الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية لرسم خرائط فائقة الدقة للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ القوارض

Pia Virginia Pelaez; Sara Romanzi; Adrien Bertolo; Mohamed Nouhoum; Theo Meranger; Nathalie Ialy-Radio; Thomas Deffieux; Sophie Pezet; Jeremy Ferrier

doi:10.3791/68612

مقالة منهجية

الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية لرسم خرائط فائقة الدقة للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ القوارض

DOI:

10.3791/68612

⸱

نوفمبر 14, 2025

Pia Virginia Pelaez^*¹ , Sara Romanzi^*¹ , Adrien Bertolo¹ , Mohamed Nouhoum¹ , Theo Meranger¹ , Nathalie Ialy-Radio² , Thomas Deffieux² , Sophie Pezet² , Jeremy Ferrier¹

¹Iconeus, ²Physics for Medicine Paris, Inserm U1273, ESPCI Paris, PSL University, CNRS UMR 8063

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية (ULM) هو تقنية تم تطويرها مؤخرا تسمح بمستوى غير مسبوق من الدقة في تصوير الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي. في هذا العمل ، نصف بالتفصيل كيفية الحصول على صور فائقة الحل للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ في القوارض باستخدام منصة تصوير بالموجات فوق الصوتية وظيفية موحدة مصممة للأبحاث قبل السريرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية (ULM) هو تقنية تصوير فائقة الدقة تتيح التصور في الجسم الحي لبنية الأوعية الدموية الدقيقة للدماغ متجاوزة حد الحيود للموجات فوق الصوتية التقليدية. من خلال اكتشاف وتتبع الفقاعات الدقيقة المحقونة عن طريق الوريد أثناء دورانها عبر الأوعية الدماغية ، تنتج ULM خرائط عالية الدقة لكثافة الأوعية الدموية وسرعة التدفق وسعة الإشارة المتناثرة على المقاييس المكانية حتى 5-10 ميكرومتر. يقدم هذا البروتوكول سير عمل كامل لإجراء تصوير ULM في القوارض ، بما في ذلك تحضير ، وتحديد موضع المسبار ، والحصول على الصور ، وحقن الفقاعات الدقيقة ، ومعالجة البيانات ، باستخدام منصة الموجات فوق الصوتية الوظيفية المخصصة. تم وصف طريقتين للتحضير ، تم تكييفهما للفئران (عبر الجمجمة) والجرذان (ذات النوافذ القحفية) ، متبوعة بتعليمات مفصلة لمحاذاة المسبار والاستهداف التشريحي باستخدام أطلس دماغ متكامل. أثناء الاستحواذ ، تتم مزامنة تسلسلات الموجات فوق الصوتية فائقة السرعة مع حقن البلعة للفقاعات الدقيقة لالتقاط بيانات التدفق الديناميكي. تتضمن خطوات إعادة البناء اللاحقة تصفية الفوضى ، واستيفاء الصورة ، واكتشاف الفقاعات الدقيقة ، وتوطين البكسل الفرعي ، وتتبع المسار. تشمل المخرجات خرائط الكثافة التي تعكس إشغال السفينة ، وخرائط السرعة التي تكشف عن أنماط التدفق والاتجاه ، وخرائط السعة التي توفر تباينا إضافيا للتفسير الهيكلي. توضح النتائج التمثيلية الاستحواذ الناجح عبر المستويات الإكليلية الكاملة وتسلط الضوء على المزالق الشائعة مثل جودة الحقن الرديئة ، والتحف الحركية ، والانحراف الناجم عن الجمجمة. يتوافق البروتوكول مع كل من الدراسات المقطعية والطولية وهو مناسب بشكل خاص للتحقيق في التغيرات الدماغية الوعائية في نماذج الشيخوخة والسكتة الدماغية وتمدد الأوعية الدموية والأمراض التنكسية العصبية. من خلال الجمع بين اختراق العمق والدقة الزمانية المكانية العالية والتصوير الوظيفي الخالي من الملصقات ، تقدم ULM أداة قوية لتحليل دوران الأوعية الدقيقة للدماغ غير الجراحي في النماذج قبل السريرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من أن الدماغ يمثل 2٪ فقط من كتلة الجسم ، إلا أنه يستهلك حوالي 20٪ من الأكسجين والجلوكوز للحفاظ على نشاط الخلايا العصبية¹. يتم تلبية هذا الطلب الأيضي المرتفع من خلال شبكة الأوعية الدموية المعقدة ، من الشرايين والأوردة الكبيرة إلى الأوعية الدموية الدقيقة مثل الشرايين والأوردة والشعيرات الدموية ، والتي يتم تنظيمها من خلال اقتران الأوعية الدموية العصبية². وقد تورط تعطيل هذه العملية المضبوطة بدقة في مجموعة واسعة من الاضطرابات العصبية. يعد فصل الأوعية الدموية العصبية ، على سبيل المثال ، سمة مرضية مبكرة في أمراض مثل مرض الزهايمر وباركنسون وهنتنغتون والتصلب الجانبي الضموري (ALS) ، وغالبا ما يسبق السمات المميزة الكلاسيكية للتنكس العصبي مثل علم أمراض الأميلويد بيتا وتاو³^،⁴^،⁵^،⁶. لذلك كان تصوير الطبيعة المعقدة للدماغ في الجسم الحي مصدر قلق أساسي لتلبية الحاجة المتزايدة لفهم العمليات الفسيولوجية. وفرت التطورات التكنولوجية قدرات فريدة لفحص وظائف الدماغ ونشاطه ، بشكل مباشر وغير مباشر ، مع زيادة الدقة والدقة وإمكانية الوصول.

برزت الموجات فوق الصوتية دوبلر كأداة قوية للقياس الوظيفي لنشاط الدماغ باستخدام تدفق الدم⁷. على وجه الخصوص ، ينقل تصوير دوبلر الكهربائي ، المصمم للكشف عن حركة خلايا الدم الحمراء (RBCs) ، نبضات الموجات فوق الصوتية المتكررة إلى الأوعية الدموية ويسجل سعة أصداء الموجات فوق الصوتية المتناثرة عن طريق تحريك كرات الدم الحمراء⁸. كان ظهور التصوير بالموجات فوق الصوتية فائق السرعة ، وتحديدا الموجات فوق الصوتية الوظيفية (fUS) ، بمثابة نقطة محورية في التغلب على القيود السابقة. في الواقع ، تقوم الموجات فوق الصوتية التقليدية بمسح الأنسجة سطرا بسطر - وهو نهج متسلسل يحصر تطبيقه على الشرايين الدماغية الرئيسية ، حيث لا يمكن اكتشاف تدفقات الدم البطيئة النموذجية للأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ⁹. تستخدم تقنية fUS الحديثة عمليات إرسال متعددة للموجات المستوية للحصول على آلاف الإطارات في الثانية ، مما يحسن بشكل كبير كلا من الدقة الزمنية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR). بشكل حاسم ، يتيح fUS اكتشاف التغيرات الديناميكية الدموية في الأوعية الصغيرة جدا بسرعات منخفضة تصل إلى 1 مم / ثانية ، مما يدعم التصوير الوظيفي في الوقت الفعلي لنشاط الدماغ وصولا إلى مستوى الشرايين⁸.

في حين أن طرق دوبلر فائقة السرعة قد حسنت بشكل كبير تصوير الأوعية الدموية الدقيقة ، إلا أنها لا تزال مقيدة بدقة الحيود المحدودة للموجات فوق^{الصوتية 10}. جنبا إلى جنب مع fUS ، يخترق الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية (ULM) هذا العائق ، مما يتيح تصور هياكل الأوعية الدموية الدقيقة على مستوى الشعيرات الدموية من خلال الاستفادة من عوامل التباين وخوارزميات التوطين عالية الدقة¹¹. يوفر هذا رؤى غير مسبوقة حول مورفولوجيا الأوعية الدموية ووظيفتها. وبشكل أكثر تحديدا ، في ULM ، يتم حقن عوامل التباين المصنوعة من فقاعات دقيقة مملوءة بالغاز مستقرة ، يبلغ قطرها حوالي 1-3 ميكرومتر ، في مجرى الدم. إنها تعمل كمبعثرات صوتية قوية يمكن اكتشافها كمصادر نقطية فردية. بالنظر إلى أن الفقاعات الدقيقة أصغر بكثير من الطول الموجي بالموجات فوق الصوتية ، يمكن عزلها مكانيا وزمانيا ، وتظهر على أنها وظيفة انتشار النقاط (PSF) للنظام. مستوحاة من تقنيات الدقة البصرية الفائقة مثل STORM و PALM ، يتم تحقيق توطين البكسل الفرعي لهذه الفقاعات الدقيقة باستخدام طرق تفكيك الالتفاف التي ترسم مواقعها بدقة عالية¹⁰^،¹²^،¹³^،¹⁴. يسمح ذلك بحل هياكل الأوعية الدموية بدقة مكانية تتراوح من 5 إلى 10 ميكرومتر ، وهو ما يتجاوز بكثير الحد المفروض على الحيود لتصوير دوبلر التقليدي فائق السرعة بالموجات فوق الصوتية.

ULM هي أداة قوية وفعالة لرسم خرائط الأوعية الدموية وصولا إلى مقياس الشعيرات الدموية وتتغلب على قيود العديد من الطرق البصرية التي تقتصر على الطبقات السطحية. تعد قدرتها على إجراء تصوير الأوعية الدموية الدقيقة في الحية ، مما يسمح بإجراء دراسات طولية ودوائية ، ميزة رئيسية أخرى ل ULM على التقنيات الأخرى التي تتطلب تثبيت الدماغ وتلطينه. تمتد المعلومات المستخرجة إلى ما هو أبعد من خرائط الأوعية الدموية الثابتة ، مما يوفر تقديرات كمية لتدفق الدم وصولا إلى مستوى الشعيرات الدموية ، وبالتالي فتح طرق واعدة لكل من التطبيقات قبل السريرية والسريرية. لتسهيل قابلية التكاثر ، نصف سير عمل كامل لتصوير الدماغ القائم على ULM في القوارض ، والذي يتم تنفيذه باستخدام منصة تصوير بالموجات فوق الصوتية وظيفية موحدة مصممة للأبحاث قبل السريرية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الإجراءات الموضحة في هذه الدراسة وفقا لتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية الصادر في 22 سبتمبر 2010 (010/63 / UE) وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', project #2020-16). أجريت التجارب على الفئران الذكور البالغة C57BL / 6 Rj (عمرها شهران ، 20-30 جم) وفئران Sprague-Dawley Rj: Han (200-300 جم) من مصادر تجارية. تم إيواء في مجموعات من أربعة لكل قفص تحت دورة ضوئية / داكنة مدتها 12 ساعة ، مع درجة حرارة ثابتة تبلغ 22 درجة مئوية ، مع توفير الطعام والماء بشكل محرر. قبل بدء التجارب ، خضعت جميع لفترة تأقلم لمدة أسبوع واحد على الأقل مع ظروف السكن. يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تحضير

التخدير وتحضير في الفئران
1. ضع الماوس في غرفة تحريض الأيزوفلوران ، مع إعطاء 2٪ إيزوفلوران بالهواء (0.075 لتر / دقيقة) والأكسجين (0.175 لتر / دقيقة ، أو الهواء الطبي).
2. بعد 5 دقائق من تحريض التخدير ، انقل إلى الإطار التجسيمي ، والذي يتم وضعه فوق وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم ، وضمان توصيل الأيزوفلوران المستمر عبر قناع بنفس التركيز ومعدل التدفق.
3. تأكد من عمق التخدير الكافي عن طريق التحقق من عدم وجود ردود فعل استجابة لقرصة إصبع القدم أو الذيل باستخدام ضغط ثابت ولكن غير ضار. في حالة وجود رد فعل ، قم بزيادة تركيز الأيزوفلوران قليلا. إعادة التقييم قبل المتابعة.
4. ضع مرهم العين لمنع تكون إعتام عدسة العين.
5. حلق رأس الماوس باستخدام أداة تشذيب. ضعي كريم مزيل الشعر ، واتركيه لمدة 1-1.5 دقيقة ، ثم اشطفيه بالماء الدافئ وجففيه بالشاش. كرري العملية حسب الحاجة حتى تتم إزالة الشعر بالكامل. تجنب ترك كريم مزيل الشعر لفترات أطول من الوقت ، فقد يتسبب في تلف كيميائي للجلد.
6. ضع جل الموجات فوق الصوتية بالطرد المركزي (خال من الفقاعات ، منزوع الغازات) على الرأس لضمان الاقتران الصوتي.
التخدير وتحضير في الفئران
1. بعد وزن الفئران، يتم تطبيق حقنة داخل الصفاق لخليط من الكيتامين (75 ملغ/كغ) وإزيلازين (10 ملغ/كغ) باستخدام حقنة 1 مل. احلق الفراء أعلى الرأس ونظف الجلد بمحلول اليود.
  ملاحظة: الكيتامين مادة شديدة التنظيم في العديد من البلدان وقد تتطلب تصريحا خاصا للشراء والاستخدام. يمكن استخدام أنظمة التخدير البديلة لتحقيق التخدير على المستوى الجراحي.
2. ضع على جهاز تجسيمي يتم وضعه فوق وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة الجسم. ضعي كمية وفيرة من مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف وتكوين إعتام عدسة العين.
3. حقن ميلوكسيكام تحت الجلد (2 مجم / كغ) باستخدام حقنة 1 مل للتسكين أثناء الجراحة.
4. تأكد من عمق التخدير الكافي عن طريق التحقق من عدم وجود ردود فعل استجابة لقرصة إصبع القدم أو قرصة الذيل باستخدام ضغط ثابت ولكن غير ضار. في حال وجود رد فعل، يتم تطبيق جرعة إضافية تساوي ربع جرعة التخدير الأولية. انتظر حوالي 5 دقائق قبل إعادة تقييم عمق التخدير. تابع فقط بمجرد تأكيد طائرة التخدير الجراحية وإعادة التقييم كل 20-30 دقيقة.
5. قم بعمل شق طولي على طول الخيط السهمي باستخدام مشرط ، مما يضمن أن الجرح عميق بما يكفي ليشمل الجلد والأنسجة الضامة المرتبطة بالجمجمة.
6. حافظ على ترطيب الأنسجة المحيطة جيدا طوال الجراحة باستخدام محلول ملحي فسيولوجي.
7. باستخدام مثقاب دوار ، تتبع برفق الخطوط العريضة لنافذة الجمجمة عن طريق وضع علامة على الطبقة السطحية للجمجمة. للوصول الأمثل إلى الدماغ ، يجب أن تكون النافذة حوالي 14 مم في البعد الجانبي و 2 مم على الأقل في البعد الأمامي الخلفي ، اعتمادا على حجم الجمجمة.
8. استمر في الطحن على طول المخطط حتى تختفي مقاومة العظام. أثناء الحفر ، ضع بضع قطرات من المحلول الملحي الفسيولوجي بشكل دوري لتبريد العظام وتقليل الضرر الحراري. يجب إدخال ملعقة رفيعة ذات حواف مستديرة بسهولة في الفجوة دون قوة.
9. باستخدام ضربات توسيع قصيرة أحادية الاتجاه ، قم بتخفيف الطبقة الأخيرة من العظم حتى تصبح المقاومة بالكاد محسوسة.
10. أدخل ملعقة رفيعة منحنية قليلا ذات حواف مستديرة عند الحافة الجانبية لنافذة الجمجمة.
11. حرك الملعقة ببطء نحو المركز ، وافصل العظم برفق عن السحايا. بمجرد عدم الشعور بأي مقاومة ، ارفع قطعة العظام المنفصلة وقم بإزالتها بالكامل.
12. ضع جل الموجات فوق الصوتية بالطرد المركزي فوق الجافية. يتم تصوير وصف الإعداد التجريبي في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1: تخطيطي للإعداد التجريبي لتصوير الدماغ ULM في القوارض. يتكون نظام التصوير من وحدة اكتساب الموجات فوق الصوتية متصلة بمسبار عالي التردد مركب على مرحلة تحديد المواقع الآلية. يتم عرض كل من الفئران والجرذان في إطارات تجسيمية: يتميز الفأر بفروة رأس محلوقة للتصوير عبر الجمجمة ، بينما يخضع الجرذ للتصوير من خلال نافذة قحفية معدة جراحيا. يتم وضع قسطرة وريد الذيل لحقن عامل التباين في كلا النوعين. يسمح هذا الإعداد بالاكتساب المستقر لبيانات الموجات فوق الصوتية الوظيفية عالية الدقة أثناء حقن الفقاعات الدقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قسطرة وريد الذيل
1. استخدم مجموعة ضخ مجنحة مقاس 27 جم × 1/2 بوصة متصلة بإبرة 18 جيجا × 1/2 بوصة مع أنبوب 8 بوصات. قم بتقصير الأنبوب ، إن أمكن ، لتقليل الحجم الميت.
2. اقلب ذيل برفق 90 درجة لكشف عروق الذيل الجانبية (انظر الشكل 2). ثبت الذيل في مكانه باستخدام شريط لاصق لضمان الثبات ومنع الحركة غير الضرورية أثناء القسطرة.
3. حدد وريد الذيل بالبدء من الطرف البعيد (طرف الذيل) والتحرك نحو القاعدة. لتسهيل هذه الخطوة ، يمكن تسخين الذيل بالماء الفاتر لتعزيز توسع الأوعية وتعزيز رؤية الوريد.
4. باستخدام إصبعك ، اضغط برفق على قاعدة الذيل وحركها نحو موقع الحقن (أي عكس اتجاه تدفق الدم). تعيق هذه المناورة مؤقتا العودة الوريدية ، مما يتسبب في انتفاخ الأوردة الذيلية وتصبح أكثر بروزا ، مما يسهل إدخال القسطرة.
5. أدخل إبرة 27 جم × 1/2 بوصة لمجموعة التسريب المجنحة الموازية للوريد ، مما يضمن أن الشطبة متجها لأعلى.
6. راقب الأنبوب بحثا عن وجود ذكريات فلاش باك الدم ، مما يؤكد وضع الإبرة بشكل صحيح.
  ملاحظة: ابدأ القسطرة في نهاية الذيل البعيد لتجنب التسرب من الثقوب السابقة أثناء الحقن اللاحقة. إذا ثبت أن قسطرة وريد الذيل صعبة أو غير ناجحة ، فيمكن التفكير في طرق مركزية بديلة. وتشمل هذه الجيب الأنفي المداري الرجعي أو الوريد الوداجي أو الوريد الصافن.

figure-protocol-2
الشكل 2: تشريح المقطع العرضي لذيل القوارض يوضح معالم الأوعية الدموية للقسطرة. رسم تخطيطي لمقطع عرضي من خلال ذيل القوارض البعيدة ، يوضح المواضع النسبية للأوعية الدموية الرئيسية. يوجد شريان بالقرب من خط الوسط: الشريان الذيلي الظهري ، الموجود في المنطقة العلوية (الظهرية) ، والشريان الذيلي البطني ، الموجود في الجزء السفلي (البطني) من المقطع العرضي للذيل. عادة ما يتم تجنب هذه الشرايين أثناء الإجراءات الوريدية. تحيط بالشرايين بشكل جانبي الأوردة الذيلية ، والتي تعمل بشكل متماثل على كلا الجانبين وتقع تحت الجلد مباشرة ، مما يجعلها مواقع الوصول المفضلة للقسطرة أو حقن الفقاعات الدقيقة. تساعد هذه النظرة التشريحية في تحديد المواقع بدقة للأوردة ، خاصة عندما يتم تعزيزها عن طريق الاحترار لتعزيز توسع الأوعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحديد المواقع باستخدام برنامج IcoScan
1. على منصة الاستحواذ، ابدأ برنامج اكتساب fUS (على سبيل المثال، IcoScan for Iconeus One) وأنشئ جلسة تجريب. اضبط موضع مسبار الموجات فوق الصوتية.
  ملاحظة: ضع المسبار على ارتفاع 1 مم تقريبا فوق رأس. تأكد من أن المسبار ملامس لهلام الموجات فوق الصوتية قبل بدء أي تسلسل تصوير.
2. ابدأ اكتساب Live View واضبط موضع المسبار حسب الحاجة باستخدام تصوير حجم الدم الدماغي (CBV) في الوقت الفعلي. يجب أن يتركز الدماغ على الصورة. تحسين معلمات التصوير، مثل التباين والضغط، لتحسين جودة التصور.
3. افتح قائمة Angio3D في برنامج الاستحواذ. اضبط معلمات المسح (الشريحة الأولى والشريحة الأخيرة وحجم الخطوة) ، مما يضمن أنها تغطي الدماغ بالكامل. ابدأ الاستحواذ.
  ملاحظة: عند إعداد معلمات الفحص ، تأكد من أن الفحص يغطي الجزء الخلفي من الدماغ ، أي الشرايين الخلفية بأكملها.
4. احتفظ ببرنامج الاستحواذ مفتوحا وابدأ برنامج IcoStudio لتحليل البيانات وتصورها. قم بتحميل فحص Angio3D .
5. انتقل إلى لوحة تسجيل الدماغ وقم بتسجيل المسح الضوئي في إطار إحداثيات Allen Mouse المشترك باستخدام وضع التسجيل التلقائي بالكامل أو اليدوي.
6. احفظ التسجيل كملف .bps.
7. بعد ذلك ، انتقل إلى قائمة التنقل في الدماغ . في لوحة Atlas Manager ، استخدم متصفح شجرة الأصل/الطفل لاستعراض Allen Mouse Brain Atlas. حدد المناطق التشريحية المستهدفة ، والتي سيتم تثبيتها على المسح الضوئي في لوحة 3 طرق عرض.
8. اختر مستوى تصوير يتداخل مع مناطق الاهتمام. قم بتعيين علامتين يدويا في العرض الإكليلي لتحديد شريحة التصوير المستهدفة.
9. انقر فوق نظام تحديد المواقع في الدماغ (BPS) لاستخراج إحداثيات المحرك المقابلة لموضع المسبار لتصوير المستوى المحدد. تحقق من معاينة الصورة ، المحسوبة من فحص Angio3D ، وانقر فوق نسخ إحداثيات BPS.
10. قم بالتبديل إلى برنامج IcoScan وافتح لوحة تحديد المواقع المسبار . انقر فوق إدخال إحداثيات BPS والصق القيم المستخرجة في الخطوة 1.4.9. سيتحرك المسبار تلقائيا ويتماشى مع مستوى التصوير المحدد.
11. قم بإجراء اكتساب Live View للتأكد من أن مستوى التصوير الحالي يطابق المستوى المتوقع من الخطوة 1.4.8.
  ملاحظة: من خلال حفظ نفس العلامات المكانية وإعادة استخدامها ، يمكن إعادة تعريف مستوى التصوير باستمرار عبر الجلسات ، مما يتيح إعادة وضع المسبار بدقة للدراسات الطولية.

2. الاستحواذ على ULM

تحضير الفقاعات الدقيقة
ملاحظة: يمكن استخدام مجموعة متنوعة من عوامل التباين بالموجات فوق الصوتية المتوفرة تجاريا. ومع ذلك ، قد يختلف تكوين الغاز وتركيز الفقاعة والقطر والاستقرار اعتمادا على المنتج المستخدم. يرجى اتباع توصيات الشركة المصنعة فيما يتعلق بالتحضير والتخزين.
1. باستخدام حقنة معقمة ، قم بحقن 5 مل من محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ في القارورة من خلال الحاجز.
  ملاحظة: بالنسبة لإعطاء البلعة المتكررة أو التسريب المستمر ، يمكن استخدام محلول كلوريد الصوديوم بحجم أقل بنسبة 0.9٪ لتحضير معلق فقاعي دقيق أكثر تركيزا. اضبط عامل التخفيف وفقا لذلك بناء على التطبيق المقصود.
2. حرك القارورة بقوة لمدة 20 ثانية لإعادة تعليق الفقاعات الدقيقة بالكامل وتحقيق تشتت موحد.
تسجيل ULM
1. حدد معلمات التسجيل مسبقا ، بما في ذلك تسلسل الموجات فوق الصوتية ومعدل الإطارات وإجمالي وقت التسجيل.
  ملاحظة: المعلمات الموصى بها للتسجيل هي 5-10 دقائق عند 2.5 هرتز.
2. ارسم حجم الفقاعات الدقيقة المراد حقنها وابدأ في الاستحواذ. بمجرد بدء الاستحواذ ، تابع حقن الفقاعات الدقيقة. يوصى بحقن 200 ميكرولتر للفئران و 100 ميكرولتر للفئران ، عند التخفيف المناسب.
3. قم بتأكيد تحسين التباين على صورة Live View. بعد ذلك مباشرة ، اغسل الفقاعات الدقيقة المتبقية في الحجم الميت عن طريق حقن سائل فسيولوجي في القسطرة. يظهر مثال نموذجي لملف تعريف شدة الفقاعات الدقيقة في الشكل 3.
4. انتظر حتى يكتمل الاستحواذ واحفظ البيانات.
5. في نهاية عملية الاستحواذ ، تابع ما يلي ، اعتمادا على البروتوكول المستخدم:
  1. للفئران (بروتوكول غير جراحي): عكس التخدير عن طريق إيقاف إعطاء الأيزوفلوران ومراقبة أثناء التعافي في بيئة دافئة حتى يستيقظ تماما.
  2. بالنسبة للفئران (بروتوكول غازي مع نافذة قحفية): يتم القتل الرحيم للحيوان عن طريق الحقن داخل الصفاق من يوثاسول (بنتوباربيتال الصوديوم ، 140 مجم / كغ) ، وفقا للإرشادات المؤسسية والأخلاقية.

figure-protocol-3
الشكل 3: شدة إشارة الفقاعات الدقيقة بمرور الوقت. (أ) رسم توضيحي لمنطقة الاهتمام (ROI) المستخدمة لاستخراج الإشارة ، والتي تشمل شريحة الدماغ الإكليلية بأكملها. (ب) المسار الزمني لشدة إشارة الفقاعات الدقيقة أثناء اكتساب مدته 5 دقائق. تم حقن بلعة الفقاعات الدقيقة عند 30 ثانية ، مما أدى إلى ارتفاع مميز في سعة الإشارة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. إعادة بناء الصورة باستخدام برنامج IcoLab

افتح IcoLab وانتقل إلى ULM بالنقر فوق علامة التبويب ULM في الجزء الأيسر من الشاشة.
انقر فوق حساب خرائط ULM لبدء سير عمل المعالجة ، كما هو مفصل في الشكل 4.
حدد المجلد المصدر الذي يحتوي على البيانات التي تم الحصول عليها.
اختر الفحص المحدد المراد معالجته واضبط حدود وقت المعالجة إذا لزم الأمر.
انقر فوق التالي للمتابعة إلى خطوة الإبلاغ. في خطوة إعداد التقارير، قم بتكوين مسار مجلد الإخراج حيث سيتم حفظ الملفات المعالجة. قم بتعيين معلمات المرئيات للصور التي سيتم تضمينها في تقرير PowerPoint.
راجع ملخص الخيارات المحددة المعروضة على الشاشة النهائية.
عندما تكون جاهزا ، انقر فوق تشغيل لبدء المعالجة. بمجرد اكتمال المعالجة ، سيتم إنشاء ملف .trk ، يحتوي على جميع إحداثيات الفقاعات الدقيقة المترجمة ، جنبا إلى جنب مع ملفات TIFF النقطية للكثافة والسرعة والسعة العكسية المتناثرة (BSA).
ملاحظة: قد يتطلب الاستحواذ لمدة 5 دقائق عدة ساعات من المعالجة. من الأفضل تنفيذ هذه الخطوة بين عشية وضحاها أو على محطة عمل مخصصة.
1. إنشاء خرائط كثافة الفقاعات الدقيقة: يتم تجميع المواضع الموضعية لجميع الفقاعات الدقيقة المكتشفة خلال وقت الاستحواذ المحدد. قم بتعيين هذه المواضع على شبكة مكانية ثابتة الدقة.
  ملاحظة: يعكس كل بكسل في خريطة الكثافة الناتجة عدد الفقاعات الدقيقة المترجمة داخل تلك الحاوية المكانية. الإخراج النهائي هو صورة بتدرج الرمادي (TIFF) حيث تتوافق كثافة البكسل مع إشغال الأوعية الدموية ، مما يتيح إعادة بناء شبكة الأوعية الدموية عالية الدقة.
2. إنشاء خرائط السرعة: يتتبع البرنامج الفقاعات الدقيقة الفردية عبر إطارات متتالية لتشكيل مسارات. لكل مسار ، يحسب البرنامج متجه السرعة بقسمة الإزاحة على الوقت المنقضي (مما ينتج عنه متجه سرعة بمم / ثانية).
  ملاحظة: يمكن إنشاء نوعين من خرائط السرعة: خرائط السرعة المطلقة ، حيث يخزن كل بكسل متوسط حجم سرعة الفقاعات الدقيقة التي تمر عبرها ، وخرائط السرعة الاتجاهية ، حيث تتحلل السرعة على طول المحور التشريحي المختار (أي x أو z) ، ويتم تخزين المكون الموقع المقابل. يتم تنقيط هذه الخرائط على نفس الشبكة المكانية وحفظها كصور TIFF فردية.
3. إنشاء خرائط BSA: لكل فقاعة دقيقة موضعية ، يتم عرض سعة إشارة الموجات فوق الصوتية الخام (شدة التشتت الخلفي). قم بإسقاط هذه السعات على الشبكة المكانية ، مع تجميع شدة الإشارة في كل بكسل. تسلط خريطة BSA الناتجة الضوء على المناطق التي مرت فيها الفقاعات الدقيقة عبر المنطقة البؤرية للحزمة ، مما يوفر تباينا يكمل خرائط الكثافة والسرعة¹⁵.

figure-protocol-4
الشكل 4: مخطط انسيابي لخط أنابيب المعالجة لإعادة بناء خريطة ULM. يوضح الشكل خطوات المعالجة المتسلسلة التي يتم إجراؤها في برنامج التحليل لإنشاء خرائط ULM من بيانات الموجات فوق الصوتية الأولية. بدءا من الإطارات المركبة (ن = 200) ، تطبق الخطوة 1 تصفية فوضى تحلل القيمة المفردة (SVD) لعزل إشارات الفقاعات الدقيقة (MB) من خلفية الأنسجة. في الخطوة 2 ، تخضع إشارات MB لاستيفاء Lanczos ، مما ينتج عنه مكدس صور تمت معالجته مسبقا. تقوم الخطوة 3 بإجراء الكشف عن الحد الأقصى المحلي وتربطها بوظيفة انتشار النقطة (PSF) للنظام لتحديد مواقع الفقاعات الدقيقة المرشحة. في الخطوة 4 ، يتم استخدام توطين البكسل الفرعي (اكتشاف النقطة الوسطى) وتتبع الجسيمات لاستخراج مسارات الفقاعات الدقيقة ، والتي يتم من خلالها حساب خرائط السرعة والسعة المتناثرة للخلف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تصور البيانات باستخدام برنامج IcoStudio

قم بتحميل ملف .trk في IcoStudio لبدء استكشاف البيانات.
اضبط معلمات التصور مثل التباين والضغط وخريطة الألوان في اللوحة اليمنى لتحسين تمثيل البيانات.
قم بتعيين وقت التكامل باستخدام شريط التمرير المزدوج في أسفل طريقة العرض الرئيسية لتحديد إطارات البداية والنهاية.
افتح علامة التبويب Density لعرض تكرارات الفقاعات الدقيقة واختر بين Absolute Density (العد لكل بكسل) والكثافة الاتجاهية (مرجحة محوريا).
استخدم علامة التبويب السرعة لعرض سرعة الفقاعات الدقيقة بالملليمتر/ثانية من خلال أوضاع متعددة: مطلق واتاتجاه ومحوري وجانبي. اضبط عتبات التباين والضغط والسرعة لتحسين التصور.
استكشف علامة التبويب BSA لتصور انعكاسية الفقاعات الدقيقة، مما يوفر آلية تباين بديلة تسلط الضوء على هياكل الأوعية الدموية الدقيقة والحركة خارج المستوى. قم بتصدير لقطات شاشة PNG عالية الدقة أو إنشاء ملفات TIFF للتحليل الكمي باستخدام إعدادات حجم البكسل ونوع البيانات القابلة للتخصيص.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر الأمثلة التمثيلية في الشكل 5 مثالا نموذجيا لبيانات ULM لدماغ الفئران الذي تم الحصول عليه أكثر من دقيقة واحدة من التسجيل بعد 200 ميكرولتر من حقن بلعة الفقاعات الدقيقة ، بدقة 10 ميكرومتر.

figure-results-1
الشكل 5: مخرجات ULM التمثيلية المكتسبة من فأر مجمجم بعد حقن فقاعة دقيقة واحدة. يتم عرض خرائط أمثلة لكثافة الفقاعات الدقيقة (MB) (على اليسار) والسرعة (المركز) والسعة المتناثرة (على اليمين) لشريحة دماغية إكليلية كاملة ، تم الحصول عليها أكثر من دقيقة واحدة من التسجيل بعد حقن بلعة 200 ميكرولتر من الفقاعات الدقيقة. شريط المقياس: 2 مم. تبرز الأجزاء الداخلية المكبرة الأوعية الدموية الدقيقة القشرية اليسرى (شريط المقياس: 0.5 مم). تعكس خريطة الكثافة التوزيع المكاني لأحداث MB ، وتكشف عن بنية شبكة الأوعية الدموية. توضح خريطة السرعة سرعة التدفق واتجاهها للميغابايت الفردية ، مما يتيح التمييز بين أنواع السفن. تظهر خريطة السعة إشارة الموجات فوق الصوتية المتناثرة من MBs ، مما يوفر آلية تباين إضافية تعزز تصور مورفولوجيا الأوعية الدموية والحركة خارج المستوى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

توضح الخرائط الناتجة ثلاث وجهات نظر تكميلية للأوعية الدموية الدماغية الدقيقة: كثافة الفقاعات الدقيقة (MB) (يسار) ، والسرعة (المركز) ، والسعة المتناثرة (على اليمين). تتوافق كل خريطة مع شريحة إكليلية كاملة من الدماغ ، مع مجموعات مكبرة تسلط الضوء على الأوعية الدموية الدقيقة القشرية اليسرى (أشرطة المقياس: 2 مم و 0.5 مم ، على التوالي).

توضح خريطة الكثافة التوزيع المكاني لتكرارات MB عبر مجال الرؤية. يتم حل مورفولوجيا الأوعية الدموية أقل بكثير من حد الحيود ، مما يكشف عن كل من الأوعية الكبيرة والهياكل الشعرية الدقيقة. يتيح هذا النوع من الخرائط تصورا واضحا لطوبولوجيا شبكة الأوعية الدموية ، بما في ذلك التشعبات والأنماط المتفرعة ، حتى في المناطق القشرية العميقة.

تعرض خريطة السرعة سرعة تدفق ميغابايت الفردية المسقطة على طول الاتجاه المحوري (z). ينتج عن هذا الإسقاط قيم سرعة موقعة ، حيث تعكس السرعات السالبة التدفق التصاعدي إلى القشرة وتعكس القيم الموجبة التدفق الهابط. في القشرة الدماغية للقوارض ، تكون بنية الأوعية الدموية نمطية للغاية: تنحدر الشرايين المخترقة من سطح المحور إلى الطبقات القشرية ، بينما تصعد الأوردة من القشرة إلى السطح لتصريف الدم غير المؤكسج¹⁶. يتيح هذا الترتيب التشريحي المتسق استخدام قياسات السرعة الاتجاهية للتمييز بين أنواع الأوعية ، حيث تشير السرعات المحورية الموجبة عادة إلى التدفق الشرياني والسرعات السالبة التي تشير إلى التصريف الوريدي. بشكل عام ، تتوافق قيم السرعة المقاسة باستخدام ULM مع النطاقات التي تم الإبلاغ عنها سابقا في الأدبيات¹⁰^،¹⁷ ، والتي تمتد من 10-20 مم / ثانية في الشرايين المخترقة إلى عدة سنتيمترات في الثانية في الشرايين الرئيسية داخل الجمجمة. تتماشى هذه النتائج مع الملاحظات السابقة التي تفيد بأن الفقاعات الدقيقة المتدفقة تحاكي عن كثب السلوك الريولوجي لخلايا الدم الحمراء¹⁸ ، مما يثبت صحة استخدام ULM لقياس ديناميكيات تدفق الدم الفسيولوجية على النطاق الدقيق.

توفر خريطة السعة المتناثرة (BSA) تمثيلا مكانيا لشدة إشارة الموجات فوق الصوتية التي يتم إرجاعها بواسطة كل ميغابايت. نظرا لأن الطاقة المتناثرة يتم تعظيم الطاقة العكسية عندما تمر MBs عبر المنطقة البؤرية ، توفر هذه الخريطة تباينا بناء على الموضع المرتفع. يساعد في تحسين التجزئة من خلال تحديد الحركة خارج المستوى أو الأوعية ذات السعة المنخفضة ، خاصة في الأعماق الأكبر أو بالقرب من الحواف البؤرية. كما أن خرائط BSA ذات قيمة لكشف توهين الإشارات المرتبط بالعمق أو تحديد حالات عدم التطابق في التراصف البؤري¹⁵.

لإثبات قابلية استنساخ استهداف الطائرة باستخدام نظام تحديد المواقع في الدماغ ، يوضح الشكل 6 أ خرائط كثافة الأوعية الدموية ULM المكتسبة في نفس الفأر تحت التخدير في اليوم 0 (الأسبوع 1) واليوم 7 (الأسبوع 2) ، مستهدفا نفس المستوى الإكليلي. يظهر تراكب كلتا الخريطتين تطابقا مكانيا قويا لإشارة الأوعية الدموية ، مما يؤكد دقة إعادة وضع الطائرة وموثوقية التجارب الطولية ، كما هو موضح^{سابقا 19}.

يمكن تطبيق التحليل الكمي على أي من هذه المخرجات. على سبيل المثال ، يمكن للمستخدمين تقسيم السفن باستخدام عتبات الشدة أو خوارزميات التجميع ، ثم استخراج الإحصائيات الإقليمية مثل كثافة الأوعية الدموية ومتوسط سرعة التدفق والمعلمات المورفومترية بما في ذلك نصف قطر الوعاء ومتوسط الطول وعدد الفروع والواصفات الهيكلية الأخرى لشبكة الأوعية الدموية. يمكن إجراء المقارنات عبر المناطق القشرية أو المجموعات التجريبية (على سبيل المثال ، حقن المخدرات مقابل السيطرة) مباشرة على هذه الخرائط أو من خلال الإحصائيات البارامترية المشتقة على السفن المحددة بشكل شائع²⁰^،²¹. كمثال على هذا التحليل ، أجرينا تقديرات إقليمية لمعلمات الأوعية الدموية في القشرة الحسية الجسدية اليسرى (S1BF ، الشكل 6 ب) والمهاد الأيسر (الشكل 6 ج). تم أولا تحديد خرائط الكثافة ثنائية ، وهيكلية ، وتم تقدير نصف قطر الأوعية باستخدام تحويل المسافة الإقليدية. تم الحصول على سرعات التدفق مباشرة من مسارات MB ، وتم اشتقاق معدل التدفق من نصف قطر الوعاء باستخدام قانون Poiseuille كما هو مفصل سابقا²¹. وقد طبقت هنا المنهجية نفسها الموصوفة في تلك الدراسة. تعرض مخططات الشعيرات توزيعات نصف قطر الوعاء وسرعته ومعدل التدفق ل d0 و d7 ، مما يدل على قابلية التكرار الجيدة عبر الجلسات. تتيح مخرجات ULM متعددة الوسائط هذه معا توصيفا شاملا لشبكة الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ ، مما يوفر رؤى تشريحية وديناميكية بدقة غير مسبوقة.

figure-results-2
الشكل 6: التكاثر الطولي لاستهداف الطائرة ومثال على القياس الكمي للأوعية الدموية باستخدام نظام تحديد المواقع في الدماغ. (أ) خرائط كثافة الأوعية الدموية ULM التي تم الحصول عليها من نفس الفأر المخدر في اليوم 0 (الأسبوع 1) واليوم 7 (الأسبوع 2) ، مستهدفة نفس المستوى الإكليلي باستخدام نظام تحديد المواقع في الدماغ (شريط المقياس = 1 سم). يظهر تراكب كلتا الخريطتين تطابقا مكانيا قويا للإشارة الوعائية ، مما يوضح قابلية تكرار تحديد موضع المستوى عبر الجلسات. (ب ، ج) القياس الكمي التمثيلي لمعلمات الأوعية الدموية المستخرجة من منطقتين من المناطق: القشرة الحسية الجسدية اليسرى (S1BF ، B) والمهاد الأيسر (C). لكل منطقة ، نعرض خريطة كثافة الأوعية الدموية عند d0 (شريط المقياس = 0.5 سم) ، جنبا إلى جنب مع مخططات شعيرات توضح توزيع نصف قطر الوعاء (ميكرومتر) ، وسرعة التدفق (مم / ثانية) ، ومعدل التدفق (مم³ / ثانية) عند d0 و d7 (المتوسط ، النسبة المئوية 25-75 ، الشعيرات = 1.5×IQR ، القيم المتطرفة مرسومة بشكل فردي). توضح هذه النتائج قدرة خط الأنابيب على استخراج المقاييس المورفومترية والديناميكية الدموية من بيانات ULM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية (ULM) تقدما تحويليا في التصوير بالموجات فوق الصوتية ، مما يتيح التصور فائق الدقة للأوعية الدموية الدقيقة بما يتجاوز حد الحيود التقليدي. تسلط هذه المناقشة الضوء على الخطوات الحاسمة في بروتوكول ULM ، وتتناول التعديلات المحتملة واستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، وتستكشف قيود الطريقة ، وتقيم أهميتها مقارنة بطرق التصوير البديلة ، وتأخذ في الاعتبار أهميتها وتطبيقاتها المحتملة في البحوث الطبية الحيوية.

الخطوات الحاسمة في بروتوكول ULM

هناك عدة خطوات حاسمة للتنفيذ الناجح ل ULM ، وتأثيرها موضح في الشكل 7. واحدة من أهم الخطوات هي إعطاء الفقاعات الدقيقة ، حيث يؤثر كل من التركيز وجودة التسليم بشكل مباشر على نتائج التصوير. التركيز الأمثل ضروري لتحقيق التوازن بين الدقة المكانية وقابلية الكشف. يمكن أن يؤدي التوصيل غير الكافي ، مثل سوء وضع القسطرة أو التسرب ، إلى إشارة الأوعية الدموية منخفضة جدا وعمليات إعادة بناء غير مكتملة ، كما هو موضح في الشكل 7 ب ، حيث يصل عدد قليل فقط من الفقاعات الدقيقة إلى مجرى الدم. يعد التصوير بمعدل الإطارات العالي ، عادة في نطاق الكيلوهرتز ، ضروريا لالتقاط الحركة السريعة للفقاعات الدقيقة وتمكين التتبع الموثوق به عبر الإطارات. أي عدم استقرار أثناء الاستحواذ ، مثل الحركة التي يحدثها التنفس ، أو ضعف التثبيت ، أو عدم كفاية التخدير ، يمكن أن يؤدي إلى تدهور دقة التوطين. مثال على ذلك موضح في الشكل 7 ج ، حيث تؤدي الحركة المفرطة أثناء الاستحواذ إلى خريطة كثافة غير واضحة وغير قابلة للاستخدام.

يعتمد توطين الفقاعات الدقيقة وتتبعها على خوارزميات معالجة الصور المتقدمة التي تكتشف الفقاعات الفردية ، وإجراء توطين البكسل الفرعي ، وتعيد بناء المسارات بدقة الحيود الفرعي. حتى مع الاستحواذ والمعالجة المناسبين ، لا يزال بإمكان العوامل التشريحية مثل الانحرافات الناجمة عن الجمجمة التأثير على جودة الصورة. في التصوير عبر الجمجمة ، خاصة في الفئران الأكبر سنا ، يمكن أن يؤدي سماكة الجمجمة إلى حدوث تشويه صوتي. يؤدي هذا إلى قطع أثرية مميزة للتظليل أسفل الخيط السهمي ، حيث لا يتم اكتشاف فقاعات دقيقة ، كما هو موضح في الشكل 7 د. تقلل هذه الانحرافات من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويمكن أن تحجب هياكل الأوعية الدموية ما لم يتم تصحيحها باستخدام الترشيح التكيفي أو عن طريق تحسين وضع المسبار.

عندما يتم تنفيذ جميع الخطوات بنجاح ، يمكن تحقيق خرائط ULM عالية الجودة ، كما هو موضح في الشكل 7 أ ، حيث يتم إعادة بناء شبكة وعائية كثيفة وجيدة الحل من خلال نهج عبر الجمجمة.

figure-discussion-1
الشكل 7: أمثلة مرجعية واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لجودة تصوير ULM في الفئران. تظهر اللوحة (أ) خريطة كثافة ULM microbubble عبر الجمجمة عالية الجودة (MB) تم الحصول عليها في فأر بالغ صغير ، مما يوضح رسم خرائط الأوعية الدموية الناجحة عبر المستوى الإكليلي الكامل. تعرض اللوحة (ب) مثالا على إشارة الأوعية الدموية الضعيفة بسبب تسرب الفقاعات الدقيقة أو عدم كفاية الوصول الوريدي ، مما يؤدي إلى اكتشافات MB المتناثرة. تظهر اللوحة (ج) اكتسابا متأثرا بالحركة المفرطة للحيوانات، مما ينتج عنه خريطة كثافة ضبابية وغير قابلة للتفسير. تسلط اللوحة (D) الضوء على الانحراف الصوتي الناجم عن الجمجمة الذي يتم ملاحظته عادة في الفئران الأكبر سنا ، ويمكن رؤيته كمخروط ظل أسفل الخيط السهمي حيث لا يتم اكتشاف MBs بسبب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. تعمل هذه الأمثلة كمراجع مرئية لتحديد ومعالجة القطع الأثرية التجريبية الشائعة في تصوير ULM. شريط المقياس: 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

قيود الطريقة

على الرغم من مزاياها العديدة ، إلا أن ULM لها قيود متأصلة تؤثر على قابليتها للتطبيق. يعد تحيز الأوعية الدموية خارج الطائرة مشكلة مهمة في التصوير ثنائي الأبعاد ، حيث لا يتم إعادة بناء الأوعية الدموية الممتدة خارج مستوى التصوير بشكل كاف ، مما يؤدي إلى خرائط الأوعية الدموية غير المكتملة. يمكن تخفيف هذا القيد عن طريق الانتقال إلى نهج التصوير الحجمي (3D)²² ، على الرغم من أن هذا يزيد من التعقيد الحسابي. تشكل تحديات القسطرة الوريدية أيضا عقبة ، خاصة في نماذج الصغيرة ، حيث يمكن أن يكون تحقيق توصيل متسق للفقاعات الدقيقة أمرا صعبا من الناحية الفنية. يعد استقرار الفقاعات الدقيقة أيضا عاملا مقيدا ، خاصة أثناء جلسات التصوير الممتدة. نظرا لقصر عمر الدوران ، قد تتطلب الفقاعات الدقيقة حقن البلعة المتكررة أو بروتوكولات التسريب المستمر للحفاظ على التباين الكافي طوال فترة الاستحواذ. تظل القطع الأثرية الحركية مصدر قلق كبير ، خاصة بالنسبة للموضوعات المستيقظة ، حيث يمكن حتى للحركات اللاإرادية الصغيرة أن تؤدي إلى تدهور التصوير فائق الدقة. أخيرا ، يقتصر اختراق العمق في ULM بطبيعته على التوهين بالموجات فوق الصوتية. في حين أن هذا لا يمثل مشكلة بشكل عام لتصوير القوارض بترددات عالية (على سبيل المثال ، 15 ميجاهرتز) ، إلا أنه يصبح أكثر صعوبة في الكبيرة مثل الخنازير أو الرئيسيات غير البشرية. في هذه الحالات ، قد تكون هناك حاجة إلى مجسات منخفضة التردد لتحقيق عمق تصوير كاف ، ولكن هذا يأتي على حساب انخفاض الدقة المكانية - مما يؤكد على مقايضة رئيسية بين العمق والتفاصيل التي يجب مراعاتها عند ترجمة ULM إلى نماذج ما قبل السريرية الأكبر.

أهمية ULM مقارنة بالطرق الحالية

يوفر الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية (ULM) مزايا كبيرة مقارنة بطرق التصوير التقليدية ، لا سيما في سياق تصوير الأوعية الدموية الدقيقة. من بين نقاط قوتها البارزة قدرتها على تجاوز حد الحيود للموجات فوق الصوتية التقليدية ، وتحقيق تصوير الحيود الفرعي على المقاييس المكانية المماثلة للتقنيات البصرية مثل الفحص المجهري ثنائي الفوتون. على عكس هذه الطرق البصرية ، يوفر ULM اختراقا أعمق للأنسجة ، مما يسمح بالوصول إلى مناطق الدماغ التي يصعب تصورها بشكل غير جراحي.

يوفر ULM أيضا إمكانات تصوير وظيفية ، مما يتيح التقييم الكمي لسرعة تدفق الدم وديناميكيات التروية وإعادة تشكيل الأوعية الدموية. هذه الميزات تجعلها مناسبة للغاية للتحقيق في كل من العمليات الفسيولوجية والتغيرات المرضية في شبكات الأوعية الدموية العصبية. بالمقارنة مع التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، فإن ULM أكثر فعالية من حيث التكلفة ، ولا يتطلب بنية تحتية ثقيلة ، ويتجنب استخدام عوامل التباين ذات مخاطر السمية المعروفة ، ويعتمد بدلا من ذلك على الفقاعات الدقيقة المملوءة بالغاز مع ملفات تعريف أمان مواتية.

إن الجمع بين الدقة المكانية والزمانية العالية يجعل ULM ذا قيمة خاصة لمجموعة من التطبيقات البحثية. إنه قوي بشكل خاص في الدراسات التي تستهدف هياكل الأوعية الدموية الدقيقة ونوى الدماغ العميقة ، حيث غالبا ما تكون الطرائق التقليدية قصيرة. علاوة على ذلك ، على عكس الأساليب النسيجية التي تتطلب تثبيت الأنسجة وتلطيخها ، تتيح ULM التصوير في الوقت الفعلي للحيوانات الحية ، مما يدعم التصميمات الطولية والتدخلات الديناميكية مثل التحديات الدوائية.

بالإضافة إلى رسم خرائط الأوعية الدموية الثابتة ، تتيح ULM أيضا التصوير الوظيفي عالي الدقة من خلال التقاط ديناميكيات تدفق الدم الدماغي بدقة مكانية وزمانية استثنائية. أظهرت التطورات الحديثة جدواها للتصوير العصبي الوظيفي للدماغ بالكامل في القوارض ، مما يكشف عن التغيرات المستحثة بالتحفيز والعفوية المعتمدة على النشاط في تدفق الدم على مستوى الشعيرات الدموية عبر شبكات الدماغ^{الموزعة 2}. هذا يضع ULM كأداة قوية للدراسات الوظيفية ، مما يؤدي بشكل فعال إلى سد الفجوة بين التصوير الديناميكي الدموي على نطاق متوسط ورسم خرائط النشاط العصبي.

اعتبارات قابلية الاستخدام والكفاءة والتكرار

تم تحسين سير عمل ULM الموضح في هذا البروتوكول لسهولة التنفيذ وقابلية التكرار عبر الإعدادات التجريبية المختلفة. يضمن استخدام المكونات المتاحة تجاريا ، بما في ذلك الفقاعات الدقيقة المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) و EMA وإجراءات تخدير القوارض القياسية ، إمكانية الوصول على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تكامل خط أنابيب المعالجة بالكامل داخل البرنامج المخصص (IcoLab) يعزز بشكل كبير قابلية الاستخدام من خلال أتمتة الخطوات المعقدة مثل توطين الفقاعات الدقيقة وإعادة بناء المسار وإنشاء الخرائط. تقلل هذه الواجهة المبسطة من الحاجة إلى التعليمات البرمجية المخصصة وتقلل من تدخل المستخدم ، وتدعم نتائج متسقة عبر المستخدمين والتجارب. في حين أن معالجة ULM عالية الدقة مكثفة من الناحية الحسابية ، خاصة بالنسبة لعمليات الاستحواذ الطويلة أو البيانات الحجمية ، فإن أدوات معالجة الدفعات وتسريع وحدة معالجة الرسومات تقلل بشكل كبير من وقت التحليل. يدعم التصميم المعياري للبروتوكول أيضا قابلية التكاثر ، مما يسمح للباحثين بضبط معلمات الاستحواذ والمعالجة مع الحفاظ على إطار تحليلي قوي. يتضمن البروتوكول أيضا قسما مخصصا حول تحديد موضع المسبار باستخدام IcoScan و IcoStudio ، والذي يمكن المستخدمين من إعادة وضع المسبار بشكل موثوق في نفس شريحة التصوير بالضبط عبر الجلسات ، بدقة تبلغ حوالي 100 ميكرومتر. هذه الميزة ذات قيمة خاصة للدراسات الطولية ، حيث يكون الاتساق المكاني الدقيق ضروريا لتتبع تغيرات الأوعية الدموية بمرور الوقت. تعمل هذه الميزات بشكل جماعي على تقليل حاجز دخول المستخدمين الجدد وتدعم النشر القابل للتطوير ل ULM في كل من دراسات التصوير الاستكشافية والطولية.

استنتاج

يقدم هذا البروتوكول سير عمل كاملا لتنفيذ الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية (ULM) في تصوير دماغ القوارض ، ويغطي التحضير الجراحي ، وإدارة الفقاعات الدقيقة ، والحصول على الصور ، ورسم خرائط الأوعية الدموية عالية الدقة باستخدام منصة استحواذ وتحليل موحدة محسنة للأبحاث قبل السريرية. يمثل ULM تقدما كبيرا في التصوير الطبي الحيوي ، حيث يوفر دقة فائقة في الجسم الحي تصورا للأوعية الدموية الدقيقة بتفاصيل غير مسبوقة. بالمقارنة مع طرق التصوير الحالية ، يوفر ULM مزيجا فريدا من الدقة المكانية العالية ، وقياس التدفق الوظيفي ، وإمكانية الوصول ، مما يجعله مناسبا بشكل خاص لدراسات تطور الأوعية الدموية ، والاقتران العصبي الوعائي ، والفيزيولوجيا المرضية للأمراض. مع استمرار نضوج التكنولوجيا ، تستعد ULM لتصبح حجر الزاوية في كل من الأبحاث قبل السريرية ، وفي النهاية ، تطبيقات التصوير العصبي السريري.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TD هو المؤسس المشارك والمستشار العلمي لشركة Iconeus ، التي تقوم بتسويق ماسحات التصوير العصبي بالموجات فوق الصوتية. PP و SR و AB و TM و MN و JF هم موظفون في Iconeus. يعلن جميع المؤلفين الآخرين عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا فيليب ماتيو ولانتونيرينا عبد العجيج من الفيزياء للطب في باريس على دعمهما في التعامل مع ورعايتها. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 باستخدام BioRender.com.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جهاز تحكم في درجة حرارة الحيوانات (لوحة تسخين مقترنة بمسبار مستقيم)	فيزيتمب	TCAT-2DF
أتيباميزولي	أوريون فارما، فرنسا	Antisedan	محلول قابل للحقن بسعة 5 ملغ/مل
فئران C57BL/6	مختبرات جانفييه	SC-C57J-M	فئران ذكر C57BL/6Rj، عمرها 8 أسابيع
مثقاب الأسنان	فوردوم، الولايات المتحدة الأمريكية	مجموعة K.1070 للمحرك الدقيق الدوار عالي السرعة
كريم إزالة الشعر	فيشي	لا يوجد
مرهم العين	TVM، المملكة المتحدة	أوكري-جل
ماكينة قص الشعر	فيمب	إيزيس جي تي 421 إيسكولاب
برنامج معالجة IcoLab (الإصدار 1.2.0.0)	إيكونيوس، فرنسا	آيكو لاب
تكوين Iconeus One Xpand	إيكونيوس، فرنسا	آيكونيوس ون إكسباند
مسبار IcoPrime بسرعة 15 ميجاهرتز	إيكونيوس، فرنسا	مسبار آيكو برايم-15 ميجاهرتز
برنامج اكتساب IcoScan (الإصدار 1.9.0)	إيكونيوس، فرنسا	إيكو سكان
برنامج تحليل IcoStudio (الإصدار 2.2.0)	إيكونيوس، فرنسا	إيكو ستوديو
محلول اليود	مايلان، فرنسا	لا يوجد
محطة تخدير إيزوفلوران	مينيرف، إستيرني، فرنسا	لا يوجد
الكيتامين	فيرباك، فرنسا	كيتامين1000	محلول قابل للحقن بسعة 100 ملغ/مل
ميلوكسيكام	بويرغر إنغلهايم	ميتاكام	محلول قابل للحقن بسعة 0.5 ملغ/مل
إبر	تيرومو، فرنسا	AN*1838R1	18 G × & frac12; ” إبرة بحجم 8" الأنابيب
المياه المالحة	مختبر جيلبرت للجرعات الفيزيائية، صيدلية، فرنسا	لا يوجد
المشرط	دريكسكو الطبية، فرنسا	80011
فقاعات SonoVue الصغيرة	براكو إيميجينج	SonoVue 8ul/ml
الملعقة	فيميد، فرنسا.	مجموعة K.1070 للمحرك الدقيق الدوار عالي السرعة
سبراج-داولي Rj:هان الفئران	مختبرات جانفييه	RN-SD-M	RjHan:SD - جرذان ذكور سبراج داولي، 200-300 جرام
الإطار المجسم	ديفيد كوبف (توجونغا، الولايات المتحدة الأمريكية)	900-WA	استخدام محول الفأرة (مرجع: 922) وقضبان الأذن غير المتمزقة (المرجع: 922)
حقنة	دريكسكو الطبية، فرنسا	2058
جل الموجات فوق الصوتية	دريكسكو الطبية، فرنسا	ميدي'جيل
مجموعة التسريب المجنحة	تيرومو، فرنسا	SV*27EL
زيلازين 2٪	باير، فرنسا	رومبون	محلول قابل للحقن بوزن 20 ملغ/مل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jamadar, S. D., Behler, A., Deery, H., Breakspear, M. The metabolic costs of cognition. Trends Cogn Sci. 29 (6), 541-555 (2025).
Renaudin, N., et al. Functional ultrasound localization microscopy reveals brain-wide neurovascular activity on a microscopic scale. Nat Methods. 19 (8), 1004-1012 (2022).
Agarwal, N., Carare, R. O. Cerebral Vessels: An overview of anatomy, physiology, and role in the drainage of fluids and solutes. Front Neurol. 11, 611485(2021).
Ahmad, A., Patel, V., Xiao, J., Khan, M. M. The role of neurovascular system in neurodegenerative diseases. Mol Neurobiol. 57 (11), 4373-4393 (2020).
Sweeney, M. D., Kisler, K., Montagne, A., Toga, A. W., Zlokovic, B. V. The role of brain vasculature in neurodegenerative disorders. Nat Neurosci. 21 (10), 1318-1331 (2018).
Kolinko, Y., Krakorova, K., Cendelin, J., Tonar, Z., Kralickova, M. Microcirculation of the brain: Morphological assessment in degenerative diseases and restoration processes. Rev Neurosci. 26 (1), 75-93 (2015).
Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: A review of the preclinical and clinical state of the art. Curr Opin in Neurobiol. 50, 128-135 (2018).
Mace, E., et al. Functional ultrasound imaging of the brain: Theory and basic principles. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 60 (3), 492-506 (2013).
Tanter, M., Fink, M. Ultrafast imaging in biomedical ultrasound. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 61 (1), 102-119 (2014).
Errico, C., et al. Ultrafast ultrasound localization microscopy for deep super-resolution vascular imaging. Nature. 527 (7579), 499-502 (2015).
Réaux-Le-Goazigo, A., et al. Ultrasound localization microscopy and functional ultrasound imaging reveal atypical features of the trigeminal ganglion vasculature. Commun Biol. 5 (1), 330(2022).
Siepmann, M., Schmitz, G., Bzyl, J., Palmowski, M., Kiessling, F. Imaging tumor vascularity by tracing single microbubbles. IEEE Int Ultrason Symp. , 1906-1908 (2011).
Couture, O., Hingot, V., Heiles, B., Muleki-Seya, P., Tanter, M. Ultrasound localization microscopy and super-resolution: A state of the art. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 65 (8), 1304-1320 (2018).
Dencks, S., Schmitz, G. Ultrasound localization microscopy. Z Med Phys. 33 (3), 292-308 (2023).
Renaudin, N., Pezet, S., Ialy-Radio, N., Demene, C., Tanter, M. Backscattering amplitude in ultrasound localization microscopy. Sci Rep. 13 (1), 11477(2023).
Blinder, P., et al. The cortical angiome: An interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosci. 16 (7), 889-897 (2013).
van Raaij, M. E., et al. Quantification of blood flow and volume in arterioles and venules of the rat cerebral cortex using functional micro-ultrasound. Neuroimage. 63 (3), 1030-1037 (2012).
Lindner, J., Song, J., Jayaweera, A. R., Sklenar, J., Kaul, S. Microvascular rheology of definity microbubbles after intra-arterial and intravenous administration. J Am Soc Echocardiogr. 15 (5), 396-403 (2002).
Nouhoum, M., et al. A functional ultrasound brain GPS for automatic vascular-based neuronavigation. Sci Rep. 11, 15197(2021).
Lowerison, M. R., et al. Super-resolution ultrasound reveals cerebrovascular impairment in a mouse model of Alzheimer's disease. J Endocrinol. 44 (9), 1-14 (2024).
Nyúl-Tóth, A., et al. Novel intravital approaches to quantify deep vascular structure and perfusion in the aging mouse brain using ultrasound localization microscopy (ULM). J Cereb Blood Flow Metab. 0 (0), 1-19 (2024).
Demeulenaere, O., et al. In vivo whole brain microvascular imaging in mice using transcranial 3D Ultrasound Localization Microscopy. EBioMedicine. 79 (1), 103995(2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الفحص المجهري للتوطين بالموجات فوق الصوتية لرسم خرائط فائقة الدقة للأوعية الدموية الدقيقة في دماغ القوارض

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة