X و Enter وارسم قيمة Y واحدة لكل نقطة ك Y ، وانقر فوق إنشاء.
  2. في العمود X ، أبلغ عن الأوقات بالكسور العشرية فقط للمرحلتين المستقرة والإضاءة ؛ إذا تم الاحتفاظ بالمعلمات المقترحة لعمليات الاستحواذ ، فقم بنسخ ولصق العمود تحت "الوقت العشري" في جدول البيانات المقدم، الجدول التكميلي S1.
  3. الصق القيم التي تم الحصول عليها ككثافة نووية نسبية في الجدول ، فقط للمراحل المستقرة والإضاءة.
  4. في قسم النتائج، حدد التحليل التالي: تحليلات XY | الأسي | الانحدار غير الخطي (Curve Fit) وانقر فوق موافق.
  5. في المعلمات ، حدد الهضبة متبوعا باضمحلال طور واحد كنموذج ، وفي معلمات التقييد ، حدد ثابتا يساوي 2.25 ك X0 (وقت بدء الإضاءة) ، ثابت يساوي 1 ك Y0 (الكثافة النووية النسبية في بداية الإضاءة) ، ثابت يساوي 0 للهضبة (القيم التي يجب أن تميل إليها الكثافة النووية النسبية) ، وتشير إلى أن K (معدل التصدير) يجب أن يكون أكبر من 0. اترك المعلمات الأخرى افتراضيا. انقر فوق موافق.
  6. في قسم النتائج ، يشير الصف K إلى جميع معدلات التصدير لنوى الحالة المختبرة.
  7. كرر الخطوات من 4.2.1 إلى 4.2.1.5 للشروط الأخرى إذا لزم الأمر.
قم بإنشاء الرسم البياني لمعدل التصدير.
1. قم بإنشاء جدول جديد: حدد أدخل قيم X ك X و Enter وارسم قيمة Y واحدة لكل نقطة ك Y ، وانقر فوق إنشاء.
2. لكل شرط (في أعمدة)، الصق قيم K التي تم الحصول عليها في الخطوة السابقة وقم بتبديل قيمها.
3. لإنشاء الرسم البياني لمعدل التصدير ، انتقل إلى قسم الرسوم البيانية ، وحدد العمود كعائلة رسم بياني ، وفي قسم الصندوق والكمان ، حدد مخطط الكمان كنوع رسم بياني ، مع مخطط الكمان. إظهار جميع النقاط كمؤامرة. انقر فوق "موافق" لرؤية الرسم البياني. تخصيص طريقة تمثيل البيانات إذا لزم الأمر.
4. لإجراء اختبار إحصائي لمعدل التصدير ، قم بإجراء اختبار ويلش على الوجهين ، كما هو موضح في Yoo and Mitchison¹⁴ ، باتباع الخطوات التالية:
  1. في الجدول الذي يحتوي على معدلات التصدير لجميع الشروط ، انقر فوق تحليل | مقارنة المجموعات | T-Test (والاختبارات غير المعلمية) ، حدد الشروط المراد اختبارها ، وانقر فوق موافق. ضع علامة غير مقترن ، نعم استخدم الاختبار البارامتري ، واختبار t غير المقترن مع تصحيح ويلش. لا تفترض SDs متساوية ، وانقر فوق موافق.
5. مراقبة نتائج التحليل في جدول قسم النتائج والإبلاغ عن الرسم البياني لمعدل التصدير إذا لزم الأمر.

5. التعديلات مع LINuS

ملاحظة: يمكن بسهولة تكييف البروتوكول الموصوف أعلاه لمراقبة الاستيراد النووي باستخدام LINuS من خلال تطبيق التغييرات التالية.

