مقالة منهجية

إعادة برمجة Xenofree المحددة لأسلاف دم الحبل السري للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات والشبيهة بالبلاستومير

583 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68613

⸱

أغسطس 22, 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحدد هذا البروتوكول طرقا محددة كيميائيا للزينويات الخالية من المغذيات (XF) ، والتغذية الخالية (FF) ، وإعادة البرمجة العرضية لأسلاف الدم النخاعي لدم الحبل السري البشري (CB) إلى الخلايا الجذعية التقليدية متعددة القدرات المستحثة عن الإنسان (hiPSC). يمكن إرجاع XF / FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) بكفاءة إلى الخلايا الجذعية الساذجة الخاضعة للتنظيم من قبل المثبطات (TIRN-SC) الشبيهة بالبلاستومير التي تمتلك تمايزا معززا وإمكانات خيمية بين الأنواع.

الملخص

يمكن إعادة برمجة السلف النخاعي لدم الحبل السري البشري (CB) إلى حالة الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC) عالية الدقة المستحثة البشرية باستخدام النواقل العرضية غير المتكاملة والإشارات اللحمة. يمكن لاحقا إرجاع خطوط CB-hiPSC التقليدية هذه كيميائيا بكفاءة عالية إلى حالة الخلايا الجذعية الساذجة الخاضعة للتنظيم من قبل مثبطات Tankyrase / PARP (TIRN-SC) الشبيهة بالبلاستومير مع القدرة الوظيفية. TIRN-SCs الخاضعة للتنظيم بواسطة PARP هي خلايا جذعية بشرية ذات مرونة جينية عالية ، وبصمات جينية مستقرة ، ولها فاعلية تمايز أكبر من hiPSCs التقليدية المعدة للسلاسب. هنا ، يتم تحديد طرق XF / FF المحسنة لإعادة البرمجة العرضية الفعالة التي يتم تنشيطها بواسطة السدى الوسيط لأسلاف الميلويد CD34 + CD33 + CB إلى XF / FF hiPSC التقليدي. أدى ارتداد TIRN إلى تحفيز الهيب PSC التقليدي XF / FF بشكل متكرر لاعتماد السمات النسخية والوراثية والوظيفية لخلايا الجنين البشري في مرحلة الانقسام مع انخفاض التعبير الجيني الجاهز للنسب. لقد تحققنا من أن XF-hiPSC المشتق من CB الذي تم إرجاعه من TIRN أظهر تحسنا ملحوظا في التمايز الموجه متعدد السلالات (بما في ذلك سلالات الأوعية الدموية) عبر ذخيرة واسعة من الخلفيات المستقلة وراثيا. تعمل هذه الطرق كخطوة أولى لإنشاء خطوط TIRN-SC متوافقة مع cGMP لبنوك TIRN-SC (UTIRN-SC) المانحة "العالمية" المحددة من قبل HLA من الدرجة السريرية. يمكن أن يكون لاشتقاق خطوط UTIRN-SC مع تحسين تعدد استخدامات التمايز من أسلاف CD34 + CD33 + CB تأثير كبير على الطب التجديدي. على سبيل المثال ، يمكن أن تولد UTIRN-SCs بنوك أنسجة من أسلاف القلب والأوعية الدموية والمتبرعين العصبيين المحددة بالتبريد والمحفوظة بالتبريد للعلاجات الخلوية الشاملة متعددة السلالات "الجاهزة".

المقدمة

على الرغم من أن الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) توفر فرصا واعدة للعلاجات الخلوية الشخصية ، إلا أن تطبيقها السريري يواجه تحديات كبيرة ، بما في ذلك الورم ، والمناعة ، وعدم التجانس الظاهري والوظيفي1 ، مما يؤثر على سلامتها وفعاليتها وفعاليتها من حيث التكلفة. علاوة على ذلك ، يتم إنشاء الأسلاف الملتزمة بالنسب المشتقة من خطوط hiPSC التقليدية المعدة بكفاءات تمايز بين الخطوطالمتغيرة للغاية 2 ، وتظهر محدودة في الجسم الحي النقش والوظائف. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه القيود باستخدام طرق إعادة البرمجةالمحسنة 3 أو حالات الخلايا الجذعيةالبديلة 4،5.

على الرغم من أن كفاءات إعادة البرمجة العرضية غير الفيروسية للجلد أو الخلايا الجسدية الدموية في hiPSC منخفضة (~ 0.01٪ -2٪)6 ، يمكن تحقيق إعادة برمجة أربعة عوامل محسنة للغاية لأسلاف CB ويمكن أن تصل إلى 50٪ من الكفاءات السائبة في ظروف الزراعة المشتركة المنشطة للجذع اللحمي الوسيط (MSC)7. في هذا النظام ، تم تسريع إعادة البرمجة الخلوية لأسلاف النخاع المعدني CB عن طريق الإشارات اللحمية القابلة للذوبان والمعتمدة على التلامس. تمايزت خطوط hiPSC العرضية المشتقة من CB العلفية (SP) إلى أسلاف الأوعية الدموية (VP) بكفاءة أعلى من hiPSC المشتقة من الخلايا الليفيةالتقليدية 3،5. أظهر VP المشتق من SP-CB-iPSC هوية نسخ VP جنينية أكثر أصالة ، وانخفاض الشيخوخة ، والحساسية لتلف الحمض النووي3،4. أظهر VP المشتق من SP-CB-iPSC أيضا تطعيم أكثر قوة في الجسم الحي من VP التقليدي المشتق من hiPSC بعد الزرع الجهازي أو المباشر في الجسم الزجاجي للفئران البالغة المصابة بنقص المناعة في نقص تروية الشبكية3،4.

أنشأ Zimmerlin et al. نظام إعادة برمجة كيميائي من خطوتين ("LIF-5i -> LIF-3i") ينقل الخلايا الجذعية البشرية التقليدية متعددة القدرات إلى حالة TIRN-SC مع إمكانية تمايز متعددة السلالاتمحسنة 5. أظهرت أسلاف الأوعية الدموية المتمايزة المشتقة من TIRN-SC وظائف أعلى ، واستقرارا جينيا أكبر ، وتفوقا في النقش الحي ، كما يتضح من قدرتها المحسنة على الهجرة إلى الطبقات العصبية العميقة لشبكية العين الإقفارية 4 وإعادةإعادة الأوعية الدموية. خضع TIRN-SC لإعادة البرمجة البروتينية لاكتساب حالة هجينة وظيفية تشبه بلاستومير مع مساهمة عالية في مقايسة الوهم بين الأنواع8. حافظت TIRN-SC على تعبير DNMT1 وكانت محمية من التآكل في المناطق الجينومية المطبوعة ب CpG. ومن المثير للاهتمام ، أن SP-CB-hiPSC تم إعادته إلى TIRN-SC بشكل أكثر كفاءة من hiPSC المستمدة من طرق بديلة أقل كفاءة5،9.

وبالتالي ، فإن TIRN-SCs هي حالة خلايا جذعية بديلة مع قدرة محسنة على التمايز متعدد السلالات ومساهمة فعالة في الوهم. مزيد من التحسين ل
ستعمل إعادة برمجة TIRN-SC في ظروف زراعة محددة ومتوافقة مع ممارسات التصنيع الجيدة على تسهيل توليد مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأنسجة الوظيفية القابلة للطعم للعلاجات. لتلبية الحاجة إلى أسلاف علاجية فعالة من حيث التكلفة ، يمكن تطبيق هذه الطرق لإنتاج بنوك من الدرجة cGMP من "المتبرع العالمي" TIRN-SC (UTIRN-SC) باستخدام CD34 + CB المكونة للدم أو أسلاف الدم المحيطية. يمكن أن تخدم الأسلاف المشتقة من UTIRN-SC المحددة ب HLA احتياجات عدد أكبر من المرضى الذين يحتاجون إلى تجديد فوري متعدد السلالات للأنسجة المعقدة.

قد توجه النماذج التي تم تطويرها لزرع نخاع العظم السريري (BMT) تطوير بنوك UTIRN-SC من الخلايا الجذعية المكونة للدم المتطابقة جزئيا مع HLA ، أو الخلايا الجذعية المكونة للدم المتطابقة جزئيا مع HLA-haplo من سجلات المتبرعين الوطنيين. سيوفر التحليل الحسابي العالمي التنبؤي لأفضل 10 أنماط فردانية مجتمعة من 18 دولة ، بما في ذلك الولايات المتحدة الأمريكية ، تغطية متوسطة للمرضى بنسبة 68.4٪ من hiPSC "haplobanks" 10. لا يمكن لبنك UTIRN-SC المحدد توفير أسلاف ملتزمة بالنسب فحسب ، بل يمكنه أيضا دعم تطبيقات TIRN-SC العلاجية لأنظمة تكميل الكيسة الأريمية متعددة الأنواع داخل الأليفة (مثل الخنازير) لجيل الأعضاء بأكملها11،12 ، بما في ذلك توليد أسلاف مكونة للدم المحفزة للتحمل لتقليل رفض الكسب غير المشروع في المجموعات ذات التنوع الجيني الواسع (على سبيل المثال ، الولايات المتحدة الأمريكية).

يعد بروتوكول إعادة البرمجة المعدل هذا لتوليد خطوط XF / FF hiPSC المختصة ب TIRN خطوة أولى لتطوير بنوك UTIRN-SC المستقبلية المتوافقة مع cGMP. يحدد هذا البروتوكول إعادة البرمجة التدريجية للسدى والتحقق الوظيفي من أسلاف النخاع CB البشري في خطوط XF-hiPSC التقليدية. أظهرت XF-hiPSC ارتدادا سهلا إلى TIRN-SC ، بكفاءة مماثلة للطرق غير XF7 وحققت تعدد القدرات الوظيفية غير المقيدة ، بما في ذلك تحسين القدرة على إنتاج أورام مسخية مخفضة من تحيز النسب جيدة التكوين (بالنسبة إلى XF-hiPSC متساوي الجين) 4،5،9. نحدد أيضا البروتوكولات التي تتحقق من صحة XF-hiPSC المعدل من TIRN لتمايزها المباشر المحسن والقوي مع سلالات الأوعية الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تتوافق جميع تجارب إعادة البرمجة مع المبادئ التوجيهية التي نشرتها الأكاديمية الوطنية للعلوم والجمعية الدولية لأبحاث الخلايا الجذعية (ISSCR). بالنسبة لتوليد hiPSC ، تمت الموافقة على بروتوكولات جمع الخلايا المانحة والموافقة المستنيرة من المتبرع من قبل إشراف مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بجامعة جونز هوبكنز (JHU). أجريت جميع التجارب تحت إشراف أبحاث الخلايا الجذعية المؤسسية (ISCRO) في JHU وتتوافق مع المعايير المؤسسية فيما يتعلق بالموافقة المستنيرة وتقييم المصدر. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء جميع عمليات استخدام والعمليات الجراحية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام في معهد JHU (IACUC). جميع التجارب التي تنطوي على إجراءات حيوانية (على سبيل المثال ، الحقن تحت الجلد / داخل العضلات من NOD. تمت مراجعة الفئران Cg-PrkdcScid IL2rgtm1Wjl / SzJ (NOG SCID) (مختبرات جاكسون ، بار هاربور ، ME) لتحليل الورم المسخي ونقل الكيسة الأريمية إلى الفئران الزائفة الحوامل ICR) والموافقة عليها من قبل JHU IACUC. تضمنت هذه المراجعات اعتبارات للتضحية الأخلاقية ، والإسكان الإنساني ، والتدابير المناسبة لتقليل الانزعاج الحيواني.

1. إعادة البرمجة العرضية hiPSC خالية من المغذي

  1. تحضير الخلايا السلفية المكونة للدم من المتبرع
    1. استخدم الخلايا الجذعية / السلفية المكونة للدم CD34 + المحفوظة بالتبريد (على سبيل المثال ، 1 × 106 خلايا CB حديثي الولادة) فور الولادة أو قم بتخزين المبردات في خزان تخزين النيتروجين السائل. تأكد من الحفاظ على الخلايا باستمرار في حالة تجميد أثناء النقل والمناولة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام الخلايا المانحة غير المحفوظة بالتبريد مباشرة بعد التجميع وتخصيب CD34 باستخدام البروتوكولات المعتمدة.
    2. قبل إذابة الخلايا في الحمام المائي ، افتح البريدي المعقم برفق داخل خزانة السلامة الحيوية لإطلاق أي غاز محاصر داخل القارورة ثم أغلق القارورة بإحكام.
    3. ضع القارورة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة. قم بتدوير القارورة برفق حتى لا يتبقى ثلج تقريبا. أخرج القارورة من الحمام المائي وقم بتعقيمها جيدا (أي 70٪ رذاذ الإيثانول).
      ملاحظة: تتطلب جميع الخطوات تقنية معقمة مناسبة ويتم تنفيذها داخل خزانة غطاء أمان بيولوجي معقمة.
    4. انقل الخلايا برفق وببطء إلى أنبوب مخروطي معقم فارغ سعة 50 مل. اغسل القارورة ب 1 مل من وسط التمدد البارد المكونة للدم (XF-HP) (الجدول 1) وامزجه برفق (بالتنقيط على طول حواف الأنبوب) مع الخلايا لتخفيف مادة DMSO المكونة للتبريد.
    5. اترك الأنبوب واقفا في رف لمدة 30 ثانية وأضف ببطء (بالتساقط) 2 مل من وسط XF-HP البارد. قم بتدوير تعليق الخلية برفق أثناء إضافة الوسط. كرر هذه الخطوة مرتين عن طريق إضافة 4 و 8 و 4 مل بالتتابع من الوسط البارد XF-HP (حتى الحجم الإجمالي 20 مل). الطرد المركزي للخلايا المخففة عند 100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: لا تقم بسحب الخلايا لأعلى ولأسفل في محلول الحماج بالتبريد وأثناء خطوات التخفيف. أضف XP-HP المتوسط بالتنقيط وببطء حتى يتم تخفيف DMSO بمقدار 10 أضعاف على الأقل. استخدم الوسط البارد لأن تخفيف DMSO يؤدي إلى تفاعل طارد للحرارة.
    6. شفط طافي خال من الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. قم بإزاحة بيليه الخلية برفق. أعد التعليق في 2 مل من وسيط التمدد XF-HP لعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
    7. انقل الخلايا المذابة إلى ألواح متعددة الآبار لزراعة الخلايا منخفضة للغاية (على سبيل المثال ، نقل 2 مل من الخلية / الخليط المتوسط XF-HP إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار).
    8. لف الطبق بإحكام في غلاف ساران لتقليد ظروف نقص الأكسجين. انقل اللوحة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب). بدلا من ذلك ، ضع اللوحة غير المغلفة في حاضنة مع تحكم O2 (5٪ O2 ، 5٪ CO2 ، جو رطب).
    9. استزراع الأسلاف المكونة للدم لمدة 3 أيام في وسط XF-HP.
  2. تحضير الخلايا السلفية الجذعية الوسيطة (MSC)
    1. قم بإذابة كمية (0.75 - 1 × 106 خلايا) من ممر منخفض (p2 إلى p3) MSC البشري عن طريق احتضان كمية محفوظة بالتبريد في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 إلى 2 دقيقة. قم بتدوير القارورة برفق حتى لا يتبقى ثلج تقريبا. أخرج القارورة من الحمام المائي وقم بتعقيمها جيدا (أي 70٪ إيثانول).
      ملاحظة: يمكن شراء أو تحضير MSC البشري منخفض الممر (p2) من نخاع العظام البشرية باستخدام البروتوكولات المعمول بها وحفظها بالتبريد. يمكن إذابة MSC قبل حوالي 7-10 أيام وتشعيعها / طلاءها كطبقة مغذية في اليوم السابق للنواة (الشكل 1).
    2. انقل الخلايا برفق وببطء (بالتنقيط على طول حواف الأنبوب) إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على وسط خلية جذعية وسيطة باردة خالية من المصل (XF-MSC) (الجدول 1) داخل خزانة السلامة الحيوية لتخفيف مادة DMSO الساخنة بالتبريد بمقدار 10 أضعاف على الأقل (على سبيل المثال ، نقل 1 مل من الخلية المحفوظة بالتبريد إلى وسيط 9 مل XF-MSC).
    3. استخدم 1 أو 2 مل من وسط XF-MSC البارد لشطف الأنبوب وخلطه في الأنبوب المخروطي. الطرد المركزي للخلايا المخففة عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. شفط طافي خال من الخلايا في خزانة السلامة الحيوية. أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 1 مل من وسط XF-MSC لعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
    5. انقل الخلايا المذابة إلى ألواح متعددة الآبار لزراعة الخلايا المعالجة بالأنسجة (على سبيل المثال 5,000-6,000 خلية لكل سم2 أو حوالي 50,000 خلية في بئر واحد من صفيحة 6 آبار). ضع الأطباق في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب). قم بتحديث وسيط XF-MSC كل 2-3 أيام داخل خزانة السلامة الحيوية.
    6. في اليوم السابق للنوة ، قم بشفط طافي خال من الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية. اغسل MSC مرة واحدة باستخدام PBS (2 مل / بئر). شفط PBS. أضف 1 مل / بئر من كاشف تفكك الخلية (على سبيل المثال ، 1X محلول Trypsin-EDTA). احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 .
    7. قم بتحييد كاشف التفكك عن طريق إضافة 1 مل من وسط XF-MSC (تخفيف 2 أضعاف على الأقل) وقم بترتيتر برفق باستخدام ماصة في معلق خلية واحدة. اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 100 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. شفط المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط XF-MSC لعد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا التلقائي.
    9. قم بإشعاع (2,000 راد) أسلاف اللحمة المتوسطة تحت 5 ممرات باستخدام مشع g أو الأشعة السينية ولوحة على سطح اصطناعي مطلي بالببتيد Arg-Gly-Asp (RGD) ألواح 6 آبار (2 × 105 خلايا لكل بئر) في وسط XF-MSC. احتفظ بالأطباق طوال الليل في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
  3. إعادة البرمجة العرضية Xenofree
    1. اجمع مزارع CB HP التي يبلغ عمرها 3 أيام في وسط توسعة XF-HP في أنبوب مخروطي سعة 15 مل في خزانة السلامة الحيوية. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. شفط طافي خال من الخلايا في خزانة السلامة الحيوية.  أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 1 مل من وسط التمدد XF-HP لعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الأوتوماتيكي.
    3. اجمع بين 1 × 106 خلايا HP موسعة مع 100 ميكرولتر من محلول نوة الخلايا CD34 + البشرية (مجموعة نواة الخلايا البشرية CD34 + ). أضف 6 ميكروغرام من الإبيسوم المركز المنقى (<5 ميكرولتر) وانقله بعناية إلى كوفيت نوكليوفكتور باستخدام ماصة نقل البلاستيك لمجموعة النواة. تجنب الفقاعات. ضع الكوفيت في جهاز النواة واستخدم البرنامج U-008.
      ملاحظة: قم بإعداد مخزون من ناقل pCEP4 العرضي القائم على EBNA pEP4 EO2S EM2K (OCT4 ، SOX2 ، MYC ، KLF4) عن طريق التحويل الروتيني في TOP10 بكتريا قولونية وتنقيتها باستخدام مجموعات البلازميد Maxi-prep. في يوم النواة ، قم بتنظيف وتركيز البلازميد باستخدام مجموعة تنقية PCR 7.
    4. مباشرة بعد النواة ، أضف 500 ميكرولتر من وسط التمدد XF-HP الدافئ مسبقا إلى الكوفيت وانقل الخلايا في 1 مل من وسط XF-HP إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار لثقافة الخلايا ذات السعة المنخفضة للغاية باستخدام ماصة نقل معقمة.
      ملاحظة: الخلايا ذات النواة هشة للغاية ولن تنجو من إجهاد القص من أطراف الماصة العادية سعة 1 مل. يعد النقل إلى ألواح ثقافة التعلق المنخفضة للغاية خطوة تعزز استعادة خلايا ما بعد النواة قبل التثبيت النهائي على ألواح مطلية ب RGD.
    5. لف اللوحة بإحكام في غلاف بلاستيكي لتقليد ظروف نقص الأكسجين. ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب). بدلا من ذلك ، ضع اللوحة غير المغلفة في حاضنة مع تحكم O2 (5٪ O2 ، 5٪ CO2 ، جو رطب). احتضن لمدة 4 إلى 6 ساعات.
      ملاحظة: ستسمح هذه الخطوة لخلايا HP ذات النواة بالتعافي قبل نقلها إلى طبقات أحادية MSC.
    6. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل في خزانة السلامة الحيوية. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    7. استنشق المادة الطافية داخل خزانة السلامة الحيوية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط التمدد XF-HP. صفيحة نواة خلايا HP على MSC مشع بكثافة حوالي 17,500 خلية لكل سم2 في ألواح مطلية ب RGD في وسط تمدد XF-HP (2 مل / بئر) مكمل بمثبط ROCK Y-27632 (التركيز النهائي 10 ميكرومتر). ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
    8. بعد يومين من النواة ، أضف 2 مل (حجم متساو) من وسط E8 في كل بئر داخل خزانة السلامة البيولوجية.
    9. استبدل نصف حجم وسط الاستزراع كل يومين بوسيط E8. اجمع الخلايا العائمة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي بحجم 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وأضف الخلايا المستردة مرة أخرى إلى المزرعة.
    10. في اليوم 21 ، قم بإعداد أطباق 6 آبار معالجة بزراعة الأنسجة المغلفة بالفيترونكتين. أضف 1 مل من محلول الفيترونكتين المخفف (على سبيل المثال ، 40 مل / مل ل Vitronectin-XF) إلى بئر واحد من صفيحة 6 آبار واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    11. اختر مستعمرات XF-hiPSC الفردية يدويا باستخدام مجهر مقلوب داخل خزانة السلامة البيولوجية. ترتيورات مع الماصة ونقل المستعمرات المفردة على ألواح مطلية بفيتامين في وسط E8 مكمل بمثبط ROCK Y-27632 (التركيز النهائي 5 ميكرومتر). ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
    12. في اليوم التالي ، استبدل الوسيط بعناية بوسيط E8 بدون مكملات مثبطات ROCK. قم بتغيير وسط E8 كل يوم بعد ذلك (2 مل / بئر) في خزانة السلامة الحيوية.

2. ثقافة وصيانة hiPSC الروتينية

  1. عندما تصبح المستعمرات أكبر بعد 5 إلى 6 أيام (أي قطرها من 0.5 إلى 1 مم أو حوالي 80٪ من التقاء) ، قم بشفط الوسط في خزانة السلامة الحيوية.
  2. أضف 2 مل / بئر PBS لغسل الخلايا. استنشق برنامج تلفزيوني. أضف 1 مل من محلول تفكك الخلايا القائم على EDTA. احتضان لمدة 5 دقائق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب). تأكد من أن الخلايا متصلة بشكل فضفاض (على سبيل المثال ، الخلايا المستديرة اللامعة ، ولكنها لا تزال متصلة باللوحة) باستخدام المجهر.
  3. استنشق محلول التفكك برفق داخل خزانة السلامة الحيوية دون تعطيل الخلايا.
  4. اجمع الخلايا في 1-2 مل من وسط E8 المكمل بمثبط ROCK Y-27632 (التركيز النهائي 5 ميكرومتر) مع سحب غير قوي للحفاظ على كتل الخلايا. نقل كتل الخلايا إلى ألواح معالجة بالخلايا المزروعة ب vitronectin (انظر القسم 1.3.11) 6 آبار (ما يعادل 10 مستعمرات لكل بئر أو تقسيم 1:10). ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
  5. استمر في الزراعة الفرعية باستخدام محلول تفكك الخلايا القائم على EDTA كل 5-7 أيام.
    ملاحظة: عادة ما يكون الاستنساخ الفرعي الإضافي أو الانتقاء اليدوي للمستعمرات مطلوبا لإعادة برمجة SP-CB-hiPSC ، ولكن إذا كانت استنساخ hiPSC تحتوي على مستعمرات ذات مورفولوجيا غير طبيعية (على سبيل المثال ، التمايز التلقائي مثل الخلايا الليفية أو تكوين الجسم الجنيني ، وظهور مستعمرات غير طبيعية غير مسطحة) ، فحدد المستعمرات يدويا باستخدام ماصة دقيقة ومجهر داخل خزانة السلامة الحيوية أو تخلص من المستنسخة الشاذة. إعادة البرمجة غير الفعالة وغير المستقرة ل hiPSC غير متوافقة مع ارتداد TIRN-SC.

3. التحقق من صحة النمط الظاهري لاستنساخ XF-hiPSC

  1. قم بتوسيع استنساخ XF-hiPSC لما لا يقل عن 5-7 مقاطع للتحقق الأولي (الشكل 2) كما هو موضح في القسم 2 ، قبل الحفظ بالتبريد على المدى الطويل والتطبيق في الدراسات الوظيفية. سجل عدد الممرات على كل قارورة محفوظة بالتبريد.
    ملاحظة: يمكن تأكيد التوصيف الأولي لاستنساخ XF-hiPSC منخفض المرور من خلال فحوصات متعددة مثل نشاط أكالين فوسفاتيز ومستضد TRA-1 أو الكشف المناعي NANOG.
  2. قم بإجراء التحقق من صحة XF-hiPSC والتعداد باستخدام تلطيخ الفوسفاتيز القلوي (الشكل 2 أ ، ب).
    ملاحظة: يمكن تحديد كفاءات إعادة البرمجة في الثقافات السائبة في P0 بعد 3-5 أسابيع من النوى العرضية عن طريق تعداد عدد المستعمرات المعاد برمجتها بالكامل لكل خلايا إدخال مفردة مطلية في اليوم 37،13.
    1. وسط ثقافة الشفط في خزانة السلامة الحيوية.
    2. اغسل الخلايا باستخدام PBS (2 مل لكل بئر). شفط PBS. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة محلول بارافورمالدهيد / PBS بنسبة 2٪. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. قم بإزالة محلول بارافورمالدهايد / PBS والتخلص منه وفقا لإرشادات سلامة النفايات الكيميائية.
    4. اغسل الخلايا باستخدام PBS (2 مل لكل بئر). شفط PBS. أضف 1-2 مل من ركيزة الفوسفاتيز القلوية واحتضانها لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريض بطيء.
    5. اغسل 3 مرات باستخدام PBS لإيقاف التفاعل. تصوير مجهري وتعداد.
      ملاحظة: تجنب وقت الحضانة المفرط أو درجة الحرارة لأنها قد تؤدي إلى تلطيخ إيجابي كاذب.
  3. قم بإجراء التحقق من صحة تلطيخ XF-hiPSC وتعدادها باستخدام البقع المناعية لمستضد TRA-1 (الشكل 2 ج).
    ملاحظة: لإعادة البرمجة العرضية ، يجب إجراء الكشف عن التعبير المعدل وراثيا والعمود الفقري لناقل EBNA1 أثناء الممرات الأولية باستخدام البروتوكولات المنشورة7. يتضمن التحقق الروتيني التنميط النووي عن طريق G-banding (الشكل 2D) أو فحوصات التغطية القائمة على مصفوفة الجينوم الكامل. يمكن أيضا فحص تعدد القدرات الوظيفية الأساسية باستخدام بروتوكولات تمايز الورم المسخي (الشكل 2 ه) أو بطاقات أداء التعبير الكمي متعدد الجينات لتمايز الجسم الجنيني غير الموجه14.
    1. في خزانة السلامة الحيوية ، تقوم البقع المناعية بتكرار الآبار لمستضدات TRA-1-60 أو TRA-1-81 لمدة 30 دقيقة عن طريق إضافة الأجسام المضادة للبقع الحية المترافقة بالفلوروكروم إلى وسط E8 بالتركيز المناسب.
    2. استنشق وسط الثقافة. يغسل مرتين باستخدام E8 متوسط (2 مل لكل بئر).
    3. تصوير مجهري وتعداد في وسط E8 أو وسط خال من الفينول باللون الأحمر.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، قم بإصلاح الخلايا باستخدام محلول بارافورمالدهيد / PBS بنسبة 2٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وصبغة مناعية لمستضدات TRA-1 باستخدام الأجسام المضادة القياسية.
  4. التحقق من صحة النمط المناعي XF-hiPSC عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    1. في خزانة السلامة الحيوية ، استنشق وسط الاستزراع.
    2. اغسل الخلايا في PBS (2 مل لكل بئر). شفط PBS. أضف كاشف التفكك الأنزيمي (على سبيل المثال ، Accutase ، 1 مل لكل بئر). احتضان اللوحة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
    3. اجمع الخلايا عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الثقافة وقم بالمرور عبر مصفاة خلية (مرشح 40-70 ميكرومتر). خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. إعادة تعليق حبيبات الخلية في PBS مع 5٪ FBS (1 مل لكل ما يعادل البئر). احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي. قم بتوزيع حوالي 100,000-200,000 خلية في أنابيب مستديرة القاع لكل مقايسة FACS (مع الحفاظ على الأحجام عند حوالي 100 ميكرولتر لكل فحص).
    5. بالنسبة للبقع خارج الخلية ، بعد خطوة حجب اختيارية باستخدام مصل الفأر الأنيق (أضف 5 ميكرولتر لكل فحص ، 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، احتضن بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم (على سبيل المثال ، TRA-1-81 PE ، SSEA4 APC) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يغسل ب 3 مل PBS. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. قم بالتعليق في المخزن المؤقت FACS (على سبيل المثال، PBS مع 5٪ FBS) والاستحواذ باستخدام أداة FACS.
      ملاحظة: استخدم دائما عناصر التحكم في النمط المتماثل المناسبة وقم بتلطيخ عينات متوازية للتحقق من صحة خصوصية البروتينات المكتشفة للمناعة.
    6. بالنسبة للتلطيخ داخل الخلايا (على سبيل المثال ، NANOG-PE ، OCT3 / 4-PE ، SOX2-PE) ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لخطوات التثبيت / النفاذية. احتضان بالأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم أو ضوابط النمط المتماثل المطابقة. الحصول على أداة FACS.

4. الحفظ بالتبريد وذوبان المستنسخة XF-hiPSC

  1. قم بتوسيع استنساخ XF-hiPSC لما لا يقل عن 5-7 مقاطع لإجراء التحقق الأولي (الشكل 2) قبل الحفظ بالتبريد والتطبيق على المدى الطويل في الدراسات الوظيفية. سجل عدد الممرات على كل قارورة محفوظة بالتبريد.
    1. وسط ثقافة الشفط في خزانة السلامة الحيوية.
    2. اغسل الخلايا باستخدام PBS (2 مل لكل بئر). شفط PBS.  أضف محلول انفصال الخلايا القائم على EDTA (1 مل لكل بئر) لفصل مستعمرات XF-hiPSC إلى كتل الخلايا. احتضان اللوحة لمدة 5 دقائق في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب). تأكد من أن الخلايا متصلة بشكل فضفاض (على سبيل المثال ، الخلايا المستديرة اللامعة) باستخدام المجهر.
    3. قم بشفط محلول التفكك برفق دون تعطيل مستعمرات الخلية أحادية الطبقة وجمع الخلايا في وسط E8 سعة 1-2 مل مع سحب غير قوي للحفاظ على كتل الخلايا (10-50 خلية لكل كتلة). اجمع XF-hiPSC في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق المادة الطافية في خزانة السلامة البيولوجية. إعادة تعليق بيليه الخلية في محلول التجميد (الجدول 2 ، ~ 1 مكافئ جيدا لكل مل).
    5. نقل الخلايا إلى أنابيب مبردة للتخزين على المدى الطويل. ضع الأنابيب في وعاء تجميد بطيء واترك العينات تتجمد طوال الليل في فريزر -80 درجة مئوية. في اليوم التالي ، ضع المبردات في فريزر النيتروجين السائل لتخزينها على المدى الطويل.
  2. للذوبان ، قم بإعداد صفيحة عن طريق الطلاء المسبق بفيتامين الفينكتين (انظر القسم 1.3.11).
    1. ضع القارورة المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية وقم بإذابة الخلايا لمدة ~ 1-2 دقيقة.
    2. انقل XF-hiPSC ببطء إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من وسط الذوبان (الجدول 2) لتخفيف الخلايا ببطء 10 أضعاف داخل خزانة غطاء أمان بيولوجية معقمة.
      ملاحظة: لا تقم بسحب الماصة بقوة.
    3. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق المادة الطافية الخالية من الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط E8 (1-2 مل) مكمل بمثبط ROCK (التركيز النهائي 5 مل).
      ملاحظة: سيؤدي استبعاد Y-27632 إلى ضعف كفاءات الاسترداد بعد الذوبان.
    5. انقل الخلايا المذابة إلى 1 أو 2 بئر مطلية بالفيترونكتين من صفيحة مكونة من 6 آبار. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسط بوسط E8 العادي بدون مثبط ROCK لتوسيع الخلايا.

5. التمايز الدموي الوعائي Xenofree ل XF-hiPSC

  1. قم بتمييز XF-hiPSC باستخدام بروتوكول التمايز الدموي والأوعية الدموية المحسن الخالي من xenofree (الشكل 3)4.
    ملاحظة: تم تعديل هذا البروتوكول من15.
    1. قم بإعداد XF-hiPSC عند التقاء ~ 40-50٪ (1-3 أيام بعد المرور).
    2. استنشق وسط الثقافة وإضافة 2 مل وسط تحديد الأديم المتوسط (الجدول 2) في خزانة السلامة الحيوية.
    3. بعد يومين ، استنشق الوسط وأضف 2 مل / بئر من وسط تمايز الأوعية الدموية (الجدول 2) في خزانة السلامة الحيوية. إذا كان هناك الكثير من الخلايا الميتة أو العائمة مرئية في هذه الخطوة ، فقم بغسلها مرة واحدة باستخدام 2 مل من PBS.
    4. استبدل وسط تمايز الأوعية الدموية كل يومين في خزانة السلامة الحيوية حتى اليوم 11.
      ملاحظة: إذا تحول المتوسط إلى اللون الأصفر بسبب كثافة الخلايا العالية وانخفاض درجة الحموضة ، أضف 1 مل من الوسط الطازج أو استبدله كل يوم.
  2. بعد 7-10 أيام من الثقافة في وسط تمايز الأوعية الدموية ، قم بتنقية الخلايا الوعائية CD31 + أو CD34 + من الطبقة الأحادية الملتصقة باستخدام طريقة فرز خلايا الخرزة المغناطيسية.
    ملاحظة: قد يعرض كل استنساخ فردي حركية تمايز مميزة. تحديد النقطة الزمنية الذروة لتعبير CD31 / CD34 عن طريق تحليل FACS (الشكل 4 أ). مطلوب تحليل FACS لتخصيب الخرزة المغناطيسية قبل وبعد المغناطيسية. يمكن استرداد الأسلاف المكونة للدم (HP) في هذه المرحلة من المادة الطافية وإثرائها باستخدام حبات CD34 الدقيقة. يمكن التحقق من صحة HP المشتق من CD34 + XF-hiPSC باستخدام مقايسة ميثيل السليلوز (الشكل 4B-C) 16.
    1. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بشفط وسط الثقافة وغسل الخلايا في PBS (2 مل لكل بئر). استنشق PBS وفصل مستعمرات hiPSC إلى خلايا مفردة عن طريق إضافة كاشف التفكك الأنزيمي (على سبيل المثال ، Accutase ، 1 مل لكل بئر). احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
    2. في خزانة السلامة الحيوية ، اجمع الخلايا عن طريق إضافة حجم متساو من وسط الاستزراع. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط تمايز الأوعية الدموية (الجدول 2). احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي. خصص حوالي 50,000-100,000 خلية لاختبار FACS لتخصيب الخرزة قبل المغناطيسية باستخدام الجسم المضاد المضاد ل CD31 أو المضاد ل CD34 المترافق مباشرة.
    4. الطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن مؤقت لتخصيب الخرزة المغناطيسية (PBS pH 7.2 ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 2 ملي مولار EDTA) في خزانة السلامة البيولوجية.
    5. مرر الخلايا عبر مصفاة خلية (مرشح 40-70 ميكرومتر). جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. إعادة التعليق في 60 ميكرولتر مخزن مؤقت لتخصيب الخرزة المغناطيسية.
    6. أضف 20 ميكرولتر من كاشف حجب FcR ، ثم أضف 20 ميكرولتر من حبيبات CD31 أو CD34 واحتضانها لمدة 15-20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    7. اغسل الخلايا بمخزن مؤقت لتخصيب الخرزة المغناطيسية سعة 2 مل في خزانة السلامة الحيوية وجهاز طرد مركزي (300 × جم ، 5 دقائق).
    8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل مخزن مؤقت لتخصيب الخرزة المغناطيسية في خزانة السلامة الحيوية.
    9. ضع عمود LS في المجال المغناطيسي لفاصل الخلايا المغناطيسية داخل خزانة السلامة الحيوية. اغسل العمود بمخزن مؤقت لتخصيب الخرزة المغناطيسية سعة 3 مل.
    10. تطبيق الخلايا على العمود.  اجمع الخلايا غير المسماة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل العمود 3 مرات باستخدام 3 مل من المخزن المؤقت لتخصيب الخرزة المغناطيسية.
    11. قم بإزالة العمود من الفاصل وضعه على أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل.
    12. اغسل الخلايا المصنفة مغناطيسيا عن طريق إضافة 3-5 مل من وسط النمو البطاني. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    13. أعد تعليقه في وسط نمو البطانة سعة 1 مل في خزانة السلامة الحيوية. احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا التلقائي. خصص حوالي 50,000 خلية لفرز تخصيب الخرزة بعد المغناطيسية نقاء عن طريق تحليل FACS باستخدام الجسم المضاد المضاد CD31 أو المضاد ل CD34 المترافق مباشرة.
    14. يمكن توسيع VP المعزول بشكل أكبر على ألواح قوارير معالجة بزراعة الأنسجة المغلفة بالفبرونكتين (10 ميكروغرام / مل) في وسط نمو البطانة.

6. إرشادات التصميم التجريبي للتحقق الوظيفي من XF-hiPSC

  1. إنشاء مخزونات من XF-hiPSC التي تم التحقق من صحتها في الممرات الأولى باستخدام طريقة غير متكاملة ، مثل إعادة برمجة episomal7،17 أو Sendai virus18 أو mRNA19 .
    ملاحظة: يتم توفير مقارنة بين كفاءة وموثوقية الطرق غير المعاد البرمجة في مكان آخر6. يمكن التحقق من إزالة المواد المعدلة وراثيا في طرق إعادة برمجة فيروس سينداي العرضية أو سينداي خلال الممرات الأولية باستخدام طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل7،20. الاحتفاظ بالجينات المعدلة وراثيا غير متوافق مع جيل TIRN-SC.
  2. التحقق من صحة النمط النووي الطبيعي في استنساخ XF-hiPSC عن طريق فحوصات التغطية القائمة على مجموعة G أو مجموعة الجينوم الكامل9.
  3. التحقق من صحة التعبير الجيني والسلامة اللاجينية لخطوط XF-hiPSC (أي بصمات الوالدين ، تنشيط X) باستخدام مثيلة الحمض النووي ومصفوفات التعبير الجيني أو طرق التسلسل5،11،14.
  4. تحقق من صحة تعدد القدرات الوظيفية الأساسية باستخدام بروتوكولات تمايز الورم المسخي (الشكل 2E) ، أو فحوصات تمايز الجسم الجنيني الكمي (EB) باستخدام مصفوفات RT-PCR14 ، أو فحوصات التمايز الموجهة نحو الطبقات الجرثوميةالثلاث 9.
    ملاحظة: يتم توفير طرق كمية لقدرة التمايز متعدد السلالات ومؤشر التكاثر داخل السلالة لمقايسات الورم المسخي باستخدام التوصيف النسيجي بواسطة الفحص المجهري في مكان آخر4. تم تفصيل بروتوكولات التمايز الموجه نحو سلالات الأديم المتوسط ومواصفات الأوعية الدموية (الشكل 4A-C) سابقا4،5،9 ، بالإضافة إلى مقايسة التمايز الموجهة نحو الأديم الباطن النهائي (الشكل 4 د) 5. يتم توفير أمثلة على مقايسة التمايز الموجه نحو الأديم الظاهر في مكان آخر4،5.

7. التكيف الكيميائي TIRN ل XF-hiPSC

  1. قم بشراء أو إعداد مغذيات MEF داخلية منخفضة الممر من أجنة الفئران الهجينة CF1 أو CF1 x DR4 E13.5 باتباع البروتوكولات المنشورة9،21. لوحة 200,000 MEF مغذيات لكل بئر في صفيحة جيلاتين (0.1٪ جيلاتين في الماء ، 1 مل لكل بئر) صفيحة 6 آبار معالجة بزراعة الأنسجة قبل يوم واحد على الأقل من خطوة التكيف مع TIRN (يتم توفير بروتوكولات TIRN التفصيلية في مكان آخر4،5،9).
  2. الحفاظ على وتوسيع مزارع XF-hiPSC الخالية من الجينات المعدلة وراثيا مع أنماط نواة طبيعية تم التحقق من صحتها في نظام استزراع خال من المغذيات (على سبيل المثال ، وسط E8 ، انظر الجدول 1 للصياغة الداخلية).
  3. استبدل وسط E8 بوسط LIF-5i (2 مل لكل بئر ؛ الجدول 1) بعد أن وصلت مزارع XF-hiPSC إلى ~ 50٪ من التقاء (أي بعد 3-5 أيام من الطلاء الأولي) في خزانة السلامة البيولوجية.
  4. في اليوم التالي ، قم بشفط وسط الثقافة وغسل XF-hiPSC المكيف مع LIF-5i مرة واحدة باستخدام PBS (2 مل لكل بئر) في خزانة السلامة البيولوجية. شفط طافي وأضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الأنزيمية إلى كل بئر. احتضن لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 .
  5. قم بترتيتوري برفق باستخدام ماصة في معلق خلية واحدة في خزانة السلامة الحيوية. تحييد باستخدام وسيط LIF-5i (1 مل لكل بئر). اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل.  جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. استنشق المادة الطافية في خزانة السلامة البيولوجية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط LIF-5i.
    ملاحظة: إذا أمكن ، خذ حصة لحساب الخلايا. من الممكن تحييد النشاط الأنزيمي باستخدام وسيط LIF-5i / LIF-3i دون مكملات بمثبطات أو عوامل نمو.
  7. اغسل لوحة MEF مرتين باستخدام PBS (2 مل لكل بئر في ألواح 6 آبار) وأضف الخلايا (1 مكافئ جيدا للخلايا المكيفة مع LIF-5i على بئر واحد من مغذيات MEF في وسط 2 مل LIF-5i).
    ملاحظة: يعد تحسين كثافات الطلاء الأولية لكل خط XF-hiPSC على حدة أمرا اختياريا. إذا تم حساب الخلايا في الخطوة السابقة ، فقم بوضع ما لا يقل عن 1 × 106 خلايا لكل بئر على المغذيات.  انقل اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
  8. زراعة وصيانة XF-hiPSC لمدة 3-5 أيام في LIF-5i على MEF في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، جو رطب). قم بتغيير LIF-5i متوسط يوميا.
  9. عندما تتشكل مستعمرات TIRN-SC على شكل قبة (بعد 3-5 أيام من الاستزراع على المغذيات) ، قم بشفط وسط الثقافة في خزانة السلامة الحيوية. اغسل كل بئر ب 2 مل من PBS.
  10. شفط PBS. أضف 1 مل من محلول انفصال الخلايا (على سبيل المثال ، Accutase) إلى كل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، جو رطب).
  11. أضف 1 مل من وسط LIF-3i (الجدول 1) إلى كل بئر في خزانة السلامة الحيوية لتحييد كاشف التفكك. قم بترتيتوري الخلايا بلطف وجمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  12. استنشق المادة الطافية في خزانة السلامة البيولوجية. أعد التعليق في وسط LIF-3i (1 مل لكل بئر) لعد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الأوتوماتيكي. لوحة ~ 5 × 105 خلايا في 2 مل LIF-3i وسط لكل بئر على MEF مشع في ألواح جيلاتينية مكونة من 6 آبار في خزانة السلامة الحيوية.
    ملاحظة: كرر الخطوات 7.12 5o 7.16 لجميع المقاطع اللاحقة.  بعد الثقافة الأولية المتكيفة مع LIF-5i ، تزرع لوحة LIF-3i بكثافة أقل (2 × 105 خلايا / بئر) وتمر كل 3-4 أيام.
  13. تمرير XF-hiPSC الذي تم إرجاعه بواسطة TIRN لما لا يقل عن 6-7 مقاطع مستمرة في وسط LIF-3i قبل استخدامه في الدراسات الوظيفية أو الحفظ بالتبريد. سجل عدد الممرات في وسط الاستزراع الخالي من xenofree (على سبيل المثال ، E8) أو وسائط LIF-5i / LIF-3i TIRN.
    ملاحظة: يعد ارتداد TIRN لخطوط XF-hiPSC عالية التمرير (على سبيل المثال ، >p40) غير فعال ولا يوصى به. غالبا ما تحتوي خطوط المرور العالي على عيوب كروموسومية أو فرعية ، والتي لا تتوافق مع ارتداد TIRN الفعال ، وستؤدي إلى ضعف كفاءات الارتداد واستقرار ثقافة محدود. أيضا ، لا ينصح باستخدام مزارع TIRN التي خضعت لأكثر من 15 مقطعا في وسط LIF-3i للدراسات الوظيفية. التأثير الوظيفي لارتداد TIRN ل XF-hiPSC هو الأبرز بين 7 و 15 مقطعا في وسط LIF-3i.

8. المبادئ التوجيهية للتصميم التجريبي للتمايز الموجه ل TIRN-SC المشتق من XF / FF hiPSC.

  1. استخدم بشكل مباشر TIRN-SC المشتق من XF / FF hiPSC في بروتوكولات التمايز الموجهة الراسخة دون أي خطوة "إعادة تحضير" (على سبيل المثال ، لا توجد متطلبات لإعادة الخلايا الجذعية TIRN إلى الظروف التقليدية "الجاهزة" قبل استخدامها في فحوصات التمايز الموجهة).
  2. للتقييم الوظيفي لتأثير TIRN على XF-hiPSC ، قم بإعداد الثقافات المتساوية الأشقاء ، برقم ممر مكافئ بالتوازي. الحفاظ على مزارع XF-hiPSC المتساوية الجين الجاهزة / TIRN بالتوازي في الوسائط الخاصة بها (على سبيل المثال ، E8 على vitronectin vs. LIF-3i على MEF) ، وإجراء فحص الورم المسخي في نفس الوقت (الشكل 5) ، أو التمايز باستخدام الجسم الجنيني المتطابق أو بروتوكولات ومواد التمايز الموجهة (الشكل 6).
  3. إجراء تقييم وظيفي للأسلالات المتمايزة الطرفية ، عندما يكون ذلك ممكنا. على سبيل المثال ، يمكن تقييم أسلاف الأوعية الدموية عن طريق التعبير عن البروتين ، ومقايسة امتصاص البروتين الدهني منخفض الكثافة المترافق DiI (LDL) ومقايسة أنبوب Matrigel (الشكل 7).
    ملاحظة: فحوصات وظيفية إضافية ل CB-hiPSC- و TIRN-SC VP المشتق (على سبيل المثال ، فحوصات امتصاص DiI-Ac-LDL / الشيخوخة / الانتشار / الهجرة ، في المختبر فحوصات أنبوب Matrigel ، مقايسات Matrigel الحيوانية ، فحوصات xenotransplantation) مفصلة في مكان آخر3،4.
  4. اضبط وحسن كثافات الطلاء الأولية والحركية (الشكل 6) لكل استنساخ XF-hiPSC فردي في كل مقايسة تمايز.
    ملاحظة: تتمتع XF-hiPSC المعكوسة ب TIRN بقدرة تكاثرية وتمايزية أكثر قوة في فحوصات التمايز الموجه من مزارع XF-hiPSC.تتطلب ثقافات TIRN عادة كثافة طلاء أولية أقل من مزارع E8 ، ولا تتطلب استخدام المكملات الغذائية المضادة لموت الخلايا المبرمج لتعزيز بقاء النسيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يعمل هذا البروتوكول على تحسين الطرق المنشورة لإعادة برمجة السلف النخاعي الفعالة إلى حالة عالية الدقة متعددة القدرات باستخدام النواقل العرضية والإشارات اللحمية7. يحدد البروتوكول (الشكل 1) طرقا محددة لإعادة البرمجة الفوقية اللحمية XF / FF لأسلاف CB CD34 + البشرية في XF-hiPSC ، ويوجه إلى كيفية التحقق من صحة وظائفها عبر مواصفات الأوعية الدموية الموجهة ، متبوعا بارتداد TIRN إلى الخلايا الجذعية TIRN الشبيهة بالبلاستومير في ظروف LIF-3i / MEF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أبلغت مجموعة زامبيديس في الأصل عن طريقة عرضية محسنة للغاية من أربعة عوامل لإعادة برمجة أسلاف النخاع المعدني CB الملتزمة بالسلالة في CB-hiPSC بكفاءة كبيرة تصل إلى 50٪ في الخلايا المنقاة التي تعبرعن episome 7. هنا ، قدمنا نسخة معدلة من بروتوكول إعادة البرمجة العرضي الأصلي لسلف CB البشري في ظروف سدى XF / FF. استخدمت هذه الطريقة قدرة إعادة البرمجة المعززة للخلايا النخاعية CD33 + CD45 + CD34 − الملتزمة بالنسب لتحقيق إعادة برمجة سريعة وك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا توجد إفصاحات للإعلان.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية للصحة / NEI (R01EY032113; ETZ) ، صندوق أبحاث الخلايا الجذعية في ماريلاند (2023-MSCRFV-5995 ؛ 2024-MSCRFV-6248 ؛ 2025-MSCRFV-0005 ؛ 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) ، ومؤسسة ليزا دين موسلي (ETZ).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Amaxa Biosystems Nucleofector IIلونزاأه اي بي - 1001
الأجسام المضادة المضادة CD143 (BB9) ، APC مترافق   ؛BD Biosciences557929استخدام 10-20 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة CD144 ، PE مترافق   ؛BD Biosciences560410استخدام 10-20 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة CD146 ، PE مترافق   ؛BD Biosciences550315استخدام 10-20 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة CD184 / CXCR4 ، APC مترافق   ؛BD Biosciences555976استخدام 10-20 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة ل CD31BD Biosciences550389تمييع 1: 100 في محلول حجب للمقايسة المناعية الفلورية
الأجسام المضادة المضادة CD31 ، APC مترافق   ؛العلوم الحيوية الإلكترونية17-0319-42استخدام 2 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة CD34 ، APC المقترنة   ؛BD Biosciences555824استخدام 5 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة CD45 ، PE مترافق   ؛BD Biosciences555483استخدام 10-20 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة ل NANOG ، PE مترافقBD Biosciences560483استخدام 10-20 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة ل OCT4 ، PE مترافقآر آند د سيستمزIC1759Pاستخدام 10 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة SOX17 ، Alexa488 مترافق   ؛BD Biosciences562205استخدام 5 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة ل SOX2 ، PE مترافقآر آند د سيستمزIC2018Pاستخدام 10 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة ل SSEA-4 ، APC مترافق   ؛آر آند نظام DFAB1435Aاستخدام 5 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة ل SSEA-4 GloLIVE ، NL493 مترافقآر آند نظام DNLLC1435Gيستخدم عند التخفيف 1:50 (التلطيخ المناعي الحي والثابت)
طقم مترافق مضاد ل TRA-1-60 A488ثيرموفيشر العلميةأ25618
الأجسام المضادة المضادة TRA1-60 ، PE مترافقBD Biosciences560193استخدام 10 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة TRA-1-60 GloLIVE ، NL557 مترافق   ؛آر آند د سيستمزNLLC4770Rاستخدم في   A تخفيف 1:50 (مناعة حية وثابتة)
الأجسام المضادة المضادة TRA-1-60 StainAlive ، DyLight 488 مقترنجذع09-0068يستخدم عند تخفيف 1: 100 (تلطيخ مناعي حي وثابت)
الأجسام المضادة المضادة TRA1-81 ، PE مترافقBD Biosciences560161استخدام 10 & L لكل مقايسة (FACS)
الأجسام المضادة المضادة TRA-1-81 StainAlive ، DyLight 488 مترافقجذع09-0069يستخدم عند تخفيف 1: 100 (تلطيخ مناعي حي وثابت)
طقم CD31 MicroBead ، بشريميلتيني بيوتيك130-091-935
طقم CD34 MicroBead ، بشريميلتيني بيوتيك130-046-702
CD34+ المتبرعون المختلطون ،   ؛ دم الحبل السري ، 1 مليون خليةجميع الخلاياCB ، CR ، CD34 + ، مختلط ، PS ، CS10 ، 1 مترتشمل المصادر البديلة للخلايا كبد الجنين ونخاع العظام البالغين والدم المحيطي المعبأ
ماوس CF1نهر تشارلز023
CHIR99021آر آند نظام DL5283إعادة التكوين عند 100 ملي مولار في DMSO
ألواح Corning Costar المعالجة بزراعة الأنسجة من 6 آباركورنينج3506
الركيزة Corning Synthemax II-SC ، قارورة 10 مجمكورنينج3535استخدم في 5 μ g / cm 2 < / sup > كبديل ل Corning 3978
لوحة Corning Synthemax-R ذات 6 آباركورنينج3978تم إيقافها واستبدالها ب 3535
كوستار 6 آبار شفافة مسطحة القاع مرفق فائق الانخفاض 6 آباركورنينج3471
الكونتيسة   شريحة غرفة عد الخلاياثيرمو فيشر العلميج 10228
عداد الخلية الآلي للكونتيسةثيرمو فيشر العلميAMQAX1000
CryoStore CS10تقنيات الخلايا الجذعية100-1061
DII-AC-LDLثيرمو فيشر العلميL3484استخدم في 5-15 & micro ؛ جم / مل
DMEM (وسط النسر المعدل من Dulbecco)   ؛ثيرمو فيشر العلمي11995065
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAXثيرمو فيشر العلمي10565018
DMEM / F-12 ، HEPESثيرمو فيشر العلمي11330032
DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد)سيجما ألدريتشD2650
ماوس DR4مختبر جاكسون3208
أساسي 8 (E8) متوسطتقنيات الخلايا الجذعية5940
مصل بوفين الجنين (FBS)ثيرمو فيشر العلميSH30071.03
الإصلاح والإصلاح طقم نفاذية خلية PERMثيرمو فيشر العلميغاز 004
فورسكولينجذع04-0025إعادة التكوين عند 100 ملي مولار في DMSO
الجيلاتين (الخنازير)سيجما ألدريتشجي 1890-100 جرامأعد تعليقه في الماء وتعقيمه باستخدام الأوتوكلاف
نواة الخلية البشرية CD34 +   ؛ عدهلونزافي بي اي -1003
ماوس متساوي IgG1 PE مترافقBD Biosciences554680
ماوس متساوي IgG2a PE مترافقBD Biosciences558595
النمط المتماثل الفئران IgG2b PE مترافقآر آند د سيستمزIC013P
استبدال مصل خروج المغلوبثيرمو فيشر العلمي10828-028
حمض الأسكوربيكميليبور سيجماأ 8960
L-الجلوتامين (100X)ثيرمو فيشر العلمي25030-081
أعمدة LSميلتيني بيوتيك130-042-401
ماتريجلكورنينج356237استخدام 200 & L / بئر في ألواح 48 بئر
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM NEAA) (100X)ثيرمو فيشر العلمي11140-050
ميثوكولت إس إف H4436تقنيات الخلايا الجذعية04436
فاصل MidiMACSميلتيني بيوتيك130-042-302
mTeSR1 متوسطتقنيات الخلايا الجذعية85850
قوارير Nalgene المبردةثيرمو فيشر العلمي5000-0020
محلول بارافورمالديهايد ، 4٪ في برنامج تلفزيونيثيرمو فيشر العلميJ19943. ك 2تمييع إلى التركيز المطلوب باستخدام PBS
PD0325901سيجما ألدريتشطراز PZ0162إعادة التكوين عند 100 ملي مولار في DMSO
البنسلين / الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر العلمي15140-122
pEP4 E02S EM2K episomeأدجين20923تم نشر البلازميدات في TOP10 E.  قولوني (Invitrogen) ومنقى بمجموعات QIAGEN Plasmid Maxi.
محلول ملحي مخزن من الفوسفات (PBS)الصناعات البيولوجية02-023-1 أ
Poietics الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية  لونزابي تي -2501يمكن إذابة 750,000 خلية في المقطع 2 وتوسيعها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ل 1-2 ممرات قبل الاستخدام أو الخدمات المصرفية الثانوية
بورمورفامينجذع04-0009إعادة تشكيل عند 10 ملي مولار في DMSO
المؤتلف أكتيفين أبيبروتك120-14 [إ]إعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
المؤتلف البشري FGF2بيبروتك100-18 بإعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
FGF البشري المؤتلف الأساسي (bFGF)بيبروتك100-18 بresupend في 100 µ جم / مل في 0.1٪ مصل بقري / ألبومين بشري في PBS
ملجد FLT3 البشري المؤتلفآر آند د سيستمز308-FKHB أو   308E-GMPإعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
الأنسولين البشري المؤتلفبيوجوهمز10-365
مؤتلف الإنسان كيت يجندآر آند د سيستمزBT-SCF أو BT-SCF-GMPإعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
LIF البشري المؤتلفبيبروتك300-05resupend في 100 µ جم / مل في 0.1٪ ألبومين مصل بقري / بشري في PBS
المؤتلف البشري TGF &beta ؛ 1بيبروتك  100-21resupend في 100 µ جم / مل في 0.1٪ ألبومين مصل بقري / بشري في PBS
الثور البشري المؤتلف  آر آند د سيستمز288-TPN أو 288E-GMPإعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
ترانسفيرين الإنسان المؤتلفميليبور سيجماتي 3705
التوصيف البشري BMP4بيبروتك120-05إعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
SB431543سيليكيمس 1067إعادة تشكيل عند 10 ملي مولار في DMSO
SIGMAFAST ، ركيزة الفوسفاتيز القلوية ، كروموجينيك ، قرصميليبور سيجماب 5655قم بإذابة 1 قرص في 10 مل من الماء النقي
سيلينيت الصوديومميليبور سيجماس 5261
Stemolecule Y27632 في المحلولجذع04-0012-02مثبط الصخور في المحلول (10 ملم)
كاشف تفكك خلايا StemPro Accutaseثيرمو فيشر العلميأ 11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)ثيرمو فيشر العلميA1067501قم بإعداد وسط XF-MSC عن طريق خلط مكمل StemPro MSC SFM XenoFree سعة 5 مل مع 500 مل من StemPro MSC SFM Baseal Medium. يمكن حفظ الوسط المقتبس بالتبريد عند -20 درجة مئوية.
StemSpan SFEMتقنيات الخلايا الجذعية9600
حاوية تجميد Thermo Scientific Mr. Frostyثيرمو فيشر العلمي5100-0001
Ulex Europaeus Agglutin I (UEA-1) ، مصاب بالحيويةمختبرات ناقلاتب -1065-2تمييع 1: 200 في محلول حجب لفحص الفلورسنت
فيجفبيبروتك100-20إعادة التعليق في   (100 & جم / مل) في PBS المعقم ، 0.1٪ ألبومين مصل بشري أو بقري
حل Verseneثيرمو فيشر العلمي15040066
مصفوفة فيترونيكتين XFتقنيات الخلايا الجذعية7180تمييع في 40 µ ؛ L / mL في CellAdhere المخزن المؤقت للتخفيف
[إيف939]سيجما ألدريتشX3004إعادة التكوين عند 100 ملي مولار في DMSO
β-mercaptoethanolثيرمو فيشر العلمي21985-023حساسة للضوء

المراجع

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PARP
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة