يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إنشاء نظام تربية تريبس الفلفل الحار (Scirtothrips dorsalis Hood) لفحص ضراوة الفطريات المسببة للحشرات

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68600

⸱

يوليو 18, 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

في هذه المقالة

ملخص

تم إنشاء بروتوكول الاختبار الحيوي للأوراق المنفصلة لتربية تريبس الفلفل الحار بكميات كبيرة باستخدام طريقة معدلة للأوراق المنفصلة في حاويات زجاجية تحتوي على أجار ، مما يضمن بقاء عاليا وتطورا متزامنا. يتيح هذا النظام الفحص الفعال لضراوة الفطريات الممرضة للحشرات ضد يرقات الطور الثاني ويوفر إمدادات تريبس موثوقة للتقييمات المختبرية والدفيئة والميدانية.

الملخص

تريبس الفلفل الحار (Scirtothrips dorsalis Hood) هي آفة ذات أهمية اقتصادية لمحاصيل الزينة والمواد الغذائية في تايوان. تعمل الفطريات المسببة للحشرات (EPF) كعامل مكافحة بيولوجي صديق للبيئة لإدارة التربس. من الأهمية بمكان فحص ضراوة عزلات EPF ضد تريبس الفلفل الحار في ظل ظروف المختبر قبل التطبيق الميداني. ومع ذلك ، فإن البيانات المحدودة حول طريقة تربية تريبس الفلفل الحار تشكل تحديات للفحص المختبري على نطاق واسع. لمعالجة هذه المشكلة ، قمنا بتطوير طريقة تربية مختبرية معدلة للإنتاج الضخم للمكورات العلفية الظهرية.

تستخدم الطريقة نظام تربية أوراق منفصلة باستخدام حاوية زجاجية تحتوي على أجار مناسبة لتقييم EPF ضد تريبس الفلفل الحار. يعد نظام الاختبار الحيوي المحسن للأوراق المنفصلة مناسبا لتقييم فعالية EPF ضد تريبس الفلفل الحار. يتمتع النظام بالقدرة على إنتاج أعداد كبيرة من التربس في نفس المرحلة التنموية لفحص الفوعة. وفقا للاختبار ، أظهرت النتيجة أن عزل Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213) أظهر أعلى ضراوة (53.6٪) ضد يرقات الطور الثاني من تريبس الفلفل الحار بعد 7 أيام من التلقيح (d.p.i.). علاوة على ذلك ، ظلت أقراص الأوراق المدمجة في أجار طازجة لأكثر من 7 أيام ، مما سمح للتربس بالبقاء على قيد الحياة (معدل بقاء 90٪ من معالجة التحكم) طوال فترة المراقبة ، مما يشير إلى استقرار نظام التربية. يوضح هذا البروتوكول نظاما مستقرا للتربية للإنتاج الضخم ولتقييم ضراوة عزلات EPF ضد تريبس الفلفل الحار والتي قد يكون لها فائدة على تريبس الأخرى ، مما يتيح فحص عزلات EPF المحتملة للسيطرة على تريبس في الحقل.

المقدمة

تريبس الفلفل الحار (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) هي آفة متعددة الآفات تصيب أكثر من 100 نوع نباتي عبر 40 عائلة مختلفة من النباتات ، بما في ذلك الخضروات ومحاصيل الزينة والفاكهة1. موطنها الأصلي آسيا الاستوائية وشبه الاستوائية وجنوب شرق آسيا والهند واليابان وتايوان2. على حد علمنا ، فإن تريبس الفلفل الحار هو آفة المحاصيل الزراعية والزينة ، بما في ذلك المانجو والشاي والتوت واللوتس في تايوان. خلال العقدين الماضيين ، أصبح تريبس الفلفل الحار آفة اقتصادية كبيرة في العديد من البلدان بسبب زيادة العولمة والتجارة الزراعية المفتوحة. بالإضافة إلى ذلك ، ساهمت الإمكانات الإنجابية العالية والقدرة على التكيف مع المناطق التي تم غزوها حديثا في انتشار هذه الآفة1،3.

يتغذى تريبس الفلفل الحار بشكل أساسي على أوراق الشجر الصغيرة والبراعم وبتلات الزهور والفواكه غير الناضجة ، مما يؤدي إلى نخر وموت الأنسجة3. علاوة على ذلك ، فهي بمثابة ناقل لأمراض النبات المختلفة ، بما في ذلك فيروس نخر براعم الفول السوداني (GBNV) ، وفيروس بقعة المروحة الصفراء للفول السوداني (GCFSV) ، وفيروس البقعة الصفراء للفول السوداني (GYSV) 4 ، وفيروس خط التبغ (TSV)5. نتيجة لذلك ، يمكن أن تؤدي التغذية بالتربس الحار إلى تقليل غلة وقيمة المحاصيل المتأثرة بشكل كبير. تعتمد الإدارة الناجحة لتريبس الفلفل الحار على خطة متكاملة لإدارة الآفات تستخدم استراتيجيات المكافحة الثقافية والبيولوجية والكيميائية1. في تايوان ، يستخدم المزارعون العضويون عادة مواد غير كيميائية ، مثل زيت النيم ضيق المدى ، أو طرق المكافحة البيولوجية ، بما في ذلك استخدام العث المفترس وحشرات القراصنة الدقيقة (عن طريق الملاحظة الشخصية). ومع ذلك ، بناء على تعليقات المزارعين ، قد يتداخل تطبيق هذه الزيوت خلال موسم الإزهار والإثمار مع التلقيح ويتلف حبوب اللقاح ، مما يؤدي إلى انخفاض المحصول والقيمة الاقتصادية. لذلك ، فإن تطوير تدابير تحكم بديلة فعالة لتريبس الفلفل الحار أمر بالغ الأهمية للمزارعين العضويين.

الفطريات الممرضة للحشرات (EPF) هي مجموعة من الفطريات القاتلة للحشرات التي ثبت أنها تقنية فعالة ومستدامة لإدارة الآفات6،7،8. أثبتت العديد من الدراسات فعالية EPF ضد تريبس الفلفل الحار. أظهرت EPFs التجارية ، Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) ، و Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC) ، تحكما كبيرا في تريبس الفلفل الحار على نباتات الورد9،10. يمكن أيضا تقليل أعداد تريبس الفلفل الحار على نباتات الفلفل بواسطة Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11. تم اختبار EPFs الأخرى ، مثل Lecanicillium lecanii و Purpureocillium lilacinum ، ضد تريبس الفلفل الحار في محاصيل مختلفة ، بما في ذلك نبات الفلفل الحار والشاي ، وكانت فعالة في مكافحة هذه الآفة12،13.

أجريت بعض الدراسات السابقة التي تبحث في فعالية EPFs في مكافحة التربس في البيوت البلاستيكية أو الحقل دون الفحص الأول لأنواع / سلالات EPF الأكثر فعالية ، مما يحد من فعاليتها. قد يؤدي الفحص الدقيق للأجسام التبعية الكريمة إلى تحسين إدارة الآفات بشكل كبير. قامت العديد من الدراسات بتربية تريبس للفحوصات الحيوية على النباتات السليمة داخل أقفاص11،14. في حين أن نظام تربية النباتات السليم يوفر بيئة أكثر طبيعية للتربس ، إلا أنه يشكل تحديات في إدارة مراحل النمو المختلفة ، حيث تظهر تريبس سلوكيات مميزة في كل مرحلة. قد يؤدي هذا التباين إلى تعقيد اختيار المراحل المستهدفة لأغراض تجريبية محددة. علاوة على ذلك ، قد تؤثر ظروف التربة داخل نظام تربية النباتات السليم على تشرنق وتربس الفلفل الحار ، وبالتالي تقليل عدد الأفراد المتاحين للمقايسات الحيوية اللاحقة15 ، مما يحد من الموارد لمزيد من المقايسات البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب أنظمة تربية النباتات بأكملها مساحة أكبر ورعاية مستمرة للنباتات ، حيث قد تغير النباتات المجهدة سلوك تريبس ويمكن أن تستغرق وقتا أطول وكثيفة للموارد. هناك عدد قليل من التقارير عن أنظمة تربية تريبس القائمة على المواد النباتية غير الحية (على سبيل المثال ، الأنسجة النباتية المنفصلة أو الأنظمة الغذائية الاصطناعية) لتجارب المقايسة الحيوية المختبرية ، لكن تفاصيل هذه الطرق كانت في كثير من الأحيان غير واضحة أو تم حذفها12،16.

هدفت هذه الدراسة إلى تطوير نظام تربية جماعي بسيط وفعال من حيث التكلفة ومستدام لتريبس الفلفل الحار في ظل ظروف المختبر. في هذا البروتوكول ، تم تعديل طريقة تربية قرص الأوراق7 لتقديم نهج أكثر كفاءة وتحكما لتربية تريبس الجماعية ، مما يسمح بالاختيار الدقيق لمراحل النمو للمقايسات الحيوية من خلال رقابة صارمة على الظروف البيئية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطوير نظام اختبار حيوي مستقر وقابل للتكرار لتقييم ضراوة عزلات الفطريات المسببة للحشرات (EPF) بنسبة 50٪ من الوقت المميت (LT50) و 50٪ متوسط التركيز المميت (LC50) ، والتي تشير إلى الوقت المقدر تحت جرعة محددة ، وتركيز المعلق الفطري المطلوب للتسبب في نفوق 50٪ من تريبس الفلفل الحار ، على التوالي. من خلال تطبيق هذه الطريقة ، يمكن تحديد تريبس التي تم جمعها ميدانيا بشكل صحيح ، ويمكن الحفاظ على المستعمرات المختبرية المستقرة للتربس لاختبار فعالية العزلات الفطرية المختلفة باستخدام منهجية أسهل وأكثر قابلية للتكرار.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يظهر المخطط الانسيابي التجريبي الكامل في الشكل 1.

1. جمع حقل تريبس الفلفل الحار وصيانة المستعمرة

  1. مجموعة تريبس الفلفل الحار
    1. افحص بصريا جانبي الأوراق وداخل الأزهار بحثا عن غزو تريبس الفلفل الحار على نباتات التوت في مزرعة عنبية مصابة.
    2. سجل تفاصيل كل عينة (على سبيل المثال ، جزء من النبات وشدة الإصابة) ، وتأكد من ممارسات الإنتاج مع المزارعين ، مثل الزراعة التقليدية أو الزراعة العضوية ، بما في ذلك استخدام الزيوت المعدنية والأعداء الطبيعيين.
    3. قم بقص الأوراق والزهور الموبوءة بالتربس الحار ونقلها إلى كيس السحاب البلاستيكي (جدول المواد) ، ثم أغلق كيس السحاب ببعض الهواء بالداخل للحفاظ على تريبس على قيد الحياة. إحضار العينة إلى المختبر في غضون 3 ساعات.
      ملاحظة: ضع العينة في مبرد عندما يكون وقت التجميع الميداني أكثر من 3 ساعات.
    4. قم بإعداد وعاء تربية زجاجي (ارتفاع 35 مم ، قطر داخلي 45 مم) ، ضع ثلاث طبقات من المناديل الورقية الدائرية (قطر 40 مم) في قاع حاوية التربية الزجاجية ، ثم أضف 8-10 قطرات (400-500 ميكرولتر) من الماء المصفى (الشكل 1 وجدول المواد).
    5. اجمع ورقة مانجو حمراء صغيرة من حقول المانجو (الشكل 1). اغسل الورقة وتحقق تحت المجهر البصري (جدول المواد) بحثا عن بيض الحشرات أو أي تلوث حشري آخر قبل تحضير حاوية التربية الزجاجية. قطع ورقة المانجو بقاطع جلدي (جدول المواد) إلى قرص دائري (40 مم) وضعها على منشفة ورقية مبللة.
      ملحوظة: تعتبر أوراق المانجو موارد أكثر استقرارا لتغذية تريبس من أوراق التوت الصغيرة ، التي تنمو موسميا فقط.
    6. راقب تريبس الفلفل الحار تحت المجهر البصري بتكبير 10 أضعاف ، وانقل 10 تريبس بالغ (خمسة ذكور وخمس إناث) باستخدام فرشاة طلاء دقيقة (جدول المواد) إلى حاوية التربية الزجاجية.
    7. أغلق كل حاوية تربية زجاجية بطبقتين من البارافيلم (جدول المواد) وقم بعمل حوالي 40 ثقبا صغيرا باستخدام دبوس حشرات # 00 للتهوية (جدول المواد).
    8. احتفظ بحاوية التربية الزجاجية في حاضنة عند 25 ± 1 درجة مئوية ، ~ 70٪ رطوبة نسبية مع فترة ضوئية من الضوء: الظلام (L: D) = 12 ساعة: 12 ساعة (جدول المواد).
    9. قم بإزالة البالغين باستخدام فرشاة طلاء بعد 48 ساعة.
      ملاحظة: بناء على ملاحظتنا ، ستضع أنثى تريبس البيض ~ 2 أيام بعد نقلها إلى حاوية التربية الزجاجية.
    10. راقب أنسجة الأوراق مع البيض تحت مجهر مجسم لتأكيد وضع البيض بشكل أكبر (الشكل 1 وجدول المواد). ضع قرص أوراق المانجو الطازج على الورقة مع البيض وأضف 8-10 قطرات من الماء المصفى على المنشفة الورقية للحفاظ على الرطوبة.
  2. الحفاظ على سكان تريبس الفلفل الحار
    ملاحظة: يفقس البيض في يرقات الطور الأول بعد ~ 5-7 أيام.
    1. انقل الورقة التي تحتوي على يرقات 1st instar مباشرة إلى حاوية تربية زجاجية جديدة.
      ملاحظة: باستخدام فرشاة طلاء ، انقل يرقات الطور 1 برفق إلى حاوية تربية زجاجية جديدة ، وتجنب التلوث من النمو الفطري الفاسد وغير المتوقع على أوراق المانجو. بناء على ملاحظتنا ، تضع الأنثى البالغة ما معدله 6 بيضات يوميا.
    2. راقب تريبس الفلفل الحار يوميا. أضف 8-10 قطرات من الماء المصفى كل 4 أيام في المنشفة الورقية. أضف قرص أوراق المانجو الطازج داخل الحاوية كل 4 أيام ، قبل أن تجف الورقة القديمة.
      ملاحظة: تظهر اليرقات1st incent إلى البالغين في ~ 7-10 أيام ، اعتمادا على العوامل البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة.
    3. راقب عدد تريبس الفلفل الحار يوميا حتى يتطور تريبس إلى بالغين ، وكرر الخطوات من الخطوة 1.1.4 للحفاظ على السكان على المدى الطويل.
  3. تربية جماعية تريبس الفلفل الحار
    1. اجمع الإناث البالغات من السكان الذين يتم الحفاظ عليهم وقم بإعداد وعاء تربية زجاجي بناء على الخطوات المذكورة أعلاه.
    2. انقل 10 إناث بالغات إلى الحاوية واتبع الخطوات من الخطوات 1.1.4 إلى 1.1.10 للحصول على ورقة مع البيض.
      ملاحظة: تضع الأنثى البالغة ما معدله 6 بيضات يوميا.
    3. انقل برفق ~ 120 يرقة الطور 1 إلى حاوية تربية زجاجية جديدة باستخدام فرشاة طلاء.
    4. راقب تريبس الفلفل الحار يوميا. أضف 8-10 قطرات من الماء المصفى على المنشفة الورقية كل 4 أيام. أضف قرص أوراق المانجو الطازج إلى الحاوية كل 4 أيام قبل أن تجف الورقة القديمة.
    5. اجمع 1 يرقات الطور في 5-7 أيام بعد وضع البيض. جمع يرقات الطور الثاني بعد 7-10 أيام ؛ اجمع البالغين بعد ~ 14 يوما للمقايسة الحيوية (الشكل 2).
      ملاحظة: راقب التشكل للتمييز بين المراحل المختلفة من تريبس الفلفل الحار لمزيد من التجارب (الشكل 2).

2. التحديد الجزيئي لتريبس الفلفل الحار

ملاحظة: يجب تحديد تريبس التي تم جمعها من الحقل إلى مستوى الأنواع عن طريق التحديد الجزيئي باستخدام جزء من جين أوكسيديز السيتوكوندرية الأول (COI) ، وهو علامة شائعة الاستخدام لتريبس الفلفل الحار17،18.

  1. استخراج الحمض النووي الجيني للفلفل الحار
    1. اجمع تريبس الفلفل الحار البالغ في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل (جدول المواد).
    2. قم بتجانس تريبس الفلفل الحار باستخدام مدقة الحبيبات ، ثم عزل الحمض النووي الجيني باستخدام المجموعة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (جدول المواد).
  2. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل الحمض النووي
    1. تضخيم جزء الحمض النووي المتوقع لتريبس الفلفل الحار باستخدام PCR Master Mix (2x) مع زوج أولي COI ، التمهيدي الأمامي LCO 1490 والتمهيدي العكسي HCO 2198 ، والذي يضخم جين COI للميتوكوندريا الجزئي (جدول المواد).
      1. قم بإعداد خليط PCR سعة 20 ميكرولتر يحتوي على 2 ميكرولتر من قالب الحمض النووي الجيني thrip ، و 1 ميكرولتر لكل من البادئات الأمامية والعكسية ، و 10 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix ، و 6 ميكرولتر من ddH2O (جدول المواد).
      2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام جهاز تدوير حراري مع ظروف التدوير التالية: التمسخ الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، و 35 دورة من 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 52 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، متبوعا بتمديد نهائي قدره 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (جدول المواد).
    2. تحقق من أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام الاغاروز 1٪ للتحقق من نتيجة التضخيم (الشكل 3).
    3. استئصال النطاق المستهدف (كان حجم الأمبليكون المتوقع 658 نقطة أساس) وتنقية أمبليكون COI PCR من تريبس الفلفل الحار باستخدام مجموعة تنقية Gel / PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أرسل المنتج المنقى للتسلسل من خلال خدمة التسلسل التجاري. (جدول المواد).
  3. تحليل التسلسل
    1. تقييم جودة التسلسل باستخدام البرنامج المشار إليه (جدول المواد).
    2. فتح ملف FASTA أو TXT وقص القواعد منخفضة الجودة يدويا في كل من النهايات 5 و 3 عن طريق حذف التسلسلات غير المرغوب فيها.
    3. قم بإجراء بحث BLAST على قاعدة بيانات NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) باستخدام المعلمات الافتراضية لتأكيد هوية الأنواع.

3. تحضير الفطريات المسببة للحشرات

ملاحظة: يتم سرد عزلات EPF المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1.

  1. استعادة العزلات الفطرية من مكتبة الموارد الفطرية
    1. قم بإذابة مخزون الكونيديا الفطري المحفوظ (الكونيديا المعلقة في 30٪ جلسرين) من فريزر -80 درجة مئوية.
    2. انقل ما يقرب من 10 ميكرولتر من معلق الكونيديا ووزع بالتساوي على صفيحة سابورو دكستروز أجار (SDA) مقاس 5.5 سم 1/4 باستخدام موزع خلية في غطاء التدفق الرقائقي. يتم تحضير الوسط عن طريق خلط 0.75 جم من مرق سكر العنب Sabouraud و 1.5 غرام من الأجار في 100 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH2O) (جدول المواد).
    3. أغلق طبق بتري بالبارافيلم (جدول المواد) وانقل اللوحة إلى حاضنة الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما.
    4. استزراع الفطريات الفطرية التي تنمو بنشاط عن طريق الخطوط على صفيحة 1/4 سابورو دكستروز أجار (SDA) الطازجة. احتضان الفطريات في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما للسماح بنمو الكونيدات قبل الحصاد.
      ملاحظة: استخدم الثقافات الفطرية التي يبلغ عمرها حوالي 10 أيام لإجراء المقايسات الحيوية اللاحقة. لا ينصح باستخدام الثقافات التي يزيد عمرها عن 14 يوما لاختبار الفوعة بسبب التخفيضات المحتملة في قابلية البقاء الكونيدية.
  2. تحضير تعليق كونيديا
    1. أضف 2-3 مل من 0.03٪ توين 80 إلى سطح مزرعة فطرية عمرها 10-14 يوما على 1/4 SDA. اكشط الكونيديا برفق باستخدام حلقة معقمة (جدول المواد).
    2. انقل المعلق الفطري إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 مل.
    3. قم بتجانس التعليق عن طريق الدوامة بأقصى سرعة وقم بتصفيته من خلال ورق الترشيح لإزالة حطام الخيوط والحصول على تعليق كونيديا نقي.
    4. استخدم مقياس كثافة الدم (جدول المواد) للتحقق من عدد الكونيديا تحت المجهر الضوئي وتخفيف التعليق إلى 108 كونيديا / مل.
    5. انقل المعلق المخروطي إلى بخاخ دقيق معقم بالأشعة فوق البنفسجية لتطبيق المقايسة الحيوية اللاحقة.
      ملاحظة: تأكد من أن التعليق المخروطي يتم دوامه جيدا قبل كل عملية نقل لتجنب الاستقرار. قبل الاستخدام ، قم بتعقيم البخاخ الدقيق عن طريق تعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة داخل غطاء التدفق الرقائقي.

4. فحص الفوعة ضد تريبس الفلفل الحار

  1. تحضير يرقات الطور الثاني
    1. اجمع يرقات الطور الثاني باتباع الخطوات 1.3.1-1.3.5 للتجربة التالية.
      ملاحظة: يميز يرقات الطور الثاني من خلال لون جسمها الأصفر وبطنها العريض مقارنة باليرقات الأولى (الشكل 2).
  2. تحضير حاوية التلقيح
    ملاحظة: حدد أنواع الأوراق بناء على المحصول المستهدف من تريبس الفلفل الحار. في هذه الدراسة ، تم جمع تريبس الفلفل الحار من حقل أوراق التوت الأزرق المصابة "Biloxi" (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp). لذلك ، سيتم إجراء الاختبار الحيوي ل EPF ضد تريبس الفلفل الحار على أوراق التوت.
    1. اجمع أوراق التوت الصغيرة من مزرعة التوت واغسل أوراق التوت لإزالة الغبار السطحي وأي مفصليات أخرى إن وجدت.
    2. جفف الأوراق في الهواء أو استخدم مناشف ورقية لمسح الماء ؛ بعد ذلك ، تحقق من سطح أوراق التوت بحثا عن أي مفصليات أو بيض آخر تحت مجهر مجسم. قم بإزالة أي مفصليات الأرجل إن وجدت.
    3. قم بقص قرص أوراق قطره 2.8 سم باستخدام قاطع جلدي (جدول المواد) ، وقم بتطهير الورقة باستخدام مبيض 1٪ (محلول هيبوكلوريت الصوديوم) ، واشطف 2x بالماء المعقم لإزالة أي بقايا مبيض على الأوراق.
      ملاحظة: قم بإعداد قرص الورقة قبل تصلب أجار لضمان إمكانية دمج قرص الورقة في أجار الماء بشكل صحيح.
    4. الأوتوكلاف محلول أجار الماء بنسبة 2.5٪ (2.5 جم أجار لكل 100 مل من ddH2O) للتعقيم.
    5. صب 3 مل من أجار الماء بنسبة 2.5٪ في عبوات زجاجية صغيرة (ارتفاع 35 مم ، قطر داخلي 30 مم) داخل غطاء تدفق رقائقي قبل أن يتجمد الأجار. اترك الأجار يبرد إلى حوالي 40 درجة مئوية حتى يصل إلى حالة شبه صلبة.
    6. ضع قرص الورقة برفق (الجانب المحوري لأعلى) على الأجار ، وقم بتضمينه قليلا مع الحد الأدنى من التعرض فوق سطح الأجار. بمجرد أن يتجمد أجار الماء تماما ، تصبح الحاويات الزجاجية جاهزة للمقايسة الحيوية.
  3. تطعيم EPF ومراقبته
    1. قبل التطبيق ، قم بتدوير التعليق المخروطي جيدا. باستخدام بخاخ دقيق ، ضع 0.1 مل من التعليق بالتساوي (المحضر في الخطوة 3.2.4) على سطح كل قرص ورقة من مسافة حوالي 10 سم داخل الحاوية الزجاجية.
      ملاحظة: اختبر مناطق الرش قبل التجربة. تأكد من أن الرش يغطي قرص الورقة بالكامل بالتساوي بطبقة رقيقة. إذا تراكمت القطرات في الماء الراكد على الورقة ، قلل من حجم التلقيح لتجنب الإفراط في التبول.
    2. جفف معلق الكونيديا بالهواء على الورقة لمدة 30 دقيقة في ظل ظروف معقمة (على سبيل المثال ، في غطاء التدفق الرقائقي).
    3. انقل 10 من يرقات الطور الثاني إلى كل حاوية باستخدام فرشاة طلاء دقيقة وأغلق كل حاوية تربية زجاجية بطبقتين من البارافيلم
    4. اصنع ~ 30 ثقبا صغيرا باستخدام دبوس حشرات # 00 (جدول المواد) للتهوية.
    5. تلقيح الحاوية عند حاضنة 25 ± درجة مئوية مع ~ 70٪ رطوبة نسبية وفترة ضوئية L: D = 12 ساعة: 12 ساعة.
    6. مراقبة وتسجيل وفيات تريبس الفلفل الحار تحت مجهر مجسم بتكبير 10 أضعاف يوميا لمدة 7 أيام.
    7. احتفظ باليرقات الميتة داخل الحاوية الزجاجية لمراقبة الفطريات لتأكيد عدوى EPF.

5. الاختبار الحيوي لعزلات EPF المختارة

ملاحظة: يمكن اختيار إما عزل EPF الأكثر ضراوة أو العديد من العزلات ذات الفوعة العالية لإجراء اختبار حيوي يعتمد على الجرعة ضد تريبس الفلفل الحار. واستخدمت ثلاثة تركيزات كونيدية مختلفة، تتراوح بين 106 إلى 108 كونيديا/مل، لتقييم العلاقة بين الجرعة والإمراضية.

  1. تحضير تعليق كونيديا
    1. استرجع عزل EPF المحدد باتباع الخطوة 3.1.
    2. تحضير ثلاثة تركيزات من معلقات الكونيديا (10 و6 و 10و 7 و 108 conidia / mL) كما هو موضح في الخطوة 3.2.
  2. تحضير يرقات الطور الثاني
    1. اجمع يرقات الطور الثاني باتباع الخطوة 4.1 للحصول على بالغين ناشئين حديثا.
  3. تحضير حاوية التلقيح
    1. اتبع الخطوة 4.2. لتحضير حاوية التلقيح التي تحتوي على أقراص أوراق التوت المضمنة في أجار الماء.
  4. تطعيم EPF ومراقبته
    1. إجراء تلقيح EPF بثلاثة تركيزات من معلق الكونيديا، كما هو موضح في الخطوة 4.3.

6. التحليل الإحصائي

  1. حساب الوفيات
    1. قم بتحويل بيانات الوفيات لكل سلالة فطرية عن طريق تحويل Arcsin قبل إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لتقييم الاختلافات بين العلاجات الفطرية (تم تعيين مستوى الأهمية على أنه ص < 0.05).
    2. قم بإجراء مقارنات لاحقة لوسائل العلاج باستخدام اختبار Tukey's Honest Significant Difference (HSD).
  2. حساب متوسط الوقت المميت (LT50) ومتوسط التركيز المميت (LC50)
    1. احسب متوسط الوقت المميت (LT50) ومتوسط التركيز المميت (LC50) باستخدام تحليل انحدار Probit.
    2. قم بإنشاء وتعبئة المتغيرات المسماة "الإجمالي" و "الاستجابة" و "المدة" (ل LT50) أو "التركيز" (ل LC50) بالبيانات المرصودة في واجهة البرنامج.
      ملاحظة: إذا كان معدل الوفيات التراكمي لا يتجاوز 50٪ خلال فترة المراقبة ، فلا يمكن تقدير قيم LT50 و / أو LC50 بشكل موثوق.
    3. إجراء تحليل Probit بالانتقال إلى تحليل | الانحدار | بروبيت. قم بتعيين "الإجمالي" كإجمالي عدد الحشرات التي تم اختبارها ، و "الاستجابة" كعدد الحشرات الميتة ، و "المدة" أو "التركيز" كمتغير مشترك. اضبط مستوى الدلالة لعامل التغايرية على 0.05 بالضغط على الخيارات وضبط مستوى الدلالة لاستخدام عامل التغايرية على 0.05.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهر المخطط الانسيابي التجريبي المقدم في هذه الدراسة أنه يمكن إنشاء نظام تربية مستقر لتريبس الفلفل الحار ، بدءا من الجمع الميداني إلى فحص ضراوة عزلات EPF (الشكل 1). على الرغم من أن الملاحظة المورفولوجية يمكن أن تميز تريبس الفلفل الحار عن تريبس الزهور الأخرى ، إلا أن استخدام تسلسل COI الجزئي كعلامة جزيئية ، بما في ذلك حجم أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل COI ، يمكن أن يؤكد بشكل أكبر تحديد تريبس التي تم جمعها في الحقل على أنها تريبس الفلفل الحار (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تريبس الفلفل الحار هو آفة مهمة عالميا تؤثر على العديد من المحاصيل المهمة اقتصاديا مثل الذرة والفول السوداني والفلفل وفول الصويا والفراولة والبطاطا الحلوة والطماطم1،11،19. تعتمد استراتيجيات المكافحة الحالية على مناهج متكاملة تتضمن الممارسات الثقافية وعوامل المكافحة البيولوجية والمعالجات الكيميائية ، بما في ذلك استخدام الأعداء الطبيعيين والديدان الخيطية و EPFs11 ،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح ينطوي عليه هذا العمل.

شكر وتقدير

نتقدم بشكر خاص للسيد لين ، Huanf-Jen من مزرعة Humi Blueberry (حي Wufeng. ، مدينة Taichung) ، الذي قدم نباتات التوت. تم دعم هذا البحث من قبل 113-2313-B-005 -024 -MY3 من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (NSTC).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
# 00 دبوس الحشراتEntosphinx DMM0220صنع في المملكة المتحدة
أنبوب طرد مركزي 1.5 ملكورنينج أندرستMCT-175-Cصنع في الولايات المتحدة الأمريكية
10 μ L حلقة التلقيحNEST العلمي718201صنع في الولايات المتحدة الأمريكية
100 نقطة أساس سلم الحمض النووي IIIجينيدDL007صنع في تايوان.
2x سوبر ريد PCR ماستر ميكسالأدوات الحيويةتي-SR01صنع في تايوان
طبق بتري 6 سمألفا بلس العلمية16021صنع في تايوان
اجاربيومان العلميأ آر 001.1درجة علم الأحياء الدقيقة
الاغاروزبيومان العلميبي بي 1200صنع في تايوان
BioGreen آمن جل الحمض النووي العازلةبيومان العلميSDB001Tصنع في تايوان
مجموعة مناديل استخراج عالية السرعة سهلة الحمض النوويفيشر بيوتيكET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (صنع في أستراليا)
التمهيدي الأمامي: LCO 1490علم الجينوم PR220919G6 البريديةالتسلسل: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3 '
مجموعة GenepHlow Gel / PCRجينيدDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
حاوية تربية الزجاج شركة صن شاين لاب لمعداتالحجم: 35 مم في الارتفاع ، 45 مم في القطر الداخلي. يمكن إعادة تجميعها بأي حجم مماثل من الكوب البلاستيكي أو الزجاجي.
مقياس الخوضبول مارينفيلد640030صنع في ألمانيا
حاضنههاي بوينتإف 740صنع في تايوان
قاطع الجلودورشة عمل يدوية حقيقيةhttps://shopee.tw/jj891004؟ categoryId = 100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId = 16023929406< / أ>
MiniAmp Thermal Cyclerثيرمو فيشر العلميأ37834صنع في الولايات المتحدة الأمريكية
المجهر البصري نيكون  سي إلصنع في اليابان
فرشاة الرسمشركة فرش تيان تشنغ4716608400352يمكن استبدالها بفرشاة ألوان مائية ذات رؤوس دقيقة ، أي ما يعادل فرشاة مستديرة بحجم 0 أو 1.
منشفة ورقيةزهرة مايوBLS007-8صنع في تايوان
بارافيلم مبيميسبي إم -996صنع في الولايات المتحدة الأمريكية
مدقة بيليهبيومان العلميجي تي 100Rصنع في تايوان
التمهيدي العكسي: HCO 2198علم الجينوم PR220919G6 البريديةالتسلسل: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
مرق سابورو سكر العنبهاي ميدياMH033-500Gصنع في الهند
مجهر مجسمسوبتوبإس ز71صنع في تايوان
مخزن مؤقت TAE 50Xبيومان العلميTAE501000صنع في تايوان
توين 80بانريك أبليكيم142050.1661صنع في تايوان
حقيبة سحابشركة Wenchen للبلاستيك1809000061الحجم: 12 سم في العرض و 17 سم في الطول. (صنع في تايوان)

المراجع

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
  2. Hoddle, M. Scirtothrips dorsalis (chilli thrips). CABI Compendium. , Wallingford, CT, USA. (2022).
  3. Liburd, O. E., Panthi, B. R., Phillips, D. A. Chilli thrips on blueberries in Florida: ENY2053/IN1298. EDIS. 2020 (6), (2020).
  4. Gopal, K., Krishna Reddy, M., Reddy, M., Muniyappa, V. Transmission of peanut yellow spot virus (PYSV) by thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in groundnut. Arch Phytopathol Plant Prot. 43 (5), 421-429 (2010).
  5. Prasada Rao, R., et al. The host range of tobacco streak virus in India and transmission by thrips. Ann Appl Biol. 142 (3), 365-368 (2003).
  6. Chang, J. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Front Sustain Food Syst. 5, 596316(2021).
  7. Yang, C. J., Nai, Y. S. Assessment of aphidicidal effect of entomopathogenic fungi against mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J Vis Exp. (197), e65312(2023).
  8. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. J Vis Exp. (175), e62882(2021).
  9. Aristizábal, L., Chen, Y., Cherry, R., Cave, R., Arthurs, S. Efficacy of biorational insecticides against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae), infesting roses under nursery conditions. J Appl Entomol. 141 (4), 274-284 (2017).
  10. Francis, J. R., Manchegowda, H. K. Molecular phylogenetic identification of Metarhizium and Beauveria and their bio-efficacy against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. Int J Trop Insect Sci. 43 (3), 909-918 (2023).
  11. Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).
  12. Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae). Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).
  13. Panyasiri, C., et al. Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant. Insects. 13 (8), 684(2022).
  14. Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis). Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).
  15. Han, D., et al. Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae). Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).
  16. Tatara, A. Effect of temperature and host plant on the development, fertility and longevity of Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae). Appl Entomol Zool. 29 (1), 31-37 (1994).
  17. Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification. Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).
  18. Silva, R., et al. Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region. Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).
  19. Venette, R., Davis, E. Chilli thrips/yellow thrips, Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae) mini pest risk assessment. , Univ Minnesota Tech Bull. (2004).
  20. Mandi, N., Senapati, A. Integration of chemical, botanical and microbial insecticides for control of thrips, Scirtothrips dorsalis Hood infesting chilli. J Plant Prot Sci. 1 (1), 92-95 (2009).
  21. Samota, R., Jat, B., Choudhary, M. D. Efficacy of newer insecticides and biopesticides against thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in chilli. J Pharmacogn Phytochem. 6 (4), 1458-1462 (2017).
  22. Panthi, B. R., Renkema, J. M., Lahiri, S., Liburd, O. E. The short-range movement of Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae) and rate of spread of feeding injury among strawberry plants. Environ Entomol. 50 (1), 12-18 (2021).
  23. Priyanka, T., et al. Biology and morphometrics of Thrips parvispinus (Karny) (Thysanoptera: Thripidae) on chilli, Capsicum annuum L. Pest Manag Hortic Ecosyst. 30 (1), 85-92 (2024).
  24. Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies. Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).
  25. Xu, X. M., Guerin, L., Robinson, J. Effects of temperature and relative humidity on conidial germination and viability, colonization and sporulation of Monilinia fructigena. Plant Pathol. 50 (5), 561-568 (2001).
  26. Lee, S. J., et al. Transcriptional response of bean bug (Riptortus pedestris) upon infection with entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana JEF-007. Pest Manag Sci. 75 (2), 333-345 (2019).
  27. Yang, Y. -T., et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae). Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).
  28. Qayyum, M. A., et al. Entomopathogenic fungi: prospects and challenges. Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إنشاء نظام تربية تريبس الفلفل الحار (Scirtothrips dorsalis Hood) لفحص ضراوة الفطريات المسببة للحشرات
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.