زراعة الخلايا
1. بدلا من Leptomycin B في الخطوة 1.5 ، استخدم importazole¹⁸ كمثبط نووي ، بتركيز 10 ميكرومتر لمدة ساعة واحدة قبل الاستحواذ.
التصوير
1. للحصول على الاستيراد الأمثل للنظام ، استبدل 150 تكرارا لنبضات الإضاءة 36 مللي ثانية بالليزر 458 نانومتر في الخطوة 2.2.1 ب 250 تكرارا لمدة إجمالية ~ 9 ثوان.
  ملاحظة: يمكن أن يعتمد توقيت التسلسل على نوع الخلية ، وقد تحتاج معلمات كلا المجسات إلى التعديل لتكون مثالية ، نظرا لأن الأنظمة تعتمد على التعرف على NLS و NES ، وهما نوعان خاصان^{بنوع الخلية 19}^،²⁰.
معدل النقل والإحصاءات والأرقام
1. بدلا من تركيب منحنى على هضبة متبوعا باضمحلال طور واحد في الخطوة 4.2.1.5 ، حدد الهضبة متبوعا بتحليل ارتباط مرحلة واحدة .
2. قم بتقييد X0 إلى 2.25 ، و Y0 ك 1 ، و K (معدل الاستيراد في حالة LINuS) أكبر من 0.
  ملاحظة: تحليلات LINuS مع TrackMate متطابقة مع تحليلات LEXY. لا تزال الكثافة النووية النسبية هي القيمة المقاسة والتحليلية ، ولكن بدلا من ملاحظة انخفاض بسبب تصدير المسبار ، يجب ملاحظة تخصيب إشارة الفلورسنت في النواة بعد إضاءة الضوء الأزرق.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يجب أن يسمح البروتوكول المذكور أعلاه للمستخدمين بتصور توطين المسبار ونقله أثناء الاستحواذ في تصوير الخلايا الحية. يظهر مثال على الصور المتوقعة التي تم الحصول عليها لتصور الصادرات النووية باستخدام LEXY في الشكل 4. يجب ملاحظة انخفاض سريع في الإشارة من النواة وإثراء العصارة الخلوية بعد جولتين من إضاءة الضوء الأزرق. يمكن أن يكون الاسترداد التدريجي لإشارة المسبار مرئيا بعد إيقاف دورات الإضاءة. للتحكم في النظام ، يشهد Leptomycin B ، وهو مثبط للتصدير ، على أنه يمكن تصور التغيير في التصدير من خلال التحليلات ، لأنه يمنع تصدير LEXY عند إضاءة الضوء الأزرق (الشكل 4).

figure-results-1
الشكل 4: تصور إشارة LEXY بمرور الوقت. التقاط النقاط الزمنية التمثيلية لمراحل الاستقرار والإضاءة والتعافي ، المكتسبة من خلال تصوير الخلايا الحية. تمثل حالة الميثانول حالة التحكم. عند إضاءة الضوء الأزرق النابض ، باللون الأحمر ، يتم نقل إشارة الفلورسنت mCherry ، مراسل موقع LEXY ، من النواة إلى العصارة الخلوية. بعد إيقاف الإضاءة ، يتم استرداد الإشارة في النواة. يظهر العلاج بمثبط التصدير Leptomycin B عند 1 نانومتر أو 0.5 نانومتر غياب أو نقصان تصدير LEXY عند حظر التصدير. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

فيما يتعلق بالتحليلات ، في حين أن قيم منحنى الكثافة النووية النسبية خلال المرحلة المستقرة يجب أن تكون حوالي 1 ، بعد تنشيط الضوء الأزرق ، يجب أن تظهر انخفاضا بطيئا حتى تصل إلى هضبة في نهاية مرحلة الإضاءة (الشكل 5 أ). إذا كان الانخفاض سريعا جدا أو بطيئا جدا ، فيمكن تحسين معلمات الاكتساب (انظر المناقشة). يمكن أن تؤكد معالجة اللبتومايسين B بتركيزات كافية أيضا أن التحليلات والتقنية حساسة بما يكفي لإظهار أن الصادرات النووية محظورة تماما ، مع قيم كثافة نووية نسبية مستقرة عند حوالي 1 للتجربة بأكملها. ومع ذلك ، يجب أن تظهر تركيزات اللبتومايسين B المتوسطة تصديرا نوويا خفيفا (الشكل 5 أ). يجب تأكيد هذه الملاحظات المرئية كميا مع مراعاة معدل التصدير (الشكل 5 ب).

figure-results-2
الشكل 5: الكثافة النووية النسبية المتوقعة ل LEXY ومعدل النقل. (أ) يمثل الرسم البياني الكثافة النووية النسبية لإشارة الفلورسنت الخاصة ب LEXY بمرور الوقت ، مع تطبيعها إلى متوسط شدة mCherry للمرحلة المستقرة. تنخفض الكثافة النووية النسبية لحالة الميثانول (التحكم ، الأحمر) بمقدار النصف بعد الإضاءة ، على عكس الخلايا المعالجة بمثبط التصدير Leptomycin B ، بتركيز 0.5 نانومتر (أزرق فاتح) أو 1 نانومتر (أزرق داكن). أشرطة الخطأ: SEM. (B) معدل تصدير ظروف التحكم و Leptomycin B ، التي تم الحصول عليها عن طريق ملاءمة المنحنى لنموذج أحادي الأسي. القيم التي تم الحصول عليها عند حظر التصدير بواسطة Leptomycin B أقل بكثير من حالة التحكم. N = 18 خلية للميثانول (أحمر) ، و 19 خلية ل Leptomycin B 0.5 نانومتر (أزرق فاتح) ، و 15 خلية ل Leptomycin B 1 nM (أزرق داكن). تم حساب قيم P عن طريق اختبار ويلش t على الوجهين. P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵.: الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي S1: جدول بيانات مع حسابات محددة مسبقا. يتم توفير جدول البيانات هذا لتسهيل التحليل. يمكن نسخ قيم الشدة التي تم الحصول عليها باستخدام TrackMate ولصقها مباشرة في جدول البيانات للحصول على قيم الكثافة النووية النسبية الطبيعية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S2: مثال على النتائج المتوقعة لحالة التحكم في تحليل LEXY. يمثل جدول البيانات مثالا على القيم التي تم الحصول عليها لحالة التحكم في خط خلية LEXY المستقرة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما هو مذكور في البروتوكول ، فإن إنشاء خطوط خلوية مستقرة يحسن بشكل كبير من جودة التحليلات. أولا ، يؤدي وجود 100٪ من الخلايا التي تعبر عن المجسات إلى زيادة عدد النوى التي يتم تتبعها وتحليلها ، مما يعزز متانة التحليلات. ثانيا ، يقلل من موت الخلايا الناجم عن الإفراط في التعبير عن المجسات وسمية كواشف التعدي المستخدمة. وأخيرا ، يقلل من عدم التجانس القوي لإشارات الفلورسنت بين الخلايا. هذه المعلمة ذات أهمية لأن الإشارة المشبعة لن تسمح بالكشف الصحيح عن تغير الشدة بعد الإضاءة. وينطبق نفس الاستنتاج على الإشارات الضعيفة، التي قد تؤدي إلى تبييض أو عدم السماح بتحديد الاختلافات. لذلك ، نوصي أولا باختبار المجسات عن طريق التعدي للتأكد من أنها تعمل بشكل صحيح ، وإعداد معلمات الاستحواذ ، ثم إنشاء خطوط خلوية مستقرة بسرعة. لقد أنشأنا نواقل الفيروسات العدسية لكل من مجسات LEXY و LINuS ، والتي تتوفر للمشاركة عند الطلب ، بالإضافة إلى خطوط NIH / 3T3 LEXY أو LINuS المستقرة التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الفيروسات العدسية.

إذا تم نقل المجسات أو إذا كانت الخلايا متناثرة ، فمن المحتمل أن تقلل المعلمات المقترحة من عدد المسارات المكتشفة ، وستكون التحليلات أقل قوة. إذا كانت هذه هي الحالة ، فيمكن للمستخدمين أن يكونوا أكثر تساهلا مع البقع المحذوفة في التتبع عن طريق تقليل عدد البقع في المسارات (نقترح الاحتفاظ ب 45 نقطة على الأقل من أصل 50 نقطة). تحذير: إذا تم تقليل هذا الفلتر ، فيجب ضبط ملف Excel المقدم (الجدول التكميلي S1) يدويا: في الواقع ، لن تأخذ القيم الملصقة من CSV المستوردة في الاعتبار الفجوات. يحتاج المستخدم إلى العثور على مكان البقع المفقودة باستخدام رقم TrackID وربطها برقم النواة ، والذي عادة ما يستغرق بضع جولات نسخ ولصق.

من المعلمات الحاسمة لضمان نجاح التجربة إبقاء الخلايا في الظلام. نظرا لأن المجسات تتفاعل مع الضوء الأزرق ، يجب على المستخدمين ضمان نقل الخلايا في الظلام لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستحواذ. يكفي وجود صندوق صغير مغلق أو استخدام الألمنيوم لتغطية الطبق. وبالمثل ، من الضروري توخي الحذر الشديد لاستخدام ضوء mCherry فقط للبحث عن الخلايا في المجهر ، لأن الإضاءة بالضوء الأزرق تنشط الخلايا. إذا حدثت إضاءة نهائية تحت المجهر ، فابحث عن حقل بعيد آخر للاستحواذ. سيساعد رسم ملف تعريف المحور Z في الخطوة 3.6 في معرفة ما إذا كانت الخلايا قد تأثرت بإضاءة ، وما إذا كان المنحنى يتناقص بدلا من أن يكون هضبة.

تم إعداد تسلسل التصوير ليتكون من ثلاث مراحل. أولا ، المرحلة المستقرة ، لتقييم التبييض المحتمل ولكن أيضا للتأكد من أن توطين LEXY ثابت دون تنشيط (1). ثانيا ، مرحلة التنشيط ، التي تتكون من جولات من إضاءة الضوء الأزرق النابض ، للحث على انتقال LEXY من النواة إلى العصارة الخلوية (2). أخيرا ، مرحلة الاسترداد الاختيارية ، حيث تعود الإشارة تدريجيا إلى موقعها الأولي في النواة (3).

يمكن أن يكون التسلسل الموصوف لعمليات الاستحواذ خاصا بنوع^{الخلية 19}^،²⁰. بالنسبة للتجربة الأولى ، يجب على المستخدم اختبار وتعديل طاقة الليزر وتوقيته لرؤية النظام ينتقل تدريجيا بين النواة والعصارة الخلوية. من المهم أن قوة الليزر القوية جدا ، مثل التوقف المؤقت القصير جدا ، قد تمنع رؤية الانتقال التدريجي ، ولكن بدلا من ذلك انخفاض / تخصيب وحشي (اعتمادا على المسبار المستخدم) لشدة mCherry بعد الإضاءة.

إذا لم يؤد تحسين التسلسل إلى حل المشكلة ، فمن المحتمل أن NES و / أو NLS غير مناسبين لنوع الخلية المستخدم. يمكن للمستخدمين الرجوع إلى المادة⁸ من طريقة LINuS لهندسة المجسات وتعديلها. يمكن للمستخدمين أيضا الرجوع إلى هذه المقالة لتصوير LINuS باستخدام مجهر epifluorescence.

يعد تجزئة النوى خطوة حاسمة في التحليل. يجب استخدام علامة نووية قوية وموثوقة لتصوير الخلايا الحية للمجسات. نظرا لأن الإضاءة بالضوء الأزرق تنشط انتقال المسبار ، ولأن المجسات تتم مراقبتها باستخدام بروتين الفلورسنت mCherry ، يجب أن تكون هذه العلامة مرئية في الطيف الأحمر البعيد أو قريبة. في حالتنا ، نستخدم SiR-DNA الذي يلطخ الخلايا خلال 1 إلى ~ 24 ساعة من الحضانة ، ولكن استخدام SPY-DNA 650 يعد أيضا خيارا (انظر جدول المواد للحصول على مراجع).

أخيرا ، إذا أثبت التجزئة مع StarDist جنبا إلى جنب مع التتبع المصفى ل TrackMate كفاءته ، فمن المهم ملاحظة أنه يجب على المستخدم دائما التحقق بصريا من نتائج التجزئة والقياس الكمي. قد يتم تضمين خلية منقسمة أو محتضرة في القياس الكمي ، في حين لا ينبغي ذلك. لتقليل مخاطر تحليل مثل هذه الأحداث ، تنسب ورقة Excel المقدمة رمز لون إلى الكثافة النووية النسبية (أزرق = قيم منخفضة ، أحمر = قيم عالية). من خلال فحص الألوان قبل رسم القيم في GraphPad Prism ، يجب أن يكون المستخدم قادرا على ملاحظة أي قيم غير عادية. على سبيل المثال ، يجب أن تختلف الشدة النووية النسبية ل LEXY من عالية (حمراء ، كميات قوية من المسبار في النوى) أثناء المرحلة المستقرة إلى منخفضة (أزرق ، كميات مخفضة من المسبار في النوى) في نهاية مرحلة الإضاءة ، قبل العودة إلى القيم العالية (الأحمر) ، في مرحلة الاسترداد (كما هو موضح في الجدول التكميلي S2).

يقدم هذا البروتوكول مزايا مختلفة مقارنة بالطرق المقترحة^{سابقا 5}^،⁶. يسهل خط الأنابيب شبه الأوتوماتيكي تحليل النقل النووي LEXY و LINuS ، ويوفر دقة أكبر من القياس الكمي اليدوي المقترح^{سابقا 5}^،⁶. سيمكن استخدام بروتوكولنا المبتدئين في هذا المجال من إجراء تحليلات فعالة ، ولكنه سيوفر أيضا أداة جديدة للمستخدمين ذوي الخبرة ، الذين سيحتاجون إلى واجهة وصول مفتوحة واحدة فقط لإجراء تحليلات شبه آلية لنقل النواة النواة إلى النواة.

يمكن استخدام هذه الطريقة لتطبيقات أخرى من دراسة معدل النقل النووي للسيتوبلازمات العالمي في خطوط خلايا NIH3T3. في الواقع ، من خلال بعض خطوات التحسين ، يمكن تكييفه لدراسة معدل نقل المسبار في أنواع مختلفة من الخلايا أو^{الحية 8}. علاوة على ذلك ، من خلال دمج بروتين ذي أهمية إما ل LEXY أو LINuS ، من الممكن أيضا دراسة معدل نقله أو التأثيرات النهائية لانتقاله الناجم عن الضوء داخل أو خارج النواة. على سبيل المثال ، من الممكن عزل بروتين في السيتوبلازم باستخدام LEXY ، أو فرض توطينه في النواة باستخدام LINuS⁵^،⁶^،²¹^،²²^،²³. أخيرا ، يمكن أيضا توسيع نطاق التحليلات الموصوفة لتشمل تطبيقات أكثر من LEXY و LINuS ، لتتبع أي إشارة تنتقل بين المقصورات تحت الخلوية التي يمكن تقسيمها.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نقدر منشأة التصوير بالرنين المغناطيسي ، وهي عضو في البنية التحتية الوطنية France-BioImaging (https://ror.org/01y7vt929) ، بدعم من الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN) ، وخاصة ماري بيير بلانشارد وخوليو ماتيوس لانجيراك وبابتيست مونتيروسو لمساعدتهم في إعدادات المجهر وتحليلات فيجي. نحن ممتنون لجميع أعضاء مختبر بومنديل على نصائحهم ومناقشاتهم المثمرة ، ولا سيما باريسا نوباري لمساعدتها في بدء المشروع. نشكر جوي دوفورد على التدقيق اللغوي للمخطوطة.

يتم دعم العمل في مجموعة CB من قبل المركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS) ، والمعهد الوطني للسرطان (المعهد الوطني الفرنسي للسرطان) / Canceropole Grand Sud-Ouest (Grant Emergence 2023 E07) ، والوكالة الوطنية للبحوث (ANR-23-TERC-0015-01 و ANR-21-CE12-0039) ، والمعهد الوطني للسرطان (Grant INCa PLBIO23-207-2023-180) وجامعة مونبلييه (برنامج I-SITE، فرنسا 2030 ، مشروع NAChO ، مشروع ChOICe).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكولاجين	سيجما ألدريتش	08-115
المجهر متحد البؤر	لايكا	SP8
دي إم إيه إم	جيبكو	31966021
إكسل	مايكروسوفت
FBS	سيجما ألدريتش	إف 7524
فيبرونيكتين	سيجما ألدريتش	إف 1141
برنامج فيجي	فيجي		ImageJ 2.16.0 / 1،54p ؛ Java1.8.0_322
أطباق الفلور	دوتشر	FD3510-100	البديل: غرفة Attofluor (Invitrogen #A7816)
GraphPad بريزم 10.4.1	GraphPad Software، Inc.
إمبورتازول	سيجما ألدريتش	SML0341
اللبتومايسين ب	سيجما ألدريتش	L2913
ليكسي البلازميد	أدجين	72655	بي دي ان 122
بلازميد LINuS	أدجين	61347	بي دي إن 77
بنسلين ستربتومايسين	جيبكو	15140-122
DMEM خالي من الفينول الأحمر	جيبكو	21063-029
SiR-DNA	سبيروكروم	SC007	البديل: SPY-DNA650 (سبيروكروم #SC501)
البرنامج المساعد Stardist 2D	ستارديست		StarDist_0.3.0
البرنامج المساعد TrackMate	تراك ميت		تراك ميت - 7.14.0

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).
Kelley, J. B., Paschal, B. M. Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport. Methods. 157, 106-114 (2019).
Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).
Beyer, H. M., et al. Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
Niopek, D., et al. Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells. Nat Commun. 5, 4404(2014).
Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein export. Nat Commun. 7, 10624(2016).
Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2. J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).
Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS). Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).
Lataster, L., et al. Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21. Biology. 12 (9), 1194(2023).
Forlani, G., et al. Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells. ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).
Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins. Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).
Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).
Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport. J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).
Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).
Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nat Commun. 6, 8497(2015).
Kudo, N., et al. Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).
Soderholm, J. F., et al. Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β. ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).
Henderson, B. R., Eleftheriou, A. A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals. Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).
Lu, J., et al. Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus. Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).
Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), dev175067(2019).
Kögler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
Zhang, W., et al. Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9. Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Live Cell Imaging LEXY Probe LINuS Probe Nuclear Export Nuclear Localization Lentiviral Vectors FIJI Software

استخدام أدوات علم الوراثة البصرية LEXY و LINuS وتحليل الصور الآلي لتحديد ديناميكيات النقل النووي للسيتوبلازمات في الخلايا الحية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة