مقالة منهجية

تقنية الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة طفيفة التوغل في الفأر

DOI:

10.3791/68631

⸱

يوليو 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Duke University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, Duke University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحقن تحت الشبكية هي تقنية لا غنى عنها للتطوير قبل السريري للعلاجات لأمراض المستقبلات الضوئية وRPE. نصف تقنية حقن تحت الشبكية المحسنة عبر الصلبة في الفئران تعمل على تحسين معدلات النجاح أثناء الجراحة وتقليل تلف الشبكية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتضمن الطريقة التقليدية لتوصيل المواد إلى الفضاء تحت الشبكية في الفأر ثقبا مزدوجا للشبكية العصبية ، مما يتسبب في أضرار جراحية واسعة النطاق. يؤدي هذا إلى التباين في مقاييس النتائج اللاحقة للوظيفة البصرية ، مثل تسجيلات مخطط كهربية الشبكية (ERG) أو فحوصات الرؤية السلوكية ، والتي تربك تقييمات فعالية العلاجات التجريبية. للتغلب على هذه الحواجز ، قمنا بتحسين تقنية الحقن تحت الشبكية طفيفة التوغل عبر الصلبة في الفئران. في هذه التقنية ، يتم الوصول إلى القبسط الفائق باستخدام منظار الجفن من سلك التنغستن المصنوع خصيصا لإجراء استئصال الصفاق الملتحمة وبضع الوتر. يتم إجراء بضع التصلب الدقيق باستخدام سكين ماسي دون اختراق شبكية العين ، يتم من خلاله إدخال إبرة زجاجية دقيقة بعناية بزاوية ضحلة. يتم تسليم الحمولة الصافية إلى الفضاء تحت الشبكية باستخدام مضخة الحقن المجهري. يستخدم التصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) لتقييم حجم وموضع الفقاعة تحت الشبكية مباشرة بعد الحقن. قارنا نتائج هذه التقنية بالطريقة التقليدية عبر الشبكية التي يتم إجراؤها باستخدام حقنة محملة بنابض مع بضع إبرة 33G. أشارت تسجيلات ERG إلى الحفاظ الممتاز على وظيفة الشبكية في الفئران المحقونة عبر الصلبة ، مقارنة بتلك الموجودة في الفئران الضابطة غير المحقونة. في المقابل ، لوحظ انخفاض ملحوظ في إشارة ERG في الأتربات المحقونة تقليديا. باختصار ، قمنا بتحسين تقنية طفيفة التوغل للحقن تحت الشبكية في الفئران. نثبت أن هذه التقنية هي طريقة قوية وفعالة لإدارة العلاج الجيني تقلل من الضرر التشريحي لشبكية العين ولها تأثير ضئيل على وظيفة الشبكية. تقلل هذه الطريقة من عتبة تطوير العلاجات التي تستهدف كلا من ظهارة الشبكية المصطبغة والمستقبلات الضوئية لعلاج مجموعة واسعة من أمراض الشبكية والبقعية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحقن تحت الشبكية هو إجراء جراحي للعين يتم فيه توصيل المواد إلى المساحة المحتملة بين الشبكية والظهارة المصطبغة في الشبكية (RPE). بالمقارنة مع الطرق الأخرى لتوصيل الدواء إلى الجزء الخلفي ، مثل الحقن داخل الجسم الزجاجي أو فوق الزجاجي ، تحقق الحقن تحت الشبكية الوصول الفوري إلى كل من المستقبلات الضوئية و RPE. لتوصيل جزيئات العلاج الجيني الفيروسي ، يحقق الحقن تحت الشبكية معدلات أعلى بكثير من المستقبلات الضوئية ونقل RPE ، مما يسمح بانخفاض العيارات الفيروسية وتقليل خطر السمية الفيروسية1. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفضاء تحت الشبكية محصور تشريحيا ، مما يحد من الانتشار الجهازي للجزيئات الفيروسية ويقلل من خطر الاستجابات المناعية2. في البشر ، يكون ملف أمان الحقن تحت الشبكية مواتيا للغاية ، مع تعافي بنية الشبكية ووظيفتها إلى مستويات خط الأساس في غضون شهر واحد بعد الحقن3،4. تستخدم الحقن تحت الشبكية في عدد من التطبيقات ، مثل زرع الخلايا الجذعية وتوصيل الأدوية بالجزيئاتالصغيرة 2 ، وأكثر استخداماتها شيوعا هو توصيل النواقل الفيروسية للعلاج الجيني لأمراض الشبكية. إن العيارات الفيروسية المنخفضة نسبيا ، والحد الأدنى من التعرض الجهازي ، وارتفاع معدل وخصوصية التنبيغ المرتبط بالحقن تحت الشبكية جعلها تقنية لا غنى عنها في مجال شبكية العين. تستخدم الحقن تحت الشبكية بنجاح في المرضى لعلاج اضطرابات الشبكية الوراثية ، بما في ذلك التهاب الشبكية الصباغي وداء ليبر الخلقي5،6.

نظرا لأهميتها في هذا المجال ، فإن القدرة على إجراء الحقن تحت الشبكية في الفئران أمر بالغ الأهمية للدراسات قبل السريرية التي تبحث في علاجات أمراض الشبكية الوراثية. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لحقن تحت الشبكية للفأر لها معدلات فشل عالية وغالبا ما تسبب تلفا جراحيا لشبكية العين ، مما قد يحد من موثوقية واتساق مقاييس النتائج الوظيفية. تقليديا ، يتم إجراء الحقن تحت الشبكية في القوارض عبر الشبكية ، بحيث تخترق الإبرة الشبكية الأمامية ، وتمر بالعدسة ، وتدخل مساحة تحت الشبكية نتيجة لاختراق ثان للشبكية7،8 (الشكل 1 أ). على الرغم من سهولة تنفيذها نسبيا ، إلا أن هذا الإجراء يقدم تناقضا ملحوظا في النتائج التجريبية بسبب المدى المتغير للضرر الجراحي. هذا محدود بشكل خاص للدراسات التي تستخدم مقاييس نتائج الرؤية السلوكية والوظيفية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العدسة البلورية كبيرة بشكل غير متناسب في الفئران مقارنة بالبشر. هذا يزيد بشكل كبير من خطر تلف العدسة أثناء الحقن عبر الشبكية ، مما يجعل غير صالح للاستخدام لتقييمات الرؤية الوظيفية4.

خيار بديل هو طريق الحقن عبر الصلبة ، والذي يتجنب هذه المشكلات من خلال الوصول إلى الفضاء تحت الشبكية باستخدام نهج خلفي ، حيث تخترق الإبرة الصلبة ، المشيمية ، غشاء Bruch ، و RPE4،9 (الشكل 1 ب). يقلل هذا النهج من تلف الشبكية عن طريق تجنب اختراق الشبكية تماما. كما أنه يرتبط بانخفاض ارتجاع المواد المحقونة من الفضاء تحت الشبكية10 ، مما يسمح بنتائج أكثر اتساقا وأفواج تجريبية أصغر. على الرغم من أن تقنية الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة في الفئران قد تم وصفها سابقا في الأدبيات ، إلا أن اعتمادها على نطاق واسع لا يزال محدودا بسبب صعوبتها التقنية ، والتي يمكن أن تعيق معدلالنجاح 4. هنا ، نصف العديد من التحسينات على إجراء الحقن عبر الصلبة ، مما يجعل أداءه أسهل وأسرع ، ويقلل من التباين التجريبي ، ويحسن معدلات نجاح الحقن. تشمل هذه التحسينات تطوير منظار جفن الفأر ، وإعطاء الأتروبين قبل الجراحة ، وإنشاء بضع التصلب الدقيق باستخدام سكين الماس ، وتحسين حجم الإبرة ونهج الحقن. تحقق هذه التقنية تغطية ممتازة لنقل الفيروس للمستقبلات الضوئية و RPE ، دون التسبب في أي تأثير جراحي يمكن اكتشافه بواسطة ERG.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع التجارب وفقا للجنة رعاية المؤسسي بجامعة ديوك وبيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون لاستخدام في أبحاث طب العيون والرؤية.

1. تحضير

  1. يجب إعطاء حقنة داخل الصفاق بمقدار 1 ملغم/كغ من الأتروبين (بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر) قبل 30 دقيقة من إجراء الحقن تحت الشبكية. تزيد هذه الخطوة بشكل كبير من معدلات النجاح عن طريق منع ردود الفعل القاتلة للعيون القلبية والجهاز التنفسي الناجمة عن ارتفاع ضغط العين العابر أثناء الحقن11،12.
    ملاحظة: تم تحسين جرعة الأتروبين الخاصة بنا للفئران C57BL / 6 وقد تحتاج إلى تعديلها لسلالات الفئران الأخرى. لم نلاحظ أي فروق ملحوظة بين الجنسين أو العمر في جرعات الأتروبين.
  2. أثناء الإجراء بأكمله ، احتفظ بالماوس على سطح دافئ لزيادة راحة وتقليل تطور إعتام عدسة العين البارد.
  3. تخدير الفأر باستخدام 2٪ من الأيزوفلوران المستنشق في الأكسجين (2 لتر / دقيقة) حتى يتم ملاحظة الاستلقاء ولم يعد يستجيب لقرص إصبع القدم. ضع قطرة من 0.5٪ بروباراكايين على العين للتخدير الموضعي.
  4. ضع قطرة من خليط 0.2٪ سيكلوبنتولات و 1٪ فينيليفرين على العين لتوسيع التلميذ لتصوير ما بعد الجراحة للفقاعة تحت الشبكية بواسطة OCT. يعمل فينيليفرين أيضا على تقليل النزيف أثناء الجراحة عن طريق تضييق الأوعية الدموية السطحية13.

2. بضع التصلب

  1. قبل البدء في الإجراء ، قم بتحميل إبرة زجاجية دقيقة بالحجم المطلوب من المحلول المراد حقنه. قم بتوصيل الإبرة بالحاقن الدقيق ، مع ضبط ضغط التعويض عند 5 هيكتوباسكال (hPa) لمواجهة عمل الشعيرات الدموية. نستخدم عادة 1 ميكرولتر للحقن تحت الشبكية.
  2. ضع الماوس تحت مجهر مجسم. استخدم التكبير بمقدار 20x للخطوتين 2.3-2.6 والتكبير 50x للخطوات 2.7-3.5.
  3. بالنسبة للفئران الصغيرة ، قم بإجراء بضع الكثم الجانبي قبل الإجراء ، من أجل توفير وصول وتصور واسع لموقع الجراحة.
  4. قم بفضح الفورنكس الفائق بمساعدة منظار سلكي مصغر مصنوع خصيصا (الشكل 1 ج). شل حركة المنظار للسماح بتراجع الجفن العلوي بدون استخدام اليدين.
  5. باستخدام مقص Vannas بزاوية ، قم بإجراء شق شبه حار (~ 1 مم خلف الطرف) في الملتحمة العلوية وكبسولة Tekon لفضح 3-4 ساعات ساعة متفوقة من الصلبة. احرص على تجنب ثقب الجيوب الأنفية الوريدية المدارية الرجعية. قم بإزالة أي بقايا من كبسولة Tenon التي تغطي موقع الحقن المقصود بعناية ولكن بدقة.
  6. أمسك الحافة الأمامية لبضع الصفاق الملتحمة وبضع الوتر باستخدام ملقط مسنن مغلق وقم بإنشاء الكرة الأرضية برفق لفضح الصلبة العلوية. قم بتثبيت الملقط المغلق للسماح بإجراء تدقيق بدون استخدام اليدين.
  7. ضع قطرة من المحلول الملحي المتوازن (BSS) على العين على الفور لمنع جفاف الصلبة العارية. نجد أيضا أن التكبير البصري الناتج عن قطرة BSS مفيد.
  8. باستخدام سكين ماسي ، قم بإجراء بضع صلبة دقيق عند ~ 12 الساعة و ~ 1-2 مم من الطرف. ضع الشفرة في مستوى عرضي فيما يتعلق بالصلبة للتأكد من أن بضع التصلب صغير وضحل قدر الإمكان.
    ملاحظة: يتم ذلك لسببين: (1) يسمح بضع التصلب الصغير بملاءمة إحكام للإبرة الزجاجية ، وبالتالي تقليل الارتجاع أثناء خطوة الحقن ، و (2) يعد بضع التصلب الضحل أمرا بالغ الأهمية لتجنب اختراق شبكية العين. لاحظ أن كمية صغيرة من الدم المشيمي قد تظهر في موقع بضع الصليب، مما لا يعني أي آثار سلبية على نتيجة الإجراء.

3. الحقن تحت الشبكية عبر الصلبة

  1. استعدادا للحقن ، استخدم إسفنجة جراحية لإزالة كل BSS برفق من سطح العين.
  2. أمسك الإبرة المشطبة لأسفل بزاوية ضحلة على الصلبة وأدخل الطرف ببطء وحذر في بضع الصلبة للوصول إلى المساحة تحت الشبكية. من أجل تجنب اختراق شبكية العين ، افعل ذلك بزاوية ضحلة نسبيا وعميقة بما يكفي لمسح فتحة التصلب بمقدار 0.5-1 مم.
    ملاحظة: يتم وضع شطبة الإبرة لأسفل من أجل تقليل إمكانية التوصيل المشيمي وتقليل احتمالية ثقب شبكية العين بطرف الإبرة المتقدم.
  3. أثناء الإمساك بالإبرة في وضع ثابت ، ابدأ الحقن عند 500 هيكتوباسكال باستخدام دواسة القدم وحافظ على الضغط دون انقطاع لمدة 15 ثانية.
  4. لإنهاء الحقن، حافظ على ضغط الحقن حتى تتم إزالة الإبرة بالكامل من عملية التصلب إذا توقف الضغط قبل الأوان بينما لا تزال الإبرة في الفضاء تحت الشبكية ، فيمكن لجزء كبير من الحمولة المحقونة الخروج بسرعة من العين مرة أخرى إلى الإبرة عن طريق العمل الشعري.
  5. بمجرد سحب الإبرة ، لاحظ ارتجاعا جزئيا للمحلول المحقون من خلال موقع التصلب هذا متوقع ، بالنظر إلى أن حجم 1 ميكرولتر يتجاوز سعة الفضاء تحت الشبكية حتى في الفئران البالغة. قد يشير عدم وجود الارتجاع إلى فشل الحقن بسبب الولادة المشيمية أو داخل الجسم الزجاجي غير المقصودة.
  6. قم بإزالة ملقط القفل ومنظار الجفن من العين. احرص على تجنب الضغط على الكرة الأرضية ، لأنه قد يتسبب في مزيد من ارتجاع المحلول المحقون.
  7. بعد الحقن مباشرة ، ضع مرهما وفير للعين على العين للسماح بتصور الفقاعة تحت الشبكية بحلول14 أكتوبر.
  8. ضع مرهم الإريثروميسين الموضعي على العين وقدم رعاية عامة بعد الجراحة للحيوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يولد الحقن الناجح باستخدام هذه التقنية عبر الصلبة فقاعة تحت الشبكية يمكن ملاحظتها في OCT مباشرة بعد إجراء الحقن (الشكل 2 أ). نظرا للتحدي التقني لهذه التقنية ، فإن خطوة التصوير لا غنى عنها لتحديد المحقونة بنجاح. بالنسبة للباحثين الذين يخططون لاستخدام هذه التقنية في تجارب العلاج الجيني ، نوصي بإجراء حقن تدريبية بجزيئات الفيروس المرتبط بالغدة (AAV) التي تحمل جين مراسل الفلورسنت. تحقق جزيئات AAV التي يتم تسليمها باستخدام هذه التقنية مساحة نقل كبيرة جدا من RPE (الشكل 2 ب)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم التقنية الموضحة هنا العديد من التحسينات على نهج الحقن عبر الصلبةالموصوف سابقا 4 ، مما يعزز موثوقية الإجراء ويقلل من الضرر الجراحي للعين. أحد هذه التحسينات هو استخدام منظار لسحب الجفن العلوي ، مما يسمح بالوصول المستقر وغير المقيد وبدون استخدام اليدين. غالبا ما تكون المنظار التجاري ضعيفة التحسين ، حتى بالنسبة للفئران البالغة ، وغير متوفرة تماما للأحداث. للتغلب على هذه العقبة ، قمنا بتصميم specula حسب الطلب (الشكل 1C) ، والذي نقوم ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جون فلانيري (جامعة كاليفورنيا ، بيركلي) لتزويدنا بفيروس AAV1-Best1-GFP. التمويل المستلم: المعاهد الوطنية للصحة R01 EY031748 (CBR) ، المعاهد الوطنية للصحة P30 EY005722 (إلى جامعة ديوك) ؛ جائزة FFB Free Family AMD (CBR) ؛ منحة غير مقيدة من أبحاث لمنع العمى (مركز ديوك للعيون) ؛ برنامج تسريع البحوث الانتقالية FFB TA-GT-0424-0875-DUKE-TRAP (VA) ، NIH K08 EY033857 (OA) ؛ جائزة البداية القوية للطبيب والعالم بجامعة ديوك (OA).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.9٪ حقن كلوريد الصوديوم ، USPهوسبيراPAA130066
1٪ محلول كبريتات الأتروبين للعيون ، USPأكورنمؤتمر الحوار الوطني 17478-215-05
30° سكين الماسكاتيناك 2-6560
AmScope 6W LED إضاءة مزدوجة معقوفةأمسكوبليد-11 سي آر
مقص بزاوية فاناسروبوزآر إس-5618
محلول الري المعقم BSSالكون289010-0902
قطرات العين الموسعة سيكلوميدريلالكون0065-0359-020.2٪ سيكلوبنتولات ، 1٪ فينيل إيفرين
أطراف ماصة epT.I.P.S. اللودر الصغيرTMإيبندورف5242 956.003
حاقن دقيق فيمتو جيت 4iإيبندورفE5252000021المنتج المتوقفة
مرهم العين المزلق GenTeal Tearsالكون16027802
إبر الحقن المجهري الزجاجيكلونبري العلميةب 100-58-5030° شطبه. قطر الدائرة: 50 & م خارجي ، 29 & م داخلي
محلول الأيزوفلورانكوفيتروس29405
مجهر تصوير الشبكية MICRON IV مع OCT الموجه بالصورفينكسغير متاح
المجهر المجسم SteREO Discovery.V8زييس495015-0001-000
ستيرن-كاستروفيجو قفل الملقط المسننكاتيناك 5-2552
ملقط مسننروبوزآر إس-5172
أسلاك تنظيف التنغستن لإبر قياس 23 ثانيةهاملتون18306
Ultracell PVA العين الرماحجزر فيرجن البريطانية الطبية40400-8
محاقن الأنسولين Ultra-Fine2015  دينار بحريني3284383/10 مل ، 8 مم (5/16 بوصة) ، 31 جيجا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trapani, I., Banfi, S., Simonelli, F., Surace, E. M., Auricchio, A. Gene therapy of inherited retinal degenerations: prospects and challenges. Hum Gene Ther. 26, 193-200 (2015).
  2. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Res. 58, 217-226 (2017).
  3. Simunovic, M. P., Xue, K., Jolly, J. K., MacLaren, R. E. Structural and Functional Recovery Following Limited Iatrogenic Macular Detachment for Retinal Gene Therapy. JAMA Ophthalmol. 135, 234-241 (2017).
  4. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J Vis Exp. (118), e54808(2016).
  5. Testa, F., et al. Three-year follow-up after unilateral subretinal delivery of adeno-associated virus in patients with Leber congenital Amaurosis type 2. Ophthalmology. 120, 1283-1291 (2013).
  6. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Hum Genet. 135, 327-343 (2016).
  7. Bennett, J., Anand, V., Acland, G. M., Maguire, A. M. Cross-species comparison of in vivo reporter gene expression after recombinant adeno-associated virus-mediated retinal transduction. Methods Enzymol. 316, 777-789 (2000).
  8. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  9. Hejri, A., et al. A non-surgical method for subretinal delivery by trans-scleral microneedle injection. Bioeng Transl Med. 10 (3), e10755(2025).
  10. Sastry, A., et al. Microscope-Integrated OCT-Guided Volumetric Measurements of Subretinal Blebs Created by a Suprachoroidal Approach. Transl Vis Sci Technol. 10, 24(2021).
  11. Blanc, V. F., Jacob, J. L., Milot, J., Cyrenne, L. The oculorespiratory reflex revisited. Can J Anaesth. 35, 468-472 (1988).
  12. Dewar, K. M. The oculocardiac reflex. Proc R Soc Med. 69, 373-374 (1976).
  13. Katzung, B. G. Basic & clinical pharmacology. , 9th ed, Lange Medical Books/McGraw Hill. New York, USA. (2004).
  14. Mai, X., Huang, S., Chen, W., Ng, T. K., Chen, H. Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy. J Vis Exp. (179), e63421(2022).
  15. L'Abbate, D., Prescott, K., Geraghty, B., Kearns, V. R., Steel, D. H. W. Biomechanical considerations for optimising subretinal injections. Surv Ophthalmol. 69, 722-732 (2024).
  16. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nat Protoc. 17, 1468-1485 (2022).
  17. Stockslager, M. A., et al. Optical method for automated measurement of glass micropipette tip geometry. Precis Eng. 46, 88-95 (2016).
  18. Li, Q., Rycaj, K., Chen, X., Tang, D. G. Cancer stem cells and cell size: A causal link. Semin Cancer Biol. 35, 191-199 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AAV

مقالات ذات صلة