Method Article

الفحص المجهري متعدد التوافقات التوافقي المتزامن الخالي من الملصقات

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول دليلا تفصيليا للتقنية المجهرية متعددة التوافقيات الخالية من الملصقات (SLAM) المتزامنة ، بما في ذلك تفاصيل حول كيفية توليد مصدر ضوء الليزر ، وإعداد عينة من الأنسجة ، وإجراء التصوير ، وتحليل البيانات. تقدم SLAM الفحص المجهري غير الخطي عن طريق قياس أربعة تباينات تكميلية خالية من الملصقات للتحقيق في البيئة المكروية للأنسجة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصور الفحص المجهري البصري غير الخطي عينات بيولوجية عن طريق الكشف عن الإشارات من التفاعل غير الخطي لنبضات الليزر فائقة القصر مع الجزيئات الداخلية. تسمح هذه الطريقة بتحديد كيميائي وهيكلي سريع بدقة تحت الخلوية بطريقة خالية من العلامات وغير مدمرة ، مما يتيح نهجا قويا للتحقيق في الخلايا والأنسجة. تشمل هذه التباينات غير الخطية المميزة التألق الذاتي المتحمس للفوتون المتعدد والتوليد التوافقي. نظرا لأن كل من هذه التباينات تقدم مزايا وقيودا فريدة ، فإن مزيجها وتسجيلها المشترك في الزمانية المكانية يوفر لوحة تباين تكميلية تعزز القدرات التحليلية للفحص المجهري البصري غير الخطي. لذلك ، طورت مجموعتنا الفحص المجهري متعدد التوافقيات (SLAM) الخالي من الملصقات ، وهي تقنية تصوير تقيس أربع إشارات بصرية غير خطية يتم إنشاؤها بشكل متزامن أو أكثر ، بهدف تحديد السمات المورفولوجية والتمثيل الغذائي والوظيفية المتميزة في العينات البيولوجية. هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير SLAM للأنسجة ، مع التركيز على المكونات الأساسية للتقنية ، بما في ذلك مصدر الليزر وضغط النبض والمجهر. بالإضافة إلى ذلك، نناقش إعداد العينة ونحدد خط أنابيب معالجة البيانات لبيانات SLAM. سير العمل المقدم مناسب للتحقيق في حالة التمثيل الغذائي والترتيب والاستجابات الخلوية وتكوين كل من الأنسجة البشرية والحيوانية دون الاعتماد على الملصقات الخارجية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستفيد الفحص المجهري البصري غير الخطي من استجابة العينة للإشعاع البصري المكثف (الضوء مع المجالات الكهربائية أكبر من 3 × 103 فولت / سم) لاشتقاق تباين الصورة ، حيث يعتمد الاستقطاب المستحث (وبالتالي الإشارة المتولدة) بشكل غير خطي على شدة الحادث1،2،3. نظرا لأن هذه التناقضات المتعددة يتم بوساطة كل منها من خلال تفاعلات مختلفة بين الضوء والمادة ، فإن الفحص المجهري غير الخطي يوفر وصولا متزامنا إلى معلومات فريدة فيما يتعلق بكل من التشكل والمشهد الكيميائي للعينة1،2،3. في حين أن تقنيات الفحص المجهري التقليدية التي تنطوي على تفاعل خطي مع ضوء الإضاءة تتيح أيضا التصوير الكمي ، فإن الفحص المجهري غير الخطي يسمح بنهج متعدد الوسائط ، وغالبا ما يكون له عمق تصوير محسن وتقسيم بصري ، بينما يتسبب أيضا في تلف ضوئي أقل للعينة4. في سياق التطبيقات الطبية الحيوية ، مثل التقييم الشبيه بالأنسجة أثناء الجراحةللأنسجة 5،6 ، تتيح هذه التقنية التحقيق المباشر للجزيئات الحيوية الأصلية ، مما يسهل التحقيقات السلسة للخلايا الحية دون الحاجة إلى علامات أو تعديلات خارجية. يتجنب هذا النهج استخدام العلامات ، أو الملصقات7 ، أو الجزيئات الخارجية ، أو البروتينات الفلورية المعبر عنها وراثيا ، أو الجسيمات النانوية ، والتي لا تتطلب عملا مكثفا فحسب ، بل لديها أيضا القدرة على تعطيل الكيمياء الحيوية الأصلية للعينة والتأثير سلبا على الخلايا أو الأنسجة المستهدفة8،9،10. وبالتالي ، يعمل المجهر غير الخطي كأداة تحليلية قوية وحقيقية توفر تصويرا مستمرا للهياكل المجهرية دون تغيير السلامة الكيميائية والهيكلية للعينة. تفتح هذه القدرة مجموعة واسعة من التطبيقات ، بدءا من التشخيص واكتشاف الأدوية إلى إشارات الخلايا وبيولوجيا الأنظمة.

تمنح التباينات متعددة الفوتون مثل التألق الذاتي ثنائي الفوتون (2PAF) ، والتألق الذاتي ثلاثي الفوتون (3PAF) ، والجيل التوافقي الثاني (SHG) ، والجيل التوافقي الثالث (THG) مزايا تحليلية في توصيف العينات. يتم إنشاء 2PAF بواسطة مركبات الفلافين الذاتية ، مع كون فلافين أدينوزين ثنائي النوكليوتيد (FAD) هو الأكثر وفرة في الأنظمةالبيولوجية 11. يستفيد 3PAF من الإثارة القريبة من الأشعة تحت الحمراء لتصور الكروموفورات الجوهرية مثل NAD (P) H وتمكن من التصوير الأيضي مع التحايل على السمية الضوئية المرتبطة بالأشعة فوق البنفسجية ومشكلات التوهين12. يكشف SHG على وجه التحديد عن الهياكل الجزيئية غير المتماثلة المركزية مثل الكولاجين الليفي (الأنواع الأول والثاني والثالث) ومصفوفات البروتين13،14،15،16،17 ، مما يوفر رؤىهيكلية 1. أخيرا ، يتفوق THG ، الحساس للواجهات والميزات الهيكلية الصغيرة ، في تصوير توزيعات الدهون والحويصلات خارج الخلية18،19،20،21،22.

تم استكشاف كل من إشارات التباين هذه بشكل مستقل من قبل مجموعات البحث ، مما أدى إلى إنشاء مكانة للفحص المجهري غير الخطي متعدد الفوتون كأداة موثوقة ومتعددة الاستخدامات للتطبيقاتالبيولوجية 23،24،25،26. قاد هذه الجهود مخترعو مجهر 2PAF ، الذين سخروا تقنيتهم المبتكرة لعمل رؤى جديدة حول مورفولوجيا الأنسجة ، واستقلاب الخلايا ، وحتى السمات الوظيفية للأمراض مثل مرض الزهايمر والسرطان23. أدى عملهم في النهاية إلى تطبيقات رائدة في علم الأعصاب27،28. في السنوات التالية ، سلط العديد من الباحثين الضوء على حساسية SHG للتغيرات في المصفوفة خارج الخلية ، السقالة التي توفر الدعم الهيكلي للخلايا والتي تخضع لتغييرات كبيرة أثناء التسبب في السرطان29. والجدير بالذكر أن Campagnola et al.14،24،30،31 أظهر أن الفحص المجهري SHG يتيح تصور التجميعات الجزيئية وفوق الجزيئية ، مما يكشف عن تفاصيل مثل ترتيب وتركيز ونوع الكولاجين التي لا يمكن اكتشافها باستخدام التقنيات التقليدية القائمة على التألق. أكدت هذه النتائج إمكانات الفحص المجهري SHG كأداة تشخيص قابلة للتطبيق في البيئات السريرية. أخيرا ، تم تطبيق الفحص المجهري THG بنجاح لتصور طبقات الشبكية في القوارض بدقة تحت الخلوية25 ، ورسم خرائط لهياكل الدماغ32 ، والتقاط التضاريس متعددة الجوانب لغزو خلايا الورم الميلانيني33.

تضمنت هذه التطبيقات التاريخية للفحص المجهري غير الخطي عموما ليزر فيمتو ثانية (fs) مقترنا بهدف فتحة عددية عالية (NA) لتوليد وتجميع الإشارات غير الخطية ، والتي تم توجيهها بعد ذلك باستخدام مرآة ثنائية اللون إلى مرشح ممر النطاق وتم جمعها باستخدام أنبوب مضاعف ضوئي (PMT) 34. على الرغم من التطبيقات المماثلة ، ركزت معظم التطبيقات على الحصول على تباين واحد فقط ، أو على الأكثر ، مع التغاضي عن الآخرين. لتحقيق إمكانات المجهر متعدد الفوتون بشكل كامل ، Boppart et al. نفذ أولا الاستحواذ المتسلسل على التباينات غير الخطيةالمتعددة 21،35،36،37 ، متبوعا بكتشوفها المتزامن4،22،38،39،40،41. تعمل التقنية الناتجة ، والمعروفة باسم الفحص المجهري متعدد التوافقيات الخالية من الملصقات (SLAM) ، في تسجيل إشارات 2PAF و 3PAF و SHG و THG غير الخطية مكانيا وزمانيا من خلال الإثارة أحادية اللقطة واكتشاف تعدد الإرسال ، وبالتالي تحقيق قوة تحليلية فائقة. يوفر التوطين المشترك الزماني المكاني لهذه القنوات الأربع بيانات عالية التصنيف وغنيةبالميزات 42 مما يوفر مزايا على البيانات المكتسبة بالتسلسل من خلال التخلص من القطع الأثرية للحركة وضمان تسجيل الصور المحسن. وبالتالي ، يتيح SLAM توليد الميزات المركبة ، مثل نسب الأكسدة البصرية للاختزال ، والتي تميز بشكل فعال خصائص التمثيل الغذائي43،44،45. علاوة على ذلك ، فإن التحليل المشترك للإشارات عبر الطرائق يسهل هندسة ميزات إضافية بناء على ارتباط القنوات وتحديد موقعها. على سبيل المثال ، شي وآخرون أظهر أهمية ميزات التوطين في الفحص المجهري SLAM في التصنيف الدقيق لخلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) المستخدمة في إنتاج الأدوية42. وبهذه الطريقة ، يضع SLAM الأساس لما يعتبر الآن أحدث ما توصلت إليه التكنولوجيا في الفحص المجهري متعدد الفوتون ، مما يمهد الطريق للتطورات المستقبلية في هذاالمجال 46.

في هذا البروتوكول ، نحدد المكونات الرئيسية لمجهر SLAM (الشكل 1) ونصف منهجية خطوة بخطوة لتنفيذه. يتضمن ذلك توليد وتشكيل نبضات الإثارة ، وإعداد عينة الأنسجة التمثيلية ، وإجراءات التصوير ، والمعالجة ، بالإضافة إلى عرض البيانات الناتجة. من خلال استخدام التكنولوجيا الجاهزة والتقنيات المعمول بها ، يكون هذا البروتوكول عالميا وقابلا للتحويل ويمكن إعادة إنتاجه بسهولة باستخدام أنظمة بصرية مماثلة عبر مختبرات مختلفة.

figure-introduction-1
الشكل 1: التصميم البصري لمجهر متعدد التوافقيات (SLAM) متزامن خال من الملصقات. يخرج ليزر الفيمتو ثانية ضوءا 1040 نانومتر في نبضة 370 fs بمعدل تكرار 10 ميجاهرتز. يتم التحكم في شدة واستقطاب الليزر بعناية قبل ضخ بلورة فوتونية لتوليد استمرارية فائقة. ثم يتم ضغط النبضات بواسطة مشكل نبضي وتوجيهها إلى مجهر مسح ليزر مخصص (صندوق متقطع). تعزل المرايا ثنائية اللون ومرشحات مرور النطاق الإشارات غير الخطية الناتجة عن العينة قبل اكتشافها بواسطة كاشفات الفوتون عالية الحساسية مثل أنابيب المضاعف الضوئي (PMTs) أو أجهزة الكشف الضوئي الهجينة (HPDs). يعتمد التصميم البصري على نظام موصوفسابقا 41. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع الدراسات التي أجريت على وفقا للبروتوكول UIUC # 23031 المعتمد من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي بجامعة إلينوي واتبعت بدقة جميع الإرشادات واللوائح ذات الصلة.

1. شق ومحاذاة الألياف البلورية الضوئية (PCF)

  1. باستخدام قواطع الألياف أو قواطع الأسلاك ، قم بقص قسم من الألياف البلورية الضوئية (PCF ، جدول المواد) بطول يزيد قليلا عن 15 سم.
    ملاحظة: سيتم شق أطوال لا تقل عن 1.5 سم من كل طرف من طرفي PCF لأن هذا الطول مطلوب لتثبيت PCF بإحكام أثناء الانقسام. تم تحديد الطول النهائي ل PCF (12 سم) المستخدم في هذه الدراسة بناء على محاكاة سابقة باستخدام معادلة شرودنجر غير الخطيةالمعممة 47 والاختبار التجريبي. بشكل عام ، قد يختلف أفضل طول ل PCF اعتمادا على نوع PCF ومدخلات ليزر المضخة والاستمرارية الفائقة المطلوبة.
    تنبيه: أثناء قطع PCF ، ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) لحماية عيون المجرب وجلده. تخلص على الفور من قصاصات الألياف في حاوية التخلص من الأدوات الحادة.
  2. قم بإزالة حوالي 3 سم من الطلاء البلاستيكي من كل طرف من طرفي PCF باستخدام أداة إزالة الألياف (جدول المواد) أو شفرة الحلاقة ، وقم بتنظيف أي بلاستيك متبقي بالمناديل الورقية (جدول المواد) والميثانول بنسبة 100٪.
  3. ضع أحد طرفي PCF في الحامل على ساطور ألياف ضوئية دقيق (جدول المواد) وقم بمحاذاة الشفرة على بعد 1.5 سم من نهاية PCF. أغلق المشابك بعناية واضغط على زر الشق .
    ملاحظة: اتبع بعناية دليل المستخدم الخاص بساطور الألياف ، بما في ذلك إرشادات محددة لشق PCFs. قد تتطلب الإعدادات ، مثل توتر الألياف ، ضبطا دقيقا للحصول على شقوق متسقة وعالية الجودة لكل نوع من أنواع PCF.
  4. افحص الوجه والجانب المشقوق من PCF باستخدام المجهر المدمج (تكبير 10×) على محطة عمل معالجة الألياف الزجاجية (جدول المواد) ، للتأكد من أن الشق ذو نوعية جيدة (الأشكال 2 أ ، ج). أعد الشق إذا كان هناك حطام (الشكل 2 د) أو خدوش (الشكل 2 ه) أو لم يكن السطح المشقوق مسطحا وعموديا على طول PCF (الشكل 2 ب).
    ملاحظة: يجب توخي الحذر الشديد في هذه الخطوة والخطوات اللاحقة لتجنب لمس الأطراف المشقوقة من PCF على أي سطح لتجنب التسبب في تلف.
  5. اقطع الطرف الثاني من PCF ، مع ضمان الطول النهائي المطلوب.
    ملاحظة: يتم قطع PCF المستخدم في هذا البروتوكول إلى 12 سم.
  6. كما هو الحال مع الخطوات السابقة ، افحص الطرف المشقوق حديثا ل PCF (راجع الخطوة 1.4). إذا بدا الشق معيبا أو غير متسق ، فتخلص من PCF الحالي وكرر العملية بأخرى جديدة.
  7. قم بتثبيت طرف إدخال PCF على مرحلة ذات 3 محاور (جدول المواد) عند البعد البؤري تقريبا لعدسة اقتران الألياف كما تم قياسها باستخدام المسطرة. ادعم الطرف الآخر من PCF بشكل آمن بعمود مؤقت أو حامل.
    ملاحظة: لا تقم بتثبيت الإخراج بعد لتجنب كسر PCF أثناء الضبط الإجمالي.
    تنبيه: يعد دعم طرف الإخراج وإحاطته بكتل شعاع كافية أمرا ضروريا لتقليل مخاطر التعرض لليزر.
  8. ضع مقياس الطاقة الضوئية (جدول المواد) في مسار الحزمة قبل PCF مباشرة لقياس طاقة الإدخال. تأكد من حظر ليزر الفيمتو ثانية (جدول المواد) بواسطة الغالق 1 قبل تشغيل الليزر.
    ملاحظة: أكمل دائما أي برامج تدريبية مطلوبة على سلامة الليزر لفهم المخاطر المرتبطة باستخدام الليزر.
    تنبيه: عند تشغيل الليزر ، ارتد نظارات أمان ليزر مناسبة مصنفة خصيصا للطول الموجي وقوة الليزر المستخدم. قبل تشغيل الليزر ، قم بإزالة جميع المجوهرات والساعات والعناصر العاكسة الأخرى التي يمكن أن تسبب انعكاسات شاردة خطيرة.
  9. قم بتشغيل الليزر واتركه يسخن لمدة "وقت الإحماء البارد" المحدد لليزر. افتح الغالق 1 واضبط الطاقة باستخدام لوحة نصف الموجة (HWP1) قبل فاصل الشعاع المستقطب مباشرة حتى يقرأ مقياس الطاقة 260 ميجاوات أو أقل.
    ملاحظة: تم تحديد استخدام 260 ميجاوات للمحاذاة تجريبيا على أنه منخفض بما يكفي لتجنب إتلاف PCF (حتى أثناء المحاذاة غير الصحيحة) مع الاستمرار في توفير شعاع ساطع للتصور على عارض الأشعة تحت الحمراء أو هدف الفلورسنت.
  10. قم بحظر الليزر باستخدام الغالق 1 وحرك عداد الطاقة إلى نهاية إخراج PCF.
  11. قم بإلغاء حظر الليزر واضبط المحور البصري لوجه إدخال PCF باستخدام المرحلة ثلاثية المحاور حتى تظهر الإشارة على عداد الطاقة ، مما يشير إلى أن بعض الضوء مقترن باللب أو الكسوة أو الطلاء البلاستيكي ل PCF. إذا كان وضع مدخلات PCF في بؤرة الحزمة يتجاوز نطاق المرحلة ثلاثية المحاور ، فقم بحظر الليزر ، ثم اضبط PCF وأعد تثبيته.
    ملاحظة: يمكن استخدام عارض الأشعة تحت الحمراء (IR) أو هدف الفلورسنت لتصور مكان تركيز الحزمة.
  12. باستخدام المرحلة ذات 3 محاور ، اضبط بعدا واحدا للمحور البصري ل PCF للعثور على النطاق الذي يقترن به الضوء ، واحسب منتصف هذا النطاق ، وحرك المرحلة هناك. كرر هذا للبعد الثاني لتوسيط الحزمة تقريبا على قلب PCF.
    ملاحظة: يمكن أن تساعد علامات التجزئة μm على المرحلة ثلاثية المحاور في قياس المسافات والعثور على مركز PCF.
  13. اضبط بشكل متكرر الأبعاد الثلاثة للمرحلة ثلاثية المحاور في تسلسل متكرر مع تحسين كفاءة الاقتران لتوسيط الحزمة وتركيزها بدقة في قلب PCF.
    ملاحظة: إذا كانت الحد الأقصى لكفاءة الاقتران ، كما تم قياسه بواسطة عداد الطاقة ، أقل بشكل ملحوظ من 80٪ من مصراع إغلاق طاقة الإدخال 1 ، فقم بفك PCF وفحصه بحثا عن التلف. في حالة تلفها ، أعد التشغيل من الخطوة 1.1 ، وإلا ، قم بحظر الليزر ، وأعد تثبيت PCF وأعد تشغيل المحاذاة من الخطوة 1.11.
  14. قم بحظر الشعاع باستخدام الغالق 1 وقم بزيادة طاقة الليزر إلى 1.6 واط.
    ملاحظة: تم تحديد استخدام 1.6 واط من خلال المحاكاة والاختبار التجريبي لتوليد استمرارية فائقة واسعة بما فيه الكفاية ، مع البقاء تحت عتبة الضرر في PCF.
  15. افتح الغالق 1 واضبط مرة أخرى المرحلة ثلاثية المحاور بشكل متكرر لضبط موقع إدخال PCF لتحسين كفاءة التوصيل.
    ملاحظة: من الناحية التجريبية ، عادة ما تكون الكفاءة القصوى حوالي 80٪.
  16. أغلق الغالق 1 وقم بتثبيت إخراج PCF عند البعد البؤري للمرآة المكافئة تقريبا. ضع كتلة شعاع عند إخراج المرآة المكافئة.
  17. قلل طاقة الليزر مرة أخرى إلى 260 ميجاوات أو أقل.
  18. افتح الغالق 1 واستخدم مرحلة المرآة المكافئة المكونة من 3 محاور لمحاذاة المحور البصري للمرآة المكافئة لتقليل تشويه الحزمة. بعد ذلك ، اضبط التركيز وقم بموازاة الشعاع في المجال البعيد.
    ملاحظة: استخدم عارض الأشعة تحت الحمراء أو هدف الفلورسنت لعرض شعاع الإخراج.
  19. اضبط المرايا بعد المرآة المكافئة لضمان محاذاة الشعاع مع بقية النظام البصري.
    ملاحظة: قم بتثبيت أهداف محاذاة الوجه الدائمة أو قزحية العين لجعل هذه الخطوة قابلة للتكرار.
  20. أغلق الغالق 1 وقم بزيادة طاقة الليزر إلى 1.6 واط. افتح الغالق 1 وتحقق من أن مسار الشعاع لم يتغير.
  21. قم بقياس طاقة خرج مشكل النبض (جدول المواد) باستخدام مقياس الطاقة. قم بتدوير لوحة نصف الموجة أمام مشكل النبض (HWP3) لتحسين كفاءة نقل مشكل النبض.

figure-protocol-1
الشكل 2: نهايات مشقوقة للألياف البلورية الضوئية (PCF). (أ ، ب) صور من جانب الشقوق. (C-F) صور لوجه الشقوق. (أ) PCF المشقوق جيدا له وجه مسطح وعمودي. (ب) PCF ضعيف الشق مع وجه مائل ومتشقق. (ج) PCF مشقوق جيدا بوجه نظيف. (د) PCF الذي أسيء التعامل معه وبه أوساخ على سطحه. (ه) PCF ضعيف الشقوق مع خدوش على سطحه. (و) PCF قديم تم استبداله. هناك تلف مرئي في قلب PCF كما هو موضح من البقعة المظلمة في وسط PCF. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. توصيف النبض وتحسينه

  1. باستخدام مقياس الطيف أو محلل الطيف البصري (OSA ، جدول المواد) ، قم بقياس الليزر بعد المرآة المكافئة للتحقق من توليد الاستمرارية الفائقة ل PCF.
  2. قم بتدوير لوحة نصف الموجة بعد مقسم الحزمة المستقطبة (HWP2) لتحسين عرض الاستمرارية الفائقة.
  3. قم بتشغيل الارتباط التلقائي للفحص المجهري (جدول المواد). باستخدام البرنامج ، اضبط الكاشف على الكاشف الداخلي واضبط نطاق المسح على 5 ps لضمان التقاط العرض الكامل للارتباط التلقائي للنبض.
    ملاحظة: بالنسبة للإعدادات ذات عرض النبضة الأطول (على سبيل المثال، بسبب التشتت في PCF طويل)، يجب زيادة نطاق المسح بشكل مناسب. ضع في اعتبارك أن عرض النبضة المقاس بواسطة الارتباط التلقائي للشدة ليس هو مدة النبضة الحقيقية ، ولكن لا يزال من الممكن أن يكون بمثابة مرجع مفيد لضغط النبض. من أجل التوصيف الدقيق والكامل لكل من اتساع النبضة والطور ، يجب استخدام تقنيات محلولها طيفيا مثل البوابات البصرية المحللة بالتردد (FROG)48 .
  4. قم بإلغاء حظر الليزر ومحاذاة الارتباط التلقائي مع الحزمة الخارجة من مشكل النبض حتى تظهر إشارة.
    ملاحظة: سيؤدي وضع مرايا مؤقتة (اثنتان عند الإدخال واثنتان عند خرج الارتباط التلقائي) إلى تمكين محاذاة الحزمة مع الارتباط التلقائي دون التأثير على بقية النظام البصري.
  5. تأكد من إغلاق الغالق 2 وقم بتطبيق وسائط الغمر المناسبة (مثل الماء أو الزيت) على العدسة الموضوعية (جدول المواد). ضع الكاشف الخارجي للارتباط التلقائي على مرحلة المجهر (جدول المواد) واضبط المرحلة لوضع الكاشف فوق الهدف مباشرة.
    ملاحظة: على عكس أهداف المجهر النموذجية ، فإن الأهداف الموصى بها المستخدمة في الفحص المجهري SLAM هي الأشعة فوق البنفسجية الناقلة لتحسين اكتشاف THG38.
  6. قم بتشغيل مرايا الجلفانومتر المسح الضوئي (جدول المواد) لضبط جهدها على الصفر. افتح الغالق واستخدم عارض الأشعة تحت الحمراء أو هدف الفلورسنت للتحقق من وصول الشعاع إلى الكاشف الخارجي.
  7. اضبط كاشف الارتباط التلقائي ليكون الكاشف الخارجي. اضبط موضع المرحلة حتى تظهر الإشارة.
    ملاحظة: إذا كان الكاشف مشبعا ، فقم بخفض الطاقة باستخدام مرشح الكثافة المحايدة.
  8. اضبط المعاملات كثيرة الحدود (أوامر التشتت) لآلة تشكيل النبض لتقليل عرض النبضة المقاس بواسطة الارتباط التلقائي بشكل متكرر. قم بتقليل نطاق مسح الارتباط التلقائي بشكل مناسب مع انخفاض عرض النبضة لتحسين الدقة وتصور وظيفة الارتباط التلقائي.
    ملاحظة: يجب أن يكون عرض النبضة الأمثل كما تم قياسه بملاءمة غاوسية بضع عشرات من الفيمتو ثانية (fs).

3. تحضير العينة

ملاحظة: من أجل البساطة ، يصف هذا البروتوكول تصوير الأنسجة خارج الجسم الحي . ومع ذلك ، نظرا لطبيعة SLAM الخالية من الملصقات ، يمكن تكييف إجراءات التصوير في الجسم الحي بسهولة38.

  1. قتل عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون2 أو أي طريقة أخرى للقتل الرحيم المعتمدة من IACUC.
  2. احصد الأعضاء (الأعضاء) ذات الأهمية باستخدام إجراء التشريحالقياسي 49 في غضون 10 دقائق بعد الوفاة واشطفها بمحلول ملحي مبرد مسبقا بفوسفات (PBS) لإزالة الدم.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم حصاد الكبد والرئتين.
  3. قم بتشريح العضو عموديا أو أفقيا باستخدام شفرة ، اعتمادا على الاتجاه المطلوب للتحليل. تأكد من إجراء التشريح بدقة للحفاظ على سلامة بنية الأنسجة.
  4. ضع قطعة الأنسجة في طبق مزرعة أنسجة معقم مليء بوسط زراعة الخلايا الكامل الخالي من الفينول باللون الأحمر. قم بتبريد المناديل على حرارة 4 درجات مئوية إذا لم يتم جمع الصور على الفور.
    ملاحظة: كانت وسائط زراعة الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة هي HEPES Buffered-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) المكملة بمصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و 4 ملي مولار من الجلوتامين ، ومكملات وسط نمو الخلايا البطانية (جدول المواد). تم اختيار هذه الوسائط بعناية للحفاظ على الجدوى الفسيولوجية للخلايا الظهارية والبطانية الموجودة في عينة الأنسجة الكلوية خلال مدة التصوير50.
  5. لإعداد معايير معايرة التألق ، قم بتصفير مقياس دقيق لوزن قارب وزن مضاد للكهرباء الساكنة وقياس ما يقرب من 5 مجم من ملح ثنائي الصوديوم ثنائي الصوديوم بالأدينين الأدينين ( FAD ، جدول المواد) أو 5 مجم من ملح ثنائي الصوديوم ثنائي النوكليوتيد من النيكوتيناميد الأدينين المختزل (NADH ، جدول المواد).
  6. استخدم ماصة أحادية القناة لتوزيع حجم مناسب من عازلة HEPES بطول 1 متر في قوارب الوزن التي تحتوي على مساحيق FAD أو NADH موزونة مسبقا لتحضير محاليل مخزون 5 ملليمتر. الماصة لأعلى ولأسفل بشكل متكرر لإذابة المسحوق.
  7. قم بإعداد حلول عمل 1 ملي مولار من محاليل المخزون بمقدار التخفيف بنسبة 1: 5 في المخزن المؤقت HEPES.
    ملاحظة: تم تحديد تركيز العمل 1 ملي مولار المستخدم في هذه الدراسة تجريبيا لإنتاج إشارة عالية مع تجنب تشبع الكاشف.
  8. قم بتخزين حلول FAD و NADH في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين معايير المحلول في الثلاجة لعدة أيام ، ولكن يوصى بإعداد حلول جديدة لكل تجربة.
  9. قبل جمع صور الفحص المجهري SLAM مباشرة ، ضع عينات الأنسجة في أطباق تصوير ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم (جدول المواد). بدلا من ذلك ، استخدم غطاء زجاجي. قم بتقسيم حلول FAD و NADH في أطباق أو أغطية متطابقة.
    ملاحظة: يوصى بشدة باستخدام الزجاج غير المطلي أو الزجاج المطلي ب poly-D-lysine بسبب انخفاض إشارة الخلفية. تأكد من أن سمك الزجاج مناسب لهدف المجهر المستخدم (استخدمت هذه الدراسة # 0).

4. إعداد وتشغيل SLAM

  1. تحقق من حظر إدخال الليزر إلى PCF بواسطة الغالق 1 وقم بتشغيل الليزر. دع الليزر يسخن لمدة "وقت الإحماء البارد" المحدد لليزر.
    ملاحظة: يتم استخدام وقت الإحماء البارد لمدة 30 دقيقة لليزر في هذه الدراسة.
  2. تحقق من أن مسار الحزمة خال من العوائق وضع مقياس طاقة ضوئية في مسار الحزمة قبل PCF مباشرة. افتح الغالق 1 وقم بقياس طاقة الإدخال.
  3. أغلق الغالق 1 وحرك عداد الطاقة إلى خرج PCF بعد المرآة المكافئة. افتح الغالق 1 وقم بزيادة إخراج PCF إلى أقصى حد باستخدام مرحلة الإدخال ثلاثية المحاور.
  4. دع PCF يسخن لمدة 10 دقائق ، ثم قم بزيادة طاقة الخرج مرة أخرى. سجل انتقال PCF. إذا انخفض ناقل الحركة إلى أقل من 50٪ ، فاستبدل PCF.
    ملاحظة: أثناء تشغيل مجهر SLAM (في الخطوات التالية) ، يوصى بقياس طاقة خرج PCF كل ساعة لضمان اتساق البيانات.
  5. حرك عداد الطاقة بعد مرشح الكثافة المحايدة (ND) وقم بتدوير المرشح للتحكم في طاقة الليزر التي تصل إلى العينة.
    ملاحظة: اضرب القدرة المقاسة في نفاذية المكونات البصرية المتبقية. يتم قياس النفاذية عن طريق وضع مقياس الطاقة بعد العدسة الموضوعية. في هذه الدراسة ، تم استخدام متوسط طاقة ليزر يبلغ 20 ميجاوات في العينة. تم تحديد قوة الليزر تجريبيا للعينة المحددة وعمق التصوير ونظام المجهر لإنشاء صور عالية الجودة مع تجنب تلف العينة أو عدم خطية الكاشف. على الرغم من عدم وجود معيار محدد ، إلا أن التصوير متعدد الفوتون النموذجي الخالي من الملصقات يقتصر على عدة عشرات إلى مئات الملي واط 7،32،33،51،52.
  6. قم بتشغيل الجلفانومتر والمرحلة. افتح برنامج الاستحواذ وأدخل المعلمات المطلوبة للتصوير.
    ملاحظة: استخدمت هذه الدراسة 512 × 512 بكسل ووقت سكون بكسل يبلغ 13.65 ميكرو ثانية لتصوير مجال رؤية 360 × 360 ميكرومترمربع. تم حساب متوسط خمسة إطارات تم التقاطها عند 0.333 هرتز في إطار واحد عالي الجودة.
  7. ضع العينة على المسرح باستخدام وسائط الغمر المناسبة للهدف كما تم استخدامه من قبل في الخطوة 2.5.
  8. أطفئ أضواء الغرفة وأغلق الستائر.
    ملاحظة: لتجنب إتلاف أجهزة الكشف ، لا تقم أبدا بتشغيل أضواء الغرفة أثناء تشغيل أجهزة الكشف أو فتح مصاريع الكاشف.
  9. قم بتشغيل مصادر الطاقة ومكبرات الصوت للكاشف.
  10. أغلق صندوق الإضاءة المحيط بالمسرح.
  11. استخدم مفاتيح التحكم الإلكترونية لفتح مصاريع الكاشف يدويا (S3 ، S4 ، S5 ، S6).
  12. في برنامج الحصول على المجهر، انقر فوق انقر لبدء الاستحواذ لبدء جمع صور SLAM. اضبط تركيز المجهر عن طريق تدوير المقبض الموجود على وحدة التحكم في مرحلة المجهر (جدول المواد) حتى يتم التركيز على العينة.
    ملاحظة: يولد الغطاء الزجاجي إشارة THG قوية، والتي يمكن استخدامها لتحديد عمق التصوير بدقة باستخدام موضع المسرح المعروض على وحدة التحكم في مرحلة المجهر. على سبيل المثال ، تم التقاط جميع صور معايير المحلول التي تم التقاطها في هذه الدراسة في مستوى بؤري 20 ميكرومتر فوق الغطاء.
  13. استخدم عصا التحكم في وحدة التحكم في مرحلة المجهر لتحديد مجال الرؤية المطلوب في العينة، ثم انقر فوق إيقاف وإعادة تعيين.
    ملاحظة: إذا كانت الصورة مشبعة، فارجع إلى الخطوة 4.5، وقم بخفض الطاقة. إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء أقل من 10 ، فقد تتم زيادة الطاقة بعناية بدلا من ذلك.
  14. ضمن علامة التبويب حفظ ، انقر فوق حفظ البيانات لتبديلها إلى نعم، ثم انقر فوق انقر لبدء الاكتساب. انتظر حتى ينتهي الاستحواذ قبل المتابعة.
  15. لتغيير العينة أو معالجتها أثناء التصوير ، أغلق مصاريع الكاشف واستخدم مصباحا يدويا أو كشرا أماميا للإضاءة. بمجرد تعديل العينة، ارجع إلى الخطوة 4.10.
    ملاحظة: لتمكين التكرار والتحليل الكمي، قم بتجميع صور SLAM لمعايير حل FAD وNADH. تأكد من أن مجال الرؤية وحجم الصورة وقوة الإثارة متوافقة مع ما تم استخدامه للعينات البيولوجية.
  16. لإنهاء الحصول على صورة SLAM ، أغلق مصاريع الكاشف ، وقم بإيقاف تشغيل أجهزة الكشف قبل تشغيل أضواء الغرفة.
  17. قم بحظر الليزر باستخدام الغالق 1 ، ثم قم بإيقاف تشغيل الليزر.
  18. قم بإيقاف تشغيل الجلفانومتر والمرحلة. أغلق برنامج الحصول على المجهر.
  19. تخلص من المناديل بشكل مناسب ونظف مكان العمل.

5. تصور البيانات

ملاحظة: قد يحدث تحليل الصور التالي في برنامج تحليل الصور مثل ImageJ53 (جدول المواد) أو لغة برمجة ذات إمكانات تحليل الصور ، مثل Python أو MATLAB. توضح الخطوات التالية كيفية إجراء مرئيات البيانات باستخدام ImageJ.

  1. تأكد من أن الصور من كل قناة بتنسيق صورة بدون فقدان البيانات (على سبيل المثال، TIFF أو PNG).
    ملاحظة: يقوم برنامج التحكم في المجهر المخصص المستخدم في هذه الدراسة بحفظ الصور تلقائيا كملفات TIFF. لحفظ صورة كملف TIFF، افتحها في ImageJ وحدد File > Save As > Tiff.
  2. لإنشاء صور قياسية للإضاءة ، افتح صور قناة FAD و NAD (P) H لحلول FAD و NADH ، على التوالي ، في ImageJ. لكل صورة، حدد Process > Filters > Gaussian Blur...، اضبط Sigma (Radius) على 41، ثم انقر فوق OK.
    ملاحظة: اضبط Sigma (نصف القطر) لمرشح Gaussian حسب الحاجة لتنعيم الصورة بشكل كاف.
  3. لتصحيح الإضاءة غير المتساوية في نفس الوقت وتطبيع شدة التألق ، افتح صور قناة FAD و NAD (P) H للعينة. لكل صورة، حدد Process > Image Calculator...، وبالنسبة إلى Image1 حدد نموذج الصورة، وبالنسبة للعملية حدد Divide، وبالنسبة إلى Image2، حدد صورة الإضاءة القياسية التي تتوافق مع قناة الصورة النموذجية، ثم انقر فوق OK.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتصحيح تقلب النظام والحفاظ على الاتساق في التقييمات الكمية للتألق الذاتي ، مثل نسبة الأكسدة والاختزال البصرية (ORR).
  4. إذا تم التقاط صور متعددة لتشكيل مجال رؤية أكبر أو مكدس z، فقم بدمج الصور معا أو دمجها في صورة واحدة أو مجموعة من الصور.
  5. لإنشاء صورة ORR ، قم أولا بجمع صور FAD و NAD (P) H. حدد Process > Image Calculator...، بالنسبة إلى Image1 وImage2، حدد صور قناة FAD وNAD(P)H على التوالي، بالنسبة للعملية حدد إضافة، ثم انقر فوق OK. لحساب صورة ORR ، حدد Process > Image Calculator ...، بالنسبة إلى Image1 حدد صورة قناة FAD ، وبالنسبة للعملية حدد Divide ، وبالنسبة إلى Image2 حدد نتيجة مجموع FAD و NAD (P) H ، ثم انقر فوق موافق.
  6. لتطبيق خريطة ألوان على صورة ORR، حدد Image > Color > Edit LUT...، انقر فوق Open، وحدد ملف جدول البحث المطلوب (.lut) وانقر فوق OK. حدد Image > Adjust > Brightness/Contrast واضبط التباين حسب الرغبة.
    ملاحظة: يوصى باستخدام خريطة ألوان متساوية مثل خريطة الألوان (المقلوبة) CET-I254,55 المستخدمة في هذه الدراسة. لعكس خريطة ألوان في ImageJ بعد تطبيقها على صورة، حدد Image > Color > Invert LUTs.
  7. لتحسين وضوح الميزات في صورة ORR ، قم بقياس السطوع حسب شدة قنوات التألق. أولا، حدد نتيجة مجموع FAD وNAD(P)H وحدد عملية > تحسين التباين...، وتأكد من تحديد التطبيع ، ثم انقر فوق موافق. حدد تحرير > نسخ لنسخ هذه النتيجة إلى الحافظة. بعد ذلك ، حدد صورة ORR وحدد Image > Type > RGB Color "، ثم حدد Image > Type > HSB (32 بت). حرك شريط التمرير الموجود أسفل الصورة بالكامل إلى اليمين لعرض قناة السطوع ، حدد تحرير > لصق، ثم حدد صورة > كتابة > ألوان RGB.
  8. لتصور صورة SLAM كمركب ، افتح قنوات SLAM الأربع في ImageJ وحدد: Image > Color > Merge Channels ... بالنسبة إلى C2 (أخضر)، حدد صورة قناة SHG، وبالنسبة إلى C5 (سماوي)، حدد صورة قناة NAD(P)H، وبالنسبة إلى C6 (أرجواني)، حدد صورة قناة THG، وبالنسبة إلى C7 (أصفر)، حدد صورة قناة FAD. تأكد من تحديد إنشاء مركب وانقر فوق موافق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن يجعل النهج المعقد متعدد القنوات ومتعدد الوسائط لمجهر SLAM (الشكل 1) من الصعب على المستخدمين الجدد استكشاف المشكلات وإصلاحها وفهم النتائج. أولا ، يتميز PCF المشقوق جيدا بوجه نظيف (الشكل 2 ج) بسطح مستو عمودي على طول PCF (الشكل 2 أ). يشير وجه الشق المائل المكسور (الشكل 2 ب) ووجود خدوش (الشكل 2 ه) إلى وجود شق ضعيف. تشير الأوساخ أو الحطام الموجود على سطح PCF الموضح في

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد إنشاء استمرارية فائقة مناسبة أمرا بالغ الأهمية لتصوير SLAM الناجح ، ولكنه قد يكون صعبا بسبب تعقيد إعداد PCF. يعد ضمان التشق الدقيق والتعامل الدقيق مع PCF أمرا ضروريا للحفاظ على الأسطح النظيفة خالية من الحطام أو الأوساخ أو الخدوش ، وكلها يمكن أن تتداخل مع الاقتران الفعال ، وتوليد الاستمرارية الفائقة ، وحتى تقصير عمر PCF. نظرا لأن PCF يتطلب استبدالا منتظما ، فإن ممارسة إعدادات شق الألياف والضبط الدقيق للساطور يمكن أن تساعد في تحقيق الشقوق المثلى. بالإضافة إلى ذلك ، تعد المحاذاة الدقيقة...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل للمعدات المستخدمة في هذه الدراسة جزئيا من قبل GSK من خلال مركز التصوير الجزيئي البصري في معهد بيكمان للعلوم والتكنولوجيا المتقدمة. تم دعم هذا العمل أيضا جزئيا من قبل مركز المعاهد الوطنية للصحة / NIBIB للتصوير الخالي من الملصقات والضوئيات الحيوية متعددة المقاييس (CLIMB) (P41EB031772) ومركز العلوم والتكنولوجيا NSF لبيولوجيا الخلية الكمية. تم دعم K.K.D.T من قبل برنامج NIEHS للتدريب البحثي في علم السموم والصحة البيئية (5T32ES007326-25) ، وتم دعم A.D.C من قبل معهد بيكمان للعلوم والتكنولوجيا المتقدمة برنامج زمالة ما بعد الدكتوراه ، و A.H. تم دعمه من قبل برنامج التدريب على البيئة الدقيقة للأنسجة NIBIB (T32EB019944). يشكر المؤلفون دارولد سبيلمان على إدارته لمساحات المختبرات والمعدات والتكنولوجيا ويشكرون الدكتورين جانيت إي سوريلز وريشياشرينج آر آير على مساهماتهم السابقة في نظام مجهر SLAM المستخدم في هذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
مرحلة 3 محاورThorLabsماكس 316توقف.
طبق تصوير زجاجي مقاس 35 ممماتيكP35G-0-14-Cغطاء زجاجي # 0 غير مطلي.
دي إم إيه إمجيبكو21063029ارتفاع نسبة الجلوكوز ، HEPES ، لا فينول أحمر.
مكملات نمو الخلايا البطانية المتوسطةخلية ترويجيةسي -39210حذف مصل العجل الجنيني.
ليزر فيمتو ترين فيمتو ثانيةفيزياء الأطياف1040-5متوسط الطاقة: >5.0 واط ، طاقة النبض: >500 نانومتر ، الطول الموجي: 1040 نانومتر ± ؛ 8 نانومتر ، معدل التكرار: 10 ميجاهرتز ، عرض النبضة (FWHM): < 220 ف.
مصل الأبقار الجنينيةسيتيفاSH30071.03تتميز HyClone.
متجرد الأليافThorLabsتي 10 إس 13
فلافين الأدينين ثنائي نوكليوتيد ثنائي الصوديوم ملح هيدراتسيجما ألدريتشإف 6625
مرايا الجلفانومتركامبريدج للتكنولوجيا6215هتوقف.
محطة عمل معالجة الزجاجفيترانGPX3800
إيمج جيمختبر إليسيري بجامعة ويسكونسن ماديسونالإصدار 2.16.0توزيع فيجي.
مناديل ورقية Kimwipeكيمبرلي كلارك بروفيشنال34120
لام-الجلوتامينسيتيفاSH30034.01
مرحلة المجهرالأجهزة العلمية التطبيقيةFTP-2050
تحكم المرحلة المجهريةالأجهزة العلمية التطبيقيةMS-2000-500-UDSW
الارتباط التلقائي للفحص المجهريAngewandte Physik und Elektronik GmbHكارب
عدسة موضوعيةأوليمبوسXLPLN25XWMP2الغمر في الماء ، تكبير 25X ، 1.05 NA.
عداد الطاقة الضوئيةنيوبورت919 ص-003-10600 - 1700 نانومتر.
محلل الطيف البصريThorLabsOSA202C
ألياف الكريستال الضوئيةضوئيات NKTLMA-PM-15 NKTمساحة وضع كبيرة ، الحفاظ على الاستقطاب. القطر الأساسي: 15 & ميكروم.
ساطور الألياف الضوئية الدقيقفوجيكوراCT-101
مشكل النبضBiophotonics Solutions Inc.فيمتوجوك دتوقف.
&-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد ، هيدرات ملح ثنائي الصوديوم المخففسيجما ألدريتش10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1999).
  4. Boppart, S. A., You, S., Li, L., Chen, J., Tu, H. Simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy and beyond. APL Photonics. 4 (10), 100901(2019).
  5. Sun, Y., et al. Real-time three-dimensional histology-like imaging by label-free nonlinear optical microscopy. Quant Imaging Med Surg. 10 (11), 2177-2190 (2020).
  6. Yang, L., et al. Intraoperative label-free multimodal nonlinear optical imaging for point-of-procedure cancer diagnostics. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 27 (4), 6801412(2021).
  7. Talone, B., et al. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals features of bone composition in pathophysiological conditions. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1042680(2022).
  8. Liu, H. S., Jan, M. S., Chou, C. K., Chen, P. H., Ke, N. J. Is green fluorescent protein toxic to the living cells. Biochem Biophys Res Commun. 260 (3), 712-717 (1999).
  9. Tsoi, K. M., Dai, Q., Alman, B. A., Chan, W. C. W. Are quantum dots toxic? Exploring the discrepancy between cell culture and animal studies. Acc Chem Res. 46 (3), 662-671 (2013).
  10. Alford, R., et al. Toxicity of organic fluorophores used in molecular imaging: Literature review. Mol Imaging. 8 (6), (2009).
  11. Macheroux, P., Kappes, B., Ealick, S. E. Flavogenomics - a genomic and structural view of flavin-dependent proteins. FEBS J. 278 (15), 2625-2634 (2011).
  12. Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. Top Fluoresc Spectrosc. 5, 471-540 (2002).
  13. Ranjit, S., et al. Imaging fibrosis and separating collagens using second harmonic generation and phasor approach to fluorescence lifetime imaging. Sci Rep. 5 (1), 13378(2015).
  14. Mohler, W., Millard, A. C., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging of endogenous structural proteins. Methods. 29 (1), 97-109 (2003).
  15. Cox, G. Biological applications of second harmonic imaging. Biophys Rev. 3 (3), 131(2011).
  16. Aghigh, A., Bancelin, S., Rivard, M., Pinsard, M., Ibrahim, H., Légaré, F. Second harmonic generation microscopy: A powerful tool for bio-imaging. Biophys Rev. 15 (1), 43-70 (2023).
  17. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  18. Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt Express. 5 (8), 169-175 (1999).
  19. Oron, D., et al. Depth-resolved structural imaging by third-harmonic generation microscopy. J Struct Biol. 147 (1), 3-11 (2004).
  20. Débarre, D., et al. Imaging lipid bodies in cells and tissues using third-harmonic generation microscopy. Nat Methods. 3 (1), 47-53 (2006).
  21. Tu, H., et al. Stain-free histopathology by programmable supercontinuum pulses. Nat Photonics. 10 (8), 534-540 (2016).
  22. You, S., et al. Label-free visualization and characterization of extracellular vesicles in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (48), 24012-24018 (2019).
  23. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  24. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  25. Masihzadeh, O., et al. Third harmonic generation microscopy of a mouse retina. Mol Vis. 21, 538-547 (2015).
  26. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  27. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: Why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18 (3), 351-357 (1997).
  28. Maiti, S., Shear, J. B., Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Measuring serotonin distribution in live cells with three-photon excitation. Science. 275 (5299), 530-532 (1997).
  29. Winkler, J., Abisoye-Ogunniyan, A., Metcalf, K. J., Werb, Z. Concepts of extracellular matrix remodelling in tumour progression and metastasis. Nat Commun. 11 (1), 5120(2020).
  30. Campagnola, P. J., Dong, C. Y. Second harmonic generation microscopy: Principles and applications to disease diagnosis. Laser Photonics Rev. 5 (1), 13-26 (2011).
  31. Pavone, F. S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation imaging. , CRC Press. Boca Raton. (2016).
  32. Witte, S., et al. Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (15), 5970-5975 (2011).
  33. Weigelin, B., Bakker, G. J., Friedl, P. Intravital third harmonic generation microscopy of collective melanoma cell invasion: Principles of interface guidance and microvesicle dynamics. Intravital. 1 (1), 32-43 (2012).
  34. Carriles, R., et al. Imaging techniques for harmonic and multiphoton absorption fluorescence microscopy. Rev Sci Instrum. 80 (8), 081101(2009).
  35. Graf, B. W., Jiang, Z., Tu, H., Boppart, S. A. Dual-spectrum laser source based on fiber continuum generation for integrated optical coherence and multiphoton microscopy. J Biomed Opt. 14 (3), 034019(2009).
  36. Graf, B. W., et al. In vivo multimodal microscopy for detecting bone-marrow-derived cell contribution to skin regeneration. J Biophotonics. 7 (1-2), 96-102 (2014).
  37. Liu, Y., Tu, H., Benalcazar, W. A., Chaney, E. J., Boppart, S. A. Multimodal nonlinear microscopy by shaping a fiber supercontinuum from 900 to 1160 nm. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 18 (3), (2012).
  38. You, S., et al. Intravital imaging by simultaneous label-free autofluorescence-multiharmonic microscopy. Nat Commun. 9 (1), 2125(2018).
  39. You, S., Chaney, E. J., Tu, H., Sun, Y., Sinha, S., Boppart, S. A. Label-free deep profiling of the tumor microenvironment. Cancer Res. 81 (9), 2534-2544 (2021).
  40. Cadena, A. D. L., Park, J., Tehrani, K. F., Renteria, C. A., Monroy, G. L., Boppart, S. A. Simultaneous label-free autofluorescence multi-harmonic microscopy driven by the supercontinuum generated from a bulk nonlinear crystal. Biomed Opt Express. 15 (2), 491-505 (2024).
  41. Lee, J. H., et al. Simultaneous label-free autofluorescence and multi-harmonic imaging reveals in vivo structural and metabolic changes in murine skin. Biomed Opt Express. 10 (10), 5431-5444 (2019).
  42. Shi, J., et al. Accelerating biopharmaceutical cell line selection with label-free multimodal nonlinear optical microscopy and machine learning. Commun Biol. 8 (1), 157(2025).
  43. Georgakoudi, I., Quinn, K. P. Label-free optical metabolic imaging in cells and tissues. Annu Rev Biomed Eng. 25, 413-443 (2023).
  44. Alhallak, K., Rebello, L. G., Muldoon, T. J., Quinn, K. P., Rajaram, N. Optical redox ratio identifies metastatic potential-dependent changes in breast cancer cell metabolism. Biomed Opt Express. 7 (11), 4364-4374 (2016).
  45. Ostrander, J. H., et al. Optical redox ratio differentiates breast cancer cell lines based on estrogen receptor status. Cancer Res. 70 (11), (2010).
  46. Cadena, A. D. L., Renteria, C. A., Aksamitiene, E., Boppart, S. A. Label-free hyperspectral multiphoton microscopy. Opt Lett. 50 (5), 1484-1487 (2025).
  47. Agrawal, G. Nonlinear fiber optics. , 5th ed, Academic Press. 553-612 (2013).
  48. Trebino, R., et al. Measuring ultrashort laser pulses in the time-frequency domain using frequency-resolved optical gating. Rev Sci Instrum. 68 (9), 3277-3295 (1997).
  49. Stewart, K., Schroeder, V. A. Diagnostic necropsy and tissue harvest in rodents. J Vis Exp. , e10294(2020).
  50. Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney Int. 65 (6), 2223-2227 (2004).
  51. Huttunen, M. J., et al. Multiphoton microscopy of the dermoepidermal junction and automated identification of dysplastic tissues with deep learning. Biomed Opt Express. 11 (1), 186-199 (2020).
  52. Fung, A. A., et al. Label-free multimodal optical biopsy reveals biomolecular and morphological features of diabetic kidney tissue in 2D and 3D. Nat Commun. 16 (1), 4509(2025).
  53. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  54. Kovesi, P. Good colour maps: How to design them. arXiv. , (2015).
  55. Kovesi, P. ColorCET perceptually uniform colour maps. , https://colorcet.com (2025).
  56. Tian, Z., Liang, M. Renal metabolism and hypertension. Nat Commun. 12 (1), 963(2021).
  57. Wang, G., Shi, J., Iyer, R. R., Sorrells, J. E., Tu, H. Fiber-optic nonlinear wavelength converter for adaptive femtosecond biophotonics. arXiv. , (2024).
  58. Lozovoy, V. V., Pastirk, I., Dantus, M. Multiphoton intrapulse interference. IV. Ultrashort laser pulse spectral phase characterization and compensation. Opt Lett. 29 (7), 775-777 (2004).
  59. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), (2014).
  60. Theodossiou, A., et al. Autofluorescence imaging to evaluate cellular metabolism. J Vis Exp. (177), e63282(2021).
  61. Yang, L., et al. Label-free multimodal polarization-sensitive optical microscope for multiparametric quantitative characterization of collagen. Optica. 11 (2), 155-165 (2024).
  62. Smith, H. E., et al. The use of NADH anisotropy to investigate mitochondrial cristae alignment. Sci Rep. 14 (1), 5980(2024).
  63. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (4), (2011).
  64. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr Protoc Cytom. 61 (1), 9.39.1-9.39.18 (2012).
  65. Sorrells, J. E., et al. Label-free nonlinear optical signatures of extracellular vesicles in liquid and tissue biopsies of human breast cancer. Sci Rep. 14 (1), 5528(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles