$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
توسيم الخلايا الجذعية الوسيطة مع صبغة الفلورسنت هل
- لبدء إجراءات لوضع العلامات الخلايا الجذعية الوسيطة ، ويعرض للتريبسين عدد الخلايا للحصول على تعليق مع عدد محدد من الخلايا.
- تأخذ الخلايا من الحاضنة ونضح من وسائل الإعلام القديمة من القوارير التي تحتوي على خلايا يمكن وصفها
- غسل الخلايا مع 10 مل من مغ / كا خالية من برنامج تلفزيوني. نضح بها في برنامج تلفزيوني. فإن المغنيسيوم والكالسيوم وتمنع التربسين ، وبالتالي فإننا نستخدم برنامج تلفزيوني من دون هذه.
- إضافة قبل التربسين تحسنت 0.05 ٪ ، وذلك لأننا نستخدم قارورة T75 5ml. ضمان أن يتم تغطية كامل سطح القارورة.
- احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 5 دقائق.
- تأكيد انفصال تحت المجهر. إذا كانت الخلايا لا تزال تلتزم القارورة ، اضغط عليها عدة مرات والانتظار لفترة أطول قليلا حتى trypsinization الناجحة.
- الآن ، فإنه من الضروري تحييد التربسين بإضافة وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 ٪ FCS. نستخدم مبلغ مساو من وسائل الاعلام كما يوجد التربسين.
- ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لضمان كافة الخلايا إعادة معلقة في وسائل الإعلام.
- نقل الخلية إلى حل عقيم 15ml الانبوب البولي بروبلين توج.
- الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- نضح خارج طاف ضمان عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
- Resuspend الخلايا في DMEM والمضي قدما في عدد الخلايا.
- تعليق الخلايا ليكون المسمى في كثافة 1x10 ^ 6 في مل في مستنبت المصل الحرة (DMEM).
- وكان كل هذا التحضير لتعليق الخلية. الآن ، وانها مستعدة لبدء وضع العلامات.
- الأولى ، إضافة 5 ميكرولتر من عامل تباين هل مل من التعليق في الخلية.
- ثم ، مزيج الحل بواسطة pipetting بلطف.
- احتضان الخلايا مع الحل وضع العلامات عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في طبق المنخفضة المرفق 6 أيضا.
- بمجرد اكتمال حضانة بسيطة ، فمن الضروري لنقل الخلية إلى حل أنبوب 15 مل توج البولي بروبلين.
- أجهزة الطرد المركزي لأسفل في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- نضح بها الوسم المتوسط ، وضمان عدم تعكير الخلية بيليه.
- غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا ، والتأكد من لتفريق بيليه الخلية.
- كرر الخطوتين الأخيرتين أكثر من مرة ، حتى لا يكون هناك ما مجموعه 3 خطوات الغسيل.
- عدد الخلايا وإجراء اختبار لتحديد التريبان الأزرق بقاء الخلية. هذه الثقافة هي المعيار بروتوكولات الخلية أننا لن أشرح هنا.
- الخلايا الخاصة بك الآن على استعداد ليمكن تصوير في تصوير الضوئي.
توسيم الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ICG صبغة الفلورسنت
- لبدء إجراءات لوضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، وإعداد وكيل النقيض من خضرة الإندوسيانين. مزجها مع ترنسفكأيشن بروتامين الوكيل.
- قياس خارج 1mg من المسحوق خضرة الإندوسيانين. حل مسحوق ICG في 100 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO).
- إضافة 400 ميكرولتر من النسور Dulbecco ومتوسطة التعديل (العجل الجنين DMEM + 10 ٪ المصل) وسائل الإعلام إلى الخليط ويهز جيدا. هذه النتائج في التركيز النهائي لل2mg/ml من خضرة الإندوسيانين.
- إضافة بروتامين كيل ترنسفكأيشن. بروتامين الأفعال باعتبارها وكيلا للمكوك النقيض من ذلك ، بحيث يحصل داخل الخلية بشكل أكثر كفاءة.
- مزيج 5 سلفات بروتامين ميكرولتر ، والتي يتم توفيرها في تركيز 10mg/ml ، مع 300 و 300 ميكرولتر ICG ميكرولتر المصل الحرة Dulbecco ومتوسطة النسور التعديل.
- يهز بلطف الحل ترنسفكأيشن جديدة لمدة 5 دقائق للسماح معقدة لتشكيل.
- الحل هو وضع العلامات جاهزة.
- نضح من وسائل الإعلام القديمة من طبق بيتري hESC 10MM.
- إضافة 5ml من المصل DMEM خالية قبل تحسنت.
- إضافة الحل أعدت مسبقا بروتامين / ICG إلى الخلايا. بدء الحضانة 1 ساعة عن طريق وضع الطبق في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- بعد اكتمال الحضانة ، وإزالة الطبق من الحاضنة ونضح من الحل التوسيم.
- غسل الخلايا وذلك بدهن الطبق مع PBS 5 مل.
- نضح بها في برنامج تلفزيوني واستبدال التربسين 5ml من 0.25 ٪. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح trypsinization تحدث. فهو يساعد على التخلص الطبق قليلا في كل مرة واحدة في حين لاخر.
- ماصة بلطف صعودا ونزولا ، لتفريق المستعمرات المتبقية.
- تحييد التربسين بإضافة مبلغ مساو من KSR إلى الطبق.
- نقل الخلية إلى حل 15ml أنبوب الطرد المركزي والحل في إطار التعاون الإقليمي 400 لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام الكاملة.
- إذا كان لا يزال هناك كتل عند هذه النقطة ، ويعرض للتريبسين الطرد المركزي مرة أخرى.
- حالما يتم التوصل إلى حل أجمة خالية من الخلية ، ونضح من وسائل الإعلام القديمة وresuspend لبيليه في 10ML من قبل وسائل الإعلام تحسنت ESC الكامل.
- عند هذه النقطة ، فمن الضروري فصل الخلايا المغذية الماوس من hESCs. يتم ذلك لضمان أنه في وقت لاحق ، فقط تصوير الخلايا الجذعية يحدث.
- لهذا ، ونقل عشرةه حل خلية إلى الجيلاتين المغلفة طبق 10 سم.
- وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية واتركه لمدة 45 دقيقة. خلال هذا الوقت ، تأكد من عدم تعكير صفو الطبق. الآن ، سوف تلتزم مغذيات الطبق والخلايا الجذعية لن.
- نقل الحل للخروج من صحن بيتري. والآن لدينا الحل الخلايا المسمى واحد من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
- ويمكن الآن أن تحسب الخلايا ، ويمكن إجراء اختبار أزرق التريبان عليها.
- الخلايا جاهزة للتصوير!