مقالة منهجية

تقنيات متعددة الأومكس لتنميط انتقالات حالة الكروماتين في خلايا القنوات الصفراوية الأولية للفأر منخفضة المدخلات

DOI:

10.3791/68606

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا شاملا ل ChIP-seq منخفض المدخلات لملف تعريف تعديلات الهيستون و ATAC-seq لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين في كميات صغيرة من خلايا القنوات الصفراوية الأولية للفأر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مرض الكبد المتعدد الكيسات (PLD) هو اضطراب وراثي يتميز بتكوين أكياس مملوءة بالسوائل مشتقة من الخلايا الصفراوية ، مما يؤدي إلى مرض تدريجي وانخفاض كبير في نوعية حياة المرضى. العلاجات الحالية لمرض PLD غير كافية ، مما يؤكد الحاجة إلى استراتيجيات علاجية جديدة. لا يزال دور التنظيم اللاجني في تطور PLD ، وخاصة إمكانية الوصول إلى الكروماتين وتعديلات الهيستون ، غير مستكشف. تتطلب تقنيات التنميط اللاجيني التقليدية ، مثل ChIP-seq و DNase-seq ، أعدادا كبيرة من الخلايا ، والتي يصعب الحصول عليها من خلايا القنوات الصفراوية الأولية. لمعالجة هذا الأمر ، قمنا بتحسين بروتوكولات ChIP-seq و ATAC-seq منخفضة المدخلات لأعداد منخفضة من الخلايا الصفراوية الأولية. تسمح هذه الأساليب بتحليل تعديلات الهيستون وإمكانية الوصول إلى الكروماتين بأقل قدر من مدخلات الخلية. يستخدم ChIP-seq منخفض المدخلات نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase) لتجزئة الحمض النووي ، بينما يستخدم ATAC-seq ترانسبوزاز Tn5 لالتقاط مناطق الكروماتين المفتوحة. توفر تقنيات الكلمات المتعددة هذه رؤى قيمة حول ديناميكيات حالة الكروماتين أثناء تحولات مصير الخلايا الصفراوية في PLD وأمراض القنوات الصفراوية الأخرى. الأهم من ذلك ، أن البروتوكولات المحسنة قابلة للتطبيق بثقة على الخلايا الأولية الأخرى منخفضة المدخلات ، مما يتيح استكشاف آليات الوراثة اللاجينية عبر سياقات خلوية مختلفة. يقدم هذا العمل نهجا منهجيا لدراسة تغيرات حالة الكروماتين ، مما يساهم في تطوير استراتيجيات علاجية قائمة على علم التخلق لمرض PLD والأمراض ذات الصلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD هو اضطراب وراثي يتميز بتطور العديد من الخراجات المملوءة بالسوائل المشتقة من الخلايا الصفراوية. مع توسع هذه الخراجات تدريجيا ، فإنها تؤثر بشدة على نوعية حياة المرضى1،2. استراتيجيات العلاج الحالية ل PLD غير كافية ، حيث توفر فوائد محدودة فقط بينما تؤدي في كثير من الأحيان إلى معدلات تكرار عالية ومضاعفات3،4. لذلك ، هناك حاجة ملحة لنهج علاجية أكثر أمانا وفعالية لمواجهة التحديات السريرية التي لم يتم حلها في علاج PLD.

في ظل الظروف العادية ، تظل الخلايا الصفراوية هادئة ، بينما في PLD ، تظهر انتشارا مفرطا ، وهو محرك رئيسي لتطور المرض5،6. لا تزال الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذا الانتقال الكيسي غير واضحة. في حين أن التنظيم اللاجيني ، بما في ذلك إمكانية الوصول إلى الكروماتين وتعديلات الهيستون ، يلعب دورا حيويا في تحولات مصير الخلية7،8 ، فإن دوره في تطور PLD لا يزال غير مدروس. ومع ذلك ، تتطلب العديد من تقنيات التنميط اللاجيني عددا كبيرا من الخلايا. تتطلب ChIP-seq التقليدية ، التي تعتمد على تجزئة الكروماتين عن طريق الصوتنة ، بالإضافة إلى فحوصات إمكانية الوصول إلى الكروماتين مثل DNase-seq و MNase-seq ، عادة أكثر من 106 خلايا - تتجاوز بكثير العدد الذي يمكن الحصول عليه من الخلايا الصفراوية الأولية.

توفر هذه المخطوطة بروتوكولا شاملا ل ChIP-seq9،10،11 منخفض المدخلات لملف تعريف تعديلات هيستون و ATAC-seq11،12،13 لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين في أعداد منخفضة من الخلايا الصفراوية الأولية. يستخدم ChIP-seq منخفض المدخلات MNase لتفتيت الحمض النووي9 ، بينما يلتقط ATAC-seq شظايا الحمض النووي من مناطق الكروماتين المفتوحة باستخدام Tn5 transposase12. يقدم تحليل الأميكس المتعدد باستخدام هذه الأساليب رؤى قيمة حول ديناميكيات حالة الكروماتين أثناء تحولات مصير الخلايا الصفراوية في PLD وأمراض القنوات الصفراوية الأخرى ، وبالتالي تسهيل تطوير العلاجات المستهدفة بالوراثة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير المحاليل والخلايا الصفراوية ل ATAC-seq

  1. قبل يوم واحد على الأقل من تجربة ATAC-seq ، قم بإعداد ATAC Lysis Buffer باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 1.
    ملاحظة: يمكن تخزين ATAC Lysis Buffer عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة شهر واحد على الأقل.
  2. بالنسبة للخلايا الصفراوية الأولية المعزولةحديثا 14 ، عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم مباشرة بعد العزل واستمر في تجربة ATAC-seq.
    ملاحظة: كلما كان ذلك أسرع كلما كان ذلك أفضل لتقليل التأثير على بقاء الخلية. ومع ذلك ، إذا تم الاحتفاظ بها على الجليد ، فإن المضي قدما في غضون ساعتين لا يمثل مشكلة بشكل عام.

2. ATAC - seq

ملاحظة: استخدم 100,000 خلية صفراوية ل ATAC-seq. احتفظ بالعينات والمحاليل على الجليد. بالنسبة لتجربة ATAC-seq ، يستغرق الإجراء بأكمله حوالي يومين.

  1. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 200 ميكرولتر من ATAC Lysis Buffer الذي يحتوي على مثبط الإنزيم البروتيني ، ثم قم بتسخينه برفق للخلط ، واحتضانه على الثلج لمدة 20 دقيقة. في أول 10 دقائق، اسكري الماصة برفق حتى تمتزج.
  3. جهاز طرد مركزي عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بإعداد المخزن المؤقت لتفاعل التبديل (50 ميكرولتر) عن طريق خلط 3 ميكرولتر من مزيج الإنزيم من مجموعة إعداد مكتبة ATAC DNA ، و 10 ميكرولتر من 5x Buffer من مجموعة إعداد مكتبة ATAC DNA ، و 37 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. تخلط جيدا.
  5. تخلص من المادة الطافية بعناية ، ضع الحبيبات النووية المجمعة على الجليد ، وأضف على الفور 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل التبديل. قم بتعليقها واحتضانها برفق عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، مع تحريك قاع الأنبوب كل 10 دقائق للخلط.
    ملاحظة: قم بإعداد المخزن المؤقت لتفاعل التبديل قبل التخلص من المادة الطافية لمنع الخلايا من الجفاف.
  6. قم بتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن إزالة حبات البروتين G المتبقية من عملية عزل الخلايا الصفراوية14 في هذه الخطوة. يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -80 درجة مئوية لحفظها على المدى الطويل.
  7. قم بإجراء بناء المكتبة باستخدام مجموعة ATAC DNA Library Prep Kit وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: احتفظ بجميع العينات والمحاليل على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك. على الرغم من أن الإجراءات قد تختلف بين العلامات التجارية الأخرى للأدوات ، إلا أنها متوافقة مع البروتوكول الخاص بنا.
    1. تخصيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): قم بإعداد مزيج تخصيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (50 ميكرولتر) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق خلط المكونات التالية بالترتيب المحدد: 10 ميكرولتر من عينة الحمض النووي (من الخطوة 2.6) ، 14 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، 10 ميكرولتر من 5x TAB ، 5 ميكرولتر من جزء في المليون ، 1 ميكرولتر من TAE ، 5 ميكرولتر من برايمر P5 ، و 5 ميكرولتر من برايمر P7. ماصة برفق للخلط.
    2. انقل الأنبوب إلى جهاز PCR وقم بتشغيل البرنامج التالي: (72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) × دورة واحدة ، (98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) × دورة واحدة ، (98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) × 15 دورة ، و (72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) × 1 دورة ، واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية.
    3. التنقية: قم بإحضار حبات DNA Clean إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام ، ثم قم بإجراء تنقية حبة مغناطيسية من خطوتين.
      1. الجولة الأولى: أضف 30 ميكرولتر من حبيبات DNA Clean إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (من الخطوة 2.7.2)، وقم بخلطها برفق للخلط، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع أنبوب PCR على فاصل مغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا (~ 5 دقائق). انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد وتخلص من حبات الحمض النووي النظيفة.
      2. الجولة الثانية: أضف 7.5 ميكرولتر من حبيبات الحمض النووي النظيفة إلى المادة الطافية المجمعة (من الخطوة 2.7.3.1) ، وقم بالخلط برفق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب على فاصل مغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا (~ 5 دقائق). تخلص بعناية من المادة الطافية
    4. احتفظ بالأنبوب على الفاصل المغناطيسي واشطف حبات DNA Clean لمدة 2 × 30 ثانية مع 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية بعد كل شطف. مع بقاء الأنبوب على الفاصل المغناطيسي ، افتح غطاء الأنبوب وجفف الخرزات بالهواء لمدة 10 دقائق. أخيرا ، أضف 22 ميكرولتر من الماء الخالي من النكلياز لتصفية الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -80 درجة مئوية لحفظها على المدى الطويل.
  8. تسلسل المكتبات باستخدام جهاز تسلسل قياسي من الجيل التالي.
    ملاحظة: نوصي بالحصول على ما لا يقل عن 50 مليون قراءة في نهاية الزوج.

3. تحضير المحاليل والخلايا الصفراوية ل ChIP-seq منخفض المدخلات

  1. قبل يوم واحد على الأقل من تجربة ChIP-seq منخفضة المدخلات ، قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل ChIP ، و ChIP MNase Buffer ، و ChIP Stop Buffer ، و ChIP 2x RIPA Buffer ، و ChIP RIPA Buffer ، و ChIP LiCl Buffer باستخدام الكواشف المدرجة في الجدول 2 ، الجدول 3 ، الجدول 4 ، والجدول 5.
    ملاحظة: يمكن تخزين المحاليل المذكورة أعلاه عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
  2. بالنسبة للخلايا الصفراوية الأولية المعزولةحديثا 14 ، قم بحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم مباشرة بعد العزل واستمر في تجربة ChIP-seq منخفضة المدخلات.
    ملاحظة: كلما كان ذلك أسرع كلما كان ذلك أفضل لتقليل التأثير على بقاء الخلية. ومع ذلك ، إذا تم الاحتفاظ بها على الجليد ، فإن المضي قدما في غضون ساعتين لا يمثل مشكلة بشكل عام.

4. اليوم 1 من ChIP-seq منخفض المدخلات: تحلل الخلايا ، وهضم MNase ، وحضانة الأجسام المضادة

ملاحظة: بالنسبة لتجربة ChIP-seq منخفضة المدخلات ، يستغرق الإجراء بأكمله حوالي 3 أيام.

  1. قسم الخلايا الصفراوية إلى حصصات من 100,000 خلية لكل أنبوب واحتفظ بالعينات والمحاليل على الجليد.
    ملاحظة: في حالة إجراء تجربة ChIP-seq منخفضة المدخلات لتعديلات هيستون متعددة ، فمن المقبول زيادة الحجم بشكل متناسب قبل إضافة الجسم المضاد لتعديل الهيستون. تعتمد أحجام الكاشف في الخطوات التالية على أنبوب واحد يحتوي على 1 × 105 خلايا.
  2. جهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 19 ميكرولتر من ChIP Lysis Buffer الذي يحتوي على مثبط البروتياز ، ثم قم بالماصة برفق للخلط ، واحتضنها على الثلج لمدة 10 دقائق. تجنب توليد الفقاعات.
  4. أضف 19 ميكرولتر من ChIP MNase Buffer وقم بالماصة برفق للخلط.
  5. أضف 2 ميكرولتر من MNase (0.01 وحدة / ميكرولتر) وقم بالماصة برفق للخلط. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: وقت الحضانة أمر بالغ الأهمية. التركيز النهائي ل MNase هو 0.0005 وحدة / ميكرولتر. يمكن تحديد التركيز الأمثل ل MNase بناء على نوع الخلية وعددها.
  6. ضع العينة على الفور على الثلج، وأضف 5 ميكرولتر من ChIP STOP Buffer لإنهاء الهضم، ثم قم بالماصة برفق للخلط.
  7. أضف 45 ميكرولتر من ChIP 2x RIPA Buffer الذي يحتوي على مثبط البروتياز ، وقم بتسخينه برفق للخلط ، واحتضانه على الجليد لمدة 10 دقائق.
  8. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الطافية ببطء إلى أنبوب جديد.
    ملاحظة: يمكن إزالة حبات البروتين G المتبقية من عملية عزل الخلايا الصفراوية14 في هذه الخطوة.
  9. أضف 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت ChIP RIPA.
  10. بالنسبة لعينات الترسيب المناعي (IP) ، أضف 1 ميكروغرام من الجسم المضاد لكل عينة واحتضان المعلق على دوار (20 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  11. بالنسبة لعينات الإدخال ، لا تضيف أي جسم مضاد واحتضان التعليق على دوار (20 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية طوال الليل.

5. اليوم 2 من ChIP-seq منخفض المدخلات: الترسيب المناعي والغسيل والشطف

ملاحظة: بالنسبة لعينات IP، اتبع الخطوات 5.1-5.7. بالنسبة لعينات الإدخال، اتبع الخطوات 5.8-5.12.

  1. اغسل حبات البروتين G مسبقا مع 1 مل من ChIP RIPA Buffer المثلج.
  2. أضف 400 ميكروغرام من حبات البروتين G إلى العينات واحتضانها بالدوران (20 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
  3. اغسل الخرزات لمدة 5 × 5 دقائق باستخدام 150 ميكرولتر من ChIP RIPA Buffer المثلج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية على دوار (20 دورة في الدقيقة). قم بإزالة المادة الطافية باستخدام فاصل مغناطيسي.
  4. اغسل الخرزات ب 150 ميكرولتر من ChIP LiCl Buffer المثلج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية على دوار (20 دورة في الدقيقة). قم بإزالة المادة الطافية باستخدام فاصل مغناطيسي.
  5. أضف 30 ميكرولتر من محلول شطف ChIP (29 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز و 1 ميكرولتر من البروتيناز K) لإعادة تعليق الخرزات ورجها عند 900 دورة في الدقيقة عند 55 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. قم بنفض الغبار برفق على الأنبوب بشكل دوري للحفاظ على الحرز في حالة تعليق.
  6. اجمع المادة الطافية باستخدام فاصل مغناطيسي وانقله ببطء إلى أنبوب جديد. احتضن عند 72 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة لتعطيل البروتيناز K.
  7. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور.
    ملاحظة: يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -80 درجة مئوية لحفظها على المدى الطويل.
  8. بالنسبة لعينات الإدخال ، أضف 1 ميكرولتر من Proteinase K ورجها عند 900 دورة في الدقيقة عند 55 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  9. تنقية الحمض النووي باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم. أضف 130 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي ودوامة بقوة حتى يتحول لون المحلول إلى اللون الوردي. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 5 دقائق.
  10. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وأضف 130 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المثلج ، ثم أضف 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 6.5 ميكرولتر 3M NaAc. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة.
  11. تخلص من المادة الطافية ، واغسلها مرة واحدة ب 1 مل من الإيثانول 70٪ ، وجهاز الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة. جفف الحبيبات وأعد تعليقها في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النكلياز.
  12. قم بقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الفلور.
    ملاحظة: يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -80 درجة مئوية لحفظها على المدى الطويل.

6. اليوم 3 من ChIP-seq منخفض المدخلات: بناء المكتبة وتسلسلها

  1. قم بإجراء بناء المكتبة باستخدام مجموعة إعداد مكتبة ChIP DNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: تتضمن الخطوات "إعداد النهاية" وربط المحول "تضخيم المكتبة". ماصة 5 نانوغرام من عينات ChIP (عينات المدخلات وبروتوكول الإنترنت) لبناء المكتبة. احتفظ بجميع العينات والمحاليل على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك. على الرغم من أن الإجراءات قد تختلف بين العلامات التجارية الأخرى للأدوات ، إلا أنها متوافقة مع البروتوكول الخاص بنا.
  2. التحضير النهائي: قم بإعداد المخزن المؤقت لتفاعل التحضير النهائي (65 ميكرولتر) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عن طريق خلط 5 نانوغرام من عينة الحمض النووي (من الخطوة 5.6 أو الخطوة 5.11) ، و 15 ميكرولتر من مزيج التحضير النهائي 4 ، و 6.5 ميكرولتر من Tris EDTA ، والماء الخالي من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 65 ميكرولتر. انقل الأنبوب إلى جهاز PCR وقم بتشغيل البرنامج التالي: 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، و 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، واستمر في 4 درجات مئوية (الغطاء الساخن: 105 درجة مئوية).
  3. ربط المحول: تخفيف محول الحمض النووي S بنسبة 1: 100. قم بإعداد المخزن المؤقت لتفاعل ربط المحول (100 ميكرولتر) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق خلط 65 ميكرولتر من منتجات التحضير النهائي (من الخطوة 6.2) ، و 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت للربط السريع 2 ، و 5 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي السريع ، و 5 ميكرولتر من محول الحمض النووي المخفف S. ماصة برفق للخلط. انقل الأنبوب إلى جهاز PCR وقم بتشغيل البرنامج التالي: 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بتثبيت عند 4 درجات مئوية (الغطاء الساخن: 105 درجة مئوية).
  4. تنقيه:
    1. أحضر حبات الحمض النووي النظيفة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. أضف 60 ميكرولتر من حبات DNA Clean إلى منتجات ربط المحول (من الخطوة 6.3). قم بخلط الماصة برفق للخلط واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. ضع أنبوب PCR على فاصل مغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا (~ 5 دقائق). تخلص بعناية من المادة الطافية
    3. احتفظ بالأنبوب على الفاصل المغناطيسي. اشطف حبيبات الحمض النووي النظيفة لمدة 2 × 30 ثانية مع 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية بعد كل شطف.
    4. مع بقاء الأنبوب على الفاصل المغناطيسي ، افتح غطاء الأنبوب وجفف الخرزات بالهواء لمدة 5 دقائق. أخيرا ، أضف 22.5 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-HCL (PH 8.0) لتصفية الحمض النووي.
  5. تضخيم المكتبة: قم بإعداد المخزن المؤقت لتفاعل تضخيم المكتبة (50 ميكرولتر) في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق خلط 20 ميكرولتر من منتجات التنقية (من الخطوة 6.4) ، و 2.5 ميكرولتر من i5 PCR التمهيدي ، و 25 ميكرولتر من مزيج التضخيم. ماصة برفق للخلط. انقل الأنبوب إلى جهاز PCR وقم بتشغيل البرنامج التالي: (95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) × دورة واحدة ، (98 درجة مئوية لمدة 20 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) × 18 دورة ، (72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) × دورة واحدة ، واستمر في 4 درجات مئوية.
  6. التنقية: قم بإحضار حبات DNA Clean إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام ، ثم قم بإجراء تنقية حبة مغناطيسية من خطوتين.
    1. الجولة الأولى: أضف 30 ميكرولتر من حبات DNA Clean إلى منتجات تضخيم المكتبة (من الخطوة 6.5). قم بخلط الماصة برفق للخلط واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع أنبوب PCR على فاصل مغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا (~ 5 دقائق). انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب جديد وتخلص من حبات الحمض النووي النظيفة.
    2. الجولة الثانية: أضف 7.5 ميكرولتر من حبيبات الحمض النووي النظيفة إلى المادة الطافية التي تم جمعها. قم بخلط الماصة برفق للخلط واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ضع الأنبوب على فاصل مغناطيسي وانتظر حتى يصبح المحلول واضحا (~ 5 دقائق). تخلص بعناية من المادة الطافية احتفظ بالأنبوب على الفاصل المغناطيسي. اشطف حبيبات الحمض النووي النظيفة لمدة 2 × 30 ثانية مع 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية بعناية بعد كل شطف. مع بقاء الأنبوب على الفاصل المغناطيسي ، افتح غطاء الأنبوب وجفف الخرزات بالهواء لمدة 10 دقائق. أخيرا ، أضف 22.5 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris-HCl (PH 8.0) لتصفية الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن تخزين عينات الحمض النووي عند -80 درجة مئوية لحفظها على المدى الطويل.
  7. تسلسل المكتبات في جهاز تسلسل قياسي من الجيل التالي.
    ملاحظة: نوصي بالحصول على ما لا يقل عن 10-20 مليون قراءة في نهاية الزوج.

7. تحليل بيانات ATAC-seq و Low-input ChIP-seq

  1. إعداد البيئة الافتراضية للتحليل (miniconda)
    1. قم بتنزيل Miniconda3 من موقع الويب باستخدام الأوامر التالية واتبع تعليمات التثبيت الخاصة ب Miniconda.
      ويجيت https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      باش Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. قم بإنشاء بيئة فضائية لخط أنابيب التحليل لكل من ATAC-seq و ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda تنشيط NGSpipeline
      Conda تثبيت Bioconda :: FastQC Bioconda :: MultiQC Bioconda :: Trim-Abundance Bioconda :: Bowtie2 Bioconda :: Samtools Bioconda :: MacS2 Bioconda ::d EEPTOOLS Bioconda ::p iCard Bioconda :: IGV
    3. قم بتنزيل ملف تسلسل الجينوم المرجعي وقم بعمل فهرس محاذاة لمحاذاة ربطة العنق 2.
      https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz wget
      GRCm38.p6.genome.fa.gz gunzip
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. قم بإجراء مراقبة الجودة لقراءات ATAC-seq وقراءات ChIP-seq باستخدام FastQC وتلخيص تقرير مراقبة الجودة باستخدام MultiQC لضمان تحيز GC لنتائج التسلسل وتعقيد المكتبة الكافي لتحليل المصب. تجاهل مكتبة التسلسل ذات نتائج مراقبة الجودة المختلفة بشكل كبير.
    Fastqc -O <دليل الإخراج> ......
    دليل MultiQC     < الإخراج>
  3. تقليم محول التسلسل باستخدام القطع الوفيرة.
    trim_galore -q 20 --phred33 --strictency 3 --طول 25 -e 0.1 --مقترن -j <رقم الخيط> -o <دليل الإخراج> < يقرأ الطرف المزدوج 1> < يقرأ الطرف المزدوج 2>
  4. خريطة القراءات المشذبة إلى تجميع الجينوم المرجعي mm10 باستخدام Bowtie2 باستخدام المعلمات الافتراضية ، وتمرير معلمات الإضافة (--حساسة جدا -X 2000) إلى ربطة عنق 2 ل ATAC-seq بسبب توزيع الطول الواسع لجزء ATAC-seq.
    1. بالنسبة إلى ATAC-seq:
      Bowtie2 -P <رقم الخيط> - حساسة جدا -X 2000 -x <فهرس الجينوم من الخطوة 7.1.3> -1 <ملف FastQ المنظف من 4.2 اقرأ 1> -2 <ملف FastQ المنظف من 4.2 قراءة 2> | عرض SAMtools -S -O BAM -@ <رقم الخيط> -O <ملف BAM الإخراج>
    2. ل ChIP-seq:
      Bowtie2 -P <رقم الخيط> -x <فهرس الجينوم من الخطوة 7.1.3> -1 <ملف FastQ المنظف من 4.2 اقرأ 1> -2 <ملف FastQ المنظف من 4.2 اقرأ 2> | عرض SAMtools -S -O BAM -@ <رقم الخيط> -O <ملف BAM الإخراج>
  5. قم بإزالة القراءات ذات درجة المحاذاة المنخفضة (q30) والقراءات المحاذاة لجينوم الميتوكوندريا والكروموسوم غير القياسي.
    عرض Samtools -BH -Q 30 -F 2 <ملف BAM المدخل> | عرض SAMtools -H | grep -v 'chrM' | grep -v 'عشوائي' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <ملف BAM المصفى الإخراج>
  6. استخدم أمر Picard MarkDuplicates لإزالة قراءات تكرارات PCR.
    picard MarkDuplicates I = <إدخال ملف bam المصفى > O = < إخراج إزالة ملف bam المكررة > M = < إزالة ملف تقرير الازدواجية > REMOVE_DUPLICATES = صحيح
  7. مكالمة الذروة باستخدام أمر MACS2 callpeak مع المعلمة -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t <إزالة ملف BAM التكراري > -g mm -n <بادئة الإخراج> -B -q 0.01
  8. قم بإنشاء ملفات BigWig باستخدام الأمر Deeptools BamCoverage.
    فهرس Samtools <إزالة ملف BAM التكراري> -@ 4
    bamCoverage -b     <إزالة ملف bam المكرر> -o <إخراج ملف BigWig> -bs 50 -p <رقم الخيط> --effectiveGenomeSize2652783500 --normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. استخدم متصفح جينوم IGV لعرض ملف narrowPeak من ملفات macs2 و BigWig من Deeptools BamCoverage.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإنشاء مشهد الكروماتين للخلايا الصفراوية الأولية ، قمنا بتحسين بروتوكولات ChIP-seq و ATAC-seq منخفضة المدخلات لأعداد منخفضة (~ 100,000) من الخلايا الصفراوية الأولية. أشارت نتائج الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز للخلايا الصفراوية الأولية إلى أنه بالنسبة ل 1 × 105 خلايا القنوات الصفراوية الأولية ، أدى 0.02 U MNase عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إلى إنتاج أحادي النوكليوسومات ، والذي تم تحديده على أنه التركيز الأمثل (الشكل 1).

نظرة عامة على تحليل AT...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لرسم خريطة منهجية وشاملة لديناميكيات حالة الكروماتين الكامنة وراء انتقال الحالة للخلايا الصفراوية الكيسية ، نجحنا في تحسين ChIP-seq منخفض المدخلات و ATAC-seq لعدد محدود من الخلايا الصفراوية الأولية. على الرغم من أن هذه الدراسة ركزت على الخلايا الصفراوية الأولية ، إلا أننا واثقون من أنه يمكن أيضا تطبيق البروتوكول على الخلايا الأولية الأخرى عالية القابلية للحياة ذات التوافر المحدود. وبالمثل ، في حين أن هذه الدراسة تقدم فقط نتائج تحليل ChIP-seq ل H3K9ac و H3K9me3 ، فإن البروتوكول ينطبق بالت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82402166 إلى R.J.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTASolarbioE1170
1 م Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (الأس الهيدروجيني = 8.0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Agarose gelBiosharpBS081
ATAC DNA Library طقم الإعداديةVazymeTD501
CaCl2< / sub>Sangon BiotechA5013301 M مخزون
ChIP DNA مكتبة الإعداديةVazymeND607
حبات الحمض النووي النظيفةVazymeN411
كاشف استخراج الحمضالنووي SolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 ملي مولار (الرقم الهيدروجيني = 8) الأسهم
مقياس الفلورInvitrogenQ33226
الجليكوجينالحراري العلميR0561
مقياس الدمQIUJINGXB. ك 25.
Igepal CA-630SigmaI889610٪ مخزون
فاصل مغناطيسيPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M
مخزون MNaseSigmaN37550.01 U/µ L مخزون
NaClSangon BiotechA6104765 M مخزون
NP40SolarbioN8030
المياه الخالية من Nucleaseتقنيات الحياةAM9937
أداة PCRالنظم الحيويةالتطبيقية 4484073
طقم تنقية PCRQIAGEN28106
مثبط الإنزيم البروتينيروش04693132001
حبات البروتين GInvitrogen10004D
Proteinase KTransGenGE201-01
RotatorKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010٪  مخزون
ديوكسي كولات الصوديومسيجماS1827
خلاط حراري مريحEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220<
strong>SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
تقليم وافر0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Multi omics TechniquesChromatin StateLow input ChIP seqATAC seq ProtocolChromatin AccessibilityHistone ModificationsPrimary CholangiocytesEpigenetic ProfilingMicrococcal NucleaseTn5 Transposase
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة