يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استنفاد العصب الحسي القرنية المستهدف عن طريق الحقن تحت الملتحمة: نموذج للتحقيق في الالتصاق البكتيري والتفاعلات المناعية العصبية

446 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68614

⸱

أغسطس 29, 2025

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

في هذه المقالة

ملخص

تؤسس هذه الدراسة نموذجا دقيقا لاستنفاد العصب الحسي للقرنية باستخدام بوبيفاكائين ، مما يكشف عن تأثيره على العصب القرني والالتصاق البكتيري. يحاكي النموذج حالات الاعتلال العصبي ، ويوفر رؤى حول التفاعلات المناعية العصبية في التهابات العين ويقدم تطبيقات في توصيل الأدوية ، والحماية العصبية ، والتعديل المناعي ، ودراسات تعديل الجينات.

الملخص

تلعب الأعصاب الحسية القرنية دورا محوريا في دعم سلامة سطح العين وآليات الدفاع المناعي. ارتبط فقدان هذا التعصيب بزيادة التعرض للغزو الميكروبي ، ومع ذلك فإن المساهمة الدقيقة لاستنفاد الأعصاب في الالتصاق البكتيري على القرنية لا تزال غير مميزة بشكل كاف. هنا ، نقدم طريقة قابلة للتكرار ويتم التحكم فيها مؤقتا لقمع العصب الحسي الانتقائي للقرنية باستخدام بوبيفاكائين ، وهو مانع قناة الصوديوم طويل المفعول. من خلال الجمع بين طرق التوصيل تحت الملتحمة والموضعية ، تحقق استراتيجية التطبيق المزدوج هذه إزالة التعصيب القوية والمستدامة ، مما يسمح بالتحقيق الدقيق في كيفية تأثير المدخلات الحسية المتغيرة على قابلية القرنية للاستعمار البكتيري.

باستخدام هذا النموذج ، نحقق في كيفية تأثير إزالة التعصيب الحسي على ديناميكيات الالتصاق الميكروبي للمكورات العنقودية الذهبية ، والمكورات العنقودية البشروية ، والزائفة الزنجارية ثلاثة مسببات أمراض ذات صلة سريريا مع آليات التصاق متميزة. يضمن التلقيح البكتيري القياسي عبر طريقة نشاف المسح المختبري ترسب موحدا على سطح القرنية ، متبوعا بالتقييم الكمي للالتصاق البكتيري. يرتبط استنفاد الأعصاب الناجم عن بوبيفاكائين بانخفاض كثافة العصب القرنية وزيادة الالتصاق البكتيري ، مما يؤكد وجود صلة وظيفية بين النضوب الحسي والقابلية للإصابة الميكروبية.

من خلال محاكاة حالات الأعصاب مثل الاعتلال العصبي السكري والتهاب القرنية العصبي ، يوفر هذا النهج إطارا جديدا لدراسة التفاعلات المناعية العصبية في التهابات العين. بالإضافة إلى نماذج العدوى ، توفر استراتيجية الحقن تحت الملتحمة هذه منصة متعددة الاستخدامات للتحقيق في الحرائك الدوائية للأدوية للعين ، والتدخلات الوقائية العصبية ، والتعديل المناعي. علاوة على ذلك ، يمكن تكييفه لدراسات تعديل الجينات ، بما في ذلك التوصيل تحت الملتحمة لتركيبات كريسبر / كاس أو النواقل الفيروسية ، مما يوسع نطاق تطبيقاته في أبحاث وعلاجات العيون.

المقدمة

يلعب التعصيب الحسي للقرنية دورا مهما في الحفاظ على سلامة سطح العين والتوازن المناعي. القرنية هي واحدة من أكثر الأنسجة كثافة في الجسم ، ويتم توفيرها في الغالب عن طريق الانقسام العيني للعصب ثلاثي التوائم1. لا تتوسط هذه الأعصاب الحسية في الشعور بالألم وردود الفعل الوامضة فحسب ، بل تنظم أيضا التكاثر الظهاري والتئام الجروح والمراقبة المناعية2،3. وبالتالي ، فإن أي اضطراب في التعصيب الحسي يمكن أن يضر بحاجز القرنية ، ويغير البيئة الدقيقة لسطح العين ويزيد من التعرض للعدوى الميكروبية.

يرتبط الخلل الوظيفي الحسي للقرنية بالحالات الجهازية مثل داء السكري ويساهم في أمراض العين ، بما في ذلك أمراض العين الجافة ، واعتلال القرنية السكري ، والتهاب القرنية العصبي ، ومضاعفات ما بعد الجراحة3،4،5،6،7،8،9،10. يؤدي ضعف الأعصاب الحسية إلى انخفاض إنتاج الدموع ، وترقق الظهارة ، وتأخر التئام الجروح ، وكلها تسهل الاستعمار البكتيري11،12. ومع ذلك ، فإن الارتباط الميكانيكي الدقيق بين استنفاد الأعصاب الحسية والالتصاق البكتيري لا يزال غير مفهوم بشكل كاف. في حين أظهرت الدراسات زيادة الالتصاق البكتيري بعد إزالة التعصيب في القرنية ، إلا أن هناك نقصا في النماذج الموحدة التي تسمح بالتحقيق الخاضع للرقابة في هذه العلاقة.

لمعالجة هذه الفجوة ، قمنا بتطوير نموذج مستهدف لاستنفاد العصب الحسي للقرنية باستخدام بوبيفاكائين ، وهو مانع لقنوات الصوديوم طويل المفعول يحاكي الاعتلال العصبي السريري دون التسبب في تلف دائم للأعصاب13،14،15. يوفر هذا النهج الدوائي طريقة خاضعة للرقابة وقابلة للتكرار لدراسة استنفاد عصب القرنية وآثاره على سطحالعين 15. من خلال دمج هذا النموذج مع فحوصات الالتصاق البكتيري ، يمكننا تقييم تأثير استنفاد الأعصاب الحسية بشكل منهجي على الاستعمار الميكروبي ، ومحاكاة الجوانب الرئيسية لاعتلال القرنية السكري والتهاب القرنية العصبي.

الالتصاق الميكروبي هو حدث مبكر حرج في التهابات القرنية ، ويتأثر بتكوين الفيلم المسيل للدموع ، وخصائص السطح الظهاري ، والاستجابات المناعية للمضيف. من بين مسببات الأمراض المتنوعة القادرة على استعمار سطح العين ، المكورات العنقودية الذهبية ، المكورات العنقودية البشروية ، و P. aeruginosa تمثل ثلاث بكتيريا مهمة سريريا ذات آليات التصاق مميزة. المتصورة الزائفة الزنجارية، وهي بكتيريا شديدة الضراوة سالبة الجرام ، تستخدم عوامل الفوعة الشعرية والسوط والفرز للالتصاق بسرعة بالخلايا الظهارية للقرنية وغزوها ، مما يؤدي غالبا إلى التهاب القرنية التقرحي الشديد16،17. في المقابل ، فإن S. بشرة، وهي بكتيريا تعايش إيجابية الجرام ، تستغل في الغالب الأسطح الظهارية المعطلة وتعديلات الأغشية المسيلة للدموع لإنشاء الأغشية الحيوية ، مما يساهم في الالتهابات المستمرة وتحت الإكلينيكيةفي كثير من الأحيان 18،19. تسلط الاختلافات في استراتيجيات الالتصاق بين هذه الأنواع الضوء على الحاجة إلى فهم كيف يغير استنفاد العصب القرنية البيئة المكروية للعين لصالح الاستعمار البكتيري.

يتمثل التحدي الرئيسي في دراسة الالتصاق البكتيري في اختيار نموذج التلقيح المناسب. يخلق نموذج إصابات الخدش التقليدي ، الذي يستخدم بشكل متكرر في دراسات العدوى ، عيوبا ظهارية لتسهيل التصاق البكتيريا. على الرغم من فعاليته في محاكاة الالتهابات الناجمة عن الصدمات ، إلا أن هذا النهج يقدم متغيرات مربكة كبيرة ، بما في ذلك تلف الأنسجة المفرط والاستجابة الالتهابية المبالغ فيها ، والتي لا تمثل بدقة المراحل المبكرة من الاستعمار البكتيري في قرنيات الاعتلال العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التباين في الإصابة الميكانيكية يجعل من الصعب تحقيق نتائج قابلة للتكرار. للتغلب على هذه القيود ، يلزم وجود طريقة تلقيح بكتيرية أكثر تحكما وذات صلة من الناحية الفسيولوجية.

توفر تقنية نشاف المسح المختبري نهجا موحدا لترسب البكتيريا ، مما يضمن التصاق بكتيريا موحدا دون تعطيل الحاجز الظهاري20. تحاكي هذه الطريقة عن كثب سيناريوهات الحساسية في العالم الحقيقي ، حيث يحدث الالتصاق البكتيري في حالة عدم وجود صدمة ميكانيكية علنية ولكن في ظل ظروف تغيير تكوين التمزق والتوازن الظهاري. من خلال القضاء على التباين المرتبط بالإصابة الميكانيكية ، توفر طريقة نشاف المسح المختبري تقييما أكثر دقة لديناميكيات الالتصاق الميكروبية في قرنيات الاعتلال العصبي. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بالتقييم الخاضع للرقابة لمساهمات الأغشية المسيلة للدموع في الاستعمار البكتيري ، وهو أمر مهم بشكل خاص في حالات الخلل الحسي للقرنية حيث يضعف إفراز الدموع.

نظرا للدور الحاسم للأعصاب الحسية للقرنية في تنظيم إنتاج الدموع والتوازن الظهاري ، من الضروري إنشاء نموذج قابل للتكرار لدراسة عواقب استنفاد العصب الحسي على الالتصاق الميكروبي. تهدف هذه الدراسة إلى تحسين بروتوكول استنفاد العصب الحسي للقرنية باستخدام بوبيفاكائين ، وهو مخدر موضعي طويل المفعول ، لتقييم آثاره على إفراز الدموع والالتصاق البكتيري. من خلال استخدام مزيج من تطبيق بوبيفاكائين تحت الملتحمة والموضعي ، يضمن هذا النهج استنفادا حسيا موضعيا ومستداما في نقطة زمنية محددة من ذروة الفعالية. باستخدام هذا النموذج ، نحقق في كيفية تغيير إزالة التعصيب الحسي لديناميكيات التصاق المكورات العنقودية الذهبية ، المكورات العنقودية البشروية ، و P. aeruginosa ، مما يوفر رؤى قيمة حول العلاقة بين استنفاد الأعصاب ، وتغيرات الأغشية المسيلة للدموع ، والقابلية للإصابة بالميكروبات. هذه النتائج لها آثار أوسع لفهم قابلية الإصابة بالعدوى في حالات الاعتلال العصبي مثل اعتلال القرنية السكري والتهاب القرنية العصبي وتوفر أساسا للدراسات المستقبلية حول تفاعلات المناعة العصبية للعين والتدخلات العلاجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقا للمعايير التي وضعتها جمعية أبحاث الرؤية وطب العيون وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في كلية نيو إنجلاند للبصريات والتزمت بسياسة PHS بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر. تم الحصول على الفئران من الذكور والإناث C57BL / 6J (النوع البري ؛ السلالة رقم 000664) من مختبر جاكسون ، وتم تربية الفئران في ظل إيقاعات الساعة البيولوجية الطبيعية (دورة ضوء / ظلام مدتها 12 ساعة) وتم تزويدها بالطعام والماء. الحفاظ على تقنية معقمة في جميع الإجراءات.

1. تحضير للحقن تحت الملتحمة

  1. تحفيز التخدير باستخدام 2-3٪ إيزوفلوران في الأكسجين عبر مبخر معاير. راقب عمق التخدير عن طريق التحقق من عدم وجود استجابة انعكاسية لقرص إصبع القدم اللطيف.
  2. راقب باستمرار بحثا عن أي علامات على الانزعاج الشديد أو الضيق.
  3. إذا لوحظت ضائقة ، فقم بتحفيز التخدير العميق بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران وتأكد من عدم الاستجابة.
  4. إجراء خلع عنق الرحم لضمان القتل الرحيم.
  5. خلاف ذلك ، قم بإجراء الاستئصال على الفور باستخدام ملقط الاستئصال المنحني لتحليلات المصب.

2. إحصار العصب القرنية باستخدام الحقن تحت الملتحمة

ملاحظة: قم بتنفيذ بروتوكول من خطوتين يتضمن الحقن تحت الملتحمة والتطبيق الموضعي للبوبيفاكائين لتحقيق استنفاد العصب الحسي للقرنية. أكمل الحقن تحت الملتحمة والتطبيقات الموضعية في غضون 15 دقيقة لتقليل التعرض للتخدير الجهازي.

  1. تحضير الموقع والشق
    1. قم بإنشاء شق صغير (~ 0.5 مم) في المنطقة القزحية فوق الصدغية باستخدام إبرة 30 جراما. تجنب الأوعية الدموية وقلل من صدمة الأنسجة. استخدم الشق للوصول إلى الفضاء تحت الملتحمة لتوصيل الدواء الخاضع للرقابة.
  2. حقن بوبيفاكائين
    1. تحضير محلول هيدروكلوريد بوبيفاكائين 0.5٪ في ظروف معقمة.
    2. قم بتحميل 5 ميكرولتر من المحلول في حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر مزودة بإبرة حادة ذات محور صغير 33 جم (نمط النقطة 3).
    3. حقن المحلول في الفضاء تحت الملتحمة بزاوية 15-20 درجة لتقليل الارتجاع وضمان التوزيع المنتظم.
    4. مراقبة تكوين الفقاعات في موقع الحقن. اتركه يستمر لمدة 5-10 ثوان ويشتت داخل الجيب تحت الملتحمة حتى يتم امتصاصه بالكامل.
  3. التعزيز الموضعي لإزالة حساسية القرنية
    1. ضعي 5 ميكرولتر إضافية من 0.5٪ بوبيفاكائين مباشرة على القرنية المركزية مباشرة بعد الحقن تحت الملتحمة.
      ملاحظة: استخدم هذه الخطوة لتعزيز إزالة حساسية الأعصاب السطحية وإطالة تأثير التخدير الموضعي.
  4. المجموعة الضابطة
    1. قم بإدارة 5 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق كل من الحقن تحت الملتحمة والتطبيق الموضعي في نقاط زمنية متطابقة للحيوانات الضابطة. مطابقة الخطوات الإجرائية والحجم لمراعاة الآثار المتعلقة بالحقن.
  5. مدة العلاج وتحليل نقطة النهاية
    1. قم بإعطاء علاج بوبيفاكائين كل يومين لمدة 15 يوما لتحقيق استنفاد مستمر للأعصاب الحسية مع تقليل السمية.
    2. في اليوم 15 ، قتل الفئران رحيما بعد 4 ساعات من العلاج النهائي بالبوبيفاكائين باستخدام 5٪ إيزوفلوران في الأكسجين عبر مبخر معاير ، متبوعا بخلع عنق الرحم.
    3. اجمع القرنيات على الفور من مجموعة واحدة من الفئران (انظر الخطوة 5.5) لتقييم تغيرات كثافة الأعصاب باستخدام الكيمياء المناعية (انظر الشكل 1 والقسم 6 من البروتوكول) ، ومن مجموعة أخرى لتحليل الالتصاق البكتيري (انظر الشكل 1 والقسم 5 من البروتوكول).

3. تحضير للتلقيح البكتيري

  1. يجب تطبيق الكيتامين داخل الصفاق (80-100 ملغ/كغ) وديكسميديتوميدين (0.25-0.5 ملغم/كغ) لتخدير الفئران بعد أربع ساعات من حقن بوبيفاكائين النهائي وتطبيقه الموضعي في اليوم 15.
  2. تأكد من التخدير العميق عن طريق التحقق من عدم وجود استجابات انعكاسية لقرص إصبع القدم.
  3. اشطف سطح العين 3 مرات باستخدام ماصة تحتوي على 5 ميكرولتر من PBS المعقم لإزالة السوائل المسيلة للدموع المتبقية والحطام ، مما يضمن سطح قرنية نظيفا لدراسات الالتصاق البكتيري (انظر الشكل 1)
  4. في المجموعة التجريبية المعينة ، استخدم منديلا خاليا من النسالة في المختبر لمسح سطح القرنية بطريقة موحدة.
    1. قم بطي المناديل الورقية لضمان قبضة آمنة.
    2. امسح قرنية الفأر المخدر برفق 4x ، بدءا من القرنية المركزية وباستخدام حركة دورانية إلى اليمين واليسار لتشمل المناطق الطرفية20.
      ملاحظة: استخدم الحد الأدنى من الضغط لتجنب الإصابة الميكانيكية مع إزالة السائل المسيل للدموع بشكل فعال لتسهيل التصاق البكتيريا.

4. تحضير اللقاح البكتيري وتلقيح القرنية

  1. الثقافة البكتيرية والتحضير
    1. الثقافة S. aureus ATCC 25923 و S. epidermidis ATCC 12228 و P. aeruginosa O1 على أجار الصويا التريبتيك (TSA) وتحتضن عند 37 درجة مئوية بالماء المعقم الذي يوضع في الحاضنة للحفاظ على الرطوبة.
    2. حصاد المستعمرات الفردية وتعليقها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بالطرد المركزي للتعليق عند 5,000 × جم لمدة 5 دقائق مرة واحدة لإزالة الخلايا الميتة والمنتجات الثانوية الأيضية.
    3. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في PBS واضبط التركيز على ~ 10¹¹ CFU / مل لضمان حمل بكتيري عال لدراسات الالتصاق.
  2. بروتوكول تلقيح القرنية
    1. ضع كمية 5 ميكرولتر من المعلق البكتيري المحضر على سطح القرنية مرة كل ساعة لمدة 4 ساعات تحت التخدير المستمر.
    2. ضع الفئران على منحدر طفيف لمنع الجريان السطحي وضمان التعرض المستمر لللقاح.
    3. كرر التلقيح على فترات كل ساعة لتقليد التعرض المستمر للبكتيريا ذات الصلة بسيناريوهات العدوى السريرية.
  3. القتل الرحيم بعد التلقيح وتقييم الالتصاق البكتيري
    1. بعد 4 ساعات ، قم بإعطاء حقنة داخل الصفاق من الكيتامين (80-100 مجم / كغ) والزيلازين (5-10 مجم / كغ) لضمان التخدير العميق.
    2. قم بخلع عنق الرحم للقتل الرحيم للفئران بشكل إنساني.
    3. استئصال العينين باستخدام ملقط معقم ذو طرف منحني مع الحفاظ على ظروف معقمة صارمة لمنع التلوث.
    4. اشطف سطح العين 5-6x بمعقم 2 مل من PBS في طبق بتري باستخدام رج لطيف لإزالة البكتيريا غير الملتصقة تماما.
    5. قم بتجانس العيون المثول في 1 مل من PBS المعقم باستخدام خالط الأنسجة الميكانيكي لضمان التعافي البكتيري المتسق والحفاظ على الظروف المعقمة لمنع التلوث.
    6. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية من ستة أضعاف من المتجانس في PBS المعقمة.
    7. قم بتقطيع الألواح من كل تخفيف على ألواح TSA واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح بنمو المستعمرة.
    8. عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) والتعبير عن النتائج كسجل CFU لكل قرنية للمقارنة الكمية.

5. الكيمياء المناعية

  1. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم في اليوم 15 بعد العلاج.
  2. استئصلي العينين بعناية واشطفيه مرة واحدة باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة تحت دوران لطيف.
  3. قم بإصلاح العيون المنزوعة النواة في 2٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة ساعة واحدة للحفاظ على السلامة الهيكلية
  4. اغسل العيون الثابتة 3 × 10 دقائق في 1 مل من PBS تحت دوران لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  5. اتبع بروتوكول تسلخ القرنية الموصوف سابقا21،22
    1. قم بتشريح القرنيات داخل طبق بتري بعرض 35 مم مليء بكمية قليلة من PBS.
    2. استخدم ملقطا مستقيما لتثبيت العين المنزوعة المقال والمقص الجراحي لإنشاء شق صغير في الجانب الخلفي من الكرة الأرضية.
    3. استخدم نقطة الشق الصغيرة للقطع بعناية على طول الجانب الخلفي 360 درجة.
    4. تخلص من شبكية الفئران والعصب البصري والعدسة وصبغة القزحية وأي هياكل نسيجية إضافية ليست القرنية.
    5. قم بإزالة أي أنسجة زائدة باستخدام ملقط مستقيم الحافة أو عن طريق شق بعناية باستخدام مقص جراحي للحفاظ على القرنية سليمة.
    6. اغسل القرنيات المقطوعة 3 × 10 دقائق في 1 مل من PBS الموضوعة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة تحت دوران لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  6. احتضان القرنيات في 1 مل من محلول الحجب (3٪ BSA + Triton X-100 في PBS) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الدوران المستمر.
  7. تعزيز نفاذية الأنسجة عن طريق احتضان القرنيات في 1 مل من 20٪ EDTA لمدة ساعة إضافية في نفس الظروف.
  8. احتضان القرنيات طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الجسم المضاد الأولي للأرانب المضاد β-Tubulin III تحت دوران لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  9. في اليوم التالي ، احتضان الأنسجة بالجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للأرانب IgG المترافق Alexa Fluor 488 و DAPI للتلوين النووي لمدة 2-3 ساعات عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  10. اغسل القرنيات 3 × 10 دقائق باستخدام PBS تحت دوران لطيف.
  11. اتبع بروتوكول التركيب المسطح للقرنية الموصوفسابقا 21،22
    1. قم بتركيب القرنيات الملطخة بشكل مسطح على شرائح زجاجية عن طريق وضع القرنية على حافة الشريحة لإزالة السوائل الزائدة.
    2. أعد وضع القرنية في وسط شريحة المجهر بحيث يكون الجانب الظهاري متجها لأسفل ، على اتصال بسطح الشريحة.
    3. قم بعمل أربعة شقوق مستقيمة (طولها 1-2 مم) من الحافة الطرفية باتجاه المركز باستخدام شفرة ريشة جراحية لإنشاء نصف أرباع.
    4. ضع 20 ميكرولتر من الحامل وضع غطاء زجاجي مقاس 8 مم فوق القرنية.
    5. اضغط برفق على الغطاء لإزالة أي فقاعات هواء ومنع تجعد القرنية.
    6. قم بتخزين العينة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتجفيفها.
    7. أغلق حواف الغطاء بواقي أظافر شفاف لمنع الجفاف في الهواء ، وقم بتخزين الشرائح في الظلام حتى تصبح جاهزة للتصوير.

6. التصوير

  1. قم بإجراء الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام مجهر متحد البؤر ثنائي الفوتون المستقيم مع هدف غمس الماء 20x / 1.00 NA.
  2. ضع العينات المثبتة بشكل مسطح على مرحلة المجهر وقم بإعداد العدسة الموضوعية للغمر في الماء 20x/1.00 NA.
  3. قم بتعتيم أضواء الغرفة وقم بتغطية المجهر بقطعة قماش سوداء غير شفافة لتقليل تداخل الضوء الخارجي أثناء التصوير.
  4. تصور أعصاب القرنية باستخدام قناة ليزر Alexa Fluor 488 nm واكتشف نوى الخلايا باستخدام قناة الليزر DAPI 405 nm.
  5. اضبط حجم الإطار على 1,536 × 1,536، والثقب على 1 وحدة Airy (AU)، وسرعة المسح الضوئي على 1.02 ميكرو ثانية. قم بتمكين المسح ثنائي الاتجاه وتطبيق متوسط 2x.
  6. اضبط الكسب الرئيسي (~ 750 فولت) وقلل من شدة طاقة الليزر لمنع التبييض الضوئي والسمية الضوئية مع ضمان التقاط صورة واضحة.
  7. قم بإجراء تصوير Z-stack لالتقاط سمك القرنية الكامل. اضبط المستوى البؤري الأول في الجانب الأمامي والأخير في الجانب الخلفي من العينة.
  8. احصل على مكدسات Z بفواصل خطوات 0.8 ميكرومتر أو 1.0 ميكرومتر ، مع التقاط ما يقرب من 60 - 80 مكدسا إجماليا لكل عينة.
  9. تقييم كثافة العصب القرنية
    1. تحليل كثافة العصب القرنية باستخدام برنامج Imaris.
    2. تأكد من سمك الصورة بالكامل عن طريق التحقق من أبعاد وحدة التخزين.
    3. قم بتمكين خيار عرض وحدة التخزين لإنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد.
    4. قم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة لتحويل مكدس Z إلى طريقة عرض ثنائية الأبعاد للتصور والقياس الكمي.
    5. تصنيف كثافة العصب القرنية على مقياس 0-10 بواسطة مقيمين أعمى لضمان التقييم الموضوعي.

7. التحليل الإحصائي

  1. تقييم توزيع البيانات باستخدام اختبارات Shapiro-Wilk و Kolmogorov-Smirnov.
  2. إذا اتبعت غالبية البيانات توزيعا طبيعيا ، فقم بتقديم النتائج كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD).
  3. للمقارنات بين مجموعتين ، قم بتطبيق اختبار Student's t ، واستخدم ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبار Tukey للمقارنات المتعددة للتحليلات التي تشمل ثلاث مجموعات أو أكثر.
  4. ضع في اعتبارك قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ما لم ينص على خلاف ذلك ، تم إجراء جميع التجارب بشكل مستقل في ثلاث نسخ ، مع كل تكرار يتضمن 3-4 فئران لكل مجموعة.

انخفاض كبير في كثافة عصب القرنية بعد العلاج بالبوبيفاكائين
لتقييم تأثير استنفاد العصب الحسي المستهدف للقرنية بشكل منهجي ، تم تقييم كثافة عصب القرنية باستخدام الملصقات المناعية والفحص المجهري متحد البؤر. تلقت الفئران حقنا تحت الملتحمة بديلة من بوبيفاكائين لمدة 15 يوما ، إما بمفردها أو بالاشتراك مع التطبيق الموضعي ، لمقارنة فعالية طرق التوصيل المختلفة في تعديل سلامة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تلعب الأعصاب الحسية القرنية دورا محوريا في الحفاظ على سلامة سطح العين ، وتنظيم التوازن الظهاري ، وتعديل الاستجابات المناعية. يلاحظ التهاب العصب القرنية ، الذي يتميز بتنكس الأعصاب والالتهابات ، بشكل شائع في الحالات الجهازية مثل داء السكري ، حيث يساهم ارتفاع السكر في الدم المزمن في الاعتلال العصبي المحيطي ، بما في ذلك فقدان العصب القرني. أظهرت الدراسات أن الاعتلال العصبي السكري يؤدي إلى انخفاض حساسية القرنية ، وجفاف العين ، وضعف التئام الجروح ، وزيادة خطر الإصابة باعتلال القرنية العصبي

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5٪ محلول هيدروكلوريد بوبيفاكائين   ؛شركة فايزر ، الولايات المتحدة الأمريكيةمركز الحوار الوطني 00409-1162-01
إبرة 30 جرامالشركة المصنعة: BD Biosciences ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية305106
33 G إبرة حادة صغيرة محور (نمط النقطة 3)   ؛شركة هاميلتون ، رينو ، نيفادا ، الولايات المتحدة الأمريكية7803-05
4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول، ثنائي هيدروكلوريدثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةد 1306
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةأ7906
C57BL / 6J (النوع البري) الفئران مختبر جاكسون. 000664
دوار Cantrifugeذا لاب ديبوت (داوسونفيل ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)التوصية 2020
واقي الأظافر الشفافالرطب والبريغير متاح
مجهر تشريح (مجهر ستيريو (تشريح) SMZ-160-TLED مع منفذ ثلاثي العينين)ستيلر ساينتيفك (بالتيمور ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية)1.1002 [إ+12]
حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيكسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةE6511
الماعز المضادة للأرنب IgG Alexa Fluor 488 ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةأ 11008
هاميلتون 10-μ حقنة Lشركة هاميلتون ، رينو ، نيفادا ، الولايات المتحدة الأمريكية7635-01
مقص دقيق عالي الدقة للتشريحثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية08-953-1 ب
إيزوفلورانباترسون البيطري ، الولايات المتحدة الأمريكية07-890-8115
مبخر إيزوفلورانكينت العلمية ، الولايات المتحدة الأمريكيةVETFLO1205S
هيدروكلوريد الكيتامينDechra للمنتجات البيطرية ، أوفرلاند بارك ، كانساس ، الولايات المتحدة الأمريكيةDP00050
مناديل ورقية خالية من الوبر من Kimwipeكيمبرلي كلارك بروفيشنال ، روزويل ، جورجيا ، الولايات المتحدة الأمريكية34155
التشريح الدقيق ملقط الجبهة المنحنية (للاستئصال)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةF4142-1EA
ملقط تشريح دقيق أمامي مستقيمسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةإف 4017
أطباق بتري (100 مم)ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية263991
أطباق بتري (35 ملم)أفانتور ، عبر VWR International (رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).25373-041
محلول ملحي مخزن بالفوسفات توماس ساينتفيك ، سويدسبورو ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكيةC987D24
Prolong الذهب Antifade Mountثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةص 36930
أرنب مضاد للتوبولين الثالثسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)  تي 2200
غطاء دائري قابل للانزلاق زجاج ألماني (8 مم)ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية50-949-314
مقابض مشرطسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)  ط2896-1EA
الشرائح ، المجهرسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)  S8902-1PAK
Snap Cap أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الاحتفاظثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية3453
أدوات سورفال RT6000B أجهزة الطرد المركزي على الطاولةثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية3367898
شفرات الريش الجراحيةوورلد بريسيشن إنسترومنتس (ساراسوتا، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية)504169 
أجار الصويا التربتيكسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)  22091
زيلازين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية1236-20-8

المراجع

  1. Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
  2. Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
  3. Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
  4. Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
  5. Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
  6. Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
  7. Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
  8. Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
  9. Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
  10. Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
  11. Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
  12. Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
  13. Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
  14. Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
  15. Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
  16. Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
  17. Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
  18. Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
  19. Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
  20. Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
  21. Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
  22. Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
  23. Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
  24. Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
  25. Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
  26. Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
  27. O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
  28. Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
  29. Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
  30. Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
  31. Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
  32. Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.