مقالة منهجية

المجهر التوسعي: تصوير فلوري عالي الدقة باستخدام مجهر تقليدي

DOI:

10.3791/68595

⸱

ديسمبر 19, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكولا مفصلا يجمع بين طرق التثبيت بالتجميد والمجهر التوسعي (Cryo-ExM)، مما يسمح بتصوير عالي الدقة مع حفظ هيكلي متكيف مع عينات بيولوجية متنوعة. يتم تجميد العينات البيولوجية، وتضمينها في بوليمر قابل للانتفاخ، ويتم تفكيكها، وتوسيعها، ووضع علامات مناعية، مما يتيح التصوير بدقة فائقة باستخدام المجاهر الضوئية القياسية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر التوسعي (ExM) هو تقنية مجهر فلورية فائقة الدقة مبتكرة تقوم بتكبير العينات البيولوجية فعليا، مما يتيح التصوير إلى ما بعد حد الحيود باستخدام أنظمة تقليدية مثل المجاهر الكونفوكلية. من خلال تضمين العينات في مصفوفة هيدروجيل قابلة للانتفاخ، يسمح ExM بالتوسع المتساوي الخواص للعينة، مما يعزز الدقة المكانية دون الحاجة إلى معدات نانو متخصصة. تحافظ المتغيرات المتقدمة، مثل المجهر التوسعي فوق البنية (U-ExM)، على التفاصيل الخلوية الدقيقة، بما في ذلك العضيات والتجمعات الجزيئية الكبيرة.

تعتمد ملاحظة البنى أو العضيات الخلوية المحددة بشكل كبير على طريقة التثبيت المطبقة على العينة، لا سيما من خلال استخدام الروابط الكيميائية القائمة على الألديهايد، وترسيب البروتين مع الميثانول البارد. مؤخرا، أتاح دمج التثبيت بالتجميد — وهي تقنية تثبيت ذات معيار ذهبي — مع طريقة U-ExM من ملاحظات نانوية لمجموعة واسعة من العينات البيولوجية، من الخلايا الثديية المزروعة إلى الكائنات الحية الكاملة، في حالتها شبه الأصلية. المجهر التوسعي أداة قوية لدراسة البنى البيولوجية عبر المقاييس، من العضيات المعزولة إلى الأنسجة بأكملها. عند دمجه مع التثبيت بالتجميد، يوفر رؤى غير مسبوقة حول بنية الخلايا والعمليات الديناميكية مع تقليل التشوهات المرتبطة بطرق التثبيت التقليدية. تضع هذه التطورات إكس إم كإطار متعدد الاستخدامات للتصوير البيولوجي عالي الدقة وقريب من السكان الأصليين.

توضح الدراسة الحالية بروتوكولا مفصلا للتثبيت بالتجميد مع مجهر توسعي لعينات من مصادر مختلفة. يسلط هذا البروتوكول الضوء على الخطوات الحاسمة، بما في ذلك تثبيت العينة، وتكوين البوليمر، والتوسع، والتلوين المناعي، والتصوير، ويوفر الإرشادات اللازمة لتطبيق هذه الطريقة في أي مختبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب المجهر دورا حيويا في البحث البيولوجي، حيث يمكننا من تصور البنية الفائقة والتنظيم عبر الأنظمة الحية على نطاق غير مسبوق، من الكائنات الحية الكاملة إلى الجزيئات الفردية. يشمل مجال المجهر نظامين مميزين: المجهر الإلكتروني (EM)، عالي العزم ولكن بقدرة محدودة على وضع علامات محددة، والمجهر الضوئي، الذي يسمح برؤية دقيقة ومحددة للبنية تحت الخلوية ولكن بدقة محدودة بسبب حد الحيود للضوء. على الرغم من أن المجهر الفلوري فائق الدقة (SRM) تطور كطريقة قوية لتصوير الفلورة تحت دقة الحيود للخلايا، إلا أن تصور التفاصيل الفائقة البنية للتجمعات الجزيئية الكبيرة، مثل الكائنات الحية بأكملها، لا يزال تحديا1. علاوة على ذلك، تعتمد تقنيات SRM، التي تحقق دقة تتراوح بين 10 إلى 120 نانومتر، على المجاهر المتقدمة وخوارزميات إعادة بناء الصور وتتطلب خبرة ومجاهر متخصصة، مما يحد من إمكانية الوصول إليها في العديد من مختبرات الأحياء. طريقة فائقة الدقة الناشئة، وهي المجهر التوسعي (ExM)، تغلبت على هذه القيود. تم تطوير ExM في مختبر إدوارد إس. بويدن قبل عقد من الزمن، وهو تقنية مجهر فوتوني مبتكرة تعتبر الآن مجهرية فائقة الدقة تسمح بالتصوير دون الحاجة إلى مجاهر متخصصة2. بدلا من الاعتماد على تقنيات التصوير المتقدمة، يتضمن ExM تضمين عينات بيولوجية في بوليمر قابل للانتفاخ يتمدد بشكل متساوي الاتجاه. يزيد هذا التوسع الفيزيائي من حجم العينة بأربعة أضعاف أو أكثر، مما يعزز الدقة ويتيح الملاحظة باستخدام المجاهر الضوئية التقليدية. تم تطوير بروتوكولات ExM في الأصل على شرائح الدماغ، وقد تطورت لتحسين الدقة وتبسيط الإجراءات. تم تكييف هذه التقنية بنجاح لعدة عينات بيولوجية، بما في ذلك الخلايا حقيقية النواة، والكائنات وحيدة الخلية، والطفيليات، والأنسجة، والكائنات الحية الكاملة، مما يثبت تعدد استخداماتها 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

حاليا، هناك فئتان رئيسيتان من البروتوكولات: ما قبل التوسع 2,16 وبعد التوسع17,18، والتي تشير إلى لحظة تلوين العينة البيولوجية، سواء قبل أو بعد إجراء التوسع. سيركز هذا المقال تحديدا على بروتوكول ما بعد التوسع، حيث يتم إجراء الوسم المناعي بعد إزالة وتوسيع العينة.

في هذا البروتوكول، يتم تثبيت العينات البيولوجية بالتجميد أو الكيميائي وحضانتها بعوامل كيميائية، مما يسمح بتثبيت البروتين على البوليمر المستقبلي. ثم تدمج العينات في بوليمر قابل للانتفاخ يتكون من الأكريلاميد/بيس-أكريلاميد (المستخدم عادة في هلام الرحلان الكهربائي) وأكريلات الصوديوم (الذي يتيح التمدد). إضافة الماء تحفز تمدد الهلام، مما يزيد المسافة بين البروتينات بما يتناسب مع تمدد الهلام. يتم بعد ذلك وسم البروتينات المهمة مباشرة داخل الجل باستخدام أجسام مضادة محددة (الشكل 1).

جميع تقنيات التصوير المذكورة أعلاه، بما في ذلك المجهر الإلكتروني، والمجهر الضوئي، والمجهر فائق الدقة، وExM تتطلب تثبيت بيولوجي للعينات. التثبيت القائم على الألديهيد يخلق ترابطا متبادلا بين البروتينات، مما يحافظ على تنظيم الخلايا أثناء العلاجات اللازمة للمجهر الضوئي أو الإلكتروني. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي التثبيت أيضا إلى تشوهات وتغيرات شكلية في الخلية، والتي قد تكون دقيقة في المجهر الضوئي الكلاسيكي لكنها أصبحت أكثر وضوحا مع تقدم وتطور SRM، مما دفع العلماء لإعادة النظر في عواقب طرق التثبيت19. إحدى الطرق لتجاوز التشويهات المرتبطة بالتثبيت هي استخدام المجهر الحي، الذي يتيح التصور الديناميكي للهياكل الخلوية في حالتها شبه الأصلية. ومع ذلك، فإن المجهر الحي له عدة عيوب، أبرزها الحاجة إلى التعبير الجيني الناقل، الذي قد يؤثر على فسيولوجيا الخلايا ويغير سلوك البروتينات مقارنة بالنظائر الداخلية. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما يقدم المجهر الحي دقة أقل من المجهر الثابت وخيارات وضع العلامات محدودة، حيث يجب أن تكون العلامات الفلورية غير سامة ومستقرة في الظروف الحية، مما يحد من العلامات المتاحة. حقل المجهر الإلكتروني، نظرا لدقته العالية، ساهم بشكل كبير في تطوير طرق مثلى لتثبيت البنى تحت الخلوية أو الجزيئية الكبيرة مع الحفاظ على حالتها الأصلية. قبل عقود، تم تطوير التثبيت بالتجميد من قبل مختبرات دوبوشيه وفرانك وهندرسون، حيث تضمن تثبيت الخلية بسرعة في مياه الجسم الزجاجي وأظهر أنه النهج الوحيد للحفاظ على البنية الفائقة الأصلية20,21. بينما يمكن ملاحظة الجزيئات المنقاة مباشرة في الجليد الزجاجي باستخدام المجهر الإلكتروني التجميد، يجب تضمين الخلايا في الراتنج وتقسيمها قبل الملاحظة. لتثبيت العينات في الحالة الأصلية الأكثر قدرة على الاستقرار، تخضع العينات لاستبدال التجميد. في هذه العملية، عندما تعود جزيئات الجليد إلى حالتها السائلة، يتم استبدالها فورا بالأسيتون، الذي له معامل انتشار أعلى من الماء. أثناء إزالة الماء، قد تتجمع الجزيئات ذات الاهتمام وتنهار، مشابها لما يحدث في تثبيت الربط الكيميائي المتقاطع. للحد من هذا التجمع، يتم إجراء استبدال التجميد عند درجات حرارة منخفضة، مما يقلل التجمع عن طريق زيادة اللزوجة داخل الخلية22. هذا النهج المسيطر عليه يحد من تكوين التجمعات الكبيرة ويحافظ على البنية الفائقة الخلوية أقرب إلى حالتها الأصلية.

في عام 2022، أدى تزايد الأدلة على أن التثبيت الكيميائي يدخل القطع الأثرية، إلى جانب التقدم في مجهر التوسع، إلى تطوير مختبر جيشارد/هاميل لتطوير طريقة تدمج التثبيت بالتجميد مع مجهر التوسع، تعرف باسم 'Cryo-ExM'23. يستفيد هذا النهج من نقاط قوة كلتا التقنيتين من خلال الحفاظ على البنى البيولوجية مع أقل قدر من التشوه. يتم تجميد العينات بالتجمد باستخدام إما التجميد عالي الضغط أو الغمر اليدوي، وكلاهما يتطلب معدات متخصصة شائعة في مختبرات المجهر الإلكتروني أو المنشآت الأساسية.

توضح هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة لإجراء التثبيت بالتجميد يليه مجهر التوسع، وتقدم نتائج ممثلة من نموذجين تجريبيين: الخلايا المزروعة بشريا والطفيلي وحيد الخلية تريبانوزوما بروس، العامل المسبب لمرض النوم. سنركز على التحسينات التي يقدمها التثبيت بالتجميد مقارنة بطرق التثبيت التقليدية، ونسلط الضوء على أكثر الأخطاء والعيوب التركيبية شيوعا المرتبطة بالتقنية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد. تم تعديل هذا البروتوكول، مع تعديلات طفيفة، لمراقبة عمليات خلوية مختلفة في عينات بيولوجية مختلفة (بما في ذلك الخميرة24,25، توكسوبلازما غوندي26، أنواع القريبة27، الطحالب الخضراء28,29، حقيقيات النوى الميكروبية30، بالإضافةإلى عينات الفئران 23,31,32,33 ). لم تذكر هذه الورقة تعديلات لتكييف البروتوكول مع هذه العينات المختلفة، حيث يمكن استرجاعها من المنشورات الأصلية. هنا، تستخدم خلايا RPE1 وTrypanosoma brucei كبدائل لخلايا الثدييات والطفيليات. يركز هذا البروتوكول على خطوات التثبيت والتوسع للعينات البيولوجية؛ لذلك، لا يتم تقديم معلومات حول ثقافة العينة في هذا المقال.

1. تحضير محلول المرق

  1. محلول بولي ليسين
    1. أعد تعليق بولي-إل أو بولي-دي-ليسين هيدروبروميد (جدول المواد) في الماء للحصول على محلول مخزوني من بولي-ليسين بقوة 1 ملغ/مل. تخزين محلول المخزن عند -20 درجة مئوية وتخفيفه في الماء بمقدار 0.2 ملغ/مل لتغطية الغطاء (الجدول 1، جدول المواد).
  2. حل التثبيت
    1. تحضير محلول أكريلاميد/الفورمالديهايد الطازج (تحت الغطاء الكيميائي) بخلط 38 ميكرولتر من الفورمالديهايد (36.5٪-38٪؛ جدول المواد) و50 ميكرولتر من الأكريلاميد (40٪ ، جدول المواد) في 912 ميكرولتر من PBS للحصول على 1 مل من المحلول.
  3. محلول التجيلات بدون APS (المبادر)
    1. جهز محلول مختلط بإضافة 500 ميكرولتر من 38٪ أكريلات الصوديوم (19٪ نهائي)، 250 ميكرولتر من 40٪ أكريلاميد (10٪ نهائي)، 50 ميكرولتر من 2٪ بيس-أكريلاميد (0.1٪ نهائي)، 50 ميكرولتر TEMED (0.5٪ نهائي)، و100 ميكرولتر من 10x PBS (1x نهائي). أليكوت في الحجم مناسب لكمية كحد أقصى من جلين (80-90 ميكرولتر) وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 12 ساعة قبل الاستخدام (انظر الجدول 1 للحفاظ على المدى الطويل).
      ملاحظة: يرجى ملاحظة أن الحجم المشار إليه لتحضير خليط محلول التجلات يحسب للحصول على حجم نهائي 1 مل، لكن الحجم الفعلي للمحلول هو 950 ميكرولتر، حيث تضاف APS، التي تمثل 1/20 من الحجم الكلي لكل منهما، بشكل عفوي. تم تمديد وقت التخزين الأصلي لمحلول التجلي17 بعد أن لاحظنا أنه يمكن حفظه لمدة تصل إلى شهر واحد عند -20 درجة مئوية دون التأثير على صلابة الجل أو كفاءة التمدد.
  4. TEMED وAPS
    1. APS 10٪ بدون تركيز: تخفيف مسحوق APS في الماء، واحتفظ بالحرارة عند -20 درجة مئوية.
    2. TEMED 10٪ v/v: قم بتخفيف TEMED في الماء، وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  5. أكريلات الصوديوم (SA) 38٪
    1. تحضير 38٪ SA من SA المنقي (AK scientific أو Sigma؛ جدول المواد)
      1. أعد تعليق 38 جرام من الصوديوم أكريلات في 100 مل من الماء تحت التحريك المستمر (وهذا مهم). قم بدمج الحمض النووي تدريجيا لتجنب التراكمات وتحريك الخليط طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لضمان إعادة التعليق الكاملة. تأكد من أن المحلول شفاف وعديم اللون أو أصفر قليلا. أليكوت وخزنها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
    2. تحضير 38٪ حمض أكريليك (سيغما؛ جدول المواد)
      1. حضر 90 مل من 38٪ أكريلات الصوديوم عن طريق تحييد حمض الأكريليك باستخدام NaOH تحت غطاء كيميائي.
      2. اخلط 29 مل من الماء مع 25 مل من حمض الأكريليك أثناء التحريك.
        ملاحظة: من هذه الخطوة، يجب تنفيذ التفاعل على الجليد مع تحكم مستمر في الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة لأن التفاعل طارد للحرارة.
      3. أضف 10 نيوتنتن NaOH قطرة قطرة باستخدام ماصة باستور.
        ملاحظة: تأكد من أن درجة الحرارة لا تتجاوز 25 درجة مئوية (إذا تجاوزت، توقف عن إضافة NaOH وانتظر حتى تنخفض درجة الحرارة).
      4. استمر في التحييد حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 7-8 ثم حرك لمدة ساعة على الجليد.
        ملاحظة: إذا قفز الرقم الهيدروجيني فجأة إلى أكثر من 10، أضف حمض الأكريليك حتى ينخفض الرقم الهيدروجيني إلى 7-8.
      5. خزن المحلول في حاوية مغلقة طوال الليل. إذا كان المحلول قد ترسب، استخدم الطرد المركزي بقوة 1000 × جرام لمدة 10 دقائق. اجمع السوبرناتانت، الأليكوت، وخزنها عند -20 درجة مئوية.
  6. حل إزالة الطبعة
    1. TrisBase 1 M: قم بتخفيف 121.14 جرام من TrisBase في 1 لتر من الماء، وضبط الرقم الهيدروجيني مع HCl إلى 9، وتخزينه عند RT.
    2. حاجز إزالة الطبيعة: اخلط 200 ملليمول كبريتات الصوديوم الدوديسيل (SDS)، 200 ملليمول NaCl، 50 ملليمول TrisBase في الماء. للحصول على محلول بسعة 200 مل، أضف 10 مل من Tris-BASE 1 M (pH 9) في 124.9 مل من ddH2O، أضف 57.1 مل من SDS (مخزون 20٪/700 ملم) و8 مل من NaCl (مخزون 5 م) أثناء التحريك. المتجر في RT (الطاولة 1).

2. عملية تثبيت التجميد والتوسع

  1. تحضير العينات والتثبيت بالتجميد
    ملاحظة: هذا البروتوكول محسن للعينات التي تم زراعتها أو تحميلها على أغطية 12 مم. يرجى مراجعة حجم الحل لدعم آخر.
    1. تحضير العينة
      1. ينمو العينة في حالة متكيفة مع العينة البيولوجية، إما مباشرة على أغطية بحجم 12 مم (خلايا ملتصقة في الثدييات) أو في حالة تعليق (T. brucei).
      2. عينة التحميل على غطاء الغطاء (T. brucei) المطلية مسبقا بالبولي-ليسين كما يلي: لفترة وجيزة، حضن غطاء 12 مم في البولي-ليسين (0.2 ملغ/مل) لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية، ثم غسل سريع وجفف بالهواء.
      3. قم بطرد الطفيليات بحرارة 300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). أعد تعليق القرص في PBS مع إضافة 10٪ من وسط الزراعة وحمل على الغطاء قبل 5-10 دقائق من التثبيت بالتجميد.
    2. إعداد الغطس (الشكل 2A-C)
      تحذير: اعمل تحت غطاء كيميائي مع قفازات ومعطف مختبر عند التلاعب بالأسيتون. استخدم معطف المختبر والنظارات الواقية عند معالجة النيتروجين السائل والإيثان السائل.
      1. تحت غطاء كيميائي، املأ أنابيب 5 مل (غطاء واحد/أنبوب) ب 1 مل من الأسيتون الجاف جدا باستخدام حقنة وإبرة لتجنب تلوث الهواء.
        ملاحظة: للحفاظ بشكل أفضل على الغشاء البيولوجي، من الضروري إضافة بارافورمالديهايد (PFA)/جلوتارالديهايد (GA) (0.1/0.02٪) ضرورية. قم بتكييف الأنبوب حسب قطر غطاء الغطاء (الأنابيب > 12 مم لن تناسب أنابيب 5 مل).
      2. جمد الأنابيب في النيتروجين السائل باستخدام رف بلاستيكي أو معدني مقاوم لدرجات الحرارة الباردة للحفاظ على استقامتها.
      3. املأ نصف صندوق البوليسترين (30 سم × 30 سم / جدران بسماكة) بالثلج الجاف.
      4. املأ ديوار نوع فيتروبوت بالنيتروجين السائل حتى يتوقف عن التبخر، وانتظر 10-15 دقيقة لتثبيت درجة الحرارة. يستخدم العنكبوت ضروريا لتسهيل تبريد النظام (الشكل 2B، نجمة). أعد تعبئتها إذا لزم الأمر.
      5. أزل العنكبوت واملأ غرفة الغمر المعدنية بالإيثان السائل.
      6. انتظر 10 دقائق حتى يتوازن الإيثان.
        ملاحظة: أعد تعبئة نظام الغوص بالإيثان السائل أثناء التجربة إذا لزم الأمر (لا تستخدم العنكبوت بعد الآن في هذه المرحلة). الانتقال من الإيثان الغازي إلى الإيثان السائل صعب. استخدام الضغط المناسب أمر بالغ الأهمية لتكوين الإيثان السائل. الضغط العالي يمنع تكوين السائل بسبب تدفق الغاز المستمر داخل الغرفة المعدنية، بينما يشكل الضغط المنخفض الإيثان الصلب داخل الحجرة المعدنية وأنبوب التعبئة. تجنب تكون الجليد أمر ضروري للتجربة. الحفاظ على طرف الحشو عند واجهة السائل/الهواء يساعد في منع تكون الإيثان الصلب.
    3. الغوص (الشكل 2A-C)
      تحذير: استخدم معطف المختبر والنظارات عند التلاعب بالنيتروجين السائل والإيثان السائل.
      1. احصل على غطاء 12 مم مع ملقط رفيع.
      2. نقع أي فائض من الوسط بورق المناديل.
      3. أمسك الغطاء في منتصف المسافة باستخدام الملقط باستخدام حلقة تثبيت مكيفة لمكبس التجميد.
      4. ضع الملقط الذي يحمل غطاء الغطاء في حامل مكبس التجميد. امسح أي فائض من الوسط بورق واتمان.
      5. فعل مكبس التجميد لغرس غطاء الغطاء في محلول الإيثان في الحجرة المعدنية.
      6. انقل غطاء الغطاء بسرعة إلى الأنبوب الذي يحتوي على الأسيتون المجمد (غطاء واحد لكل أنبوب).
        ملاحظة: لا تستخدم نفس الملقط لجمع العينات وللغمر لتجنب التلوث بوسط الزراعة. كن حذرا جدا عند استخدام أغطية > 12 مم (أغطية الغطاء بقطر 15 أو 18 مم تناسب الحامل لكنها قد تكون أصعب في الغمر). خلال هذه الخطوة، يمكن غمر غطاء الغطاء في النيتروجين السائل بعد الغمر لتسهيل النقل إلى إيبندورف مع الحفاظ على العينة مجمدة. عندما يتجمد الأسيتون عند -96 درجة مئوية، يصبح وضع الأغطية على الأسيتون المجمد ضروريا لاستبدال التجميد.
    4. الاستبدال بالتجميد وإعادة الترطيب
      تحذير: اعمل تحت غطاء المحرك عند التلاعب بالعينات أثناء استبدال التجميد. ارتفاع درجة الحرارة يخلق ضغطا داخل الأنبوب، مما قد يؤدي إلى انفجار الأنبوب.
      1. حضن الأنابيب في الثلج الجاف بزاوية ميل (حوالي 45°).
      2. أتحرك طوال الليل على جهاز هزاز مداري. ضع الصندوق المغلق على جهاز هزاز عند 4 درجات مئوية أو RT لترتفع درجة الحرارة من -180 °م إلى -80 °م.
      3. أزل معظم الثلج الجاف من الصندوق (فقط احتفظ بالقليل في قاع الصندوق)، وأطلق الضغط داخل الأنابيب بفتحها وإغلاقها بسرعة، واستمر في تحريك الأنابيب لمدة 45 دقيقة على الهزاز المداري لمواصلة ارتفاع درجة الحرارة من -80 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية.
      4. انقل أغطية الألواح إلى صفيحة ذات 12 بئر (أو أي حاوية مناسبة) تحتوي على محلول إيثانول نقي مبرد مسبقا (100٪). حضانة لمدة 5 دقائق واستمر في إعادة الترطيب التدريجي كما يلي: EtOH 100٪ (5 دقائق) - EtOH 95٪ (3 دقائق) - EtOH 95٪ (3 دقائق) - EtOH 70٪ (3 دقائق) - EtOH 50٪ (3 دقائق) - EtOH 25٪ (3 دقائق) - H2 O 100٪.
      5. انقل الألواح المغلفة في PBS وجهها تحت المجهر (مع خدش السطح برأس) لتكون جميعها متجهة للأعلى.
        ملاحظة: يتم تخزين EtOH بنسبة 100٪ و95٪ عند -20 درجة مئوية، وEtOH 70٪ وEtOH 50٪ عند 4 درجات مئوية، وEtOH 25٪ وDDH2O عند RT لمواصلة رفع درجة الحرارة حتى التيار الدقيق. لوضع العلامات على الأغشية، من الضروري إضافة PFA/GA (0.1٪/0.02٪) في محاليل الأسيتون وإعادة الترطيب باستثناء ddH2O.
  2. التوسع
    1. تثبيت البروتين
      1. حضر محلول طازج بنسبة 1.4٪ فورمالديهايد/2٪ أكريلاميد (FA/AA) في PBS 1x.
      2. ضع أغطية الغطاء في صفيحة بئر 4/12 مملوءة ب 0.5/1 مل من AA/FA.
      3. الحضانة لمدة 3-5 ساعات عند 37 درجة مئوية دون تحريك.
        ملاحظة: يربط الفورمالديهايد مجموعات الأمين الحرة من البروتينات بالأكريلاميد. يساعد فائض الأكريلاميد في الحد من الترابط المتقاطع للبروتين الذي يحثه الفورمالديهايد عادة ويربط البروتينات ببوليمر التمدد المستقبلي. قد تكون هناك حاجة إلى تمديد تدريجي لتثبيت البروتين إلى الليل حسب العينة البيولوجية. على أي حال، لن يؤثر الحضانة الأطول على أي من الخطوات التالية. املأ الآبار الحرة بالماء أو ضعها في غرفة رطبة لتجنب التبخر.
    2. التجلي
      1. إذاب، APS (10٪)، ومحلول التجلات (الصوديوم أكريلات 19٪، أكريلاميد 10٪، بيس-أكريلاميد 0.1٪، TEMED 0.5٪ مخفف ب 10 مرات PBS) على الثلج قبل 10 دقائق من التجليت.
      2. جهز غرفة رطبة بطبقة رقيقة من الأنسجة الرطبة والباراغليم، ثم خزنها عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
      3. ضع الغرفة الرطبة على الثلج.
      4. أخرج الغطاء من محلول تثبيت البروتين وأخرج المحلول الزائد بورق مناديل (مرتين متتاليتين).
      5. أضف APS (تركيز نهائي 0.5٪) إلى محلول التلقطين، واستخدمه الدوامة لمدة 2-3 ثوان، وحمل قطرتين من 35 ميكرولتر على طبقة الباراغليم في الحجرة الرطبة.
      6. غط كل قطرة بغطاء الغطاء الخلوي، حيث تواجه الخلايا محلول التجل.
      7. حضن على الثلج لمدة 5 دقائق للسماح باختراق الجل.
      8. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.
    3. إزالة الطبيعة
      1. قم بتثقيب الجل باستخدام أداة ثقب الخزعة (قطرها 0.4 سم، الشكل 2D) وحرك لمدة 10/15 دقيقة في صفيحة ذات 6 آبار مملوءة ب 1 مل من محلول إزالة الطلاء حتى تنفصل الجل عن الغطاء الداخلي.
      2. انقل الهلام إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل مملوء بمخزن إزالة الطبيعة الطازج.
      3. الحضانة لمدة ساعة ونصف عند 95 درجة مئوية.
      4. انقل الجل إلى DDH2O لمدة 10 دقائق، وكرر العملية 3 مرات لغسل محلول إزالة الطلاء بشكل صحيح.
      5. قس الجل بورق مليمتر أو كالبر لتقييم عامل تمدد الهلام.
      6. انقل الجل إلى PBS لتلطيخ المناعة.
      7. بدلا من ذلك، تخزين الجل في PBS-أزيد 0.02٪ عند 4 درجات مئوية لفترة قصيرة (الجدول 1) أو عند -20°C للتخزين لفترة أطول (الجدول 1). للتخزين الطويل، يجب حضن الجل في عدة حمامات ماء: محلول الجلسرول 50٪ لمدة 2-3 ساعات تحت التحريك ووضعه عند -20 درجة مئوية في حجم كاف من المحلول، يجب تعديله حسب حجم الهلام.
        ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالجل كاملا إذا فضلت (الشكل 2D، E) (الخطوة 2.2.3.1). يمكن جمع ما يصل إلى 5 ثقوب (ما يعادل جل كامل) في أنبوب واحد (الخطوة 2.2.3.2). يجب احترام درجة حرارة ووقت إزالة الطبعة (الخطوة 2.2.3.3). قد تؤدي الحرارة العالية إلى فتح الأنبوب، مما يؤدي إلى تبخر أو طرد الجل في مخزن إزالة الطبيعة. تأكد من استخدام أنابيب قفل آمنة أو لتغطيتها. يجب غسل الجل بعد إزالة الطبيعة في ماء مقطر لأن PBS سيحفز ترسيب SDS، مما يؤثر على كفاءة الغسلات. هذه الخطوة ستؤدي إلى توسع طفيف للجل لا يؤثر على الخطوات التالية من البروتوكول (الخطوة 2.2.3.4). يمكن تخفيف الجلسرول في PBS لتوفير المساحة في حالة الجل الكبير. بالنسبة لمثقب 0.4 مم، من المثالي أن تخزن الجل في صفيحة تحتوي على 12 بئر مملوءة ب 3 مل من الماء: الجلسرول.

3. التلطيع المناعي والتوسع النهائي

  1. غير حوض PBS للحضانة لمدة 15 دقيقة أخرى.
  2. اقطع الجل بالكامل إلى أربع قطع متساوية.
  3. انقل قطع/الثقوب الهلامية إلى حامل متكيف (الشكل 2D، E) وحضن الأجسام المضادة الأولية المخففة في PBS-BSA بنسبة 2٪ لمدة 3 ساعات إلى الليل مع التحريك (انظر الجدول 2 والجدول 3 للحالات التفصيلية).
  4. جل الغسل ثلاث مرات مع PBS+Tween 0.1٪ لمدة 10 دقائق من الحقن مع التحريك.
  5. حضن الهلام إلى أجسام مضادة ثانوية وهويشت في PBS-BSA بنسبة 2٪ لمدة 3 ساعات حتى ليلة واحدة مع التحريك (انظر الجدولين 2 والجدول 3 للحالات التفصيلية).
  6. اغسلي جل 3 مرات مع PBS+Tween 0.1٪ لمدة 10 دقائق من تمارين الحقن مع التحريك.
  7. اختياري: قم بوضع علامات على البروتيوم بالكامل عن طريق حضن الجل باستخدام NHS-ester (انظر الجدول 2 للتفاصيل) في PBS لمدة ساعة ونصف عند RT تحت التحريك، ثم غسل 3 مرات في PBS+Tween 0.1٪ لمدة 10 دقائق.
  8. انقل الهلام إلى حامل متكيف وتابع توسع الجل عن طريق الحضانة في ماء مقطر (ddH2O).
    ملاحظة: يمكن تكييف تركيز ونوع المنظف (Tween، Triton-X100، Saponin) المستخدم في غسولات الأجسام المضادة مع العينات البيولوجية. استبدال الماء عدة مرات أمر ضروري للتخلص من آثار الأملاح التي تمنع التمدد الكامل.

4. التركيب والتصوير

  1. تغطي الغطاء بالبولي-لايسين (انظر القسم 1.1) عن طريق تغطية الانزلاق التغطية بحوالي 200 ميكرولتر من البولي ليسين، وتحتضن ساعة واحدة عند RT، ثم تغسل 3x في ddH2O لإزالة الفائض من البولي لايسين. دع الأغطية تجف وخزنها عند 4°C حتى الاستخدام.
  2. ضع الجل الموسع على أغطية غير مغطاة في غرفة التصوير لفحص اتجاه العينات باستخدام مجهر فلوري.
  3. بمجرد توجيهها، جفف الجل على ورق خال من الوبر لإزالة الماء الزائد وتركيبه على أغطية مغلفة بالبولي ليسين (انظر الخطوة 1.1 للبروتوكول).
  4. راقب العينات باستخدام المجهر المقلوب.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلط هذه الورقة الضوء على نتائج دمج التثبيت بالتجميد مع المجهر التوسعي على نوعين مختلفين من العينات: الخلايا الثديية المزروعة وطفيليات T. brucei . كلا العينتين كانتا ثابتتين بالتجميد أو مثبتتين كيميائيا في 4٪ PFA قبل التمدد والتلوين المناعي. لاحظ أن تثبيتات كيميائية أخرى قد تكون أكثر ملاءمة لعضيات محددة (مثل الميثانول أو الجلوتارالديهايد)، وأن PFA فقط، وهو تثبيت كيميائي شائع، تم اختياره للمقارنة مع التثبيت بالتجميد من أجل البساطة.

تم صبغ الخلايا الظهارية لصبغة الشبكية (RPE1) البشرية لتركيب αβ-tubulin وATP5a وHoechst لرؤية الأنابيب الدقيقة والميتوكوندريا والنوى على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تم حضن الهلام بإستر NHS الفلوري قبل التوسع، وهو صبغة تتفاعل مع مجموعات الأمين الحر وبالتالي تصبغ البروتيوم الخلوي بالكامل. لاحظنا عدة مزايا للتثبيت بالتجميد مقارنة بالتثبيت الكيميائي، كما أظهرنا بالفعل23. أبرز ما أبرز ما أبدا هو أن تثبيت التجميد حافظ تماما على شبكة الميتوكوندريا، سواء كانت مرئية باستخدام إستر NHS أو الأجسام المضادة المحددة ضد وحدة ATP سينثاز ألفا (ATP5a) (الشكل 3A,B). علاوة على ذلك، بما أن ATP5a متمركز في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا، يمكننا تحليل الميتوكوندريا الكريستيلية باستخدام التثبيت بالتجميد (الشكل 3B"). على العكس، لم يسمح تثبيت PFA بالحفاظ على شبكة الميتوكوندريا، وبالتالي لم تكن الميتوكوندريا كريستات مرئية في هذه الحالة (الشكل 3C"). قمنا أيضا بصبغ الأنابيب الدقيقة في كلا الحالتين وأظهرنا أن التثبيت بالتجميد يحافظ على أنابيب دقيقة ديناميكية أفضل مثل الأنابيب السيتوبلازمية أو الأثيرية (الشكل 3B-E). ومع ذلك، فإن الأنابيب الدقيقة المستقرة مثل في الجري والأهداب، وهي عضيات غير غشائية مكونة من أنابيب دقيقة ذات 9 طيات، ثلاثيات/دوبلات، كانت محفوظة بنفس القدر، إن لم تكن أفضل في الخلايا المثبتة ب PFA مقارنة بالخلايا المثبتة بالتجميد (الشكل 3B',C'). من المهم ملاحظة أن التثبيت بالتجميد، باعتباره يحافظ على تكامل البروتينات الخلوية، قد يكون أقل قابلية للتطبيق على البنى الكثيفة جدا مثل المركز المركزي/الأهداب. وقد تم إجراء هذه الملاحظة أيضا على هياكل صلبة مثل المسام النووية حيث يؤدي التثبيت الكيميائي إلى تفريغ البروتينات السيتوبلازمية، مما يسمح بمراقبة أفضل لهياكل المسام النووية 23,32. وأخيرا، يمكننا إثبات أن التثبيت بالتجميد يتجاوز أيضا تأثير الربط المتقاطع للتثبيت الكيميائي، والذي يؤثر سلبا على قدرة التمدد كما هو موضح في المغازل الانقسامية، التي كانت تتوسع تقريبا بمقدار مرتين أكثر في حالة تثبيت التجميد مقارنة ب PFA (الشكل 3D,E).

تم صبغ خلايا تريبانوزوما بروسي لاختبار TDH34 (الشكل 4A-D) لرؤية الميتوكوندريا الفريدة، ولل BiP35 (الشكل 4E,F) لتسليط الضوء على الشبكة الإندوبلازمية. بالإضافة إلى ذلك، تم صبغ الجل بنظام NHS-ester الفلوري. كما لوحظ في الخلايا البشرية، فإن التثبيت بالتجميد مع التمدد يحافظ بشكل أفضل على البنية الخلوية العامة (الشكل 4B,E)، وخاصة هذين الهيكلين الغشائيين، مقارنة بتثبيت PFA (الشكل 4C,D,F). هيكل الخلايا الميكروتوبولي في T. brucei أكثر صلابة واستقرار من الخلايا البشرية؛ وبالتالي، لم يلاحظ فرق كبير بين PFA والتثبيت بالتبريد. علاوة على ذلك، يمنعنا حد الدقة في تقنية U-ExM من التمييز بين الأنابيب الدقيقة الفردية (غير موضح).

بشكل عام، يعالج التثبيت بالتجميد حدود التثبيت الكيميائي الكلاسيكي، مثل الحفاظ على العضيات الغشائية (الميتوكوندريا، الشبكة الإندوبلازمية) والعناصر الهيكلية الخلوية الديناميكية (الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية أو الأثيرية). بالإضافة إلى ذلك، وبما أن التثبيت بالتجميد لا يخلق أي ارتباط متقاطع بين البروتينات، فإنه يحافظ بالكامل على القدرة التمددية، خاصة في البنى الصلبة والكثيفة.

التحكم في جودة التثبيت بالتجميد والتوسع ضروري للحفاظ على البنية الفائقة للعينات البيولوجية. يمكن أن تؤدي عدة أخطاء إلى ضعف التثبيت وخلق تشوهات داخل العينات البيولوجية. هنا، نسلط الضوء على أكثر عيوب التثبيت بالتجميد ونتائج التثبيت الضعيف شيوعا. أكثر الأثر وضوحا الناتج عن التثبيت بالتجميد هو ظهور شقوق داخل العينة البيولوجية (الشكل 5A)، وهو شائع أيضا في المجهر الإلكتروني التجميد. بينما لا تغير هذه الشقوق البنية الفائقة الجوهرية للعضيات، كما هو موضح في الشكل 5A (الإدخال الداخلي) للميتوكوندريا والأنابيب الدقيقة، إلا أنها قد تؤدي إلى تفسير خاطئ للأهمية البيولوجية لهذه الشقوق ويجب النظر إليها بحذر. لا يوجد ارتباط محدد بين مشاكل التلاعب وظهور أو وفرة هذه الشقوق.

إحدى الميزات المحددة التي تدل على ضعف التثبيت هي ظهور "هياكل فقاعات" داخل السيتوبلازم الخلوي، مما يشير إلى وجود بلورات جليدية. تظهر هذه الهياكل بشكل خاص مع تلوين NHS-ester (الشكل 5B). عادة ما يصاحبها حفظ محدود لعناصر الهيكل الخلوي، مثل الأنابيب الدقيقة المتموجة الشكل (الشكل 5B)، وحفظ ضعيف جدا للعضيات الغشائية (الميتوكوندريا في الشكل 5B). تشهد هذه الميزات مشاكل مهمة في التثبيت، والتي يمكن أن تحدث (1) حجم و/أو درجة حرارة الإيثان غير المناسبين (الخطوات 2.2.4-2.2.6 من البروتوكول)، (2) تسخين العينة البيولوجية بشكل غير تدريجي (الخطوات 2.3 و2.4 من البروتوكول)، و(3) وجود شوائب في محلول الاستبدال بالتجميد (الخطوة 2.2.1 من البروتوكول). تظهر الصور الممثلة لمحاليل أكريلات الصوديوم التي تبرز الجانب المتوقع من 38٪ من أكريلات الصوديوم قابلة للاستخدام (عديم اللون وشفاف [1]) أو صفراء وشفافة قليلا [2])، أو غير صالحة للاستخدام للتمدد (أصفر/برتقالي وغائم [3]) في الشكل 5C.

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل Cryo-ExM. (أ) الخلايا الحية (الخلايا البشرية أو T. brucei) تثبت بالتجميد عن طريق غمر الإيثان السائل عند -180 درجة مئوية وحضانها في أسيتون مجمد على الثلج الجاف. يتم استبدال التجميد عن طريق رفع درجة الحرارة باستمرار وببطء من -180 °م إلى -80 °م عن طريق الحضانة على الثلج الجاف، مما يؤدي إلى تسييل الأسيتون (-96 °م)، ثم من -80 °م إلى -20 °م عن طريق الحضانة بدون جليد جاف. يتم إعادة الترطيب عن طريق حمامات متتالية من الإيثانول ممزوجة بتركيز هلال من الماء المقطر مع زيادة مستمرة في درجة الحرارة من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. (ب) تتقدم العينات المعاد ترطيبها للتوسع كما يلي: تحضن العينات في خليط من الأكريلاميد: الفورمالديهايد (AA/FA) عند درجة حرارة 37 °م، مما يسمح بتثبيت البروتينات على البوليمر القابل للانتفاخ المصنوع من الأكريلاميد، وبيس-أكريلاميد، وأكريلات الصوديوم (AA/BIS/SA)، مما يمنح الجل خاصية التوسع. يتم حضن العينات في NaCl/SDS عند 95 درجة مئوية لإجراء تفاعل البروتين والبروتين وعدم الاستقرار والإزالة اللطيفة. هذه الخطوة ضرورية للتمدد متساوي الاتجاه. ثم تصبغ العينات بمناعة باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية العادية وأخيرا تتوسع في الماء المقطر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. إعداد الغوص بالتجميد والتوسع. (أ) المكبس الكريو في وضع الذراع (اللوحة العلوية) والوضع الأسفل (اللوح السفلي). يشير السهم إلى زر الضغط لتفعيل الغوص. (ب) إعداد الغمر بالتجميد جاهز للغص، مع إظهار مستوى النيتروجين السائل (N2) المناسب للتثبيت بالتجميد الواضح من ارتفاع الرغوة المحيطة بالديوار (رأس السهم الأحمر). يتم الإشارة إلى العنكبوت القابل للإزالة بالنجوم. (ج) توضيح الخطوات الرئيسية للغمر بالتجميد من تثبيت الغطاء (أعلى اليسار)، وموقع الغطاء في ديوار الإيثان السائل (أسفل اليسار)، وأنبوب الجمع لاستبدال التجميد (يمين). (د) توضيح طريقة 'التثقيب بالجل' لصبغ المناعة في عينات البشر. يتم قطع الجل المبلمر على الغطاء (1) باستخدام ثقب خزعة محددة (P)، مكونة ثقب هلام بقطر 0.4 سم (2)، يمكن تلوينها في صفيحة سيليكون (الألواح اليمنى) لتقليل كمية الأجسام المضادة. (ه) توضيح لطريقة 'القطع بالجل' للتلوين المناعي في عينات الإنسان وعينات T. brucei . يتم تقطيع الهلام المبلمرة والمشوهة (1) إلى 4 قطع متساوية (2)، مما يسمح بحضانتها في صفيحة مكونة من 12 بئر مع أجسام مضادة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. مقارنة بين تثبيت التجميد والتثبيت في الأقدام الخيالي في الخلايا البشرية. (أ) صورة قرص دوارة لخلايا RPE1 المثبتة بالتجميد والمتوسعة، ملونة بأنابيب αβ (السماوي)، وحدة ATP سينثاز 5a (ATP5a، أصفر)، وإسترال NHS (أحمر/رمادي)، مما يظهر الحفاظ الممتاز على العضيات القائمة على الغشاء والعناصر الهيكلية الخلوية، بما في ذلك المركزيات والأهداب (رأس السهم). شريط المقياس: 10 ميكرومتر. (B, C) صورة قرص دوارة لخلايا RPE1 المثبتة بالتجميد (B) وPFA (C) المصبوغة بأنابيب αβ (سماوي)، ATP5a الميتوكوندرية (أصفر)، وهوشت (الأرجواني) مع التركيز على الهدب الأولي (الأسهم، B'، C') والميتوكوندريا (B"، C"). إذا حافظت التثبيت بالتجميد وPFA على التساوي على المركزيات والأهداب الأولية، فإن التثبيت بالتجميد يتجاوز بشكل كبير PFA من حيث الحفاظ على بنية الميتوكوندريا (B"، C" - رؤوس الأسهم الحمراء تشير إلى الكريستات الميتوكوندرية التي لا ترى إلا في ظروف التثبيت بالتجميد) أشرطة المقياس: 1، 1، و2.5 ميكرومتر على التوالي. (د، ه) صورة قرص دوارة لخلية RPE1 الانقسامية المثبتة بالتجميد (D) وPFA (E) الملونة بأنابيب αβ باللون الأصفر/الرمادي، ATP5a الميتوكوندري (الأرجواني)، وهوشت (BOP الأزرق) تظهر أن التثبيت بالتجميد يسمح بتوسيع أفضل للمغزل المنسوعي (رؤوس الأسهم الحمراء) ويحافظ على أنابيب دقيقة مغزل انقسامية أفضل (الأسهم الحمراء). قياسات طول المغزل الميتوتيكي: 12 ميكرومتر و7 ميكرومتر للتثبيت بالتجميد وتثبيت PFA على التوالي. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. مقارنة بين تثبيت التجميد وتثبيت PFA في تريبانوزوما بروس. (أ، ب) صور كونفوكال لخلايا T. brucei المثبتة والمتوسعة في التجميد لتكون الخلايا الدائرية الملونة لإنزيم الهيدروجيناز الثريوني الميتوكوندري (TDH، أصفر) وإستر-NHS (أحمر/رمادي)، مما يظهر الحفاظ الممتاز على الميتوكوندريا الفريدة والبنية العامة للخلية. أشرطة الميزة: 5 ميكرومتر (C, D) صورة كونفوكية لخلايا T. brucei الثابتة والمتوسعة ب PFA وصبغت ل TDH (أصفر) وNHS-ester (أحمر/رمادي). عند مقارنة الحفاظ على البنية الميتوكوندرية والشبكة، يتفوق التثبيت بالتجميد على تثبيت PFA. أشرطة القياس: 5 ميكرومتر (E, F) صور كونفوكال لخلايا T. brucei المثبتة بالتجميد (E) وPFA المثبتة (F) والمتوسعة، ملونة لعلامة الشبكة الإندوبلازمية BiP وNHS-ester (رمادي)، تظهر أن التثبيت بالتجميد يسمح بتوسع وحفظ أفضل للشبكة الإندوبلازمية. أشرطة المقياس: 5 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5. مشاكل في التثبيت على التجميد الطبيعي. (أ، ب) صور الأقراص الدوارة لRPE1 المثبتة والموسعة بالتجميد المصبوغة ب αβ-tubulins (سماوي)، ووحدة ATP synthase 5a (ATP5a، أصفر)، وإستر NHS (أحمر)، وتظهر تأثيرات كلاسيكية للتثبيت بالتجميد: تشققات (A، سهام) وفقاعات (B، سهم). بينما لا تؤثر الشقوق على البنى الفائقة للعضيات (A)، فإن وجود الفقاعات في السيتوبلازم (B) يدل على سوء تثبيت ويغير بشكل كبير حفظ العضيات تحت الخلوية (الميتوكوندريا والأنابيب الدقيقة، الداخليات). أشرطة السلالم: 5 ميكرومتر و2 ميكرومتر (الداخل). (ج) صورة تظهر محاليل مختلفة من أكريلات الصوديوم تبرز الجانب المتوقع من 38٪ أكريلات الصوديوم قابلا للاستخدام (عديم اللون وشفاف (1) أو أصفر قليلا وشفاف (2)، أو غير قابل للاستخدام للتوسع (أصفر/برتقالي وغائم (3)). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1: شروط تخزين الحل يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: قائمة الأجسام المضادة يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: حالات المناعة الراحبة يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، نقدم بروتوكولا مفصلا يدمج التثبيت بالتجميد مع المجهر التوسعي (Cryo-ExM)، مقدما نهجا قويا لرؤية الحجرات تحت الخلوية مع تجنب التشويهات المرتبطة عادة بالتثبيت الكيميائي، مثل التشوه الهيكلي وفقدان المستضدات. من خلال الحفاظ على البنية الخلوية في حالة شبه أصلية، يلغي Cryo-ExM الحاجة إلى تحسين تثبيت واسع النمو، مما يسمح بتحديد مواقع البروتين بدقة أكبر.

على الرغم من أن البروتوكول واضح عموما، إلا أن هناك عدة خطوات حاسمة تتطلب اهتماما خاصا لضمان تحقيق نتائج ناجحة. خطوة الغمر بالتجميد حساسة بشكل خاص، لأنها تتطلب مواد محددة (انظر جدول المواد) ومستوى من المهارة، خاصة عند التعامل مع حشوة الإيثان السائل، وهو ما يمثل مشكلة. المعرفة السابقة بتقنيات التثبيت بالتجميد مفيدة؛ نوصي باستشارة أخصائي تجميد EM أو مدير منشأة المجهر الإلكتروني عند اعتماد هذه الطريقة لأول مرة. خلال مرحلة التوسع، من الضروري الالتزام الصارم بشروط إزالة الطبيعة، حيث يمكن أن تؤثر الانحرافات على حفظ العينة وكفاءة التمدد معا. أخيرا، الحفاظ على ظروف تخزين مناسبة لجميع الكواشف (انظر الجدول 1) أمر بالغ الأهمية لضمان قابلية التكرار وجودة التصوير المتسقة مع مرور الوقت.

تسلط هذه الورقة الضوء على عدة مزايا رئيسية لبروتوكول Cryo-ExM. ومن الجدير بالذكر أن التثبيت بالتجميد يقلل من فقدان البروتينات القابلة للذوبان، وهو قيد شائع في طرق التثبيت التقليدية، ويحافظ بشكل أفضل على سلامة الغشاء، مما يعزز دقة التصوير الخلوي. تكمن قوة هذه التقنية الرئيسية في توافقها مع المجاهر ذات المجال العريض والكونفوكال القياسية. على عكس العديد من طرق الدقة الفائقة الأخرى التي تتطلب معدات متخصصة وغالبا مكلفة، يمكن تنفيذ ExM باستخدام مجاهر الفلورة التقليدية. ميزة أخرى مهمة ل ExM هي تعدد استخداماته. تم تطبيق هذه التقنية بنجاح على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية – من الخلايا الفردية إلى الأنسجة المعقدة – مما يدل على تطبيقها الواسع في مجالات بحثية متنوعة. تؤكد هذه الورقة بشكل خاص على توافق هذا البروتوكول مع نظامين نموذجيين مختلفين جدا: T. brucei والخلايا البشرية، لكن لاحظ أن عينة أكبر أو أكثر تعقيدا ستتطلب تثبيت التجميد عالي الضغط لأن الغمر اليدوي لا يكفي للحفاظ على العينة كاملة 24,25,30. لقد أحدث المجهر التوسعي ثورة في القدرة على تصور البنى الخلوية على نطاق نانوي كانت في السابق صعبة أو مستحيلة الحل، مما أتاح اختراقات في مجالات مثل علم الأحياء الخلوي، وعلم الأحياء التطوري،وعلوم الأعصاب. على وجه الخصوص، كانت الطريقة تحويلية في علم الطفيليات، وهو مجال غالبا ما يفشل فيه المجهر الضوئي التقليدي. بالنسبة للعديد من الطفيليات، أثبتت مجهر التمدد فوق البنية (U-ExM) أنها تغير قواعد اللعبة، حيث أتاحت التصوير عالي الدقة للعضيات المعقدة مثل الأبيكوبلاستي، والعناصر المخروطية، والهيكلية الخلوية بوضوح غير مسبوق 6,37,38. تظهر هذه التطورات قوة U-ExM في كشف تفاصيل هيكلية لم تكن متاحة سابقا، مما يفتح آفاقا جديدة للاكتشاف في علم الأحياء الخلوي، وعلوم الأعصاب، وعلم الأحياء الطفيلي، ويساعد في البحث عن أهداف علاجية محتملة. علاوة على ذلك، يظل ExM متوافقا مع الأجسام المضادة المتألقة المناعية المستخدمة شائعا، مما يسهل دمجها في سير العمل الحالي. في معظم الحالات، تؤدي الأجسام المضادة المستخدمة بشكل روتيني في المجهر الفلوري أو البلوتينغ الغربي فعالا على العينات الموسعة، مما يلغي الحاجة إلى كواشف متخصصة. تجعل هذه السهولة من Cryo-ExM خيارا جذابا للعديد من مختبرات الأبحاث البيولوجية، حيث تقدم تصويرا عالي الدقة دون التكلفة أو التعقيد المعتاد المرتبط بأنظمة التصوير المتقدمة.

رغم مزاياها، لدى ExM بعض القيود. من العوائق الرئيسية الاستهلاك الكبير للأجسام المضادة، والتي قد تكون مكلفة أو مشكلة، خاصة للأجسام المضادة المنزلية المتوفرة بكميات محدودة. وهنا السبب في اقتراح هذه الاستراتيجية الآلية لتقليل حجم الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين المناعي (الشكل 2D,E). تزيد عملية التمدد أيضا من سمك العينة، مما يؤثر على القدرة على رؤية الهياكل الأعمق بسبب حدود مسافة العمل في أهداف المجهر القياسية. قد يكون هذا القيد تحديا خاصا عند دراسة عينات أكبر وأكثر سماكة، حيث قد لا يتم تصوير المناطق العميقة بشكل فعال باستخدام المجاهر التقليدية. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي تمدد الأنسجة أحيانا إلى تشوهات ميكانيكية، مما يتطلب خطوات تحقق وتصحيح دقيقة لضمان تمثيلات مكانية دقيقة. أخيرا، يعتمد ExM الكلاسيكي بشكل صارم على تثبيت العينة، والذي قد يختلف من عينات بيولوجية أو بنية تحت خلوية إلى ملاحظة. بينما تكون الجولات المركزية والأهداب مستقرة بما يكفي ليتم توسيعها دون تثبيت مسبق، إلا أن العضيات الخلوية تتطلب أنواعا مختلفة من التثبيت الكيميائي (PFA، الميثانول، الجلوتارالديهايد)، مما قد يخلق عيوبا وتمنع مراقبة عدة هياكل خلوية معا. وأخيرا، نظرا لأن ExM متوافق مع عدة وسائل تصوير فائقة الدقة مثل المجهر الإضاءة الهيكلي (SIM)39، ومجهر استنزاف الانبعاث المحفز (STED)40، والمجهر البصري العشوائي المباشر (dSTORM)41، ومؤخرا المجهر بصفائح الضوء42، فإن النهج الموضح في هذه الدراسة يوفر أداة متعددة الاستخدامات للتحقيق في هياكل الخلايا بدقة عالية. جمع دراسة حديثة بين تثبيت التجميد والمجهر التوسعيالتكراري رقم 32، مما دفع حدود الدقة مع الحفاظ على الحالة الطبيعية للخلية قدر الإمكان بفضل التثبيت بالتجميد.

من خلال تمكين هذه التقنيات المتقدمة من التقاط الخلايا في حالتها الأصلية، يمهد Cryo-ExM الطريق لدراسات مستقبلية للعمليات الخلوية المعقدة بوضوح غير مسبوق. يفتح هذا النهج أيضا إمكانيات جديدة للمجهر الضوئي والإلكتروني المترابط (CLEM)، مما يعزز إمكانياته في التصوير متعدد الوسائط.

في الختام، يمثل ExM أداة قوية للتصوير فائق الدقة ذات تطبيق واسع عبر مختلف العينات البيولوجية. توافقه مع المجاهر القياسية، وتعدد استخداماته في أنواع العينات، وسهولة تطبيقه نسبيا يجعله خيارا جذابا للعديد من المختبرات. مع التقدم المستمر في التقنية، نتوقع تحسينات إضافية في الدقة، واستخدام الأجسام المضادة، والتعامل مع العينات، مما سيعزز قدراتها ويجعلها أكثر سهولة لمجموعة واسعة من التطبيقات البيولوجية. يعد Cryo-ExM، على وجه الخصوص، تقدما واعدا، حيث يوفر وسيلة لدراسة البنى الخلوية بتفاصيل استثنائية مع الحفاظ على سلامتها الأصلية، مما يدفع في النهاية حدود المجهر الحديث.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جينيفر فييار على النصائح النقدية وقراءتها للمخطوطة. نعترف بمساهمة SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS، US7 Inserm، UCBL) في منشأة CIQLE (عضو في LyMIC) في الحصول على صور خلايا RPE1. نشكر مونيكا فرنانديز مونريال من BIC على منحنا الوصول إلى المكبس والإثان، ومركز تصوير بوردو، وهو وحدة خدمة تابعة ل CNRS-INSERM وجامعة بوردو، عضو البنية التحتية الوطنية France BioImaging، على اقتناء صور T. brucei . تم دعم هذا العمل من قبل CNRS (T.brucei) وINSERM (الخلايا البشرية) ومويلها من المؤسسات التالية: الوكالة الوطنية للبحث (ANR-20-CE91-0003، ANR-19-CE17-0014 إلى M.B)، وLabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) ومؤسسة البحث حول السرقة (FRC-AP2024، M.L). تم دعم P.H بتمويل ANR-OIL (ANR24-CE15-2171-01 إلى L.R)، وكانت L.K مدعومة من ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 إلى B.D)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حامل أنابيب معدني بحجم 5 ملدومينيك داتشرQB-E5خطوة الاستبدال بالتجميد
مكبس التجميد اليدوي 620الشبحhttps://rhost-em.com/خطوة تثبيت التجميد
أسيتون 99.8٪ أكروسيلأكروس أورجانيكسقطة. رقم 67-64-1 خطوة الاستبدال بالتجميد
أكريلاميد 40٪ (AA)سيغما-ألدرتشA4058إجراء التوسعة  (تثبيت)
حمض الأكريليك سيغما-ألدرتش8.00181 إجراء التمدد (البوليمر)
بيرسلفات الأمونيوم (APS)ثيرمو فيشر17874إجراء التمدد (البوليمر)
ثقب الخزعةدومينيك داتشرPUK-40مطلوب لقطع الجل قبل إزالة الطابع  
BSAسيغما-ألدرتشP1379التلطيب المناعي  
حجرة الخلية أتوفلورإنفيتروجينA7816غرفة التصوير متكيفة مع أغطية 24 مم للتصوير
غرفة الخليةخدمة التضخم مدى الحياة10900غرفة التصوير متكيفة مع أغطية 18 مم للتصوير
أغطية 12 مم & nbsp;دومينيك داتشر100040نمو الخلايا / تثبيت T.brucei
كوفرزليبس 24 مم & nbsp;دومينيك داتشر900547التصوير 
أغطية 18 ممVWR631-0153التصوير 
إيثان غاز ليندي غاز88888DEمطلوب للتثبيت بالتجميد
الفورمالديهايد 36.5– 38٪ (FA)سيغما-ألدرتش  F8775إجراء التوسعة  (تثبيت)
غلوتارالدهيد 25٪ (GA)سيغما-ألدرتش  G5882خطوة الاستبدال بالتجميد
الجلسرول  Euromedex EU3550تخزين الجل طويل الأمد 
النيتروجين السائل ليندي غاز2200975مطلوب لتثبيت التجميد (تبريد النظام)
ميكروتيوب clear-lock 5 مل دومينيك داتشر390932Aمطلوب لاستبدال التجميد
إبرة 18Gدومينيك داتشر050123Bكان مطلوبا لجمع الأسيتون
N,N-ميثيل بيساكريلاميد 2٪ (BIS)سيغما-ألدرتشM1533، SIGMAإجراء التمدد (البوليمر)
بارافورمالديهايد 16٪ (PFA)خدمات الطوارئ الطبيةقطة. رقم 15710خطوة الاستبدال بالتجميد
بولي-دي-ليسينسيغما-ألدرتشP1024طلاء أغطية الغطاء للعينات / التصوير  
بولي-إل-ليسينسيغما-ألدرتشP1274طلاء أغطية الغطاء للعينات / التصوير  
معيد الضغط  ليندي غازCPLH0SJ-LIN224جهاز تفريغ الضغط الذي يسمح بإزالة الإيثان (تثبيت التجميد بالتجميد)
Seringe Terumo 10 ملدومينيك داتشر50132كان مطلوبا لجمع الأسيتون
مجموعة سيليكون إيلاستومرداو4001834مجموعة لتحضير ألواح بئر السيليون (التلطيع المناعي) 
الصوديوم أكريلات 97-99٪ (SA)سيغما-ألدرتش408220إجراء التمدد (البوليمر)
AK ScientificR624إجراء التمدد (البوليمر)
كبريتات الصوديوم الدوديسيليوروميديكسEU0660إجراء التمدد (إزالة الطابع)
تتراميثيل إيثيلين ديامين (TEMED)ثيرمو فيشر17919إجراء التمدد (البوليمر)
أنابيب  ثيرمو ساينتفيك8060-0060أنابيب لإزالة الإيثان (تثبيت التجميد بالتجميد)
توين-20يوروميديكس1005-7التلطيب المناعي  
ملقط دومونت n° 5 أدوات العلوم الدقيقة11255-20التلاعب بالأغطية  

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacquemet, G., et al. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. J Cell Sci. 133 (11), jcs240713(2020).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Laporte, M. H., et al. Time-series reconstruction of the molecular architecture of human centriole assembly. Cell. 187 (9), 2158-2174 (2024).
  4. Steib, E., et al. WDR90 is a centriolar microtubule wall protein important for centriole architecture integrity. Elife. 9, e57205(2020).
  5. Le Borgne, P., et al. The evolutionary conserved proteins CEP90, FOPNL, and OFD1 recruit centriolar distal appendage proteins to initiate their assembly. PLoS Biol. 20 (9), e3001782(2022).
  6. Bertiaux, E., et al. Expansion microscopy provides new insights into the cytoskeleton of malaria parasites including the conservation of a conoid. PLoS Biol. 19 (3), e3001020(2021).
  7. Liffner, B., et al. Atlas of Plasmodium falciparum intraerythrocytic development using expansion microscopy. Elife. 12, RP88088(2023).
  8. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 134 (5), jcs254300(2021).
  9. Corrales, R. M., et al. Tubulin detyrosination shapes Leishmania cytoskeletal architecture and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (3), e2415296122(2025).
  10. Brunet, M., et al. Drosophila Alms1 proteins regulate centriolar cartwheel assembly by enabling Plk4-Ana2 amplification loop. EMBO J. 44 (8), 2396(2025).
  11. Langner, E., et al. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of mouse and human kidneys for analysis of subcellular structures. Cytoskeleton (Hoboken). 81 (11), 618-638 (2024).
  12. Mercey, O., et al. The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration. PLoS Biol. 20 (6), e3001649(2022).
  13. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Rep Methods. 2 (10), 100311(2022).
  14. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  15. Yu, C. J., Orozco Cosio, D. M., Boyden, E. S. ExCel: super-resolution imaging of C. elegans with expansion microscopy. Methods Mol Biol. 2468, 141-203 (2022).
  16. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  17. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  18. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 34 (9), 973-981 (2016).
  19. Schnell, U., et al. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  20. Dubochet, J. Cryo-EM-the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  21. Neuhaus, E. M., et al. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 121 (3), 326-342 (1998).
  22. Kellenberger, E. The potential of cryofixation and freeze substitution: observations and theoretical considerations. J Microsc. 161 (Pt 2), 183-203 (1991).
  23. Laporte, M. H., et al. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nat Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  24. Hinterndorfer, K., et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast. J Cell Sci. 135 (24), jcs260240(2022).
  25. Mikus, F., Dey, G. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol. 2862, 47-59 (2025).
  26. Ben Chaabene, R., et al. Toxoplasma gondii rhoptry discharge factor 3 is essential for invasion and microtubule-associated vesicle biogenesis. PLoS Biol. 22 (8), e3002745(2024).
  27. Shah, H., et al. Life-cycle-coupled evolution of mitosis in close relatives of animals. Nature. 630 (8015), 116-122 (2024).
  28. Klena, N., et al. An in-depth guide to the ultrastructural expansion microscopy (U-ExM) of Chlamydomonas reinhardtii. Bio Protoc. 13 (17), e4792(2023).
  29. van den Hoek, H., et al. In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains. Science. 377 (6605), 543-548 (2022).
  30. Mikus, F., et al. Charting the landscape of cytoskeletal diversity in microbial eukaryotes. bioRxiv. , (2024).
  31. Petrich, A., et al. Expanding insights: harnessing expansion microscopy for super-resolution analysis of HIV-1-cell interactions. Viruses. 16 (10), 1610(2024).
  32. Louvel, V., et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nat Commun. 14 (1), 7893(2023).
  33. Lemaître, F., et al. Unveiling the molecular architecture of T cells and immune synapses with cryo-expansion microscopy. bioRxiv. , (2025).
  34. Millierioux, Y., et al. De novo biosynthesis of sterols and fatty acids in the Trypanosoma brucei procyclic form: carbon source preferences and metabolic flux redistributions. PLoS Pathog. 14 (5), e1007116(2018).
  35. Bangs, J. D., et al. Molecular cloning and cellular localization of a BiP homologue in Trypanosoma brucei: divergent ER retention signals in a lower eukaryote. J Cell Sci. 105 (Pt 4), 1101-1113 (1993).
  36. Dolgin, E. 'Expansion microscopy' turns ten: how a tissue-swelling method brought super-resolution imaging to the masses. Nature. 637 (8046), 752-754 (2025).
  37. Tosetti, N., et al. Essential function of the alveolin network in the subpellicular microtubules and conoid assembly in Toxoplasma gondii. Elife. 9, e56635(2020).
  38. Gorilak, P., et al. Expansion microscopy facilitates quantitative super-resolution studies of cytoskeletal structures in kinetoplastid parasites. Open Biol. 11 (9), 210131(2021).
  39. Halpern, A. R., et al. Hybrid structured illumination expansion microscopy reveals microbial cytoskeleton organization. ACS Nano. 11 (12), 12677-12686 (2017).
  40. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  41. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  42. Daetwyler, S., Fiolka, R. P. Light-sheets and smart microscopy, an exciting future is dawning. Commun Biol. 6 (1), 502(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Super Resolution ImagingCryo FixationFluorescence MicroscopyHydrogel EmbeddingConfocal MicroscopyUltrastructure Expansion MicroscopySample FixationImmunostaining ProtocolCellular Architecture

مقالات ذات صلة