منهجية دراسة التعلم والذاكرة في الفئران اليافعة باستخدام تخدير سيفوفلوران لتقييم تعبير p-CREB و c-fos في الحصين

Summary

تبحث هذه الدراسة في كيفية إضعاف سيفوفلوران للاحتفاظ بالذاكرة وتقليل تعبير p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية الحصين عبر مسار NMDAR / p-CREB / c-fos في الفئران الأحداث. تظهر النتائج أن سيفوفلوران يسبب عجزا في الذاكرة على المدى القصير ويقلل من تنظيم علامات اللدونة المشبكية ، مع تأثيرات قابلة للعكس بعد 3 أيام ، بغض النظر عن تردد الجرعات.

Abstract

تواجه دراسة الإعاقات المعرفية أثناء نمو الدماغ تحديات بسبب الطبيعة الديناميكية للنمو العصبي والقيود المنهجية والحواجز السياقية. بحثت هذه الدراسة في نهج منهجي متكامل لدراسة الإعاقات المعرفية في الدماغ النامي الناجمة عن سيفوفلوران بناء على الذاكرة وتعبير p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية الحصينية من خلال مسار إشارات NMDAR / p-CREB / c-fos في الفئران الأحداث. تم تقسيم أربعة وستون من ذكور الفئران SD البالغة من العمر 21 يوما (وزن الجسم <80 جم) إلى خمس مجموعات: طبيعي (ن = 8) ، 60٪ O₂ (ن = 16) ، تدريب زائف (ن = 8) ، جرعة واحدة من سيفوفلوران (ن = 16) ، وجرعات متعددة من سيفوفلوران (ن = 16). تم تجميع مجموعتي سيفوفلوران الفرعيتين إلى تضحية يوم واحد (المجموعتين sev1a و sev1b) و 30 يوما (المجموعتان sev30a و sev30b) بعد التدريب (ن = 8 / مجموعة فرعية). تم التضحية بجميع الفئران الأخرى 1 ساعة بعد التدريب. تم استخدام اختبار Y-maze لتقييم التعلم والاحتفاظ بالذاكرة. تم استخدام الكيمياء المناعية لتحديد عدد الخلايا العصبية الإيجابية p-CREB و c-fos في عينات الحصين. بالمقارنة مع مجموعة 60٪ O₂ (الاحتفاظ بالذاكرة بنسبة 86.33٪ ± 17.52٪) ، أظهرت ذاكرة الفئران في مجموعات sev1a و sev1b انخفاضا كبيرا (sev1a: 44.29٪ ± 11.26٪ ؛ sev1b: 62.42٪ ± 7.27٪ ؛ الكل P<0.05) ، بينما لم تظهر مجموعات sev1b و sev30b فروقا ذات دلالة إحصائية (sev30a: 84.41٪ ± 14.15٪ ؛ sev30b: 85.21٪ ± 11.61٪ ؛ الكل P>0.05). بالمقارنة مع مجموعة 60٪ O₂ (c-fos: 92.83 ± 7.88 ؛ p-CREB: 72.22 ± 8.89) ، انخفض التعبير عن p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية للحصين في مجموعة sev1a (c-fos: 23.13 ± 3.28 ؛ p-CREB: 22.88 ± 5.18) ومجموعة sev30 (c-fos: 23.22 ± 3.13 ؛ p-CREB: 25.58 ± 2.26) (الكل P<0.05) ، بينما لم تظهر مجموعات sev30a و sev30b فروقا ذات دلالة إحصائية (جميع P>0.05). سيفوفلوران له تأثير محفز سلبي قصير المدى على قدرة الحفاظ على الذاكرة للفئران الصغيرة دون تأثير يعتمد على تردد الجرعات. يقلل سيفوفلوران من التعبير عن p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية الحصينية للفئران الأحداث.

Introduction

تواجه دراسة الإعاقات المعرفية أثناء نمو الدماغ تحديات كبيرة بسبب الطبيعة الديناميكية للنمو العصبي والقيود المنهجية والحواجز السياقية. ينطوي نمو الدماغ على تغييرات سريعة وغير خطية ، مما يعقد تحديد الضعف أثناء النوافذ^{الحرجة 1،2}. في البيئات منخفضة الموارد ، تعيق الحواجز مثل محو أمية مقدمي الرعاية ، والتنوع اللغوي ، والوصول المحدود إلى الأدوات المتخصصة (مثل التصوير بالرنين المغناطيسي) الفحص المبكر¹. التباين الفردي في نضوج الدماغ يجعل من الصعب التمييز بين الانحرافات المرضية والتنمية النموذجية^2،3. تظهر حالات مثل متلازمة داون تطورا قشريا متغيرا ، لكن أحجام العينات الصغيرة والبيانات النسيجية النادرة تحد من الرؤى الميكانيكية⁴. غالبا ما تتزامن اضطرابات النمو العصبي (مثل ASD ، اضطراب فرط الحركة ونقص الانتباه) مع القلق أو الاكتئاب ، مما يؤدي إلى إرباك التقييمات المعرفية⁵. يقيد العجز الحاد في الاتصال لدى بعض السكان استخدام الاختبارات الموحدة⁶. تؤدي هذه الميزات إلى العديد من مشكلات تصميم البحوث. في الواقع ، تستخدم معظم الدراسات تصميمات مقطعية ، وتفشل في نمذجة التغيير داخل الفرد بمرور الوقت. هناك اعتماد مفرط على السكان الغربيين المتعلمين (عينات "غريبة") ⁷. تعاني أبحاث متلازمة داون من عينات دماغية صغيرة بعد الوفاة وضوابط غير كافية متطابقة مع العمر⁴. تكافح أدوات التقييم اللحظي البيئي لحساب المتغيرات السياقية التي تؤثر على الأداء المعرفي اليومي⁵.

تشمل أهم الوظائف في الدماغ الحيواني والإنسان التعلم والذاكرة ، والتي تعتبر أساسية للتنمية البشرية والحياة بشكل عام⁸. دماغ الرضع في مرحلة النمو وعرضة لعوامل خارجية مثل الأدوية والتخدير^9،10. يعد الضرر الذي تسببه التخدير لوظيفة ذاكرة الرضع موضوعا بحثيا سريريا مهما ويمكن أن يؤخر العلاجات المثلى لمرضى الأطفال بسبب عدم القدرة على إجراء التخدير¹¹. قد يكون للاختلالات المعرفية المرتبطة بالتخدير (أو الخلل المعرفي بعد الجراحة ، POCD) عواقب طويلة المدى على الرضع¹². يمكن أن يؤثر استنشاق سيفوفلوران على وظائف الذاكرة عند الرضع^13،14 ، لكن التخدير التقليدي يعتقد أن تلف الدماغ عند الرضع ناتج بشكل أساسي عن نقص الأكسجة في الدماغ أثناء التخدير ، خاصة في التخدير العام¹⁰. لذلك ، طالما لا يوجد نقص أكسجة قصير الأمد أو طويل الأمد في الدماغ ، يجب تقليل خطر إصابة الجهاز العصبي المركزي عند الرضع¹¹. ومع ذلك ، لا يزال فهم POCD دون المستوى الأمثل. سيحتاج الرضع الذين يحتاجون إلى جراحة إلى تخدير ، ويمكن أن تساعد المعرفة الأفضل بالمسارات المعنية في تصميم استراتيجيات تخدير تقلل من خطر الإصابة باضطراب الووسمة المحيطية.

كشفت دراسة شملت المرضى البالغين الأكبر سنا الذين خضعوا لعمليات جراحية غير قلبية أن ما يقرب من 25٪ من المرضى عانوا من اضطراب الوسواس الوسوحي في غضون أسبوع واحد بعد الجراحة ، وانخفضت النسبة إلى أقل من 10٪ بعد 3 أشهر ، بينما أظهرت المجموعة الضابطة معدلات اضطراب الوسواس الوسوفوري بنسبة 3.4٪ و 2.8٪ ¹⁵. أشارت الدراسة أيضا إلى أن معظم حالات اضطراب الوسام الوسواني القهري كانت قابلة للعكس ، مع عدد قليل فقط من المرضى الذين يعانون من اضطراب الوسم المطول أو الدائم¹⁵. في الجهاز العصبي المركزي ، الغلوتامات هي الأحماض الأمينية الضادات الأكثر شيوعا¹⁶. مستقبلات N-methyl-D-aspartate (NMDAR) أمر بالغ الأهمية لتحريض وصيانة التقوية طويلة الأجل (LTP) والاكتئاب طويل الأجل (LTD)¹⁷. أظهرت الأبحاث التي أجريت على الفئران أن اللدونة المشبكية المثيرة تؤثر بشكل مباشر على نمو وظائف المخ¹⁸ ، مع تنشيط NMDAR وتدفق الكالسيوم بشكل خاص^19،20. نشاط NMDAR المعزز له آثار كبيرة على تحفيز النمو المشبكي واللدونة^19،20. لذلك ، يجب أن تؤدي درجة أعلى من حصار NMDAR من قبل مضادات NMDAR (على سبيل المثال ، سيفوفلوران) إلى انخفاض قدرات التعلم والذاكرة²¹. في حين أن تأثيرات سيفوفلوران على التعلم والذاكرة في أدمغة البالغين لم تصل إلى نتيجة واضحة^22،23 ، فإن سيفوفلوران يستخدم بشكل شائع للتخدير في جراحات الأطفال¹⁴. بصفته خصما غير تنافسي ل NMDAR ، يمكن أن يؤثر سيفوفلوران بشكل كبير على وظائف التعلم والذاكرة في الدماغ^{11،13،14،23،24}. ومع ذلك ، إلى جانب NMDAR ، تشارك مسارات وبروتينات أخرى في التعلم والذاكرة ، وأصبحت آليات تنظيم الذاكرة التي تتضمن بروتين ربط عنصر استجابة cAMP الفسفرية (p-CREB) والجينات المبكرة الفورية أكثر وضوحا^25،26،27 ، ولكنها لا تزال تتطلب فهما أفضل لتوصيل التخدير الأمثل عند الرضع والأطفال.

بناء على هذه الأطر النظرية ، بحثت الدراسة الحالية في نهج منهجي متكامل يمكن استخدامه لدراسة الإعاقات المعرفية في الدماغ النامي الناجمة عن سيفوفلوران بناء على الذاكرة وتعبير p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية الحصين من خلال مسار إشارات NMDAR / p-CREB / c-fos في الفئران الأحداث. يمكن أن تساعد النتائج في تحسين فهمنا لاضطراب الوساميل السابق وضعف الذاكرة بعد التخدير العام. استخدمت هذه الدراسة فئران عمرها 21 يوما لأنها قد فطامت للتو وكان لها وزن جسم وحالة فسيولوجية موحدة للغاية ، بما يتوافق مع مرحلة المراهقة المبكرة لدى البشر. نظرا لزيادة مرونتها العصبية وضعفها خلال هذه الفترة التنموية الحرجة ، يمكنهم نمذجة الضعف الإدراكي الناجم عن الجراحة أو التخدير بكفاءة على الدماغ غير الناضج^28،29. هذا يجعلها مناسبة بشكل خاص لدراسة المخاطر العصبية المعرفية المرتبطة بجراحة الأطفال واستكشاف استراتيجيات التدخل المحتملة. المتاهة Y هي طريقة شائعة الاستخدام لتقييم التعلم والذاكرة³⁰. يشيع استخدام الكيمياء المناعية لدراسة الخلايا العصبية والبروتينات العصبية المختلفة.

Protocol

تمت مراجعة جميع البروتوكولات في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى شينخوا ، كلية الطب بجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم الموافقة. XHEC-C-2016-023-2).

1. نظرة عامة تجريبية على والتجميع

1. احصل على 64 ، 21 يوما من الفئران الذكور SD (وزن الجسم أقل من 80 جم).
2. قسم الفئران إلى خمس مجموعات: المجموعة العادية (ن = 8) ، 60٪ مجموعة_{O 2} (ن = 16) ، مجموعة تدريب الشام (ن = 8) ، مجموعة سيفوفلوران أحادية الجرعة (ن = 16) ، ومجموعة سيفوفلوران متعددة الجرعات (ن = 16) (انظر الجدول 1).
3. ضع الفئران في منشأة حيوانية عند 20-24 درجة مئوية مع رطوبة 50٪ -60٪ وضوء طبيعي.
4. توفير ما يكفي من الغذاء والماء.
5. تأكد من مراجعة جميع البروتوكولات والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات.
6. قم بإعداد غرفة الاستنشاق (انظر الشكل التكميلي S1 ، المفصل في القسم 2.1).
7. المجموعة العادية
   1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء لمدة ساعتين (مفصل في القسم 2.2).
   2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد يوم واحد من التعرض (مفصل في القسم 4).
   3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).
8. 60٪ مجموعة O₂
   1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء لمدة ساعتين (مفصل في القسم 2.2).
   2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد 30 يوما من التعرض (مفصل في القسم 4).
   3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).
9. مجموعة تدريب شام
   1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء لمدة ساعتين (مفصل في القسم 2.2).
   2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد يوم واحد من التعرض دون تدريب منظم (اختلفت مواقع الأضواء ومناطق الصدمات بشكل عشوائي) ، ويستخدم للتحكم في تأثيرات الضوء والمحفزات الكهربائية على التعلم والذاكرة (مفصل في القسم 4).
   3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).
10. مجموعة سيفوفلوران أحادية الجرعة (مجموعة sev1a)
    1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء + 3٪ سيفوفلوران لمدة 2 ساعة (مفصل في القسم 2.2).
    2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد يوم واحد من التعرض (مفصل في القسم 4).
    3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).
11. مجموعة سيفوفلوران أحادية الجرعة (مجموعة sev30a)
    1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء + 3٪ سيفوفلوران لمدة 2 ساعة (مفصل في القسم 2.2).
    2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد 30 يوما من التعرض (مفصل في القسم 4).
    3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).
12. مجموعة سيفوفلوران بالجرعة المتكررة (مجموعة sev1b)
    1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء + 3٪ سيفوفلوران لمدة ساعتين يوميا، لمدة 7 أيام متتالية (مفصل في القسم 2.2).
    2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد يوم واحد من التعرض (مفصل في القسم 4).
    3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).
13. مجموعة سيفوفلوران الجرعة المتكررة (مجموعة sev30b)
    1. تعريض الفئران ل 60٪ هواء + 3٪ سيفوفلوران لمدة ساعتين يوميا، لمدة 7 أيام متتالية (مفصل في القسم 2.2).
    2. قم بإجراء اختبار متاهة Y بعد 30 يوما من التعرض (مفصل في القسم 4).
    3. اجمع الأنسجة بعد الاختبار السلوكي (بالتفصيل في القسم 5).

2. استنشاق سيفوفلوران

1. إعداد الغرفة (انظر الشكل التكميلي د1)
   1. قم بتوصيل الفتحة الموجودة على يسار الصندوق ب 60٪ O₂/40٪ N₂.
   2. قم بتوصيل إمداد الأكسجين بمبخر سيفوفلوران.
   3. قم بتوصيل الفتحة الموجودة على يمين الصندوق بمحلل الغاز لجهاز التخدير.
   4. قم بتوصيل الفتحة الموجودة أعلى الغرفة بنفايات الغاز.
   5. ضع الجير أسفل الشبكة في الجزء السفلي من الغرفة وأضف الصوف القطني.
   6. ضع الإعداد في غطاء الدخان.
   7. ضع وسادة تسخين أسفل الغرفة.
2. استنشاق
   1. قم بتشغيل مصدر الأكسجين ومبخر سيفوفلوران.
   2. اضبط تدفق الأكسجين على 2 لتر / دقيقة.
   3. عندما يصل تركيز سيفوفلوران إلى 3.0٪ ، حافظ على التدفق لمدة 30 دقيقة لتثبيت الغلاف الجوي في الغرفة.
   4. ضع فأرا على الجانب القطني من الغرفة.
   5. احتفظ بالفئران هناك وفقا للتجميع (انظر الخطوة 1.2).
   6. راقب لون البشرة ومعدل التنفس ومعدل ضربات القلب وقياس التأكسج النبضي.
   7. إزالة الفئران.
   8. دع الفئران تستيقظ بشكل طبيعي.
   9. أعد الفئران إلى قفصها.

3. الكواشف والأدوات التجريبية

1. تحضير الكاشف
   1. تحضير 250 مل من سيفوفلوران المتاح تجاريا لإعطاء التخدير.
   2. قم بإعداد محلول عمل الأجسام المضادة p-CREB عن طريق تخفيف الجسم المضاد للمخزون 1: 350.
   3. قم بإعداد محلول عمل الأجسام المضادة c-fos عن طريق تخفيف الجسم المضاد للمخزون 1: 200.
   4. قم بتجميع المجموعة للتلوين الكيميائي المناعي.
   5. تحضير 4٪ بارافورمالديهايد.
      1. قم بإذابة 40 جم من البارافورمالديهايد القابل للذوبان (PFA) في وعاء زجاجي يحتوي على 500 مل من الماء عالي النقاء ، وقم بتسخينه باستمرار وتقليبه مغناطيسيا إلى 60-65 درجة مئوية حتى يتشكل معلقا حليبيا.
      2. أضف قطرات من 1.0 مول / لتر هيدروكسيد الصوديوم حتى يصبح المحلول واضحا (الرقم الهيدروجيني = 7.0).
      3. أضف ما يقرب من 500 مل من PBS واخلطه جيدا في حمام جليدي أو حمام ماء بارد.
      4. تحقق من الرقم الهيدروجيني مرة أخرى ، وقم بالتصفية ، وقم بعمل حجم يصل إلى 1000 مل.
      5. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
2. إعداد المعدات
   1. ضع المتاهة Y في منطقة الاختبار السلوكي (انظر الشكل التكميلي S2).
   2. معايرة المجهر بنظام تصوير متكامل للتحليل النسيجي.
3. قم بتثبيت الميكروتوم بشفرات جديدة لتقسيم الأنسجة.
4. قم ببرمجة آلة التجفيف باستخدام بروتوكول معالجة الأنسجة القياسي.
5. قم بإعداد آلة التلوين بحمامات التلوين المتسلسلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للماكينة.
6. قم بإعداد جهاز التروية.
   1. استخدم زجاجتين ملحيتين معبأتين بالبلاستيك ، وصفي المحلول الملحي من الفتحة السفلية ، واملأهما ب PBS و 4٪ مثبت بارافورمالديهايد.
   2. قم بتعليق الزجاجات ، وقم بتوصيلها بمجموعات التسريب ، وقم بتوصيل محبس ثلاثي الاتجاهات بنهاية الإبرة السميكة لمجموعة التسريب.

4. Y المتاهة والتعلم / اختبار الذاكرة

1. قم بتجميع متاهة Y
   1. قم بإعداد المتاهة Y بثلاثة أذرع مستطيلة تحمل علامة I و II و III ، متصلة بتقاطع مثلث (انظر الشكل التكميلي S2).
   2. ضع شبكة كهربائية بمسافة 1 سم في قاع المتاهة.
   3. قم بتوصيل شرائط نحاسية رفيعة مقاس 2 سم على جدران المتاهة لمحاكاة المناطق الخطرة وتثبيت مصابيح إشارة التحفيز.
2. تحديد المناطق الخطرة والآمنة
   1. قم بكهربة المناطق الأولى والثانية والثالثة عند 16,000 فولت / م للإشارة إلى المناطق الخطرة (يضيء ضوء الإشارة عند الكهرباء).
   2. ضع علامة على المناطق غير المكهربة بضوء أحمر للإشارة إلى المناطق الآمنة.
   3. حدد التقاطع بين الذراعين على أنه منطقة غير آمنة حيث قد يتعرض الجرذ لصدمة كهربائية.
3. إجراءات التدريب
   1. في بداية التجربة ، ضع في اعتبارك المنطقة التي يقع فيها الجرذ كمنطقة آمنة.
   2. بعد 2-4 دقائق ، قم بتطبيق الكهرباء على المنطقة الآمنة ، وتشجيع الفئران على التحرك نحو المنطقة الآمنة.
   3. إذا انتقل الجرذ من المنطقة الآمنة إلى منطقة خطرة ، فسوف يعود إلى المنطقة الآمنة تحت صدمة كهربائية ، مما يعرض استجابة تجنب سلبية.
4. تطوير استجابة التجنب النشط
   1. بعد جلسات تدريبية متعددة ، قم بتشغيل الضوء في المنطقة الآمنة دون وضع صدمات كهربائية.
   2. راقب حركة الفئران نحو المنطقة الآمنة المضيئة ، مما يشكل منعكس مشروط للتمييز بين الضوء والظلام (استجابة التجنب النشطة).
5. ضع متاهة Y في منطقة هادئة ومضاءة بشكل خافت لتقليل الانحرافات الخارجية.
6. إجراء التدريب يوميا بين الساعة 9:00-11:00 صباحا ومن 2:00 إلى 4:00 مساء.
7. اسمح للفئران بالتحرك بحرية داخل المتاهة لمدة 5 دقائق قبل التجربة لمساعدتها على التكيف مع بيئة المتاهة.
8. ضبط معلمات التحفيز
   1. اضبط جهد التحفيز (16,000 فولت / م) أثناء الاختبار لضمان هروب الفئران في غضون 10 ثوان بعد تلقي صدمة كهربائية.
   2. احتفظ بضوء إشارة المنطقة الآمنة مضاءا لمدة 15 ثانية ، ثم أطفئه.
   3. ابدأ الجولة التالية من تجارب الصدمة بعد فاصل زمني قدره 45 ثانية.
9. تسلسل ضوء الإشارة والاستجابة الصحيحة
   1. اضبط تسلسل تشغيل ضوء الإشارة أثناء تشغيل I → II → III → I ، في دورة.
   2. حدد الاستجابة الصحيحة على أنها هروب الفئران من منطقة البداية مباشرة إلى المنطقة الآمنة المضيئة في غضون 10 ثوان بعد تلقي صدمة كهربائية.
10. ضع في اعتبارك أن الجرذ قد وصل إلى معيار التعلم إذا قام باستجابة الهروب الصحيحة في 8 من أصل 10 تجارب متتالية.
11. سجل أي هروب إلى ذراع بدون ضوء كرد فعل غير صحيح.
12. جلسات تدريب واختبار متعددة
    1. قم بإجراء جلسات تدريب واختبار متعددة لتقييم التعلم والذاكرة.
    2. سجل عدد الردود الصحيحة وغير الصحيحة خلال عدد ثابت من التجارب.
    3. قم بتغيير منطقة البداية لزيادة تعقيد المهمة.
13. قم بتقييم الاحتفاظ بالذاكرة على فترات (على سبيل المثال ، 24 أو 48 ساعة بعد التدريب) لتقييم قدرة الفئران على الاحتفاظ بالذاكرة.

5. الكيمياء المناعية

1. تخدير الفئران
   1. يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق بنسبة 10٪ هيدرات الكلورال (0.4 مل/100 جم) بعد ساعة واحدة من التدريب لتخدير الفئران. تخلص من محلول هيدرات الكلورال وفقا للوائح المحلية.
   2. إجراء بضع الصدر لتعريض القلب بالكامل³¹.
2. بيرفيوز الفئران المخدرة بمحلول فسيولوجي
   1. أدخل إبرة تحتوي على PBS في البطين الأيسر في اتجاه الشريان الأورطي ، وقم بتأمين الإبرة بملقط مرقئ ، واقطع على الفور الأذن اليمنى للفأر لإطلاق الدم الوريدي.
   2. حقن PBS بسرعة حتى تصبح النفايات السائلة صافية ويظهر الكبد والرئتان بيضاء.
   3. اتبع ذلك بتسريب سريع ثم بطيء بمقدار 500 مل من محلول الفورمالين بنسبة 10٪ حتى يتصلب جسم ، مما يحقق تثبيت الفورمالين.
   4. تخلص من محلول الفورمالين وفقا للوائح المحلية.
3. إزالة الدماغ
   1. افتح الجمجمة^{بسرعة 32}.
   2. قم بإزالة الدماغ بالكامل عن طريق رفعه برفق من الجمجمة وقطع الأوعية الدموية والحبل الشوكي في القاعدة ، دون الإضرار بنصفي الكرة الأرضية (كما هو موضح في الشكل التكميلي S3).
4. تشريح الحصين
   1. تشريح الحصين الثنائي.
      1. في الثقبة القذالية للفأر ، اقطع الدماغ بأكمله بالمقص.
      2. أدخل المقص بعناية قطريا في الثقبة العظمية لقطع العظم الجداري.
      3. افصل جانبي العظم الجداري باستخدام ملقط مرقئ.
      4. استخدم المقص لقطع العصب البصري من جانب واحد والتحقيق وصولا إلى قاعدة الجمجمة.
   2. ضع الحصين في محلول فورمالين 10٪ لمدة 12 ساعة.
   3. اغمر العينة في الفورمالين الذي يحتوي على تدرج من السكروز (10٪ ، 20٪ ، 30٪).
   4. يحفظ طوال الليل عند 4 درجات مئوية حتى تغرق أنسجة العينة في القاع.
5. تضمين العينة وتقسيمها
   1. قم بتضمين العينة في البارافين. تخلص من محلول الفورمالين وفقا للوائح المحلية.
   2. قسم العينة المدمجة إلى 4 ميكرومتر.
6. إزالة البارارافين وإعادة ترطيب الأقسام
   1. انقع الأقسام في 50 مل من الزيلين ثلاث مرات لإزالة البارافين ، في كل مرة لمدة 15 دقيقة.
   2. اغمر بالتتابع في 50 مل من 100٪ و 90٪ و 70٪ و 50٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل منهما.
   3. اشطف ثلاث مرات ب 50 مل من 0.01 ملي PBS لمدة 3 دقائق لكل منهما.
7. استرجاع المستضد
   1. ضع الأقسام في 50 مل من المخزن المؤقت للسترات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 6.0).
   2. سخني الأقسام في قدر ضغط من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى 120 درجة مئوية. ضع الأقسام على رف مغمور بالكامل في المخزن المؤقت. أغلق الطباخ وقم بتسخينه واحتفظ به تحت ضغط عال لمدة 3 دقائق.
   3. ارفعي قدر الطهي عن النار واتركيه ليبرد بشكل طبيعي في درجة حرارة الغرفة قبل فتح الغطاء.
   4. اشطف الأقسام في PBS (درجة الحموضة 7.2) لمدة دقيقتين ، كرر 3 مرات.
   5. ضع ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من 3٪ H₂O₂ لتغطية الجزء على الشريحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق للتخلص من نشاط البيروكسيديز الذاتي.
   6. اشطفيه ب PBS لمدة 2 دقيقة ، 3 مرات.
8. حضانة الأجسام المضادة الأولية
   1. أضف 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية (مخففة 1: 150 في 0.01 مول / لتر PBS) إلى الأقسام.
   2. احتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
9. حضانة الأجسام المضادة الثانوية
   1. اشطف الأقسام في PBS لمدة 3 دقائق و 3 مرات.
   2. احتضان الأقسام بحوالي 100-200 ميكرولتر من مساعد البوليمر لتغطية القسم الموجود على الشريحة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   3. اشطف الأقسام في 0.1 مول / لتر PBS لمدة دقيقتين ، 3 مرات.
   4. أضف ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من IgG المضاد للفأر / الأرانب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   5. اشطف الأقسام في PBS لمدة 3 دقائق و 3 مرات.
10. تطوير اللون
    1. أضف ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من محلول ديامينوبنزيدين (DAB) (يكفي لتغطية القسم الموجود على الشريحة) لتطوير اللون.
    2. دعها تتفاعل لمدة 3 دقائق تقريبا.
11. التلطيخ والتركيب
    1. قم بإجراء التلوين المضاد عن طريق إضافة ما يقرب من 100-200 ميكرولتر من الهيماتوكسيلين بالاتجاه المتساقط لتغطية القسم الموجود على كل شريحة بالكامل.
12. تجفيف وتركيب الأقسام
    1. قم بتجفيف الأقسام في 50 مل من 50٪ و 70٪ و 90٪ و 100٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق لكل منها ، متبوعا ب 50 مل من الزيلين لمدة 10 دقائق.
    2. مسح الأقسام وتركيبها باستخدام الإجراءات القياسية.
13. الفحص المجهري
    1. عد عدد الخلايا العصبية الإيجابية p-CREB- و c-fos في الحصين لكل مجموعة^33،34.
    2. افحص الأقسام تحت المجهر بتكبير 400x.
    3. سجل متوسط عدد الخلايا العصبية الموجبة في كل شريحة ، بناء على التهم من ثلاثة أقسام لكل دون تداخل.
       ملاحظة: تم تجميع جميع البيانات في جدول بيانات كمبيوتر. أجريت جميع التحليلات باستخدام برنامج إحصائي. تم تقديم النتائج كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) وتم تحليلها باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبارات SNK-q و Dunnett T3 اللاحقة³⁵. يستخدم اختبار SNK-q بشكل شائع للدراسات الاستكشافية وهو مناسب للمقارنات الزوجية بين وسائل العينات المتعددة. لا يعتمد على فرضيات محددة مسبقا ، مما يجعله مثاليا لمقارنة جميع وسائل المجموعة³⁶. يستخدم اختبار Dunnett T3 عادة للدراسات التأكيدية ذات الفرضيات المحددة مسبقا. إنها مناسبة لمقارنة مجموعات العلاج المتعددة مع مجموعة التحكم أو لمقارنة الوسائل ذات الأهمية المهنية الخاصة^35،37. عندما كانت القيمة P لاختبار ANOVA ≤ 0.05 ، تم إجراء الاختبارات اللاحقة الزوجية لتحديد المجموعات التي كانت مختلفة بشكل كبير عن المجموعات الأخرى. اعتبرت قيم P على الوجهين < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

Results

باستخدام بيانات من هذه الدراسة كأمثلة توضيحية ، عرضنا أنواع النتائج التي يمكن إنشاؤها باستخدام هذا الإطار المنهجي ، بما في ذلك صور التلوين المناعي التمثيلية بالإضافة إلى البيانات السلوكية والجزيئية من مجموعات مختلفة. ينصب التركيز على تقديم النتائج النموذجية أو المتوقعة الناتجة عن هذا النهج ، بدلا من تقديم تفسير لأهميتها البيولوجية.

نتائج اختبار التعلم والذاكرة لكل مجموعة من الفئران
تمت مقارنة المجموعات التجريبية مع مجموعة 60٪ O₂ . ذاكرة الفئران في مجموعة سيفوفلور...

Discussion

بحثت هذه الدراسة في كيفية تأثير سيفوفلوران على الذاكرة وتعديل تعبير p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية الحصينية من خلال مسار إشارات NMDAR / p-CREB / c-fos في الفئران الأحداث. تشير النتائج إلى أن سيفوفلوران كان له تأثير محفز سلبي قصير المدى (ساعة واحدة بعد التدريب ، وليس بعد 3 أيام) على قدرة الحفاظ على الذاكرة للفئران اليافعة ، دون تأثير بناء على تكرار الجرعات (جرعة واحدة أو سبع جرعات على مدى 7 أيام). قلل سيفوفلوران بشكل كبير من التعبير عن p-CREB و c-fos في الخلايا العصبية الحصينية للفئران...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوية>تجاربية< / قوية>
Sprague-Dawley (SD) الفئران	مختبرات نهر تشارلز (بكين ، الصين)	غير متاح	21 يوما ، ذكر
طعام الفئران القياسي	كياو شيلي علف (بكين ، الصين)	غير متاح	النظام الغذائي القياسي لحيوانات المختبر
<قوية> مواد كيميائية وكواشف
هيدرات الكلورال	كاشف سينوفارم الكيميائي (شنغهاي ، الصين)	80113818	مخدر للتروية الطرفية
عازلة السترات (10x)	ZSGB-BIO (بيجين، الصين)	زد لي -9064	محلول استرجاع المستضد ، درجة الحموضة 6.0
الإيثانول (100٪)	كاشف سينوفارم الكيميائي (شنغهاي ، الصين)	100092683	عامل الجفاف لعلم الأنسجة
محلول الهيماتوكسيلين للبقع	شركة باسو للتشخيص (تشوهاي ، الصين)	بكالوريوس -4041	Counterstain ل IHC
بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)	كاشف سينوفارم الكيميائي (شنغهاي ، الصين)	10011218	محلول 3٪ لمنع البيروكسيديز الذاتية
بلسم محايد	Solarbio (بكين ، الصين)	جي 8590	وسيط تركيب للشرائح
النيتروجين (N2)	شركة شنغهاي للغاز الطبي (شنغهاي ، الصين)	غير متاح	نقاء عالي ، لخليط الغاز
الأكسجين (O2)	شركة شنغهاي للغاز الطبي (شنغهاي ، الصين)	غير متاح	الصف الطبي ، لخليط الغاز
بارافين	Leica Biosystems (نوسلوخ، ألمانيا)	39601006	وسط تضمين الأنسجة
بارافورمالديهايد (PFA)	سيجما ألدريتش (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)	158127	مثبت لتروية الأنسجة وتثبيتها
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	جيبكو (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)	70011044	محلول مخزون 10x ، درجة الحموضة 7.4
سيفوفلوران	شركة AbbVie Inc. (شمال شيكاغو ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية)	غير متاح	عامل تخدير استنشاق
الصودا لايم	دبليو آر جريس وشركاه (كولومبيا ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية)	22-01-0010	ثاني أكسيد الكربون 2< / sub> ماصة لغرفة الاستنشاق
هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)	كاشف سينوفارم الكيميائي (شنغهاي ، الصين)	10019818	تستخدم لتعديل الأس الهيدروجيني لمحلول PFA
سكروز	سانغون للتكنولوجيا الحيوية (شنغهاي ، الصين)	A502693	تستخدم للحماية بالتبريد لأنسجة المخ
الزيلين	كاشف سينوفارم الكيميائي (شنغهاي ، الصين)	10023418	عامل المقاصة للأنسجة
<قوية> الأجسام المضادة والأطقم < / قوية>
الجسم المضاد c-Fos	أبكام (كامبريدج ، المملكة المتحدة)	أب190289	الأرنب المضادة للفئران ، الأجسام المضادة الأولية
طقم DAB Chromogen	ZSGB-BIO (بيجين، الصين)	زد لي -9018	الركيزة لتطوير ألوان HRP
الجسم المضاد p-CREB (Ser133)	تقنية إشارات الخلية (دانفرز ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)	9198	الأرنب المضادة للفئران ، الأجسام المضادة الأولية
طقم الكشف عن البوليمر HRP	ZSGB-BIO (بيجين، الصين)	PV-9000	الأجسام المضادة الثانوية ونظام الكشف عن IHC
<قوية>معدات< / قوية>
آلة التخدير	RWD Life Science (شنتشن ، الصين)	500 راند	لتسليم خليط الغاز المتحكم فيه
معالج المناديل الآلي	Leica Biosystems (نوسلوخ، ألمانيا)	ASP6025	للتجفيف الآلي والمقاصة
Cryostat / Microtome	Leica Biosystems (نوسلوخ، ألمانيا)	سم 1950	لتقسيم أنسجة المخ المجمدة / المضمنة
نظام المجهر	أوليمبوس (طوكيو، اليابان)	بي اكس 53	لتصوير شرائح IHC
مضخة التروية	شركة المضخات الدقيقة الأطول (باودينج ، الصين)	BT100-2J	مضخة تمعجية للتروية عبر القلب
مبخر سيفوفلوران	RWD Life Science (شنتشن ، الصين)	R510PS	للتحكم الدقيق في تركيز سيفوفلوران
جهاز Y-Maze	شركة ميد أسوشيتس (سانت ألبانز ، فاتو ، الولايات المتحدة الأمريكية)	MED-VFC-S-Y	مع شبكة كهربائية وأضواء لتجنب نشط
<قوي>برمجيات
GraphPad المنشور	برنامج GraphPad (سان دييغو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)	الإصدار 9	التحليل الإحصائي وتصور البيانات
إيمج جي	المعاهد الوطنية للصحة (بيثيسدا ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية)	الإصدار 1.53	برنامج تحليل الصور لعد الخلايا
مايكروسوفت إكسل	شركة مايكروسوفت (ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكية)	مكتب 365	برنامج جداول البيانات لتجميع البيانات