يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد طفرات الأمهات باستخدام zpc: cas9 Knock-in Zebrafish

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

يوليو 22, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد طفرة الأم التي تجمع بين zpc: cas9 مستقرة مع التسليم بوساطة Tol2 لأشرطة تعبير sgRNA.

الملخص

يعتمد تكوين البويضات والتطور الجنيني المبكر بشكل حاسم على mRNAs والبروتينات المشتقة من الأم. يتطلب القضاء على هذه العوامل الأمومية طفرات متماثلة اللواقح في إناث أسماك الزرد ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى أنماط ظاهرية قاتلة أو عقيمة ، مما يمنع اكتساب أجنة الأم الطافرة. قدم عملنا السابق نهجا سريعا لتجاوز الفتك الزيجوتي من خلال تحرير الجينوم الخاص بالبويضات. ومع ذلك ، فإن الجينات المعدلة وراثيا cas9 التي تم الإبلاغ عنها سابقا تظهر عدم استقرار وتخضع لإسكات تدريجي على مدى الأجيال المتعاقبة. علاوة على ذلك ، فإن وجود عناصر Tol2 القابلة للنقل تحيط بشريط zpc: cas9 في هذا الخط يعيق إمكانية حدوث المزيد من التكاثر sgRNA باستخدام نظام Tol2 ، وهو حاليا النظام المعدل وراثيا الأكثر كفاءة في أسماك الزرد. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة لخط أسماك الزرد الخالي من Tol2 والذي يضمن تعبير Cas9 مستقر وقوي خاص بالبويضات. هنا ، نقدم سطرا مع zpccas9 knock-in في موضع rbm24a الذي يعالج هذا المطلب. باستخدام هذه الأداة المحسنة ، نقدم خط أنابيب للتوليد السريع للطفرات الأمومية للجينات ذات الأنماط الظاهرية الطافرة المميتة الزيجوت داخل نموذج الزرد.

المقدمة

يعتمد التطور الجنيني المبكر للفقاريات بشكل كبير على الحمض النووي الريبي والبروتينات المخزنة داخل البويضة ، والتي يشار إليها مجتمعة باسم عوامل الأم. يتم تصنيع منتجات الأم هذه في الغالب خلال مرحلة ديبلوتين من الانقسام الاختزاليI 1،2،3. للتحقيق في أدوارهم الوظيفية ، من الضروري توليد أفراد متحولين متماثل اللواقح ، حيث أن الطفرة المتماثلة اللواقح فقط في البويضات يمكن أن تستنفد هذه العوامل الأمومية تماما. ومع ذلك ، فإن الحصول على مثل هذه الإناث المتحولة متماثلة اللواقح يصبح أمرا صعبا عندما تؤدي الطفرات المتماثلة اللواقح إلى الفتك أو العقم4،5. يشكل هذا حاجزا كبيرا أمام توضيح وظائف منتجات الأم المشفرة بواسطة الجينات المميتة أو المعقمة الملقحة. للتغلب على هذا القيد التقني ، تم تطوير العديد من الأساليب المبتكرة6،7،8. ومع ذلك ، غالبا ما تعاني هذه التقنيات من جداول زمنية تجريبية طويلة أو تحديات تقنية كبيرة.

في عملنا السابق ، قمنا أيضا بتطوير استراتيجية خروج المغلوب المشروطة التي تسمح بتوليد طفرات الأمهات في غضون جيل واحد9،10. يتكون النظام من مكونين رئيسيين: أسماك الزرد المعدلة وراثيا Tg (zpczcas9) ونظام البلازميد المعدلة وراثيا I-SceI الذي يحتوي على 3-4 أشرطة تعبير sgRNA. من خلال الاستفادة من هذا النظام ، نجحنا في تحقيق الضربة القاضية المشروطة لعوامل الأم فيالبويضات 9،10 ، ولكن لا يزال هناك مجال للتحسين. أولا ، لم تكن كفاءة تحرير الجينوم للخط المعدل وراثيا Tg (zpczcas9) الذي تم الإبلاغ عنه سابقا مستقرة في الحفاظ على التعبير المعدل وراثيا ل Cas9. علاوة على ذلك ، نظرا لأن هذا الخط المعدل وراثيا تم إنشاؤه باستخدام نظام الينقولات Tol2 ، لا يمكن استخدام تبديل Tol2 لدمج كاسيت تعبير sgRNA. بدلا من ذلك ، يلزم وجود تحول بوساطة I-SceI. ومع ذلك ، فإن هذا النهج أقل كفاءة من Tol2 وهو أيضا أكثر عرضة للإسكات عبر الأجيال.

للتغلب على هذه القيود ، سعينا إلى إنشاء خط ضربة قاضية يتيح تعبير Cas9 القوي والمستقر الخاص بالبويضات. يسمح هذا الخط باستخدام نظام الينقولات Tol2 لتوصيل بلازميدات التعبير عن sgRNA عالية الكفاءة في أسماك الزرد. باستخدام استراتيجية تحرير الجينوم القائمة على الإنترون11 ، نجحنا في إنشاء خط ضربة زر zpccas9 مع الموقع المتكامل في آخر إنترون من جين rbm24a (الشكل 1 أ ، ب). اخترنا هذا الموضع كملاذ آمن جيني مرشح للتعبير عن الجينات المعدلة وراثيا للأم على أساس ملاحظتين مستقلتين. 1) التكامل غير الضار: في دراستنا الأخيرة12 ، ظلت الأسماك المتماثلة اللواقح التي تحمل الحمض النووي الخارجي في هذا الموقع قابلة للحياة وخصبة تماما. 2) التعبير القوي: عندما تم إدخال كاسيت zpccas9 في نفس الموضع ، تم التعبير عن Cas9 بمستويات عالية ، مما أدى إلى كفاءات قوية باستمرار في تحرير الجينوم عبر الأجيال (الشكل 1 ج). كمكون أساسي للبلازما الجرثومية ، يشترك البروتين المرتبط بالحمض النووي الريبي Rbm24a مع Buc لدمج الحمض النووي الريبي للبلازما الجرثومي في الحبيبات الجرثومية وبالتالي ، يؤدي نقص Rbm24a الأمومي إلى الغياب التام للخلايا الجرثومية البدائية (PGCs)12. هنا ، من خلال استهداف rbm24a كمثال في عملنا الأخير ، نقدم بروتوكول فيديو محسن لتوليد وتوصيف طفرات الأمهات للجينات المميتة الزيجوتية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء التجارب وفقا لإرشادات ARRIVE وتمت الموافقة عليها أخلاقيا من قبل لجنة رعاية المؤسسية بجامعة شاندونغ (رقم الموافقة. SYDWLL-2021-15). تظهر نظرة عامة على هذا البروتوكول في الشكل 2.

1. توليد خط rbm24a-RFP zpc: cas9

  1. شاشة sgRNA للضربة القاضية
    1. تحديد وتوليف مرشحي sgRNA
      1. أرسل تسلسل آخر إنترون من rbm24a إلى CRISPRscan (http://www.crisprscan.org) لتحديد مرشحي sgRNA الأمثل الذين يظهرون درجات CRISPRscan عالية (تشير إلى الكفاءة المستهدفة) ودرجات CFD منخفضة (تعكس التأثيرات خارج الهدف). قم بتجميع oligo الطويل لكل sgRNA (sgRNA oligo).
        ملاحظة: يولد CRISPRscan sgRNA oligos تحتوي على عناصر وظيفية أساسية ، بما في ذلك تسلسل محفز T7 ، وتسلسل هدف sgRNA المكون من 20 نيوكليوتيد ، وتسلسل سقالة sgRNA المكون من 16 نيوكليوتيد. هنا ، اخترنا sgRNA بالتسلسل التالي: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3 ′ (أحرف صغيرة لمروج T7 ، أحرف كبيرة كبيرة بدليل 20-nt ، سقالة جزئية صغيرة).
      2. للحصول على قالب الحمض النووي لتخليق sgRNA ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR): 2x Taq Master mix 25 μL ؛ sgRNA التمهيدي (10 ميكرومتر) 2 ميكرولتر ؛ برايمر عالمي (10 ميكرومتر) 2 ميكرولتر ؛ منزوعة الأيونات H2O 21 ميكرولتر.
        ملاحظة: يتم عرض تسلسل جميع الاشعال في جدول المواد.
      3. امزج جيدا وانقل خليط التفاعل إلى جهاز تدوير حراري مبرمج مسبقا وابدأ بروتوكول التضخيم باستخدام معلمات التدوير على النحو التالي: دورة واحدة عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، 35 دورة (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 50 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ودورة واحدة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      4. تحضير خليط التفاعل لتخليق sgRNA في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ؛ اجمع جميع المكونات في درجة حرارة الغرفة بالترتيب التالي: 11 ميكرولتر من الماء المقطر ، 2 ميكرولتر من ATP / GTP / CTP / UTP (10 ملي مولار لكل منهما) ، 10 ميكرولتر من منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، 4 ميكرولتر من محلول تفاعل بوليميراز الحمض النووي الريبي 10x ، 2 ميكرولتر من بوليميراز T7 RNA ، و 1 ميكرولتر من مثبط RNase. حجم التفاعل الكلي 40 ميكرولتر ، تخلط جيدا عن طريق النقر وإجراء طرد مركزي قصير.
      5. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. أضف 1 ميكرولتر من DNase I ، واخلطها عن طريق النقر ، وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لضمان إزالة قالب الحمض النووي بالكامل.
      6. أضف 5 ميكرولتر من حبات السيليكا المغناطيسية ، متبوعة ب 120 ميكرولتر (حجم 4) من المخزن المؤقت لربط الحمض النووي الريبي (Gu-HCl 1 M 9.55 جم ، Tween-20 0.05٪ ، الإيثانول 100 مل). تخلط جيدا عن طريق سحب العينات. احتضن على خلاط حراري عند 1,500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي وقم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة أو نظام تفريغ.
      8. أضف 400 ميكرولتر من 90٪ من الإيثانول والدوامة لإعادة تعليق الخرز. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وتخلص من المادة الطافية.
      9. كرر خطوات غسل الإيثانول لإكمال ما مجموعه دورتي غسيل.
      10. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية وجف الأنبوب المفتوح بالهواء على كتلة تسخين 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      11. أضف 15 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز واحتضنه على خلاط حراري عند 1,500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      12. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وانقل الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.
      13. قم بتأكيد نطاق sgRNA 98 نقطة أساس بواسطة الرحلان الكهربائي الاغاروز. قم بتحديد تركيز الحمض النووي الريبي بواسطة مقياس الطيف الضوئي الدقيق ورحلان الاغاروز الكهربائي ، وقم بتسميته بوضوح ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
    2. اختبار كفاءة sgRNA
      1. لتحديد الكفاءة الفعلية ل sgRNAs ، قم بإعداد مركب البروتين النووي الريبي (RNP) للحقن المجهري. امزج 1 ميكرولتر من كل sgRNA (التركيز النهائي 50 نانوغرام/ميكرولتر) مع 1 ميكرولتر من بروتين Cas9 (التركيز النهائي 100 نانوغرام/ميكرولتر) على الثلج عن طريق سحب العينات. توصيل 2 نانولتر من مركب RNP إلى كل جنين في مرحلة خلية واحدة عن طريق الحقن المجهري.
      2. بعد 24 ساعة من الإخصاب (hpf) ، اجمع 10 أجنة لكل حقن Cas9 RNP في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وقم بإزالة الوسط الزائد بعناية. أضف 100 ميكرولتر من 50 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم (10 ميكرولتر لكل جنين) واحتضنه عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة باستخدام كتلة تسخين أو دراجة حرارية. قم بتحييد المحللة بإضافة 10 ميكرولتر من 1 M Tris-HCl (درجة الحموضة 7.0).
      3. استخدم محللة الجنين المعادلة مباشرة كقالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). صمم بادئات لتضخيم جزء يحتوي على الموقع المستهدف بتسلسلات مرافقة ≥100 نقطة أساس على كلا الجانبين. تحقق من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز وتنقيتها باستخدام استخراج الجل عند الضرورة. إجراء تسلسل سانجر للمنتجات المضخمة.
      4. القياس الكمي لكفاءة تحرير CRISPR: قم بتحليل المخططات الكروماتوغرافية للتسلسل باستخدام أداة تحليل ICE (استنتاج تعديلات كريسبر) (https://ice.synthego.com/#/). تطبيع كفاءة التحرير مقابل عينات التحكم غير المحقونة باتباع البروتوكولات الموصى بها من قبل موقع الويب.
  2. بناء بلازميد متبرع للضرب
    1. استخدم منهجية TEDA (تجميع الحمض النووي نوكلياز خارجي T5) المعمول بها لأداء تفاعل الربط13.
    2. استخدم استراتيجية تجميع جيبسون ثلاثية الأجزاء لبناء البلازميد المتبرع rbm24a-RFP KIzpc: cas9 . يشتمل الجزء الأول على ذراع تماثل 1,704 نقطة أساس 5 بوصات يشمل المنطقة الجينومية مباشرة في اتجاه المنبع من كودون التوقف rbm24a . والثاني هو تسلسل ترميز GFP. يحتوي الثالث على ذراع تماثل 2،274 نقطة أساس 3 بوصات في اتجاه مجرى كودون التوقف rbm24a ، متبوعا بشريط تعبير zpccas9 الموضوع في الاتجاه 3 'البعيد عن rbm24a 3'-UTR.
    3. قم بتجميع الأجزاء الثلاثة في موقع ApaI الخاص بمتجه pBluescript SK- باستخدام تجميع Gibson.
    4. تحقق من البلازميد النهائي من خلال تقييد الهضم وتسلسل سانجر.
  3. الحقن المجهري واختيار الأجنة مع التكامل المبكر
    1. تحضير خليط الحقن الذي يحتوي على 12 بيكوغرام من بلازميد المتبرع rbm24a-RFP KIzpc: cas9 ، و 200 بيكوغرام من sgRNA ، و 600 نانوغرام من بروتين Cas9 المؤتلف في ماء خال من النوكلياز. توصيل 1-2 نانولتر من الخليط في القرص الأريمي للأجنة ذات المرحلة الواحدة باستخدام تقنيات الحقن المجهري القياسية. عند 30 hpf ، قم بفحص الأجنة بحثا عن أنماط تعبير RFP التي تحاكي التعبير الذاتي ل rbm24a ، مما يشير إلى تكامل البلازميد المتبرع في وقت مبكر من مرحلة الانقسام. حدد هذه الأجنة مع التكامل المبكر للتكاثر ، والتي أظهرت إشارة RFP في العدسة والقلب والعضلات الهيكلية وخلايا شعر الأذن الداخلية (الشكل 3 أ ، ب).
      ملاحظة: قم بتنقية البلازميد عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم قبل الحقن للتخلص من أي RNases متبقية يتم إدخالها أثناء تحضير البلازميد.
    2. تحليل أنماط التعبير عن Rbm24a-RFP الأمومية في أجنة الجيل F1 المشتقة من rbm24a-RFP KIzpc: cas9 incrosses (الشكل 4 أ ، ب).
  4. تقييم تعبير بروتين Cas9 وكفاءة التحرير
    1. لتقييم كفاءة تحرير Cas9 ، قم بحقن 200 بيكوغرام bmp2b sgRNA في أجنة rbm24a-RFP KIzpc: cas9 المكونة من خلية واحدة (الشكل 1C ، D).
    2. لتقييم استقرار تحرير Cas9 ، حدد عدد الأجنة التي تظهر أنماطا ظاهرية للظهرية وقم بإجراء تحليل تسلسل Sanger لتقييم كفاءة التحرير (الشكل 5A-D).
      ملاحظة: على الرغم من أننا لم نكتشف أي انخفاض في تعبير Cas9 على مدى ثلاثة أجيال ، إلا أننا ما زلنا نوصي بالتحقق من كفاءة التحرير في كل جيل من هذا الخط المباشر.

2. التحول sgRNA في خط rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. حدد وتوليف sgRNAs للضربة القاضية rbm24a .
    1. حدد وتوليف مرشحي sgRNA كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد sgRNAs التي تستهدف النصف الأمامي من منطقة الترميز لضمان فقدان الوظيفة بكفاءة عالية. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تحديد مجالات البروتين الحرجة في المنطقة الطرفية C ، فإن sgRNAs التي تستهدف نهاية 3 'من تسلسل الترميز مقبولة أيضا. يولد CRISPRscan قلة sgRNA تحتوي على عناصر وظيفية أساسية ، بما في ذلك تسلسل محفز T7 ، وتسلسل هدف sgRNA المكون من 20 نيوكليوتيد ، وتسلسل سقالة sgRNA المكون من 16 نيوكليوتيد. لتحقيق ضربة قاضية فعالة لجينات الأم ، ينصح بتصميم 6-8 مرشحين لتحديد 3-4 sgRNAs عالية الكفاءة بشكل موثوق. يمكن العثور على بروتوكول مفصل في ورقة سابقة9.
    2. اختبر كفاءة sgRNA في جنين الزرد المبكر كما هو موضح في الخطوة 1.1.2.
      ملاحظة: يفضل sgRNAs ذات كفاءة تحرير تتجاوز 50٪.
  2. بناء البلازميد المعدل وراثيا الذي يعبر عن sgRNA
    ملاحظة: لزيادة كفاءة التحرير إلى أقصى حد، نوصي باستخدام أربعة sgRNAs مميزة وغير متداخلة، مفصولة ب 36 نقطة أساس على الأقل. يتم ربط sgRNAs هذه بشكل فردي في متجهات pU6x: sgRNA (pU6x: sgRNA # 1 ، # 2 ، # 3 ، # 4) ، كل منها يحتوي على محفزات U6 فريدة جنبا إلى جنب مع سقالة 3 بوصات14. بعد ذلك ، يتم تجميع متجهات U6 الأربعة هذه ، كل منها يحتوي على كاسيت تعبير sgRNA ، في متجه وجهة pGGDestISceIEB-4sgRNA عبر ربط البوابة الذهبية.
    يجب تحديد متجهات pU6x: sgRNA بالتتابع. على سبيل المثال ، في حالة استنساخ ثلاثة sgRNAs ، استخدم المتجهات # 1 إلى # 3 ؛ في حالة استنساخ أربعة sgRNAs ، استخدم المتجهات # 1 إلى # 4.
    1. الاستنساخ الفرعي لتسلسل هدف sgRNA في متجهات pU6x: sgRNA
      1. وفقا لتسلسل sgRNA المختار ، قم بتجميع بادئات التلدين: التمهيدي الأمامي: TTCGN (19) ؛ التمهيدي العكسي: AAAC [N (19)]*. حيث GN (19) هو التسلسل المستهدف 20 nt ل sgRNA. [N (19)] * يمثل التسلسل التكميلي العكسي ل 19 nt من هدف sgRNA في اتجاه 3 '.
      2. لتلدين الاشعال ، قم بإعداد الخليط على النحو التالي: 1 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي (100 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من التمهيدي العكسي (100 ميكرومتر) ، 2 ميكرولتر من 10x عازلة ، و 16 ميكرولتر من H2O منزوع الأيونات للوصول إلى الحجم الإجمالي 20 ميكرولتر.
        ملاحظة: تم عرض تسلسل جميع الاشعال في جدول المواد.
      3. ضع الخليط في جهاز تدوير حراري وقم بتشغيل البرنامج على النحو التالي: دورة واحدة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، ثم تبرد تدريجيا إلى 50 درجة مئوية بمعدل منحدر متحكم فيه يبلغ 0.1 درجة مئوية / ثانية ، وحافظ على درجة الحرارة هذه لمدة 10 دقائق ؛ استمر في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
      4. تحضير خليط التفاعل لاستنساخ التسلسل المستهدف sgRNA الملدن في نواقل pU6x-sgRNA كما هو موضح: 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإنزيم التقييد 10x ، 1 ميكرولتر من 10x T4 ligase buffere ، 0.3 ميكرولتر من T4 ligase ، 0.3 ميكرولتر من BsmBI ، 0.2 ميكرولتر من PstI ، 0.2 ميكرولتر من SalI ، 1 ميكرولتر من التمهيدي sgRNA الملدن ، 5 ميكرولتر من pU6x: sgRNA # x (20 نانوغرام / ميكرولتر) ، و 1 ميكرولتر من H2O منزوع الأيونات ، مع ضبط حجم التفاعل النهائي إلى 10 ميكرولتر.
      5. امزج مكونات التفاعل جيدا وقم بتشغيل برنامج التدوير الحراري التالي: 6 دورات (37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، 16 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة) ، دورة واحدة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، دورة واحدة عند 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، دورة واحدة عند 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      6. للتحويل ، قم بإذابة DH5α الخلايا المختصة على الجليد ، واخلط برفق 50 ميكرولتر من الخلايا مع خليط الربط عن طريق النقر على الأنبوب ، واحتضان الخليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. قم بإجراء صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، ثم انقل الأنبوب على الفور إلى الجليد لمدة دقيقتين. انشر الخلايا المحولة على صفيحة LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين واحتضان اللوحة رأسا على عقب عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة على الأقل للسماح بتكوين المستعمرة.
      7. بالنسبة لمستعمرة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اختر كل مستعمرة بكتيرية بطرف ماصة وانقلها إلى 10 ميكرولتر من H2O منزوع الأيونات ، أعد تعليق المستعمرة تماما عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل لضمان التشتت الكامل لتحليل PCR في اتجاه مجرى النهر. تحضير خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الجمع بين 5 ميكرولتر من 2x Taq Mix ، و 2 ميكرولتر من سائل المستعمرة ، و 0.4 ميكرولتر لكل من التمهيدي الأمامي M13 (10 ميكرومتر) والتمهيدي العكسي (10 ميكرومتر) ، و 2.2 ميكرولتر من H2O منزوع الأيونات ، مما ينتج عنه حجم تفاعل إجمالي يبلغ 10 ميكرولتر.
      8. قم بتشغيل البرنامج كما هو موضح أدناه: دورة واحدة عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ، و 23 دورة (94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 55 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) ، و 1 دورة عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      9. إخضاع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للرحلان الكهربائي. حدد المستعمرة الموجبة بالحجم المتوقع 482 نقطة أساس (الشكل 6).
      10. قم بتلقيح سائل المستعمرة المتبقي في 3 مل من وسط LB مع 100 ميكروغرام / مل من سبيكتينومايسين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 14 ساعة.
      11. استخرج البلازميدات من المزرعة البكتيرية باستخدام مجموعة Plasmid Miniprep Kit وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بقياس تركيز البلازميد باستخدام مقياس الطيف الضوئي المجهري.
      12. أخضع البلازميدات المستخرجة لتسلسل سانجر باستخدام التمهيدي الأمامي M13. قم بمحاذاة نتائج التسلسل مع خريطة متجه U6 المتوقعة للتحقق من الإدراج الصحيح لهدف sgRNA.
    2. تجميع ناقل pGGDestEB-4sgRNA
      ملاحظة: كما هو موضح في الشكل 7 ، يمكن ربط أربعة أشرطة تعبير sgRNA مدفوعة ب U6 بكفاءة في متجه العمود الفقري pGGDestEB-4sgRNA باستخدام مجموعة Golden Gate. يحدد عدد sgRNAs التي سيتم ربطها استخدام النواقل. على سبيل المثال ، عند تجميع أربعة أشرطة sgRNA ، استخدم pU6a: sgRNA # 1 ، pU6a: sgRNA # 2 ، pU6b: sgRNA # 3 ، pU6c: sgRNA # 4 ، و pGGDestEB-4sgRNA.
      1. قم بإعداد 20 ميكرولتر من خليط تفاعل البوابة الذهبية الذي يحتوي على: 2 ميكرولتر من 10× مخزن مؤقت لإنزيم تقييد ، 2 ميكرولتر من 10x T4 DNA ligase buffer ، 100 ng من كل pU6x: sgRNA # x بناء ، 50 نانوغرام من متجه وجهة pGGDestIEB-4sgRNA ، 1 ميكرولتر من BsaI ، 1 ميكرولتر من T4 DNA ligase ، وماء منزوع الأيونات لضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر.
      2. قم بتشغيل تفاعل تجميع البوابة الذهبية من خلال 3 دورات مدة كل منها 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية متبوعة ب 15 دقيقة عند 16 درجة مئوية ، ثم أكتمل بحضانة نهائية لمدة 15 دقيقة عند 80 درجة مئوية لتعطيل الإنزيم.
      3. للتحويل ، انقل 5 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى خلايا مختصة وصفيحة إلى وسط LB مكمل بالأمبيسلين.
      4. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرة عن طريق فحص المستعمرات باستخدام بادئات Dest الأمامية والعكسية (انظر جدول المواد) لتأكيد وجود إدراج (الشكل 8).
        ملاحظة: يجب أن يكون النطاق الرئيسي البالغ 2,415 نقطة أساس ونمط السلم موجودا لاستنساخ إيجابي.
      5. استخرج البلازميدات من المستعمرات الإيجابية والتسلسل باستخدام بادئات Dest الأمامية والعكسية لكل هدف sgRNA.
      6. قم بمحاذاة نتائج تسلسل Sanger مع تسلسل المتجه المتوقع للتحقق.
  3. الحقن المجهري والفحص المسبق للمؤسسين المعدلين وراثيا
    1. اجمع الأجنة التي ولدت بواسطة أسماك rbm24a-RFP KIzpc: cas9 متماثلة اللواقح.
    2. تحضير خليط الحقن عن طريق الجمع بين 1 ميكرولتر من pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 نانوغرام / ميكرولتر) مع 1 ميكرولتر من Tol2 transposase mRNA (50 نانوغرام / ميكرولتر).
      ملاحظة: قم بتنقية البلازميد باستخدام استخراج الفينول كلوروفورم قبل الحقن لإزالة أي RNase متبقي ربما تم إدخاله أثناء عملية استخراج البلازميد. تم تخفيف البلازميد و Tol2 mRNA مباشرة في الماء النقي.
    3. ضع غطاء زجاجي في طبق مقاس 15 سم. قم بمحاذاة الأجنة على طول حافة الغطاء وقم بإزالة الماء الزائد بعناية باستخدام ماصة. حقن 2 نانولتر من الخليط في القرص الأريمي لكل جنين في مرحلة خلية واحدة. بعد الحقن ، اشطف الأجنة برفق بالماء الأزرق وانقلها إلى طبق طازج. أخيرا ، ضع الطبق في حاضنة 28 درجة مئوية للزراعة.
      ملاحظة: قم بإعداد محلول عمل الميثيلين الأزرق (الماء الأزرق) على النحو التالي: قم بإذابة 180 جم من ملح البحر في 2.7 لتر من الماء المقطر وتعقيمه لإنتاج 100 ضعف مخزون مياه البحر. خفف هذا المرق 200 مرة بالماء المقطر المعقم للحصول على 1/100x من مياه البحر. أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون الميثيلين الأزرق بنسبة 5٪ (م / ف) إلى 1 لتر من مياه البحر 1/100x لإعداد حل العمل النهائي.
    4. عند 24 حصانا ، حدد الأجنة التي تظهر تعبيرا قويا وواسع الانتشار في BFP. عند 4 dpf ، ارفع فقط أولئك الذين يحتفظون بإشارات فلورية قوية وراثيا (الشكل 9).

3. توصيف الأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة

  1. التنميط الظاهري للأجنة المعدلة وراثيا المزدوجة
    1. اجمع الأجنة من الإناث المؤسس المعدلة وراثيا الفسيفساء التي تتزاوج مع ذكور من النوع البري.
    2. التقط الأجنة الإيجابية لأحادي البروم (BFP +) في مرحلة الخلية الواحدة تحت مجهر القصي الفلوري.
    3. تحديد العيوب التنموية الناشئة في أجنة BFP + ولكن ليس في أجنة BFP.
    4. قم بإصلاح الأجنة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. قم بإجراء تهجين كامل في الموقع ، أو تلطيخ التألق المناعي ، أو غيرها من التحليلات النسيجية عند الضرورة.
      ملاحظة: يمكن الاعتماد فقط على الأنماط الظاهرية المعيبة التي تنشأ حصريا في الأجنة التي تعبر عن الحمض النووي الريبي الإيجابي ل GFP أو BFP. يجب استخلاص الاستنتاجات بحذر ، ويجب إثبات الأنماط الظاهرية الطافرة للأمهات بأكثر من 10 حالات.
  2. التنميط الجيني للأجنة الأمومية الطافرة
    ملاحظة: لتحديد مrbm24a الأجنة ، يمكن التقاطها بسهولة عن طريق عدم وجود Rbm24a-RFP تحت المجهر الفلوري. في المقابل ، يعتمد تحديد طفرات الأم للجينات الأخرى بشكل أساسي على استراتيجية شفط الخلية قبل تنشيط الجينوم الزيجوتي ، متبوعا بتحليل RT-PCR ل mRNAs للأم في الخلايا التي تم جمعها (الشكل 10).
    1. شفط الخلية
      1. تحضير محلول الاغاروز بنسبة 1.5٪ عن طريق إذابته في 1/3x عازلة Ringer وغليها حتى تذوب. صب المحلول في طبق بتري مقاس 90 مم وأدخل قالبا (WPI ، z-molds) في الاغاروز المنصهر. بمجرد أن تصلب ، قم بإزالة القالب برفق ، مما ينتج عنه صفيحة جاهزة للاستخدام.
      2. استخدم الشعيرات الدموية الزجاجية ومجتذب لإنشاء إبر محكمة الغلق. للحصول على إبر شفط الخلايا المثلى، اضبط وزنين خفيفين وقوة التسخين على المستوى 1: 60 و Lv2: 90، وحدد إجراء الخطوة 2. قم بقص الأطراف الشعرية باستخدام ملاقط مدببة (انظر جدول المواد) لتحقيق قطر فتح يتراوح بين 30 و 40 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بإنشاء ارتفاع عند طرف الإبرة باستخدام microforge ، مما يساعد في الاختراق ويقلل من الضرر الذي يلحق بالجنين.
      3. تزاوج المؤسسات المفترضة مع أسماك الزرد البرية وجمع الأجنة. عزل الأجنة الإيجابية لالتهاب الأبيضات الحمضة في مرحلة الخلية الواحدة.
      4. عند 3 hpf ، قم بإزالة الأجنة عن طريق الحضانة في 1 مجم / مل من Pronase في 1/3x عازلة Ringer لمدة 10 دقائق وسحب لطيف ، وضع الأجنة بعناية على صفيحة الاغاروز المغمورة ب 1/3x عازلة Ringer مكملة ب 1x البنسلين والستربتومايسين. أعد توجيه الأجنة بحيث يتم توجيه الأريمة نحو الطرف الشعري.
        ملاحظة: من الأهمية بمكان نقل الأجنة بعناية ، لأنها هشة للغاية دون حماية المشيمة. لا تدعهم يلمسون سطح الوسط!
      5. استخدم حاقن دقيق لشفط 20-40 خلية من كل جنين عن طريق تقليل ضغط التوازن الذي يعوض بعناية عن قوة الشفط من العمل الشعري15. حرر هذه الخلايا في 2 ميكرولتر من H2O منزوع الأيونات عند الحافة الافتتاحية لأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق زيادة ضغط التوازن.
        ملاحظة: لتجنب التلوث المتبادل ، يجب تنظيف الإبرة الزجاجية عن طريق شفط وإخراج H2O 3x منزوع الأيونات قبل كل شفط.
      6. أضف 200 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لغسل الخلايا ، وقم بتخزين الأنابيب مؤقتا على الجليد. بعد ذلك ، قم بتحليل الأنماط الجينية للخلايا من الأجنة التي تحتوي على عيوب في النمو أو بدونها.
        ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا المحفوظة في كاشف الاستخراج عند -20 درجة مئوية حتى تظهر الأجنة المقابلة أنماطا ظاهرية شاذة.
      7. اترك الأجنة بعد شفط الخلية في صفيحة الاغاروز أو ضعها بشكل فردي في لوح مكون من 24 بئرا مغمورة بمحلول 1/3x Ringer الذي يحتوي على 1x البنسلين والستربتومايسين.
        ملاحظة: يجب توخي الحذر لنقل الأجنة المتكللة! عادة ، نقوم بفحص 20-40 جنينا في تجربة واحدة ، والتي تستغرق حوالي 1 ساعة.
    2. تحليل mRNA الأمومي ذي الأهمية في الخلايا الطموحة
      1. أضف 40 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى الخلايا الموجودة في كاشف الاستخراج واخلطها برفق. الطرد المركزي الخليط على حرارة 12,000 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      2. اجمع المادة الطافية بعناية. أضف 1 ميكرولتر من محلول الجليكوجين (20 مجم / مل) وكمية متساوية من الأيزوبروبانول (إذا كان حجم المادة الطافية 100 ميكرولتر ، فأضف 100 ميكرولتر من الأيزوبروبانول) واخلط جيدا. احتضان الخليط عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل هطول الأمطار.
        ملاحظة: نظرا لقلة كمية الحمض النووي الريبي الكلي في الخلايا المستنشقة ، يجب إضافة الجليكوجين لتعزيز كفاءة هطول الأمطار وتسهيل تصور الرواسب.
      3. قم بالطرد المركزي للعينة عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الطافية.
      4. اغسل الحبيبات 2x بإضافة 500 مل من 70٪ الإيثانول والطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
      5. تخلص من السائل وافتح الغطاء للسماح للحبيبات بالجفاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      6. أضف 7 ميكرولتر من الماء لإذابة الحبيبات. قم بإجراء النسخ العكسي باستخدام مجموعة توليف الحبلا الأول (كدنا) ، باتباع البروتوكول التفصيلي الوارد في دليل التعليمات.
      7. قم بتضخيم منطقة الترميز بأكملها باستخدام البادئات المناسبة (انظر جدول المواد) وقم بتشغيل الرحلان الكهربائي للأغاروز.
      8. استنساخ منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل ما لا يقل عن 30 نسخة لكل جنين لتحليل الطفرة التي ظهرت في الرنا المرسال.
        ملاحظة: للتأكد من وجود نمط ظاهري معيب ناتج عن طفرة مستهدفة لعامل الأم المهتم ، يجب أن تظهر جميع الأجنة (العدد > 5) ذات الأنماط الظاهرية المعيبة عدم وجود نصوص أمومية من النوع البري. على العكس من ذلك ، يجب أن تكون mRNAs الأمومية من النوع البري موجودة في جميع الأجنة التي تعبر عن sgRNA التي تتطور بشكل طبيعي (n > 5). في الوقت نفسه ، في الأجنة السلبية sgRNA ، يمكن اكتشاف mRNAs من النوع البري فقط (n > 5).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التوليد السريع للطفرات الأمومية rbm24a
قمنا ببناء ناقل معدل وراثيا يتيح التعبير عن علامة BFP للأم وأربعة sgRNAs عالية الكفاءة تستهدف تسلسل ترميز rbm24a. بعد إدخال هذا الناقل في أجنة rbm24a-RFP KIzpc: cas9 متماثلة اللواقح عبر Tol2 التبديل ، تم التعرف على Mrbm24a بسهولة وسرعة بين أجنة F1 إيجابية BFP بسبب عدم وجود بروتين Rbm24a-RFP (Figure 11A-D

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعيق الطفرات البيقية المميتة تحليل مساهمة الأم للجين. تتطلب الاستراتيجيات البديلة ، وأبرزها استبدال السلالة الجرثومية والحقن المجهري للبويضات في الموقع (OMIS) ، من الناحية الفنية 6,8. في عملية زرع الخلايا لاستبدال السلالة الجرثومية ، يتلقى الجنين المتلقي عددا قليلا جدا من PGCs ، وغالبا ما يمنع التطور الطبيعي للإناث16،17،18. يوفر استخدام ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تم منح هذا البروتوكول كبراءة اختراع من قبل الإدارة الوطنية الصينية للملكية الفكرية ، مما سيخفف من الاستخدام المقيد للطريقة بعد الحصول على إذن من المؤلفين. ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهما مصالح متنافسة أو مالية أخرى.

شكر وتقدير

نشكر Jianlin Shen و Yiteng Xu و Qingqing Wei من منصة المرافق والخدمات الأساسية ، كلية علوم الحياة. تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منح 32170816 و 32370860 و 32450630 و 31871451) ، وبرنامج العلماء المتميزين في منتصف العمر والشباب في جامعة شاندونغ ، وعلماء تايشان في مقاطعة شاندونغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2x M5 HiPer Taq PCR مزيجمي 5 بيوالقط # MF001-BD-100
الاغاروزMDbioالقط # A006L
طقم AxyPrep Plasmid Miniprepأكسيجنالقط # AP - MN - P-4
أداة الرحلان الكهربائي الشعري (Qsep400)ثنائي البصرياتغير متاح
مزيج وضع العلامات DIGروشالقط # 11277073910
DNase Iروشالقط # 4716728001
DTTثيرمو فيشر العلميالقط # R0861
مجموعة تخليق (كدنا) ذات الخيط الأولTransGen للتكنولوجيا الحيويةقط # AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLS نوكليازبرنامج GenScriptالقط # Z03389
الشعيرات الدموية الزجاجية (1.0 × 100 مم)مصنع رنتاي للمعدات التعليميةالقط # OS-2B
الجليكوجينبي بي آي لايف ساينسالقط # 28985
GraphPad المنشور 9GraphPadhttps://www.graphpad.com/
إيمج جيالمصدر المفتوحhttps://imagej.net/software/fiji/
الاغاروز منخفض الذوبانالتكنولوجيا الحيويهالقط # CA1351
Microforge (MF2)ناريشيجيغير متاح
مقياس الطيف الضوئي الدقيق (Nano-300)ألشنغغير متاح
أوليفياأوليمبوسغير متاح
البنسلين الستربتومايسينجيبكوالقط # 15140122
حاقن بيكو لتر (PLI-100A)   ؛جهاز هارفاردغير متاح
ملاقط مدببةWPIقطة # 500341
ملاقط مدببة  WPI  500341
مجتذب (PC-100)ناريشيجيغير متاح
مثبط RiboLock RNaseثيرمو فيشر العلميالقط # EO0381
آر ان تي بيثيرمو فيشر العلميالقط # R0481
خرز السيليكون هيدروكسيل المغناطيسيسانغون للتكنولوجيا الحيويةالقط # B518720-0001
T7 بوليميراز الحمض النووي الريبينيبالقط # M0251L
زولدWPIقوالب Cat # z

المراجع

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Tol2
توليد طفرات الأمهات باستخدام zpc: cas9 Knock-in Zebrafish
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.