مقالة منهجية

لاكتيلوم المعتمد على مطيافية الكتلة وتأكيد البروتينات اللاكتيلية

254 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68597

⸱

أبريل 24, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم خطوط خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في المريء كمثال لتحليل لاكتلة البروتين. تتضمن العملية تحليل لاكتيلية البروتين من زراعة الخلايا إلى تأكيد المرشحين، بما في ذلك تحليل مطيافية الكتلة المعتمدة على اللاكتلة وتأكيدها بواسطة التقرب المناعي.

الملخص

تم التعرف على اللاكتيليشن لأول مرة في عام 2019، وهو تعديل جديد بعد الترجمة (PTM) على بقايا الليزين، وقد ثبت لاحقا أنه ذو أهمية في عدة أمراض وسياقيات فسيولوجية. يمتلك متشابهين (L- وD-لاكتيلة) ومعروف بأنه يغير تكوين المعقد، أو تحديد موقع الخلية، أو استقرار البروتينات المستهدفة. يصف هذا البروتوكول طريقة لتحليل اللاكتلة من زراعة الخلايا إلى تأكيد الأهداف المحتملة التي تم تحويلها إلى لاكتيل، باستخدام خط خلايا سرطان الخلايا الحرشفية المريء TE11 كمثال. سيقدم البروتوكول التالي تفاصيل حول تحديد البروتينات الممزقة من خلال الترشيد المناعي (IP) الخاص ب L-لاكتيليسين (KL-LA) للببتيدات لتحليل مطيافية الكتلة (MS): (1) استخراج البروتين، (2) تقليل البروتين، التقليل والهضم، (3) تنقية البروتينات وتركيز الببتيدات، (4) التحليل الثقيل باستخدام حبيبات KL-LA و(5) تركيز ببتيدات KL-LA . بعد هذه الخطوات، ستجرى تحليلات لبيانات التصلب المتعدد الخام لتحديد المواقع المصابة باللاكتيل، وسيتم وصف تأكيد هذه البروتينات المزعومة باللاكتيلات بواسطة IP. باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحديد نطاق يتراوح بين 100 إلى 500 ببتيد، ويمكن تأكيد البروتينات الممزقة ذات الاهتمام. في الختام، دراسة البروتينات الممزقة باللاكتيلات لديها القدرة على تعزيز فهمنا لإشارات الخلايا المدفوعة ب PTM في كل من الحالات الطبيعية والحالة المرضية.

المقدمة

اللاكتلة هي تعديل ما بعد الترجمة (PTM) على بقايا الليسين باستخدام مستقلبات مشتقة من التحلل السكري. L-لاكتيل-CoA ولاكتويلغلوثاثيون هما ركائز ل-لاكتيليشن (KL-LA) وD-لاكتلة (KD-LA) على التوالي 1,2. L-لاكتيليشن هو عملية إنزيمية تشمل إنزيمات مثل إنزيمات الأستيل ترانسفيراز 3,4. على العكس، D-لاكتلة هي عملية غير إنزيمية عن طريق الاستبدال النووي بين اللاكتويلغلوتاثيون وبقايا الليسين5. كعملية ديناميكية، تم اتهام وجود ديأسيتيليزات مثل HDAC1-3 كممحيات لعملية اللاكتلة6. منذ اكتشافها في 20193، ثبت أنها ذات أهمية في أمراض وسياقات فسيولوجية متعددة2. تم التعرف على هذا ال PTM لأول مرة على الهيستونات من خلال ملاحظة انزياح كتلة بمقدار 72.021 دالتون باستخدام تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) - مطيافية الكتلة المتتالية (MS/MS)3. منذ ذلك الحين، تم اكتشاف اللاكتلة على بروتينات أخرى غير الهيستونات، وقد ثبت أنه يؤثر على التنوع الوظيفي أو تحديد الموقع أو استقرار البروتينات المعدلة حسب السياق 7,8,9,10.

نظرا لأن PTMs غالبا ما تكون منخفضة الوفرة11 وتكون جزءا من عملية ديناميكية وعابرة12، فإن إثراء PTM المدرس بواسطة التكرار المناعي (IP) مطلوب. بعد ذلك، يستخدم MS كثيرا لوصف البروتيوم المرتبط بPTM على الببتيدات المهضومة، مثل الفوسفوبروتيوم أو التوصيف اليوبيكويتيني11. كما هو الحال مع تلك PTMs الأخرى، مثل الببتيدات الغنية باللاكتيل، البروتيوميات القائمة على التصلب المتعدد هي الطريقة الذهبية لتحديد مواقع اللاكتيلة الجديدة.

يصف هذا البروتوكول تحديد الببتيدات الغنية ب KL-LA من خلال البروتينات المعتمدة على التصلب المتعدد، يليه تأكيد البروتينات المدمجة عن طريق التكرار المناعي. باستخدام خطوط خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في المريء (ESCC) كمثال، نصف بروتوكولا لسحب البروتينات المثقبة باللاكتيلات لتحديد الأهداف المبنية على التصلب المتعدد وتأكيدها لاحقا بواسطة IP.

البروتوكول

نظرا لأن PTMs عملية ديناميكية وعابرة، فمن المهم تحديد التقاء حيث يكون مستوى اللاكتلة الكلي مثاليا باستخدام قياس التدفق الخلوي أو البلويت الغربي باستخدام جسم مضادمضاد ل-LA مضاد ل K. على سبيل المثال، يفضل التقاء 70٪-80٪ في خطوط خلايا ESCC لتجارب اللاكتيلوم وIP، حيث يكون مستوى اللاكتلة الكلي في أعلى مستوياته. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا

  1. ازرع الخلايا في أطباق بتري بحجم 100 مم حتى يتم الوصول إلى التقاء مطلوب، كما ذكر سابقا.
    ملاحظة: نمي ما يكفي من الخلايا للحصول على ما بين 0.5-1 ملغ من البروتينات لسرطانات اللاكتيل أو أكثر من 2 ملغ للبروتينات العصبية الذهنية.
  2. اشطف الخلايا ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) المبرد مسبقا 1x.
  3. أضف 500 ميكرولتر من PBS المبرد مسبقا واجمع الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا. انقله إلى أنبوب ميكروي منخفض الارتباط بسعة 1 مل.
  4. تقوم خلايا الطرد المركزي بحرارة 2000 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) وتتخلص من الفائق الشفاف. يمكن تخزين حبيبات الخلايا عند -80 درجة مئوية.

2. اللاكتيلوم

ملاحظة: اعمل دائما بالقفازات لمنع تلوث العينات. استخدم دائما رؤوس مفلترة، أنابيب دقيقة منخفضة التماسك، وماء من درجة MS.
ملاحظة: يجب دائما إجراء النسخ البيولوجية (3-5 حسب تجربتنا) لضمان إمكانية تكرار التعديلات المحددة.

  1. استخراج البروتين
    ملاحظة: اعمل على الجليد.
    1. جهز محلول تحلل اللاكتيليس (الجدول 1) وخزن عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. أضف مثبطات البروتياز قبل الاستخدام مباشرة.
    2. استخرج البروتينات باستخدام الحجم المناسب من محلول التحلل.
    3. سونيكيت على الجليد 12 دورة من 5 ثوان نبضة + 5 ثوان تنقطع بشدة 20٪-25٪.
    4. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. نقل المادة الشفافة التي تحتوي على البروتينات إلى أنبوب ميكروي جديد منخفض التماسك.
    5. قم بقياس البروتينات باستخدام مجموعة حمض البيسينكونينيك (BCA) وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
      ملاحظة: مجموعة BCA متوافقة مع حد أقصى 3 مليون يوريا. لذا، يجب تخفيف العينات وفقا لذلك.
    6. انقل 500 ميكروغرام إلى 1 ملغ من البروتينات إلى أنابيب دقيقة جديدة منخفضة التماسك. استخدم نفس كمية البروتين لكل عينة. أكمل حجم جميع العينات باستخدام مخزن تحلل اللاكتيليوم إلى نفس الحجم النهائي.
  2. الاختزال والسلة والهضم الإنزيمي
    1. أضف الديثيوثرايتول إلى تركيز نهائي 5 ملم. حضن عند 95 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
    2. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. أضف الكلوروأسيتاميد إلى تركيز نهائي 7.5 ملليمو. حضن عند RT لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    4. أضف ثلاثة أضعاف حجم العينة (من الخطوة 2.1.6) وهو 1 متر (NH4)2CO3 لتقليل اليوريا من 8 مولار إلى 2 م.
      ملاحظة: إذا تجاوز الحجم الكلي سعة الأنابيب الدقيقة، قسمها إلى أنبوبين دقيقين.
    5. أضف 1 ميكروغرام من التربسين بدرجة MS لكل 100 ميكروغرام من البروتينات. حضن القطعة طوال الليل عند 30 درجة مئوية. تابع تنقية العينة.
  3. التنقية وتركيز الببتيدات
    ملاحظة: العمل في RT.
    1. قم بتحمض العينة بإضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى تركيز نهائي 0.2٪.
    2. حضر المحاليل التالية في مياه من درجة التصلب المتعدد طازجة: 0.1٪ TFA، 1٪ حمض الفورميك (FA)، و1٪ FA/50٪ أسيتونيتريل
    3. استخدم أعمدة C18 بجرعة 100 ملغ للمضي قدما في التنقية.
      ملاحظة: لاستخدام هذا العمود، استخدم طرفين من الماصة: حمل العمود برأس واحد واقطع طرف الآخر لطرد السائل من العمود. تأكد من بقاء العمود رطبا بشكل متسق. استخدم عمودا واحدا لكل عينة.
    4. اشحن العمود ب 1 مل من 100٪ أسيتونيتريل مع محلول الترطيب، ثم قم بإخراجه. كرر العملية مرتين.
    5. توازن العمود عن طريق شحن 1 مل من 0.1٪ TFA ثم قذف. كرر ذلك مرتين.
    6. اشحن العمود ب 1 مل من العينة المحمضة. تابع 10 دورات شحن/قذف من العينة. كرر العملية إذا بقي بعض العينة.
    7. اغسل العمود بشحن 1 مل من TFA بنسبة 0.1٪ ثم قذف. كرر العملية مرتين.
    8. للاستبعاد، استمر في 10 دورات شحن/إخراج باستخدام 750 ميكرولتر من 1٪ FA/50٪ أسيتونيتريل بسعة 750 ميكرولتر. اجمع في أنبوب ميكرو جديد منخفض الترابط. كرر ذلك مع إضافة 750 ميكرولتر من 1٪/50٪ أسيتونيتريل ليصبح المجموع 1.5 مل من الببتيدات المنقاة.
      ملاحظة: حدد الميكروتيوب على الجانب وليس على الغطاء لتجنب تلويث العينات أثناء ثقب الفتحات في الغطاء.
    9. قم بثقب من 1 إلى 3 ثقوب في غطاء الأنابيب الدقيقة باستخدام إبرة للتبخر.
    10. باستخدام جهاز تركيز الفراغ، تركز العينات على درجة حرارة 60 درجة مئوية طالما دعت الحاجة (بالنسبة للعينات في الحجم النهائي 1.5 مل، قد يستغرق ذلك على الأقل 4 ساعات). ثم تابع عملية التوصيل المناعي للببتيدات.
  4. التفاعل المناعي باستخدام خرز KL-LA
    1. جهز مخزن الغسيل ومخزن IP لاكتيليوم (الجدول 2).
    2. على الجليد، أضف 200 ميكرولتر من حاجز ال IP إلى الببتيدات المركزة، وامزج جيدا حتى تذوب. يمكن أن تكون بعض الرواسب مرئية.
    3. الطرد المركزي بقوة 12,000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة أي ترسبات.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي، يمكن إعطاء العينة جرعة كخطوة تحكم باستخدام مقياس طيف لقياس تركيز الببتيد عند 205 نانومتر.
    4. اغسل خرزات KL-LA المتقاربة بالأغاروز ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من PBS البارد مثلج 1x عن طريق الطرد المركزي عند 2000 x g لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية وإزالة الفائق الشفاف بعد كل غسل.
      ملاحظة: للحصول على 1 ملغ من البروتين في بداية هذا البروتوكول، استخدم 20 ميكرولتر من خرز KL-LA المتراكب مع الأغاروز، والتي كانت موجودة سابقا في أنابيب منخفضة الارتباط بحجم 0.5 مل لتسهيل الاستخدام.
    5. انقل المادة الشفافة التي تحتوي على الببتيدات المعلقة إلى أنبوب ميكرو بحجم 0.5 مل يحتوي على الخرزات المغسولة مسبقا. أغلق الأنابيب بطبقة بارافين لتجنب التسرب.
    6. حضن الغرفة طوال الليل مع تدوير لطيف من طرف إلى طرف عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: جميع الخطوات 2.4.7-2.4.12 تنفذ عند 4 درجات مئوية.
    7. قم بإزالة الحبيبات بالطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة دقيقة واحدة. تخلص من السوبرناتانت الشفاف.
    8. أضف 200 ميكرولتر من مخزن IP اللاكتيلومي واغسل لمدة 15 ثانية عن طريق قلب الأنبوب. استخدم الطرد المركزي بقوة 2000 x g لمدة 30 ثانية وتخلص من الفائق الشفاف.
    9. كرر الخطوة 2.4.8 مرة واحدة.
    10. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل واغسل لمدة 15 ثانية عن طريق قلب الأنبوب. استخدم الطرد المركزي بقوة 2000 × جرام لمدة 30 ثانية وتخلص من السوبرناتانت الشفاف.
    11. كرر الخطوة 2.4.10 مرتين.
    12. أضف 200 ميكرولتر من الماء بدرجة MS واغسل لمدة 30 ثانية بقلب الأنبوب. استخدم الطرد المركزي على 2000 x g لمدة دقيقة واحدة وتخلص من السوبرناتانت الشفاف.
      ملاحظة: الخطوات المتبقية من بروتوكول لاكتيلوم تنفذ في RT.
    13. قم بإزالة الببتيدات المرتبطة ب 100 ميكرولتر من محلول الإزالة (0.1٪ TFA طازجة جاهزة) لمدة دقيقة واحدة مع تدوير لطيف من الطرف إلى الطرف عند RT. الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة دقيقتين.
    14. كرر الخطوة 2.4.13 مرتين إضافيتين وادمج القطع المعدنية. تابع تنقية العينات.
  5. تركيز وتنقية ببتيدات KL-LA
    1. حضر المحاليل التالية في المياه العذبة بدرجة MS: 0.1٪ TFA، 1٪ FA، و1٪ FA/50٪ أسيتونيتريل.
      ملاحظة: قبل بدء التنقية مباشرة، حضر الكمية المناسبة من المحلول في أنابيب دقيقة بحجم 1.5 مل (الخطوة 2.5.3: 300 ميكرولتر من 100٪ أسيتونيتريل (الخطوة 2.5.4: 300 ميكرولتر من 0.1٪ TFA، الخطوة 2.5.6: 300 ميكرولتر بنسبة 0.1٪ TFA والخطوة 2.5.7: 300 ميكرولتر من 1٪ أسيتونيتريل / 50٪).
    2. استخدم رؤوس C18 بسعة 100 ميكرولتر للمضي قدما في عملية التنقية.
      ملاحظة: رؤوس C18 بسعة 100 ميكرولتر تستخدم بنفس طريقة رؤوس الماصات التقليدية. حافظ على تشغل الإبهام ولا تترك المكبس بين الخطوات للحفاظ على رطوبة العمود ومنع دخول الهواء.
    3. استنشق 100 ميكرولتر من 100٪ أسيتونونتريل وهو محلول الترطيب، وقم بتفريغه بحذر دون إخراج كل السائل. كرر ذلك مرتين.
    4. عدل العمود عن طريق استنشاق 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA ووزعه بحذر. كرر ذلك مرتين.
    5. اشحن العمود ب 100 ميكرولتر من عينة ببتيدات KL-LA . تابع مع 10 دورات شحن/إخراج في أنبوب ميكرو جديد منخفض التماسك. كرر العملية إذا بقي بعض العينة.
    6. اغسل العمود عن طريق استنشاق 100 ميكرولتر من 0.1٪ TFA ووزعه. كرر العملية مرتين.
    7. تابع 10 دورات شحن/إخراج للتخلص باستخدام 100 ميكرولتر من 1٪ FA/50٪ أسيتونيتريل في أنبوب ميكرو جديد منخفض التماسك. كرر ذلك مرتين وادمج الأنابيب الصغيرة.
      ملاحظة: قد تمنع الببتيدات المرتبطة برأس C18 الطرف من شفط 100 ميكرولتر في كل مرة. كرر هذه الخطوة حتى لا يبقى سائل في الأنبوب الدقيق (300 ميكرولتر) عند الخطوة 2.5.7.
    8. قم بثقب من 1 إلى 3 ثقوب في غطاء الأنابيب الدقيقة باستخدام إبرة للتبخر.
      ملاحظة: حدد الأنابيب الدقيقة على جانب الأنبوب بدلا من الغطاء لتجنب تلويث العينات أثناء ثقب الثقوب.
    9. باستخدام مركز فراغ، تركز العينات على درجة حرارة 60 درجة مئوية طالما احتاجت السائل للتبخر (بحجم إجمالي 300 ميكرولتر، يمكن أن يستغرق الأمر ساعتين على الأقل).
    10. أعد تعليق الببتيدات المركزة في 30 ميكرولتر من 1٪ FA.
    11. باتباع إرشادات منصة مطيافية الكتلة الخاصة بك، قم بقياس الببتيدات باستخدام مقياس طيف فوتومتر عند 205 نانومتر لتحديد تركيزها.
    12. انقله إلى قارورة زجاجية وحافظ على درجة الحرارة عند 4 درجات مئوية حتى تحليل التصلب المتعدد.

3. تحليل الماجستير والمعلوماتية الحيوية

ملاحظة: تم تحليل العينات في منشأة البروتيومكس الأساسية بجامعة شيربروك باستخدام مطياف الكتلة (MS) (يعمل في وضع الاستحواذ المعتمد على البيانات مع وضع التجزئة التسلسلية المتوازية (DDA-PASEF).

  1. مطيافية الكتلة
    1. لكل عينة، يتم حقن 375 نانوغرام من الببتيدات في نظام كروماتوغرافيا سائل عالي الأداء (HPLC).
    2. تحميل الببتيدات على عمود فخ بمعدل تدفق ثابت يبلغ 4 ميكرولتر/دقيقة.
    3. افصل الببتيدات على عمود تحليل من C18 باستخدام تدرج ساعتين بقيمة 5٪-37٪ أسيتونونتريل في 0.1٪ FA بمعدل تدفق 400 نانولتر/دقيقة.
    4. قم بتأين البخاخ الكهربائي بالإعدادات التالية: جهد الشعيرات الدموية: 1500 فولت، الغاز الجاف: 3.0 لتر/دقيقة، درجة الحرارة الجافة: 180 درجة مئوية، ضغط TIMS-in: 2.6 مللي بار.
    5. اكتساب طيف الكتلة في نطاق 100-1700 م/ز باستخدام وضع DDA التلقائي MS/MS.
      ملاحظة: الجهاز مضبوط لاكتشاف حالات الشحن من 0 إلى 5+. يستخدم تكوين مطيافية حركة الأيونات المحبوسة المزدوجة (TIMS) مع زمن تجميع 100 مللي ثانية و10 مسح تجزئة تسلسلية متوازية (PASEF) لكل دورة اكتساب، مما يؤدي إلى دورة عمل مدتها 1.17 ثانية. يتم ضبط الاستبعاد الديناميكي على 0.4 دقيقة.
    6. إجراء التجزئة باستخدام طاقة تفكك ناجم عن التصادم (CID) مدرجة خطيا من 20-59 إلكترون فولت عبر نطاق حركة الأيونات من 0.6-1.6 فولت/سم².
      ملاحظة: يتم تحديد شدة الهدف عند 20,000، مع عتبة شدة 2,500. يتم تطبيق مضلع مرشح قياسي لإعطاء الأولوية للمقدمات على طول خط المسح القطري للببتيدات المشحونة +2، +3، و+4 في مستوى الحركة m/z-الأيون.
  2. معالجة البيانات المسبقة: تحليل ماكس كوانت
    ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام برنامج MaxQuant v.2.6.713 لتحديد الببتيدات المصابة باللكتيليات.
    1. في القسم العلوي الأيمن، انقر على تبويب التكوين وتحقق من إضافة اللاكتلة كتعديل.
    2. إذا لم يكن كذلك، استخدم قاعدة بيانات Unimod.org14. سجل الدخول كضيف وابحث عن اللاكتيلة (الإصدار #2114).
    3. انقر على زر الإضافة . في الاسم، اكتب Lactylation (K)، وأدخل التركيبة كما هي مكتوبة في Unimod بالنقر على زر التغيير .
    4. تحقق من الكتلة أحادية النظير المكتسبة. انقر على موافق.
    5. في أعلى يسار الشاشة، باللون الأزرق، اضغط على زر حفظ التغييرات .
    6. في القسم العلوي الأيسر، انقر على البيانات الخام. قم بتحميل ملفات البيانات الخام وتسميتها تلقائيا باستخدام زر عدم الكسور .
    7. حدد عدد الخيوط في أسفل اليسار بناء على عدد الأنوية المتاحة على الكمبيوتر.
    8. في تبويب المجموعات الخاصة ، انقر على تعديلات باللون الأزرق.
    9. أضف الاكتلة إلى تعديلات المتغيرات بالنقر على زر السهم لإضافة إلى المربع على اليمين.
    10. انقر على القياس الخالي من الملصقات. أدخل LFQ وغير نوع التطبيع إلى لا شيء.
    11. انقر على الهضم. تأكد من إضافة تريبسين/ب إلى المربع على اليمين.
    12. زد الحد الأقصى للانقسام المفقود إلى 4 لأن اللاكتلة قد تؤثر على هضم التريبسين.
    13. انقر على الجهاز. غير من نوع البحث الرئيسي لتحمل الببتيدات إلى 20، نظرا لأن التسامح اللاكتيلي ليس من حالات PTM شائعة.
    14. في القسم العلوي الأيسر، انقر على المعلمات العالمية. أضف ملف Fasta، تم تحميله سابقا من Uniprot أو Ensembl، للأنواع المقابلة.
    15. انقر على قاعدة المعرف والاختبار للتأكد من إمكانية قراءة ملف Fasta بشكل صحيح.
    16. انقر على قياس كمية البروتين باللون الأزرق. أضف لاكتلة إلى المربع على اليمين.
    17. انقر على التعريف باللون الأزرق. غير FDR إلى 0.05. تأكد من التحقق من الببتيدات الثانية والمطابقة بين الجولات.
    18. انقر على القياس الخالي من الملصقات باللون الأزرق. ضع علامة على مربعات iBAQ وTop3.
    19. في القسم العلوي الأيمن، انقر على الأداء.
    20. في القسم السفلي، اضغط على ابدأ باللون الأزرق.
  3. تحديد البروتينات المقطعة لاكتيلا
    ملاحظة: في نهاية تشغيل MaxQuant، سيتم الحصول على عدة ملفات إخراج، مثل:
    • مواقع اللاكتلة (K): ملف أولي محل اهتمام - يحتوي على معلومات محددة عن بقايا الليسين المكسورة لاكتيلا في تسلسل ببتيد دقيق (البروتين المحدد، تحديد موقع اللاكتيلة في التسلسل، الشدة، مستوى الثقة).
    • معلمات اللاكتلة: تحتوي على جميع المعلومات حول الإعدادات والعتبات المستخدمة أثناء تحليل ماكس كوانت.
    • ببتيدات اللاكتلة: تم تحديد الببتيدات المعدلة وغير المعدلة.
    • مجموعات البروتين في اللاكتلة: تم تحديد مجموعات البروتين وارتباطها باللاكتلة المكتشفة.
    استخدام تلك الملفات يعتمد على سؤال البحث. الخطوة التالية تصف كيفية تحديد الموقع المغطى باللكتيليات.
    1. افتح ملف Lactylation (K)Sites في Excel.
    2. قم بتكرار التبويب في أسفل مواقع Lactylation (K) Sites للاحتفاظ بالبيانات الأصلية.
    3. قم بفرز أعمدة العكسية والعمودية المحتملة للملوثات من A إلى Z. إذا كانت هناك قيمة في بعض الصفوف، احذف تلك الصفوف.
    4. في هذا التبويب الجديد، احتفظ فقط بالأعمدة الضرورية، مثل: (1) البروتين: UniProt14 رقم الوصول الأساسي، (2) المواقع داخل البروتينات: الموقع المتوقع لللاكتلة، مهم للتأكيد كما هو موضح لاحقا، (3) أسماء البروتينات، (4) أسماء الجينات، (5) عدد اللاكتلة (K تم اكتشافه على الببتيد المقابل)، (6) احتمالات اللاكتلة (K) (احتمال 1 في موقع اللاكتلة)، (7) الشدة (مجموع كل الشدة الفردية التي تنتمي إلى الببتيد المقابل).
    5. أكمل أي قيم مفقودة مثل أسماء البروتينات أو أسماء الجينات.
    6. احتفظ فقط برقم الدخول الأول في عمود ''البروتينات''. يمثل الجدول الذي تم الحصول عليه جميع الببتيدات المقطعة لاكتشفا إلى جانب البروتين الأكثر احتمالا الذي يمكن العثور على هذا الببتيد.
      ملاحظة: بما أن التقطيع ليس من الوافد الوافع، فمن المتوقع تحديد ما بين 100 و500 ببتيد على أنها ممزقة باللاكتيل. نظرا لاختلاف الببتيدات المكتشفة من نسخة إلى أخرى، فمن الممكن تحديد عتبة على الأقل تم اكتشافها في نسختين بيولوجيتين.
    7. لتأكيد موقع البقايا المعدلة، استخدم أداة ويب محاذاة مثل BLAST من NIH15 أو Align من UniProt16 مع تسلسل الببتيدات في عمود "احتمالات Lactylation (K)" (امسح أي احتمال) وتسلسل البروتين من قاعدة بيانات UniProt17.
      ملاحظة: بما أنه يمكن تحديد عدة مواقع لاكتلة في تسلسل بروتين واحد، فمن الممكن محاذاة هذه المواقع في نفس الوقت. سيساعد ذلك أيضا في تحديد المواقع المكررة التي قد تكون على ببتيدات مختلفة ولكن في نفس الموقع في تسلسل البروتين.
    8. سيعتمد تحليل البيانات على سؤال البحث، لكن من الضروري النظر في خطوات التطبيع، والتوسط، والتكبير، وتحويل اللوغاريتيوم قبل إجراء أي تحليل إحصائي للبيانات18.
    9. لتأكيد البروتينات المصابة باللاكتيلات التي تم تحديدها بواسطة تحليل التصلب المتعدد، تابع بروتوكول التقرب المناعي.

4. التفاعل المناعي (IP)

  1. استخراج البروتين
    ملاحظة: اعمل على الجليد.
    1. جهز محلول التحليل الداخلي/مخزن الغسيل (الجدول 3) وخزنه عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. أضف مثبطات البروتيز قبل الاستخدام مباشرة.
      ملاحظة: لتحضير العينة، يمكن استخدام حبيبة خلية محفوظة عند -80 درجة مئوية. إذا كنت تعمل مع خلايا جديدة، اتبع الخطوات 4.1.2 و4.1.3. وإلا، أعد تعليق حبيبة الخلية في نفس حجم محلول التحلل/الغسيل المكتوب كما هو مذكور في الخطوة 4.1.2 واستمر في الخطوة 4.1.4.
    2. أضف 1 مل من محلول التحليل والغسل واحتضن الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. اجمع الخلايا باستخدام مكشطة الخلايا ونقل التحلل إلى أنبوب ميكرو بحجم 1.5 مل.
    4. حضن بتدوير لطيف من طرف إلى طرف لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    5. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. انقل المادة الشفافة إلى أنبوب ميكرو جديد بسعة 1.5 مل.
    7. قم بقياس كمية البروتين باستخدام مجموعة BCA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. تنظيف مسبق من الخرزات وحضانة الأجسام المضادة ل KL-LA
    ملاحظة: العمل على الثلج. لكل حالة تجريبية، جهز أنبوب تحكم IP (IgG من نفس نوع الجسم المضاد KL-LA ) وأنبوب ل KL-LA IP.
    1. انقل 1 ملغ من البروتينات إلى أنبوب ميكرو جديد بحجم 1.5 مل. أكمل جميع العينات إلى نفس الحجم النهائي باستخدام تحليل IP/مخزن الغسيل.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام خرز مغناطيسي أو خرزات أغاروز. في الخطوات التالية، تم استخدام خرز مغناطيسي.
    2. انقل حجم الخرزات المطلوب إلى أنبوب ميكرو جديد بسعة 1.5 مل.
    3. لغسل الخرزات مسبقا، قم بتمغنيطها لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح المحلول صافيا. تخلص من السوبرناتانت الشفاف. اغسل الخرز ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول التحليل أو الغسل IP. تخلص من المادة الشفافة بعد كل غسل. أضف نفس حجم المحلول الشفاف مثل حجم الخرزات التي تم أخذها في البداية.
    4. حضن عينات البروتين ب 10-15 ميكرولتر من الخرزات المغسولة مسبقا مع تدوير لطيف من الطرف إلى الطرف لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: للحصول على 1 ملغ من البروتين، استخدم 10-15 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية. تقلل هذه الخطوة من ارتباط البروتين غير النوع بالخرزات أثناء بروتوكول التكرار المناعي.
    5. قم بتمغنطة الخرزات لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح المحلول شفافا. انقل المادة الشفافة إلى أنبوب ميكرو جديد بحجم 1.5 مل.
    6. أضف 1.5 ميكرولتر من الجسم المضادل-LAمضاد ل K في أنبوب واحد وكمية مقابلة من IgG في أنبوب آخر.
      ملاحظة: للحصول على 1 ملغ من البروتين في بداية هذا البروتوكول، استخدم 1.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة.
    7. حضن العينات بتدوير لطيف من الطرف إلى الطرف طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  3. كيإل-لوس أنجلوس التكرار المناعي
    ملاحظة: اعمل على الجليد.
    1. جهز محلول التحليل الداخلي/مخزن الغسيل (الجدول 3) وخزنه عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. أضف مثبطات البروتيز قبل الاستخدام مباشرة.
    2. اغسل الخرزات مسبقا كما هو موضح في الخطوة 4.2.3.
      ملاحظة: للحصول على 1 ملغ من البروتين في بداية هذا البروتوكول، استخدم 40 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية.
    3. حضن العينات ب 40 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المغسولة مسبقا مع دوران لطيف من الطرف إلى الطرف لمدة 4 ساعات عند 4 درجات مئوية.
    4. قم بتمغنط الخرزات لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح المحلول صافيا. اجمع أول سوبرناتانت شفاف. اغسل الخرزات 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول التحليل أو محلول الغسيل IP. أزل المادة الشفافة بعد كل غسل.
      ملاحظة: يمكن قياس أول مادة فائقة واستخدامها في التلوين الغربي (WB). من المفيد تقييم فعالية التقرب المناعي.
    5. أعد تعليق الخرزات باستخدام 20 ميكرولتر من 2x Laemmli و5٪ من β ميركابتوإيثانول خازن.
    6. حضن على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق قبل تحميلها على جل SDS-PAGE. بدلا من ذلك، يمكن تخزين العينات المزيفة عند -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  4. اكتشاف الغرب
    1. ضع أنابيب IP على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية قبل جمع العينة وتحميلها على جل SDS-PAGE.
    2. قم بإجراء WB باستخدام جسم مضاد ضد البروتين المعني و/أو الجسم المضاد ل KL-La لتأكيد سحب البروتينات المكشوفة لبنتيلة في ألبومين مصل البقري 5٪ (BSA). تم تخفيف الأجسام المضادة الثانوية عند 1:5000 في 5٪ BSA.
    3. اكتشف النطاقات باستخدام كشف الإضاءة الكيميائية المعتمد على HRP.

النتائج

كمثال، تم زراعة خط خلايا سرطان الخلايا الحرشفية في المريء TE11 حتى وصل إلى التقاء بنسبة 80٪. وفقا لسير العمل الموضح في الشكل 1 وتحليل MaxQuant كما هو موضح في هذا البروتوكول، تم تحديد اللاكتيلوم. في تلك الخلايا، تم تحديد 137 ببتيدا على أنها محتملة لاكتيلية، تمثل 82 بروتينا فريدا، حيث تم تحديد مواقع متعددة على نفس البروتين (الشكل 2A). لاحظ أن هذا لا يشمل الببتيدات الفريدة. من المتوقع وجود عدد بين 100 و500 ببتيد محدد في تلك التجارب على خطوط سرطان الخلايا الحرشفية المريء.

البروتينات اللاكتيلية التي تم تحديدها مرتبطة بعدة عمليات بيولوجية، مثل إعادة تشكيل الكروماتين أو تجميع الكروماتين، والتي وصفت بالفعل في الأدبيات بأنها غنية بالبروتينات اللاكتيلية (الشكل 2B). بعض أولى البروتينات المكشوفة باللاكتيلات كانت الهستونات، والتي يمكن العثور عليها أيضا في هذه البيانات، مثل هيستون H1.2 (الجدول 4). يمكن تحديد اللاكتلة على عدة بقايا ليسين مختلفة من نفس البروتين. على سبيل المثال، تم تحديد موقعين لللاكتلة على هيستون H1.2: الليسينات (K) 168 (على الأرجح) و191. في الببتيد الأول (الجدول 4، السطر 2)، لوحظ أن بقايا K168 لها احتمال أعلى لتكون تلك التي تم تعريضها لاكتيلية ب 0.733 على 1 بينما K169 لديها احتمال 0.267 فقط. HNRNPA1 مثال جيد على ببتيد يحتاج إلى محاذاة لتحديد البقايا المعدلة المناسبة.

للتحقق من صحة لاكتلة HNRNPA1 بناء على نتائج لاكتيلوم (الجدول 4)، تم إجراء اختبار IP يستهدف هذا التعديل بعد الترجمة. أولا، لتحديد أي نوع من الخرزات يظهر تفاعلا مثاليا مع الجسم المضاد ل-LA المضاد ل KL-LA، تم مقارنة خرزات G وخرزات A/G. بعد إجراء اختبار IP مع جسم مضاد KL-LA وتبعه اختبار WB ضد KL-LA، لوحظ إثراء مرئي في بروتينات KL-LA مقارنة بالمدخلات كما هو متوقع في كلا نوعي الخرزات (الشكل 3). تظهر هذه النتائج كفاءة ومتانة البروتوكول في إثراء البروتينات المكشوفة باللاكتيل. لم يلاحظ فرق ملحوظ بين نوعي الخرزات اللذين تم اختبارهما. من أجل التحقق من الأهداف التي يحددها التصلب المتعدد، يمكن بعد ذلك تأكيد IPs محددة. على سبيل المثال، تم معايرة اللاكتلة في HNRNPA1، التي تم تحديدها بواسطة MS (الجدول 4). تم اكتشاف نطاق محدد يتوافق مع HNRNPA1 بعد KL-LA IP و HNRNPA1 WB، مما يشير إلى أن HNRNPA1 يتم تعديله بواسطة التقطيع (الشكل 4). بينما نجحت كل من حبيبات G وA/G في ترسيد البروتين المستهدف مناعيا، لوحظ إشارة أكثر كثافة من HNRNPA1 مع خرز A/G، مما يشير إلى زيادة الألفة أو الاستعادة.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل لتحليل اللكتيلوم. الاختصارات: IP = التكرار المناعي; KL-LA = L-لاكتيلليزين; LC-MS/MS = الكروماتوغرافيا السائلة-مطيافية الكتلة المتتالية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: النتائج التمثيلية لبعض البروتينات التي تم الحصول عليها لحمض لاكتيليم خلايا TE11. (أ) إجمالي عدد البروتينات والببتيدات التي تم تحديدها. يمكن تحديد عدة مواقع لاكتلة على نفس البروتين. (ب) أفضل 5 عمليات بيولوجية مثرية للبروتينات المصابة باللاكتيلات في خلايا TE11 تم الحصول عليها باستخدام قاعدة بيانات STRING. تم تصحيح قيمة P لاختبارات متعددة باستخدام بنجيميني-هوشبرغ. يمثل الرقم في كل شريط عدد البروتينات في الشبكة التي تم تحديدها كبروتينات مبتلة من إجمالي عدد البروتينات في هذا العلم الجيني (GO). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: التقرب المناعي ل KL-LA باستخدام خرزات G أو A/G وكشف ال WB لبان-كL-LA في خلايا TE11. يعد اكتشاف بان-كL-LA أداة تحكم حاسمة لتأكيد فعالية وخصوصية التفاعل المناعي لهذا ال PTM. تضمن هذه التجربة أن ال IP يثري بنجاح البروتينات التي تحمل تعديل KL-LA . (*) يشير إلى السلاسل الثقيلة والخفيفة للأجسام المضادة، كما لوحظ بوضوح في ممرات IP: IgG (التحكم IP) (N = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التكرار المناعي ل KL-LA باستخدام خرزات G أو A/G واكتشاف HNRNPA1 بواسطة WB. يؤكد اكتشاف HNRNPA1 بواسطة WB في الترشيحات المناعية الخاصة ب KL-LA باستخدام حبات G أو A/G أن التقطيع في خلايا TE11 (N = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الحلالتركيز النهائي
اليوريا8 م
بيكربونات الأمونيوم1 م
هيبس20 مللي مولار

الجدول 1: حاجز تحلل اللاكتيلوم. التحضير في مياه من درجة MS وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.

الحل - مخزن غسيل لاكتيلومالتركيز النهائي
NaCl100 مللي موتر
EDTA1 مللي مولار
تريس-HCl20 مللي مولار
إضافة مخزن IP للاكتيلومالتركيز النهائي
NP-400.5%

الجدول 2: مخزن غسل اللاكتيلوم ومخزن IP. التحضير في مياه من درجة MS وضبط درجة الحموضة إلى 8 لكلا المحلولين.

الحلالتركيز النهائي
كلوريد الصوديوم100 مللي موتر
فلوريد الصوديوم50 مللي موتر
تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)50 مللي موتر
β-جليسروسفات40 مللي موتر
EDTA (pH 8)5 مللي مولار
الجلسرول5%
ترايتون X-1001%
أضف الطازج:
كوكتيل مثبط البروتيز 100X1X
PMSF1 مللي مولار
الأورثوفاناديت0.2 مللي مولار

الجدول 3: تحلل/محلول الغسيل في ال IP. يجب أن يكون خاليا من المواد الكيميائية، لأنها قد تزعزع وجود PTMs على البروتينات.

المواقع داخل البروتيناتالبروتينأسماء البروتيناتأسماء الجيناتعدد اللاكتلة (K)احتمالات اللاكتلة (K)الشدة
168P16403هيستون H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403هيستون H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0بروتين شبيه ب ألفا-2-ماكروغلوبولين 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0نظير بروتين كروموبوكس 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0نظير بروتين كروموبوكس 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2بروتين JTBJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651بروتين الريبونوكليوبروتين النووي غير المتجانس A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

الجدول 4: النتائج التمثيلية للببتيدات المكبوتة لاكتيلية التي تم الحصول عليها لسلسلة سرطان الخلايا الحرشفية المريء TE11. تم الحصول على هذا الجدول بعد تحليل MaxQuant.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام التقسيس المناعي لبروتينات KL-LA المعدلة في التصلب المتعدد لاكتشاف بروتينات جديدة متسللة لاكتيلية ومواقع لاكتلة لاكتيلتها. يتم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام خرز مترافق، لكنه يمكن تحقيقه باستخدام الأجسام المضادة KL-LA أو حتى الأجسام المضادة KD-LA وفقا لسؤال البحث. إذا استخدم الجسم المضاد بدلا من الخرزات المترافقة، فإن اختيار جسم مضاد متعدد النسيلات يسهل تكوين مركبات أكثر إحكاما لأنه يمكنه الارتباط بعدة حوامت؛ ومع ذلك، قد يؤدي هذا النهج إلى إضافة تنوع. إحدى مزايا استخدام الخرزات المترافقة هي أنها تمنع الجسم المضاد من التسرب - أي إطلاقه من الدعم الصلب - مما قد يلوث عينات التصلب المتعدد. كما أنه أكثر كفاءة في الوقت من استخدام الجسم المضاد غير المترافق.

علاوة على ذلك، من المهم ملاحظة أن كمية الببتيدات المحددة في هذا النوع من التحليل يمكن أن تتأثر بعوامل متعددة1. أولا، تلعب خصوصية الأجسام المضادة دورا حاسما في ضمان التقاط البروتين الصحيح. إضافة خطوة للتنظيف المسبق باستخدام خرز الأغاروز قد يكون وسيلة لإزالة التفاعلات غير المحددة. من ناحية أخرى، من غير المعروف ما إذا كان اللاكتيليشن يمكن أن يؤثر على هضم التريبسين، حيث يقطع الببتيدات على الجانب الأقصى من بقايا الأرجينين، ولكن الأهم من ذلك، بقايا الليسين. إذا كان هذا هو الحال، فقد يؤدي ذلك إلى تقليل تغطية الببتيدات. لذا، من الممكن النظر في خيارات أخرى للبروتيازات. في هذا البروتوكول، يتم زيادة المعامل "الحد الأقصى للانفصال" لأخذ هذا القيد في الاعتبار. أخيرا، يجب أيضا أخذ التحضير والتعامل مع العينات، مثل استخدام القفازات لمنع تلوث العينات بالكيراتينات من الجلد، أو استقرار التعديل، حيث أن معدل دوران PTM هو عملية ديناميكية وأحيانا سريعة6، يجب أيضا النظر في الاعتبار.

على عكس النهج الأوسع للتصلب المتعدد الذي أدى إلى انخفاض الكشف عن PTM منخفض الوفرة، مثل اللاكتلة، فإن تحديد الببتيداتالغنية ب K L-LA عبر البروتيوميات المعتمدة على التصلب المتعدد يسمح بتحليل موقعي PTM مفصل، مثل تحديد مواقع اللاكتلة الجديدة والبروتينات المقطعة19. يمكن لنقطة ويسترن أن توفر معلومات عن النمط العام لللاكتلة الموجود في الخلايا، لكنها لا تستطيع الإبلاغ عن اللاكتلة الخاصة بالبروتين. لذا، فإن تقنية الربط الغربي هي الطريقة الشائعة لتأكيد PTM20 المكتشفة بالتصلب المتعدد. اختبار ربط القرب (PLA) هو تقنية أخرى يمكن استخدامها لتأكيد لاكتلة الأهداف المحتملة التي حددها البروتيوميات21. يمكن أن تشير هذه التقنية أيضا إلى تحديد مواقع البروتينات المعدلة، لكنها ذات خصوصية أقل. استخدام نهج IP خاص باللاكتلة مناسب لفحص PTM الواسع، لكنه قد يكون مثيرا للاهتمام إجراء بروتوكول IP خاص بالبروتين حسب سؤال البحث.

عند قياس نسبة بروتين معين ممزق لاكتيلا في مستخلص البروتين الكلي، فإن إجراء IP وحده غير كاف. بينما يسمح IP باستخدام خرزات KL-LA بالتقاط البروتينات المكسوسة باللاكتيلة، إلا أنه لا يقيس نسبة اللاكتلة بدقة، لأنه يقتصر على إثراء البروتينات المستهدفة. لذلك، يتطلب الأمر تحليل مطياف كتلي أكثر تفصيلا يسمح بقياس كمية دقيقة لللاكتيلية. لذا، فإن إجراء تحليل للطيف لبروتين محتمل أن يكون لاكتيلا باستخدام جسم مضاد ضد ذلك البروتين، يليه تحليل مطيافية الكتلة، يمكن أن يحدد نسبة البروتينات الممطية في عينة البروتين الكلية، بينما يعد إجراء IP نهجا فعالا لتأكيد لاكتيلية البروتينات التي تم تحديدها على أنها متسللة بواسطة التصلب المتعدد.

في نظام IP يستخدم الأجسام المضادة غير المترافقة، يعد تحسين نسبة الخرزات إلى الأجسام المضادة أمرا ضروريا لضمان التقاط مثالي للبروتينات المكسوسة باللاكتيل. في الواقع، يؤثر التوازن بين هذين المكونين بشكل مباشر على خصوصية وكفاءة البروتينات المضادة. يمكن أن يؤدي فائض الأجسام المضادة إلى ارتباط غير محدد، مما يزيد من الضوضاء الخلفية ويقلل من دقة الكشف بشكل عام. على النقيض من ذلك، يمكن أن يؤدي العكس إلى إثراء البروتين المستهدف غير فعال، مما يؤدي إلى إشارات أضعف وانخفاض الحساسية. هذه الاعتبارات التقنية ضرورية للحصول على نتائج موثوقة ودقيقة في دراسة البروتينات الممزقة باللاكتيل.

في الختام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لمراقبة التغيرات في ملفات التحفيز بعد اضطراب التوازن الداخلي، مثل السرطان 8,10، والتي قد تؤثر على الاستجابة المتعلقة بالأدوية. يمكن حتى تحقيق تحديد العلامات الحيوية باستخدام هذه الطريقة. قابلة للتطبيق على عدة خطوط خلية، وأنواع الأنسجة، وحتى خزعات المرضى، وتحمل هذه التقنية القدرة على تعميق فهم إشارات الخلايا المدفوعة ب PTM في الأمراض أو الحالات الطبيعية.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب مصالح للكشف عنه.

شكر وتقدير

نشكر جميع أعضاء مختبر جيرو بصدق على المناقشات العلمية. نحن ممتنون لمنصة البروتيومية ومطيافية الكتلة من كلية الطب والعلوم الصحية - جامعة شيربروك على تقديم الخدمات والإرشاد. تحظى VG بدعم مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (RJPIN-2019-06185) والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (178171). يحمل VG كرسي البحث الكندي من المستوى الثاني في علم أحياء الخلايا الجذعية في الجهاز الهضمي. حصل MH على منح دراسية من مركز أبحاث الالتهاب والأورام الهضمية في جامعة شيربروك، وجامعة شيربروك مؤسسة سيف، وCRCHUS، وبرنامج TRaIning A New Generation من الباحثين في أمراض الجهاز الهضمي والليفر (TRIANGLE)، وبرنامج FRQ. FMB هو باحث في برنامج FRQS (366044). VG وFMB أعضاء في "مركز أبحاث CHUS" الممول من FRQS.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
رأس بسحاب 100 ميكرولتر C18 بيرس87784
أكلايم PepMap100 C18شركة ديونيكس1649460.3 مم تعريف × 5 مم
الأسيتونيتريل (درجة MS)فيشرA955-4
بيكربونات الأمونيومسيغما-ألدرتشA6141-500
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة HNRNPA1نوفوس بيولوجيكس NB100-672
الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة ل-L-L-L-Lactylysine (KL-La)بي تي إم-بيوPTM1401RM
IgG مضاد للفئران، وهو الأجسام المضادة المرتبطة ب HRPCST7076S
IgG مضاد للأرانب، وهو جسم مضاد مرتبط ب HRPCST7074S
Azure 280الأنظمة الحيويةAZI280-01
مجموعة BCAثيرمو فيشر العلميP123227
مصل بوفين ألبومين (BSA)ويسنت800-095-EG
مصدر nanoESI البخاخ الأسربروكر دالتونيكس
الكلوروأسيتاميدسيغما-ألدرتشC0267
ركيزة Clarity Max Western ECLبيو-راد1705062
ديثيوثرايتول (DTT)ثيرمو فيشر العلميR0861
خرزات Dynabeads Protein G لعلاج المناعةثيرمو فيشر العلمي10004D
EDTAسيغما-ألدرتشE9884
حمض الفورميك (FA؛ درجة ماجستير (MS)ثيرمو فيشر العلميA117-50
الجلسرولفيشر ساينتيفكBP229-1
هيبس (ذكر سنة)ويسنت330-050-EL
عمود Hypersep C18 100 ملغفيشر60108-302
خرزات الأروز المترافقة مع كوالالمبور لوس أنجلوسبي تي إم-بيوPTM-1404
Laemmli 2X (SDS، بروموفينول)ويزنت، ج. ت. بيكر800-100-CG، D293-01
أنبوب ميكرو منخفض الارتباط 0.5 ملسارستيدت72.704.600
أنبوب ميكرو منخفض الارتباط 1.5 ملثيرمو فيشر العلميP190410
أنابيب دقيقة 1.7 ملأكسجينMCT-175-C
نظام نانو إيلوت HPLCبروكر دالتونيكسحجم الجسيمات 1.9 ميكرومتر، قطر التعريف 75 مم × 25 سم
الأجسام المضادة متعددة النسيات IgG الأرنب العاديةميليبور سيغما12-370
PepSepبروكر دالتونيكس1811112
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ويسنت311-425-CL
PMSFثيرمو فيشر العلمي36978
كوكتيل مثبط البروتيز (PIC)سيغما-ألدرتشP8340-5
جسيمات مغناطيسية من بروتين A/G من Sera-Mag SpeedBeadsثيرمو فيشر العلمي09-981-920
كلوريد الصوديومسيغما-ألدرتشS9888-500
فلوريد الصوديومسيغما-ألدرتشS1504
الصوديوم أورثوفاناديتسيغما-ألدرتشS6508
مطياف الكتلة TimsTOF pro&nb;بروكر دالتونيكس
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)ثيرمو فيشر العلميA116-50
تريس-HClويسنت600-125-IK
ترايتون X-100سيغما-ألدرتشX100
التربسين (درجة التصلب المتعدد)بيرس90058
اليورياثيرمو فيشر العلميتحت 15-500
Vaccufuge Plusإبندورف22820168
الماء (درجة MS)VWR10803-890A
&بيتا;-جليسروسفاتسيغما-ألدرتشG5422
β-ميركابتوإيثانولسيغما-ألدرتشM3148

المراجع

  1. Li, H., Sun, L., Gao, P., Hu, H. Lactylation in cancer: Current understanding and challenges. Cancer Cell. 42 (11), 1803-1807 (2024).
  2. Lu, Z., et al. Lactylation: The emerging frontier in post-translational modification. Front Genet. 15, 1423213(2024).
  3. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  4. Niu, Z., et al. HBO1 catalyzes lysine lactylation and mediates histone H3K9la to regulate gene transcription. Nat. Commun. 15 (1), 3561(2024).
  5. Zhao, Q., et al. Non-enzymatic lysine D-lactylation induced by glyoxalase II substrate SLG dampens inflammatory immune responses. Cell Res. 35 (2), 97-116 (2025).
  6. Moreno-Yruela, C., et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 8 (3), eabi6696(2022).
  7. Yang, W., et al. Hypoxic in vitro culture reduces histone lactylation and impairs pre-implantation embryonic development in mice. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 57(2021).
  8. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat. Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  9. Zhang, N., et al. Protein lactylation critically regulates energy metabolism in the protozoan parasite Trypanosoma brucei. Front Cell Dev Biol. 9, 719720(2021).
  10. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  11. Kim, M. -S., Zhong, J., Pandley, A. Common errors in mass spectrometry-based analysis of post-translational modifications. Proteomics. 16 (5), 700-714 (2016).
  12. Conradi, C., Shiu, A. Dynamics of post-translational modification systems: Recent progress and future directions. Biophys J. 114 (3), 507-515 (2018).
  13. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  14. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  15. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  16. Zaru, R., Orchard, S. UniProt Consortium. UniProt Tools: BLAST, Align, Peptide Search, and ID Mapping. Curr Protoc. 3 (3), e697(2023).
  17. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  18. Sun, J., Xia, Y. Pretreating and normalizing metabolomics data for statistical analysis. Genes Dis. 11 (3), 100979(2023).
  19. Yang, Y., Qiao, L. Data-independent acquisition proteomics methods for analyzing post-translational modifications. Proteomics. 23 (7-8), e2200046(2023).
  20. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein post-translational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  21. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. J Vis Exp. (185), e64294(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة