مقالة منهجية

فرز الخلايا القائم على سحاب Leucine لتنقية الخلايا المتحولة ثنائية الناقلات

DOI:

10.3791/68628

⸱

أكتوبر 24, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف بروتوكولا لتنقية الخلايا التائية المحولة المزدوجة بشكل انتقائي من خليط من الخلايا التائية المتحولة بشكل مشترك. يجمع هذا النهج بين ناقلين من الفيروسات القهقرية يقوم كل منهما بتشفير مكون واحد من منهجية فرز الخلايا المزدوجة القائمة على سحاب الليوسين والتي تتيح التنقية المناعية المغناطيسية الانتقائية للخلايا المتنقلة ذات المتجهات المزدوجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أظهرت علاجات الخلايا التائية بالتبني ، بما في ذلك الخلايا التائية لمستقبلات المستضد الخيمري (CAR) ، نشاطا سريريا مثيرا للإعجاب ضد الأورام الخبيثة الدموية وتظهر وعدا في علاج الأورام الخبيثة الصلبة. على الرغم من هذه النجاحات ، تم تحديد آليات متعددة لمقاومة العلاج المناعي للخلايا التائية تحد من النجاح العلاجي ، بما في ذلك فقدان أو ضعف التعبير عن المستضدات المستهدفة ، وتطور استنفاد الخلايا التائية ، ووجود بيئة مكروية للورم المثبطة للمناعة. تم تطوير استراتيجيات هندسة خلايا متعددة للتغلب على آليات المقاومة هذه. ومع ذلك ، يمكن أن تحدث آليات متعددة للمقاومة في وقت واحد ، مما يستلزم مزيجا من الاستراتيجيات الهندسية المتعددة لتحسين النشاط المضاد للورم. تحد قيود تغليف النواقل من توصيل كميات كبيرة من المعلومات الجينية إلى الخلايا التائية وتمثل تحديا في التعبير المشترك عن التركيبات الهندسية المتعددة. هنا ، نصف بروتوكولا للتحويل المشترك للخلايا التائية مع متجهين لتشفير جينات معدلة متعددة ، وبالتالي زيادة عدد الوظائف الهندسية. من خلال التعبير المشترك عن منهجية فرز الخلايا القائمة على سحاب الليوسين ، والتي تسمى الفرز المضغوط ، فإننا نوجه التنقية المغناطيسية المناعية الانتقائية للخلايا المتحولة المزدوجة التي تتضمن ناقلين متميزين.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أحدث العلاج بالخلايا التائية CAR ثورة في علاج ابيضاض الدم في الخلايا البائية وسرطان الغدد الليمفاوية والورم النخاعي المتعدد1،2. يتم أيضا فحص الخلايا التائية CAR بحثا عن الأورام الخبيثة الصلبةللورم 3. ومع ذلك ، فقد تم تحديد الآليات المتكررة لفشل العلاج بالخلايا التائية CAR ، بما في ذلك ضعف التعبير أو فقدان جزيء المستضد المستهدف CAR ، وتطور الخلل الوظيفي للخلايا التائية (الإرهاق) ، وقمع المناعة النشط بواسطة البيئة المكروية للورم ، والاتجار المحدود بالخلايا التائية والاستمرار في البيئة المكروية للورم3،4،5،6. في حين تم ابتكار الحلول الهندسية الفردية لمحاولة التغلب على كل من آليات مقاومة الخلايا التائية CAR3 ، فإن إدخال وظائف هندسية متعددة في منتج العلاج الخلوي للتغلب على آليات المقاومة المتعددة في وقت واحد يمثل تحديا بسبب قدرة التعبئة الجينية المحدودة لأنظمة ناقلات الفيروسات القهقرية والفيروسات العدسية7.

للتغلب على القيود المفروضة على قدرة تغليف النواقل ، تم استخدام النقل المشترك للخلايا التائية ذات النواقل المتعددة بشكل متزايد. تم استخدام النقل المشترك للناقلات لدراسة استراتيجيات هندسة الخلايا التائية ذات البوابات المنطقية والمنظمة بالأدوية في الدراسات قبل السريرية8،9،10 وفي تجربة سريرية حديثة لتقييم الخلايا التائية ثنائية CD19 / CD22 CAR للتغلب على قيود تغليف النواقل11. ومع ذلك ، فإن التحويل المشترك يولد منتجات خلايا مختلطة تحتوي على مجموعات من الخلايا التائية أحادية ومزدوجة المحولة ، مما قد يضعف وظائف المنتج إذا كان يعتمد على المكونات المشفرة بواسطة كلا المتجهين وقد يؤدي أيضا إلى المنافسة بين الخلايا التائية أحادية المحولة12.

للتغلب على هذه التحديات ، قمنا بتطوير منهجية تسمى Zip-sort ، والتي تستخدم سحابات الليوسين غير المتجانسة - كل منها معبرا عن أحد المتجهات المتحولة المشتركة - لتوجيه التنقية المغناطيسية المناعية أحادية الخطوة للخلايا المتحولة المزدوجة13. في هذا البروتوكول ، نصف طرق بناء ناقلات الفيروسات القهقرية التي تتضمن منهجية الفرز المضغوط الخاصة بنا ، وإنتاج وتركيز المواد الطافية للفيروسات القهقرية ، وتنشيط الخلايا التائية والنقل المشترك ، والتنقية المغناطيسية المناعية للخلايا المزدوجة المحولة (الفرز المضغوط).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء الدراسات على في مختبر أبحاث بارفين في مدينة الأمل (COH) بموجب البروتوكول # 23145 المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية COH وفي مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان (MSKCC) vivarium بموجب البروتوكول # 99-07-025 كما وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام المؤسسية MSKCC. تم عزل الخلايا التائية البشرية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) التي تم تنقيتها من Ficoll-Paque من مرشحات تقليل الكريات البيض التي تم الحصول عليها من مركز المتبرعين بالدم في مدينة الأمل واستخدامها بموجب البروتوكول # 24427 كما وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية لمدينة الأمل. تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لمعايير السلامة البيولوجية المؤسسية.

1. تصميم ناقلات الفرز المضغوط

  1. حدد متجه التعبير المفضل للتعديل الوراثي للخلايا ذات الأهمية.
    ملاحظة: تشتمل منهجية الفرز المضغوط على سحابات مفرزة وسحابات التقاط ، وكلاهما يتم التعبير عنه من نواقل مختلفة ، والتي تقترن داخل الخلايا وحركة المرور إلى سطح الخلية لتمكين التنقية الانتقائية للخلايا التي تتضمن كلا المتجهين (الشكل 1 أ - د) 13. يتم التعبير عن السحابات المفرزة من المتجه 1 وتحتوي على علامة تقارب. يتم التعبير عن سحابات الالتقاط من المتجه 2 وتحتفظ بالسحاب المفرز على سطح الخلية. يتكون تعديل سحاب الحظر من سحاب ثان مرتبط تساهميا ، والذي يمنع إقران السحاب غير المحدد خارج الخلية للسحاب المفرز. مطلوب تعديل سحاب الحظر لمنع الاقتران خارج الخلية عند إضافة سحاب التقاط إلى البروتينات ذات المجالات خارج الخلية الممدودة (عادة ما تكون المجالات خارج الخلية أكبر من مجال المفصلي القصير).
  2. حدد مجموعة من السحابات المفرزة والالتقاط من الجدول التكميلي 1 والملف التكميلي 1 لاختبار المتجهات وإنشائها.
  3. استنساخ تسلسلات السحاب في متجهات تعبير مزدوجة باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية13- سيقوم كل من المتجهين بتشفير إما سحاب إفراز علامة التقارب أو السوستة الملتقطة (الشكل 1 د).
    1. انظر الجدول التكميلي 1 والملف التكميلي 1 لتسلسلات بناء السوستة. تم وضع تسلسلات السحاب في 5 '(N terminus) من رسالة polycistronic لتعزيز تعبيرها وبالتالي زيادة إنتاجية الفرز. ضع الجينات المعدلة وآليا اللاحقة في اتجاه مجرى النهر ، مفصولة بببتيدات 2A ذاتية الشق (الشكل 1 د). ومع ذلك ، فقد نجحت التجارب السابقة في وضع السحابات في تكوين 3 بوصات إذا تم الحفاظ على تعبير عال.

2. إنتاج الفيروسات القهقرية

  1. قم بإعداد خلايا Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214 ، فيروس استوائي الفأر) أو خلايا Phoenix-Eco ɑ-V β-313 (إضافة ɑ-V β-3 المصممة لتعزيز التصاق Phoenix-Eco) أو 293Vec-RD11414 (فيروس استوائي بشري) أو 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 خلايا (إضافة ɑ-V β-3 مصممة لتعزيز التصاق 293Vec-RD114) قبل يوم واحد من تعدي.
    ملاحظة: لا يتطلب هذا البروتوكول تعديل خطوط التعبئة باستخدام إنتجرينات ɑ-V β-3 ، ولكن هذا التعديل يحسن التصاق هذا الخط الخلوي بقوارير زراعة الأنسجة ويسهل جمع المواد الطافية للفيروسات القهقرية.
    1. قم بتربسين الخلايا في قارورة T175 التي تحتوي على خلايا Phoenix أو 293Vec-RD114 عند التقاء ~ 80٪ مع 0.25٪ من التربسين-EDTA.
      1. قم بإزالة الوسائط ، واغسل الخلايا الملتصقة ب 10 مل من PBS ، وحافظ على الخلايا غير منزعجة لإزالة مكونات المصل التي تثبط التربسين ، وأضف 5 مل من 0.25٪ من التربسين EDTA ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      2. قم بفصل وجمع الخلايا في 5 مل من DMEM المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين و 1٪ جلوتاماكس (يشار إليه باسم DMEM الكامل).
      3. قم بإزالة الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب الوسائط.
    2. أعد تعليق الخلايا المحببة بالطرد المركزي في 10 مل من DMEM الكامل واللوحة على طبق زراعة الأنسجة مقاس 10 سم تقريبا 1.5 × 106 خلايا Phoenix-Eco أو Phoenix-Eco ɑ-V β-3 أو 293Vec-RD114 خلايا أو 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 خلايا محسوبة باستخدام مقياس دمو.
    3. قم بهز اللوحة برفق أو لفها لتوزيع الخلايا بالتساوي واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا بالالتصاق باللوحة.
  2. بعد حوالي 18-24 ساعة ، تحقق من أن الخلايا متقاربة بنسبة 60٪ -70٪ ، مع خلايا سليمة ملتصقة تظهر إسقاطات غصنية.
  3. خلايا Phoenix-Eco أو Phoenix-Eco ɑ-V β-3 خلايا بثبات أو 293Vec-RD114 أو 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 خلايا مع تركيبات ناقلات LZRS ذات الفيروسات القهقرية (Addgene Plasmid # 31601 ، تعداء مستقر عرضي قائم على EBNA) أو تركيبات ناقلات PB13 (تكامل جينومي مستقر قائم على الينقولات piggyBac ، ملف تكميلي 1) باستخدام مجموعة تعداء (جدول المواد) كما هو موضح أدناه.
    1. اجمع بين 2 ميكروغرام من الحمض النووي LZRS أو الحمض النووي الناقل PB و 16 ميكرولتر من الكاشف المحسن في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت EC في أنبوب طرد مركزي دقيق لكل تفاعل تعدي.
    2. للتكامل المستقر لتركيبات ناقلات PB ، أضف أيضا 1 ميكروغرام من ناقل المنقولات pCMV-hyPBase pCMV-hyPBase15 (معهد سانجر).
    3. دوامة برفق لمدة 5 ثوان واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف 20 ميكرولتر من كاشف التعداء ، دوامة لمدة 10 ثوان ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتوليد مجمعات ميسيل الحمض النووي.
    4. أضف 300 ميكرولتر من DMEM الكامل إلى الأنبوب ، وقم بإضافة الماصة عدة مرات لخلطها جيدا ، وأضف تعليق الميشل بالتنقيط إلى خلايا خط التعبئة المطلية باستخدام ماصة سعة 1 مل.
    5. قم بالتدوير برفق لضمان ترسب المذيلات بشكل منتظم. بعد 24 ساعة ، قم بمحاولة التربسين للخلايا المنقولة وتقييم التعبير الأولي للبناء المشفر للفيروسات القهقرية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    6. انقل الخلايا التربسينية إلى قارورة T75 مع 20 مل من DMEM الكامل وأضف 2 ميكروغرام / مل بورومايسين أو 10 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين ، اعتمادا على جينات مقاومة المضادات الحيوية ، لاختيار الخلايا المنقولة. بمجرد وصول الخلايا إلى 70٪ -75٪ ، قم بالتربسين ونقلها إلى قارورة T175 مع 40 مل من DMEM الكامل. الحفاظ على اختيار المضادات الحيوية في الوسائط أثناء توسيع خط التعبئة.
    7. عندما تكون الخلايا ملتقمة بنسبة 80٪ -85٪ ، قم بالtrypsinize مرة أخرى وقم بتأكيد تعبير البناء عن طريق قياس التدفق الخلوي. قم بتجميد جزء من الخلايا باستخدام وسائط التجميد (50٪ DMEM كامل ، 40٪ FBS ، 10٪ DMSO) وخلايا المرور إلى قارورتين T175 (نسبة تقسيم 1: 10-1: 12) مع 40 مل من DMEM الكامل.
  4. اجمع وتركز المواد الطافية للفيروسات القهقرية من خطوط التعبئة المستقرة المختارة بالكامل المزروعة في قوارير T175 عندما تصل الخلايا إلى 80٪ -85٪.
    1. قم بإزالة المضادات الحيوية من الوسائط قبل الحصاد الأول عن طريق استبدال الوسائط في T175 ب 40 مل من DMEM الطازج الكامل قبل 24 ساعة من المجموعة الأولى المقصودة.
    2. جمع وتصفية المواد الطافية بعد 24 ساعة من استبدال الوسائط عن طريق تمرير المادة الطافية التي تم جمعها من خلال محاقن سعة 50 مل مزودة بمرشحات حقنة (0.45 ميكرومتر ، فلوريد البولي فينيلدين). اجمع في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    3. أضف 5x مركز محلول البولي إيثيلين جلايكول (PEG) (40٪ (بالوزن / الحجم) PEG 8,000 ميجاوات يحتوي على 2.4٪ (بالوزن / الحجم) كلوريد الصوديوم) طاري مفلتر واقلب الأنبوب عدة مرات للخلط جيدا (خطوة ترسيب PEG).
    4. أضف 40 مل من DMEM الكامل مرة أخرى إلى قارورة T175 الأصلية المحصودة ، واحتضن لمدة 24 ساعة أخرى ، واجمع المادة الطافية الفيروسية يوميا لمدة يومين متتاليين آخرين في المجموع.
    5. ترسيب الفيروس لمدة 1-2 أيام عند 4 درجات مئوية. سيظهر الفيروس المترسب كمادة ندفية أو عائمة أو رسوبية.
    6. جهاز الطرد المركزي تعليق الفيروس المترسب PEG عند 2,100 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من الطافق غير المترسب.
    7. أعد تعليق كل حبيبات فيروسية مترسبة ب PEG في 500 ميكرولتر من RPMI مكملة ب 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 1٪ جلوتا ماكس ، و 1٪ بيروفات الصوديوم ، و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 0.1٪ β-ميركابتوإيثانول (يشار إليها باسم RPMI الكامل).
    8. استخدم الفيروس المعلق على الفور للنقل أو النقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتخزينه عند درجة حرارة -80 درجة مئوية.

3. يوم 0: إثراء الخلايا التائية للماوس وتنشيطه

  1. قم بتغطية صفيحة 6 آبار معالجة بزراعة الأنسجة ب 1.5 مل من PBS لكل بئر تحتوي على 2 ميكروغرام / مل مضاد CD3 (استنساخ 145-2C11) و 2 ميكروغرام / مل مضاد CD28 (استنساخ 37.51). احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. حصاد الطحال من الفأر المتبرع ، وفصل الخلايا من خلال مرشح 40 ميكرومتر ، وجمع خلايا الطحال في RPMI كامل. خلايا الطحال الحبيبية عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم استخدام إناث الفئران BALB / cJ التي تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع كفئران متبرعة في هذه الدراسة.
  3. تخلص من الحبيبات الطافية ، الدوامة برفق ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء ، ماصة 3x-5x للخلط ، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة ، قم بإخمادها ب 10 مل من RPMI الكامل ، وقم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  4. تخلص من الطافي ، وأضف 800 ميكرولتر من PBS مع 0.5٪ BSA و 2 ملي مولار EDTA (يشار إليه باسم مخزن MACS) ، وأضف 200 ميكرولتر من ميكروبيدات الماوس CD19. ماصة للخلط والاحتضان لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. إعداد 1 عمود LD لكل طحال الفأر. أصلح عمود LD بفاصل MACS. ضع أنبوبا مخروطيا سعة 15 مل تحته لجمع خلايا الطحال المستنفدة من CD19. بلل العمود بسعة 2 مل من المخزن المؤقت MACS.
  6. بعد الحضانة باستخدام ميكروبيدات CD19 ، اغسل الخلايا ب 5 مل من المخزن المؤقت MACS البارد ، وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. أعد التعليق في 1 مل من المخزن المؤقت ل MACS وأضف خلايا إلى عمود LD. انتظر حتى يمر التعليق قبل الغسيل بسعة 1 مل ثم 2 مل من مخزن MACS.
  7. اجمع تدفق الخلايا الطحالية المستنفدة CD19 لاستخدامها في اتجاه مجرى النهر. تخلص من عمود LD ، وقم بتدوير الخلايا الطحالية المستنفدة CD19 عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقه في 18 مل من RPMI الكامل. أضف IL-2 البشري المؤتلف (rhIL-2) إلى تركيز نهائي قدره 50 وحدة دولية / مل.
  8. تخلص من محلول الجسم المضاد من لوحة 6 آبار مغلفة بالأجسام المضادة. أضف 3 مل من خلايا الطحال المستنفدة للخلايا البائية المعلقة إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار مغلفة بالأجسام المضادة.

4. اليوم 1: نقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية للفئران

  1. قم بتغطية صفيحة 6 آبار غير معالجة بزراعة الأنسجة ب 1.5 مل من PBS لكل بئر تحتوي على 2 ميكروغرام / مل مضاد CD3 (استنساخ 145-2C11) ، 2 ميكروغرام / مل مضاد CD28 (استنساخ 37.51) ، و 20 ميكروغرام / مل ريترونيكتين.
    ملاحظة: يتم استخدام الألواح غير زراعة الأنسجة أثناء طلاء RetroNectin وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. تخلص من محلول الطلاء أو احتفظ به لإعادة الاستخدام (يمكن إعادة استخدامه مرة واحدة). لوحة كتلة مع 1 مل من PBS مع 2٪ BSA لكل بئر ، واحتضان لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ، وتخلص من محلول الحظر.
  3. في غضون ذلك ، قم بإذابة الطاف الفيروسي المترسب ب PEG في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون 500 ميكرولتر من كل فيروس قهقري مركز PEG متولد من قارورة T175 كافيا لتحويل مزدوج يصل إلى 2 × 106 خلايا تائية نشطة لكل بئر مع كفاءة نقل مزدوجة بنسبة 20٪ >.
  4. أضف المواد الطافية الفيروسية ذات التحويل المشترك إلى اللوحة المكونة من 6 آبار وفقا للظروف المرغوبة ، وارفع الحجم النهائي إلى 2 مل على الأقل مع RPMI الكامل و 50 وحدة دولية / مل rhIL-2 ، وقم بالدوران لمدة ساعة واحدة عند 2,100 × جم و 32 درجة مئوية.
  5. أضف 0.5-2 × 106 خلايا تائية نشطة لكل بئر وقم بتدوير اللوحة عند 340 × جم لمدة 10 دقائق عند 32 درجة مئوية. إذا لم تكن الخلايا ملتصقة ، كرر الدوران عند 340 × جم لمدة 10-20 دقيقة أخرى عند 32 درجة مئوية. احتضان عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

5. اليوم 2: تقييم تعبير المتجهات وإعادة النقل الاختياري

  1. قم بتعطيل 100-200 ميكرولتر من الخلايا الملتصقة لكل حالة من لوحة التنبيغ لقياس التدفق الخلوي. يجب على المستخدم تحديد علامة قابلة للكشف عن قياس التدفق الخلوي لكل متجه فردي وعلامة تقارب واستخدامها لتقييم كفاءة التنبيغ أحادي المتجه للناقل ، وكفاءة التنبيغ المزدوج المتجه ، وعرض علامة التقارب باستخدام قياس التدفق الخلوي.
  2. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي على الخلايا المتحولة بشكل مشترك كما هو موضح أدناه.
    1. قم بإعداد محاور معلمات الاكتساب لعرض مراسلي المتجهات للمتجه 1 والمتجه 2 (الشكل 1 ج).
    2. ارسم الرسوم البيانية لتلوين سحاب علامة التقارب (على سبيل المثال ، FLAG أو CD34) لكل من أرباع تعبير المتجه 1 و المتجه 2 الأربعة للتأكد من أن تلطيخ علامة التقارب يقتصر على الخلايا التي تعبر بشكل مشترك عن مراسلي نقل المتجه 1 والمتجه 2.
  3. إذا كانت الخلايا مزدوجة بدرجة كافية لضمان خلايا كافية لتجارب المصب (بشكل عام 20٪ أو أكثر من التنبيغ المزدوج) ، فقم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. قم بتغطية ضعف عدد الآبار الأولية المستخدمة لنقل كل خط من الخلايا التائية مع PBS يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة ل CD3 والمضادة ل CD28 للحفاظ على تحفيز الخلايا التائية. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. نقل الخلايا إلى آبار جديدة مع RPMI كامل مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2 (يحافظ على تحفيز الخلايا التائية).
  4. إذا لم يتم تحويل الخلايا بشكل كاف لضمان خلايا كافية لتجارب المصب (بشكل عام < 20٪ من التحويل المزدوج) ، فقم بتنفيذ الخطوات التالية.
    1. إعادة التحويل باستخدام نفس بروتوكول اليوم الأول ، ولكن زيادة لضعف عدد الآبار المستخدمة في البداية لحساب توسع الخلايا التائية.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية طوال الليل. كرر قياس التدفق الخلوي بعد 24 ساعة.
      ملاحظة: تظهر التركيبات المشفرة بالمتجه ، بما في ذلك سحاب علامة التقارب ، أقصى تعبير بعد يومين من التحويل الأولي.

6. اليوم 3: الاختيار المناعي المغناطيسي للخلايا التائية (فرز الرمز البريدي)

  1. تجمع آبار الخلايا المتولدة باستخدام نفس ظروف النقل المشترك في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  2. خلايا الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الخلايا الطافية واحتضان الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS الذي يحتوي على 30 ميكرولتر من الميكروبيدات (DYKDDDDK (FLAG) أو CD34 البشري) لكل 1 × 107 خلايا لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. بعد الحضانة، اغسل الخلايا بسعة 5 مل من المخزن المؤقت MACS البارد. خلايا الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من مخزن MACS.
  4. حدد بشكل إيجابي الخلايا التائية المحولة باستخدام عمود LS كما هو موضح أدناه.
    1. بلل العمود بسعة 2 مل من المخزن المؤقت MACS. ضع تعليق الخلية على عمود LS في الحامل المغناطيسي.
    2. اغسل بالتتابع باستخدام مخزن MACS المؤقت (1 مل ، 2 مل ، 3 مل). احتفظ Elute بالخلايا من العمود عن طريق إزالة العمود من الحامل المغناطيسي ، وإضافة 5 مل من RPMI الكامل إلى العمود ، وإدخال مكبس الخلية.
    3. التقط الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل أو مباشرة في قارورة T25. موازنة الخلايا عند 0.5 × 106 خلايا / مل في RPMI كامل مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2.
    4. إذا بدءا من 20٪ من التحويل المزدوج < ، فقم اختياريا بإزالة الخلايا على عمود LS ثان للاختيار الإيجابي المتسلسل لزيادة نقاء ما بعد الفرز.
  5. ثقافة خلايا CAR T في قوارير T25 أو T75 بحوالي 0.5 × 106 خلايا / مل من RPMI الكامل و 50 وحدة دولية / مل rhIL-2.
  6. اختياري: إذا تم استخدام الخلايا التائية للتجارب في الجسم الحي ، ففكر في الزراعة في 1 ميكرومتر داساتينيب لتخفيف الخلل الوظيفي الناجم عن منشط الإشارات للخلايا التائية CAR الذي تمت مواجهته خلال فترة الاستزراع الأولية13،16.
  7. قم بإجراء قياس التدفق الخلوي وفقا للخطوتين 2.1 و 2.2 أعلاه للخلايا التائية التي تم فرزها مسبقا والفرز اللاحق لتقييم الإنتاجية والنقاء بعد الفرز المضغوط (٪ مزدوج التحويل).
    العائد = 100 × إجمالي الخلايا المحولة المزدوجة المستردة / إجمالي الخلايا المحولة المزدوجة الموجودة في مجموعة ما قبل الفرز)

7. اليوم 4: استمرار زراعة الخلايا التائية

  1. أضف RPMI الكامل الجديد و 50 وحدة دولية / مل rhIL-2 لحجم المزرعة بالكامل للحفاظ على تركيز الخلايا التائية عند 0.5-1 × 106 خلايا / مل.
  2. اختياري: إذا تم استخدام الخلايا التائية للتجارب في الجسم الحي ، فأضف 1 ميكرومتر داساتينيب جديد.

8. اليوم 5: توصيف الخلايا التائية المضغوطة

  1. اختياري: قم بإعداد 100-200 ميكرولتر من تعليق الخلايا التائية لكل حالة ملطخة بالأجسام المضادة للكشف عن CARs أو منتجات البروتين الأخرى المشفرة بواسطة ناقلات الفرز المضغوط باستخدام قياس التدفق الخلوي.
  2. قم بإجراء تجارب في المختبر أو في الجسم الحي مع الخلايا التائية CAR.
  3. اختياري: إذا تم استخدام الخلايا التائية في التجارب في الجسم الحي ، فقم بغسل الخلايا لإزالة الدساتينيب. إعادة تعليق الخلايا بالتركيز المطلوب للحقن المداري أو الوريد الذيلي وفقا للإرشادات المؤسسية.

9. اليوم 0: تنقية وتحفيز الخلايا التائية البشرية

  1. قم بإذابة قارورة من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة المحفوظة بالتبريد بسرعة في حمام مائي (أو استخدم PBMCs المعزولة حديثا). أضف PBMCs المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من المخزن المؤقت MACS ، وقم بإعداد حصة للعد ، وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  2. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت MACS (استخدم 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 1 × 107 خلايا إجمالية). تابع عزل الخلايا التائية باستخدام مجموعة عزل الخلايا التائية ، بشري ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. باختصار ، أضف 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للبيوتين للخلايا التائية لكل 1 × 107 خلايا إجمالية. احتضان لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    2. أضف 30 ميكرولتر من مخزن MACS المؤقت لكل 1 × 107 خلايا إجمالية. أضف 20 ميكرولتر من كوكتيل Pan T Cell MicroBead لكل 1 × 107 خلايا إجمالية.
    3. احتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. املأ حجم تعليق الخلية باستخدام مخزن MACS المؤقت إلى 500 ميكرولتر على الأقل.
    4. انتقل إلى فصل الخلايا المغناطيسية باستخدام عمود LS واجمع التدفق من خلال الخلايا التائية المخصبة (التي لم تمس).
  3. عد إنتاجية الخلايا التائية وخلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الطافية. أعد تعليق الخلايا التائية البشرية في RPMI الكامل عند 1 × 106 خلايا / مل مع rhIL-2 عند 50 وحدة دولية / مل.
  4. إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من PBS ، أضف الحجم المطلوب من Dynabeads Human T-Activator CD3 / CD28 لتوسيع الخلايا التائية وتنشيطها (25 ميكرولتر من الخرزات لكل 1 × 106 خلايا ، باستخدام نسبة 1: 1 من الخرزة إلى الخلية التائية) وقم بالدوران عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لغسل الخرز. تجاهل الطافية.
  5. امزج الخلايا التائية المعلقة مع الخرز المغسول وانقلها إلى قارورة T25 للثقافة.

10. اليوم 3: نقل الفيروسات القهقرية للخلايا التائية البشرية

  1. قم بتغطية صفيحة 6 آبار غير زراعة الأنسجة ب 1.5 مل من PBS لكل بئر تحتوي على 20 ميكروغرام / مل RetroNectin.
  2. احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية. تخلص من محلول الطلاء أو احتفظ به لإعادة الاستخدام (يمكن إعادة استخدامه مرة واحدة).
  3. في غضون ذلك ، قم بإذابة المواد الطافية الفيروسية المترسبة ب PEG للنقل المشترك في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  4. أضف مادة طافية فيروسية ذات نقل مشترك إلى آبار صفيحة 6 آبار مطلية بالريترونيكتين وفقا لظروف النقل المرغوبة ، وقم بحساب وإضافة الكمية المطلوبة من الخلايا التائية (بشكل عام 0.5 - 2 × 106 خلايا تائية / بئر) ، ورفع الحجم إلى 3 مل مع RPMI كامل يحتوي على rhIL-2 وتدور لمدة 45 دقيقة عند 340 × جم عند 32 درجة مئوية.
  5. بعد 24 ساعة ، حافظ على الخلايا التائية عند 1 × 106 خلايا / مل في RPMI كامل مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2.
  6. نقل الخلايا من لوحة 6 آبار إلى قارورة T25 إذا كان الحجم المطلوب للحفاظ على التركيز المطلوب للخلايا التائية يتجاوز السعة الحجمية للوحة المكونة من 6 آبار.

11. اليوم 6: فرز الخلايا التائية CAR البشرية برمز مضغوط

  1. قم بإزالة Dynabeads من الخلايا التائية قبل التنقية المغناطيسية المناعية القائمة على علامة التقارب (الفرز المضغوط) لتجنب الاحتباس المحتمل المرتبط ب Dynabead في العمود المغناطيسي وقبل قياس التدفق الخلوي لتجنب التداخل المحتمل مع تحليل التدفق الخلوي.
  2. دوامة لفترة وجيزة لفصل Dynabeads ونقل الخلايا التائية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وإدخالها في Dynabead Magnet. اقلب الأنبوب عدة مرات وانتظر لمدة 5 دقائق حتى تلتصق Dynabeads بالمغناطيس.
  3. انقل تعليق الخلية بعناية بدون Dynabeads إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل عن طريق الشفط باستخدام ماصة. عد تركيز الخلية المستردة واستخدم الحجم لحساب إجمالي إنتاجية الخلية.
  4. قم بتقييم تعبير CAR باستخدام قياس التدفق الخلوي وفقا لبروتوكول نقل الماوس أعلاه.
  5. قم بتدوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 340 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية واحتضان في 500 ميكرولتر من MACS buffer يحتوي على 30 ميكرولتر من الميكروبيدات (DYKDDDDK (FLAG) أو CD34 البشري) لكل 1 × 107 خلايا.
  6. اتبع الخطوات 6.3-6.5 للحصول على خلايا CAR T البشرية المصنفة بسحاب.
  7. قم بتقييم الجدوى بعد الفرز عن طريق التحقق من قابلية مقياس الدم باستخدام استبعاد التربان الأزرق. من المتوقع أن تكون جدوى الفرز المسبق > 80٪. قد ينخفض هذا إلى أقل من 80٪ بعد فرز Zip ولكنه يتعافى على مدى 4-5 أيام.
  8. قم بتوسيع الخلايا التائية البشرية في RPMI كامل مع 50 وحدة دولية / مل rhIL-2 والحفاظ على تركيز الخلايا التائية عند حوالي 1 × 106 خلايا / مل. يمكن تكييف توسيع الخلايا التائية وصيانتها بعد الفرز وفقا لبروتوكولات التوسع والاستخدام القياسية للمستخدم.
  9. قم بإجراء اختبارات تجريبية في اتجاه مجرى مثل فحوصات القتل ، وإنتاج السيتوكين ، والتحليل في الجسم الحي باستخدام الخلايا التائية بشكل عام بعد اليوم 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، نوضح التحويل المشترك والاختيار المغناطيسي المناعي أحادي الخطوة للخلايا التائية المحولة بشكل مزدوج مع ناقلين متميزين للفيروسات القهقرية (يسمى الفرز المضغوط ، الشكل 1) 13. يقوم كل متجه بتشفير جزء واحد من زوج سحاب الليوسين غير المتجانس الذي يتم عرضه بشكل انتقائي على سطح الخلايا التائية المتحولة المزدوجة (الشكل 1 أ). يتم التعبير عن سحاب إفراز علامة التقارب من المتجه 1 ويقترن داخل الخلايا مع سحاب التقاط مرتبط بالغشاء معبر ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، وصفنا بروتوكولا لتوليد مجموعات ناقلات الفرز المضغوط ، وإنتاج الفيروسات القهقرية ، والخلايا التائية المشتركة للفأر والخلايا التائية البشرية ، وتنقية الخلايا المزدوجة المنقولة مغناطيسيا المناعية (الفرز المضغوط). تم تحسين البروتوكول أعلاه لنواقل الفيروسات القهقرية والخلايا التائية للفئران والإنسان. في حين أن منهجية الفرز المضغوط لم يتم تقييمها مع أنظمة النواقل الأخرى ، من حيث المبدأ ، من المرجح أن تكون أنظمة النواقل الأخرى متوافقة ، بما في ذلك الفيروسالعدسي 17 ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.R. ، S.C. ، S.E.J. و M.V.D.B. هم مخترعون مشاركون في طلبات براءات الاختراع المتعلقة بتقنية الفرز المضغوط. تقدم A.P.B. الاستشارات ل Abbvie و Bristol Myers Squibb. تلقى M.v.d.B. دعما بحثيا من Seres Therapeutics ، وخيارات الأسهم من Seres Therapeutics و ThymoFox. حصل على إتاوات من Wolters Kluwer. لقد استشار أو حصل على أتعاب من أو شارك في المجالس الاستشارية ل Seres Therapeutics و Vor Biopharma و Rheos Medicines و Frazier Healthcare Partners و Nektar Therapeutics و Notch Therapeutics و Ceramedix و Lygenesis و Pluto Therapeutics و GlaskoSmithKline و Da Volterra و ThymoFox و Garuda و Novartis (الزوج) و Synthekine (الزوج) و Beigene (الزوج) و Kite (الزوج) و MustangBio (الزوج) و Cellectar (الزوج). لديه ترخيص IP مع Seres Therapeutics و Juno Therapeutics. يشغل دورا ائتمانيا في مجلس مؤسسة DKMS (منظمة غير ربحية). وهو رئيس المجلس الاستشاري العلمي للمحصنة الذكية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلقى S.C. دعما من مؤسسة البحوث الألمانية (زمالة بحثية; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). تتلقى شركة S.E.J. دعما من جائزة التطوير الوظيفي من المعهد الوطني للسرطان (رقم الجائزة K08-CA252157). تلقى S.E.J. أيضا دعما من الجمعية الأمريكية لعلم الأورام السريري (جائزة الباحث الشاب) ، والبرنامج الوطني للمتبرعين بالنخاع (جائزة برنامج إيمي) ، ومعهد باركر للعلاج المناعي للسرطان (جائزة Bridge Scholar). يتم دعم البحث في مختبر فان دن برينك من قبل جوائز المعهد الوطني للسرطان P01-CA023766 و R35-CA284024 و R01-CA228308. جائزة المعهد الوطني للقلب والرئة والدم R01-HL164902 ، وجائزة المعهد الوطني للشيخوخة P01-AG052359. يتم دعم هذا البحث جزئيا من خلال هبة رئيس الأطباء التنفيذيين المتميزين لديانا وستيف كامبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي> خط الخلايا السرطانية ذات الصلة< / قوي>
ج 1498ATCCتيب-49
بي إم 185-سي دي 19المرجع 13
بي إم 185-سي دي 20المرجع 13
وحدة 4D-Nucleofector الأساسيةلونزاإيه إيه أف-1003 ب
وحدة 4D-Nucleofector XلونزاAAF-1003X
طقم عازلة لونزا SF
<قوي>إنتاج فيروسات< / قوي>
10 سم طبق زراعة الأنسجة (TC) المعالجكورنينج353003
أنبوب مخروطي 50 ملثيرمو ساينتفيك339652
التأثيركياجين301425
pENTR1a البلازميدأدجين17398
LZRS-RFAأدجين31601
PB MMLV puro (ناقل فيروسي للخلايا التائية للفأر)المرجع 13
PB SFG blastR (ناقل فيروسي للخلايا التائية البشرية)المرجع 13
pCMV-hyPBaseمعهد سانجر
فينيكس إيكوATCCCRL-3214
فينيكس إيكو ألفا الخامس بيتا 3المرجع 13تم تعديل Phoenix-Eco للالتزام بقوارير الثقافة بشغف أعلى
PB-EF1a intron WPRE mCD4 P2A MCS إنتجرين بيتا 3المرجع 13اختياري لتعزيز التصاق خلايا خط التعبئة والتغليف بقوارير الثقافة
PB-EF1a intron WPRE hCD8a 2A integrin alpha Vالمرجع 13اختياري لتعزيز التصاق خلايا خط التعبئة والتغليف بقوارير الثقافة
بيوفيك-RD113بيوفيك فارما
Biovec-RD113 ألفا V بيتا 3بيوفيك فارماهذه الدراسة, transfected مع ألفا V بيتا 3 ناقلات
مرشحات حقنة Millex-HV (0.45 & mu; m)ميليبورSLHVR33RRS
البولي إيثيلين جلايكول 8000 (PEG)فيشر العلميةBP233-1
كلوريد الصوديومفيشر العلميةق 271-500
بورومايسينسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-108071B
مبيد بلاستيدينسانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةSC-204655
قوارير T175 TC المعالجة   ؛كورنينج353112
التربسين-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمرجيبكو25200056
<قوية>وسائط خلية
2-ميركابتوإيثانولجيبكو21985023
RPMI1640جيبكو11-875-119
دي إم إيه إمجيبكو11-965-118
FBSسيغماإف 2442
جلوتامكسجيبكو35050061
الأحماض الأمينية غير الأساسية MEMجيبكو11140050
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140-163
بيروفات الصوديومجيبكو11360070
<تحفيز / نقل الخلايا التائية القوية> التائية
أنبوب مخروطي 15 ملثيرمو ساينتفيك339650
6 آبار لوحة غير TCجيبكو351146
6 آبار لوحة TCجيبكو353046
مضاد CD19 microbeads   ؛ميلتيني بيوتيك130-121-301
InVivoMab CD28 مضاد للماوس (استنساخ 37.51)بيو إكس سيلبي إك0015-1
InVivoPlus المضادة للماوس CD3 & epsilon; (استنساخ 145-2C11)بيو إكس سيلبي 0001-1
مصل الأبقار الألبومينسيجما ألدريتشأ4737-1 جي
داساتينيبكايمان كيميكال11498
Dynabeads الإنسان T-المنشط CD3 / CD28جيبكو11131 د
EDTA (0.5 ميجا)، درجة الحموضة 8.0، خالية من RNaseإنفيتروجينAM9260G
HybriMax RBC تحلل المخزن المؤقتسيغماR7757-100ML
عمود LDميلتيني بيوتيك130-042-901
طقم عزل الخلية Pan T ، الإنسانميلتيني بيوتيك130-096-535
مغناطيس Dynamag-15إنفيتروجين12301د
الفوسفات المحلول الملحي (1X)كورنينج21040السيرة الذاتية
ريترونكتينتاكاراتي 100 ب
رهيل -2البروليوكين (ألدسلوكين)
قارورة زراعة الخلايا T25كورنينج353109
<قوي> فرز بسحاب
µ طقم عزل MACS DYKDDDDKميلتيني بيوتيك130-101-591
طقم CD34 MicroBead ، بشريميلتيني بيوتيك130-046-702
كوادرو ماكسميلتيني بيوتيك130-090-976
MACS MultiStandميلتيني بيوتيك130-042-303
عمود LSميلتيني بيوتيك130-042-401
<قوي>قياس التدفق الخلوي ومراقبة الخلية< / قوي>
مضاد CD90.1 Thy1.1 APC (استنساخ OX-7)BD Biosciencesالقط # 561409 ؛ RRID:AB_10683163
الأجسام المضادة لعلامة V5 ، (استنساخ 4C12E11) iFluor 488برنامج GenScriptالقط # A01803 ، RRID: AB_2925231
مايك بي إيتقنية إشارات الخليةالقط # 2233; RRID:AB_823474
مايك أليكسا 647تقنية إشارات الخليةالقط # 2233; RRID:AB_823474
علامة APC المضادة ل DYKDDDK (استنساخ L5)بيو ليجندالقط # 637307 ؛ RRID:AB_2561496
ماوس مضاد للأجسام المضادة CD34 ، أليكسا فلور 647 ، (استنساخ QBEnd / 10)نوفوس بيولوجيڪلالقط # NBP2-34713AF647 ؛ RRID:AB_2925234
Streptag FITCبرنامج GenScriptالقط # A01736; RRID:AB_2622221
الخلايا البينية SX5سارتوريوس
مقياس التدفق الخلوي الخماسيأجيلينت

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Leucine ZipperCell SortingDual Vector TransductionT Cell EngineeringImmunomagnetic PurificationAdoptive T Cell TherapyCAR T CellsTumor MicroenvironmentTransgene CoexpressionCell Purification

مقالات ذات صلة