تقليص التأثير الكبير: إنتاج مبسط للفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغدة عالية الإنتاجية

Philip Ohland; Miriam L. Ferreiro; Jatina Schumacher; Linda E. Franken; Catherine McKenzie; Thomas Steininger; Philippe Ringler; Matthias E. Lauer; Denis Phichith; Julia Fakhiri

doi:10.3791/68646

مقالة منهجية

تقليص التأثير الكبير: إنتاج مبسط للفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغدة عالية الإنتاجية

DOI:

10.3791/68646

⸱

سبتمبر 12, 2025

Philip Ohland¹^,²^,³ , Miriam L. Ferreiro¹ , Jatina Schumacher¹ , Linda E. Franken¹ , Catherine McKenzie¹ , Thomas Steininger⁴ , Philippe Ringler¹^,⁵ , Matthias E. Lauer¹ , Denis Phichith¹ , Julia Fakhiri⁴

¹Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, ²Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, ³Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, ⁴Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, ⁵Biozentrum, University of Basel

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من استخدامها على نطاق واسع في توصيل الجينات ، إلا أن النواقل الفيروسية المؤتلفة المرتبطة بالغدية (rAAV) تواجه تحديات إنتاج ملحوظة. يحدد هذا البروتوكول طرق الإنتاج المصغرة والمصغرة باستخدام كل من الخلايا الملتصقة. تعمل الطرق على تبسيط توليد النواقل وتنقيتها وتحسينها ، وبالتالي تسريع البحوث قبل السريرية وتسهيل التقدم في خط أنابيب العلاج الجيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، ظهرت النواقل الفيروسية المؤتلفة المرتبطة بالغدية (rAAV) كمنصة رائدة لتطبيقات العلاج الجيني. ومع ذلك ، لا تزال عمليات الإنتاج والتنقية المرهقة اختناقات كبيرة في تطوير الأدوية. يوفر إنتاج rAAV عالي الإنتاجية وصغير الحجم دون إجراءات تنقية كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا استراتيجية بديلة قيمة لتسريع البحوث قبل السريرية والفحص العلاجي في المراحل المبكرة. يتيح هذا النهج التوليد السريع لمتغيرات rAAV المتنوعة أو التركيبات العلاجية بجودة كافية للتقييم الأولي في المختبر وفي الجسم الحي . يقدم هذا البروتوكول طريقتين متميزتين بنوع الخلية وحجم الإنتاج: إنتاج rAAV على نطاق صغير وصغير الحجم. يتم الإنتاج على نطاق صغير بتنسيق 6 آبار باستخدام خلايا الكلى الجنينية البشرية الملتصقة (HEK) 293T (micro-6-well) ، بينما يستخدم الإنتاج المصغر خلايا معلقة في صفيحة 24 بئرا (mini-HT24). تخضع النواقل المتولدة من خلال هذه الطرق لتحليلات مجرى النهر لتحسين ظروف زراعة الخلايا و / أو تستخدم لتقييم النشاط البيولوجي للجينات المحورة. تشمل القراءات التحليلية الرئيسية معايرة جينوم المتجه (vg / mL) ، وتحديد عيار القفيصة (vp / mL) ، وتحليل اللطخة الغربية ، ومقايسات نقل الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتم مقارنة النواقل المنتجة على نطاق صغير وشبه منقى باستخدام راتنجات التقارب مع المستحضرات متوسطة الحجم المنقاة عن طريق تدرجات كثافة كلوريد السيزيوم. تظهر الطرق المبسطة الموضحة هنا إمكانات كبيرة لتحسين معلمات زراعة الخلايا ، وتحديد المرشحين الرئيسيين أثناء الفحوصات (أي أشرطة الجينات المعدلة والمحسنة أو قفيصات AAV الفائقة) ، وتعزيز التعبير عن الجينات المعدلة وضوئيا. بشكل جماعي ، تدعم مهام سير العمل المقدمة إنشاء منصة قوية وفعالة للتطوير التكراري في خط أنابيب العلاج الجيني التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر بحثي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تطوير الأدوية هو عملية معقدة وكثيفة الاستخدام للموارد تتطلب دمج بيانات عالية الجودة من مراحل مختلفة ، بما في ذلك تحديد الهدف والتحقق قبل السريري والتجارب السريرية¹. استجابة للطلبات المتزايدة على جداول زمنية أسرع وتكاليف مخفضة² ، اعتمدت صناعة الأدوية بشكل متزايد فحوصات صغيرة الحجم عالية الإنتاجية (HT) جنبا إلى جنب مع الذكاء الاصطناعي المتقدم (الذكاء الاصطناعي) كحجر زاوية لاستراتيجيات التطوير الحديثة³^،⁴^،⁵. تسمح فحوصات HT بالفحص والتقييم السريع لأعداد كبيرة من الأدوية المرشحة أو متغيرات الفحص في جزء بسيط من الوقت والتكلفة مقارنة بالطرق التقليدية⁵^،⁶.

في تطبيقات العلاج الجيني ، لا سيما تلك التي تستخدم النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدة (AAV) ، تشكل التكلفة العالية للسلع والجداول الزمنية الطويلة للتصنيع تحديات كبيرة⁷. تبدأ عملية التطوير بإنتاج مادة البلازميد المطلوبة للتعداء ، يليه نمو الخلايا إلى كثافات عالية كافية لإنتاج النواقل الفيروسية. بعد تعداء ، هناك حاجة إلى فترة حضانة من يومين إلى خمسة أيام قبل الحصاد ، وتنتهي العملية بالتنقية وتوصيف الدفعات⁸^،⁹. بشكل جماعي ، يمكن أن يستغرق سير العمل هذا ما يصل إلى شهر وعادة ما يكون مقيدا بعدد محدود من الاستعدادات التي يمكن تشغيلها بالتوازي عند استخدام أعمدة التقارب أو الطرد المركزي الفائق المتدرج⁹^،¹⁰^،¹¹^،¹².

إدراكا للحاجة إلى بروتوكولات إنتاج AAV صغيرة أو صغيرة أو صغيرة الحجم ، قام المجال بتكييف العديد من الأساليب لإنتاج AAV المؤتلف (rAAV) في إعدادات معملية صغيرة. تتضمن هذه الأساليب عادة استخدام أطباق متعددة مقاس 15 سم للخلايا الملتصقة¹³^،¹⁴ أو 50-2000 مل¹⁵ قوارير اهتزاز لمزارع التعليق. في الماضي ، تم استخدام طرق تنقية AAV ، مثل الطرد المركزي الفائق المتدرج (على سبيل المثال ، iodixanol¹⁶ أو كلوريد السيزيوم (CsCl) ¹⁷ أو تدرجات السكروز¹⁸). كانت هذه الطريقة غير المكلفة والمستقلة عن النمط المصلي مناسبة للغاية لإنتاج rAAV على نطاق المختبر ، لكن طبيعتها كثيفة العمالة وقدرتها المحدودة على أجهزة الطرد المركزي الفائقة تجعلها أقل ملاءمة للتطبيقات عالية الإنتاجية¹⁹^،²⁰.

أدى الطلب المستمر على إنتاجية أعلى إلى استكشاف مناهج بديلة لتقليص إنتاج rAAV. باستخدام الخلايا الملتصقة ، تم التحقيق في تنسيقات مثل 6-well¹³^،²¹^،²² و 96-well²³ وحتى 384-well^{لوحات 24} . في الآونة الأخيرة ، تم اعتماد خلايا التعليق ، نظرا لقابليتها المحسنة للتوسع والفاعلية المماثلة أو حتى الفائقة لمستليات النواقل⁸.

ومع ذلك ، فإن الإنتاج عالي الإنتاجية ل rAAV في الخلايا المعلقة ذات أحجام الاستزراع أقل من 15 مل لا يزال مجالا متخصصا ، مع بروتوكولات منشورة محدودة⁷^،²⁵^،²⁶. تركز معظم الدراسات على أحجام أكبر لتحقيق عوائد كافية للتطبيقات النهائية⁸^،⁹^،²⁷ ، ولكن كما هو الحال مع الخلايا الملتصقة ، توفر التنسيقات المصغرة تخفيضات كبيرة في استهلاك الموارد ووقت المعالجة ، وبالتالي تلبية حاجة ماسة في هذا المجال. الأهم من ذلك ، أن البروتوكولات المصغرة والدقيقة غالبا ما تستخدم "المحللات الخام" ، أو محاصيل زراعة الخلايا غير المنقاة التي تحتوي على جزيئات ناقلة ، لتوصيف المصب والتحليلات.

توضح هذه الدراسة بروتوكولين يستخدمان كلا من الخلايا المنتجة الملتصقة والمعلقة (الشكل 1). تستخدم محللات rAAV الخام المنتجة من خلايا HEK293T الملتصقة مباشرة للتطبيقات اللاحقة ، مثل نقل الخلايا المستهدفة. في المقابل ، تخضع rAAVs المتولدة في الخلايا المعلقة لمزيد من المعالجة عن طريق تنقية راتنج التقارب عالي الإنتاجية. تم تطوير هذه الطرق خصيصا لتحسين الإنتاجية وتقييم جودة النواقل ومراقبة التعبير المعدل وراثيا ، كل ذلك مع تقليل استهلاك الكواشف والمواد باهظة الثمن. تظهر النتائج المعروضة هنا أن كلا من المحللات الخام (من الخلايا الملتصقة) والمواد المنقاة بالتقارب (من الخلايا المعلقة) مناسبة، اعتمادا على نطاق التطبيق. علاوة على ذلك ، تمت مقارنة rAAV التي تم الحصول عليها باستخدام راتنجات التقارب مباشرة مع نظيراتها التي تم تنقيتها باستخدام الطرد المركزي الفائق التقليدي لكلوريد السيزيوم من حيث المحصول والنقاء وكفاءة التحويل في الثقافات العصبية المشتركة المشتقة من الإنسان.

يمثل اعتماد المقايسات عالية الإنتاجية وصغيرة النطاق في تطوير أدوية العلاج الجيني تقدما لا غنى عنه ، مما يسرع الابتكار ويسد الفجوة بين الاكتشاف العلمي والواقع العلاجي. لا تقلل هذه الطرق من التكاليف والجداول الزمنية فحسب ، بل تتيح أيضا الاختبار الموازي للعديد من الحالات ، مما يساهم في النهاية في التطوير الفعال للعلاجات التحويلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إنتاج الآبار الصغيرة 6 لنواقل rAAV في الخلايا الملتصقة

ملاحظة: إنتاج الآبار الصغيرة 6 ل rAAV هو نسخة مقتبسة من بروتوكول منشور سابقا بواسطة Fakhiri et ^al.21.

بذر وتعداء الخلايا HEK293T
1. قم بإذابة قارورة من HEK293T خلايا²⁸ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. نقل الخلايا إلى 30 مل من وسائط زراعة الخلايا الملتصقة في قوارير T175 والحفاظ عليها في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) + 10٪ مصل العجل الجنيني (FCS) ، عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. انقسام HEK293T كل 2-3 أيام: استنشق وسط زراعة الخلايا وأضف بعناية 10 مل من محلول ملحي فوسفات (PBS) لغسل الخلايا.
  ملاحظة: تم استخدام ممرات الخلايا الموجودة أسفل المقطع رقم 15 فقط في هذا البروتوكول لضمان سلامة وصحة الخلايا ، مما يؤثر بشكل مباشر على إنتاج rAAV.
4. أضف 2 مل من 0.025٪ من حمض التربسين / إيثيلين ديامين رباعي الخليك (EDTA) إلى الخلايا واحتضان لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية (أو حتى تنفصل الخلايا).
5. أوقف التفاعل بإضافة 20 مل من الوسط الطازج وتعليق الخلايا في الوسط باستخدام ماصة 25 مل. اعتمادا على التقاء ، يمكن تخفيف الخلايا 1:10 أو 1:20 في 24 مل من وسط الجلوكوز العالي DMEM. للحصول على كثافة خلية كافية للتعداء ، قم بزرع 7 × 10⁶خلايا HEK293T في قارورة T175.
6. بعد 72 ساعة عند 37 درجة مئوية ، احصد الخلايا عن طريق التربسين (كما هو موضح في الخطوة 1.1.3-1.1.5) ، وأعد تعليقها في 20 مل من الوسط ، وعد الخلايا.
  ملاحظة: يمكن حساب الخلايا باستخدام طرق مختلفة ، اعتمادا على الدقة المطلوبة ومعدل النقل والمعدات المتاحة. بشكل أساسي ، يتم استخدام طريقتين: العد اليدوي (غرفة نيوباور) وعدادات الخلايا الآلية. يستخدم هذا البروتوكول محلل خلية مؤتمت بالكامل قائم على الصور لقياس معلمات الخلية الهامة مثل الجدوى وكثافة الخلية ومعدل التجميع.
7. خلايا البذور بكثافة 0.5 × 10⁶ خلايا / بئر في صفيحة من 6 آبار. لتوزيع الخلايا بالتساوي ، رج اللوحة برفق وضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ .
8. بعد 24 ساعة ، تصل الخلايا إلى التقاء 60-70٪ ويمكن نقلها ثلاثيا.
9. لكل بئر ، امزج 90 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل مع إجمالي 2.6 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ، بما في ذلك pTransgene و pRep / Cap و pHelper بنسبة مولار 1: 1: 1.
10. في أنبوب ثان ، أضف 5 ميكرولتر من البولي إيثيلينمين (PEI) إلى 90 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل قبل تعداء التعداء مباشرة.
11. بعد الجمع بين المحلولين ، قم بتدوير الخليط واحتضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق.
12. أضف مزيج التعداء بالتنقيط إلى كل بئر. رج الألواح برفق قبل إعادتها إلى الحاضنة.
  ملاحظة: يمكن إجراء تغيير متوسط بعد تعداء التعداء ، ولكن لم يتم تطبيقه كممارسة قياسية ، حيث حافظت الخلايا على قابلية جيدة طوال التجربة.
حصاد الخلايا وتحللها
1. 72 ساعة بعد تعداء ، استنشاق وسط الخلية بعناية من اللوحة (الصوحات).
2. افصل الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر، وقم بإعداد الماصة بعناية لأعلى ولأسفل.
3. انقل معلق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل.
4. قم بقياس صلاحية الخلية وكثافتها يدويا أو تلقائيا باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
5. انقل 50 ميكرولتر من المعلق إلى لوحة سفلية مقاس 96 على شكل حرف U لتحديد كفاءة التعداء عن طريق تحديد المجموعات السكانية الإيجابية للمراسل عبر قياس التدفق الخلوي.
  ملاحظة: يوصى دائما بإجراء التحكم في تعداء التعداء بالتوازي ، أي تعداء 1-2 بئر مع جين معدلة تحمل بروتين فلوري (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، mCherry ، إلخ) لمراقبة كفاءة التعداء على اللوحة. تعمل الآبار ذات الخلايا غير المنقولة كعنصر تحكم سلبي.
6. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق عند RT إلى خلايا الحبيبات ، والتي تحتوي على الجزء الرئيسي من النواقل المنتجة.
7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS. يمكن تخزين تعليق الخلية عند -80 درجة مئوية.
  ملاحظة: للحصول على محللة خام من الخلايا المحصودة ، استخدم أحد الطريقتين الموضحين أدناه.
8. في النهج الأول ، يمكن إخضاع الخلايا لخمس دورات تجميد وذوبان الجليد ، كل 5 دقائق ، باستخدام حمام مائي مسخن مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية والنيتروجين السائل. باختصار دوامة العينات بين الدورات لمدة 2-3 ثوان.
9. الخيار الثاني والمستخدم بشكل رئيسي في هذا البروتوكول هو الصوتنة. هنا ، انقل تعليق الخلية إلى ألواح أو أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ذات الجدران الرقيقة وضعها عند 4 درجات مئوية في جهاز صوتات حمام مائي.
  1. عينات الصوتنة لمدة 3 دقائق مع زيادات 30 ثانية عند السعة (الكثافة) بنسبة 25٪.
10. بعد الصوتنة ، قم بإزالة الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي منضدية (16،100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية) لإزالة بقايا الخلية والحصول على تعليق ناقل خال من الخلايا.
11. انقل المواد الطافية إلى أنابيب سعة 1.5 مل وماصة 10 ميكرولتر من كل عينة إلى صفيحة منخفضة الارتباط بسعة 96 بئرا لتحليل تفاعل المتسلسل الرقمي (d) أو تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (d).
12. قم بتخزين الأنابيب وألواح 96 بئرا عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
نقل خلايا HEK293A باستخدام المحللات الخام
ملاحظة: قد لا تكون HEK293A الخلايا مناسبة لجميع الأنماط المصلية AAV. لتحديد خط خلوي مناسب ، يرجى الرجوع إلى قواعد البيانات مثل SPIRIT²⁹ (انظر جدول المواد للحصول على رابط لقاعدة بيانات SPIRIT) أو مقالات البحث الأصلية^{ذات الصلة 30} ^، ³¹.
1. HEK293A الخلايا في ثلاث صفيحات 96 بئرا قبل يوم واحد من التنبيغ بكثافة 1.5 × 10⁶ خلايا لكل لوحة.
2. في اليوم التالي ، امزج 10 ميكرولتر من النواقل المنتجة بأحجام مختلفة من PBS لتوليد تخفيفات 1: 2 و 1:10 و 1: 100.
3. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتحويل الخلايا في لوحة 96 بئرا في نسخ ثلاثية تقنية.
4. احتضان الخلايا مع rAAVs بدون تبادل متوسط لمدة 72 ساعة. بعد ذلك ، قم بإجراء التجارب النهائية اعتمادا على الجينات المعدلة وراثيا المعبر عنها ، مثل قياسات مستوى البروتين ، وتحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير البروتين الفلوري ، وتحليلات الضربة القاضية / بالضربة القاضية ، وما إلى ذلك.
5. بالنسبة لقياس التدفق الخلوي القياسي كما يتم إجراؤه في هذا البروتوكول ، قم بشفط الوسط وافصل الخلايا بإضافة 25 ميكرولتر من 0.025٪ التربسين / EDTA.
6. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
7. أوقف التفاعل بإضافة 175 ميكرولتر من ألبومين مصل البقر 1٪ (BSA) في PBS في كل بئر.
8. استخدم 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لتحليل قياس التدفق الخلوي.

2. إنتاج Mini-HT24 لنواقل rAAV في خلايا التعليق

ملاحظة: في إعداد mini-HT24 ، على عكس إنتاج micro-6-well الموصوف سابقا ، يتم إنشاء مستحضرات منقاة من نواقل rAAV باستخدام خلايا التعليق. تنتج مزارع التعليق كميات أكبر من rAAV بسبب زيادة كثافة الخلايا التي يمكن تحقيقها في نفس حجم الثقافة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام تنسيق بئر بعمق 24. يتم تنقية محللات الخلايا الخام بإنتاجية عالية باستخدام راتنجات التقارب AAVX بهدف توليد منتجات أنظف مطلوبة لتطبيقات معينة حيث لا تكون المحللات الخام مناسبة (انظر قسم المناقشة).

زراعة وتعداء ثلاثي للخلايا المعلقة في صفائح بئر بعمق 24
1. قم بإذابة قارورة من خلايا الإنتاج الفيروسي المعلقة (VPC) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. خلايا المرور أقل من 30 مرة لضمان الجودة المتسقة للنواقل المنتجة.
2. انقل الخلايا إلى 30 مل من وسائط زراعة التعليق في قارورة اهتزاز وزرعتها لمدة 2-3 أيام في ظروف مزرعة الصيانة: 37 درجة مئوية ، 8٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، رطوبة 95٪ ، و 140 دورة في الدقيقة (نصف قطر منصة الاهتزاز 25 مم).
3. حدد كثافة الخلايا القابلة للحياة بعد 2-3 أيام (انظر الملاحظة في الخطوة 1.1.6). استمر في الاستزراع الفرعي والتوسع حتى يتم الوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا القابلة للحياة المطلوبة لإنتاج AAV.
  ملاحظة: خلايا الاستزراع الفرعي بكثافة قابلة للحياة تبلغ > 4 × 10⁶ خلايا / مل و < 6 × 10⁶ خلايا / مل أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة بناء على خط الخلية الفردي المستخدم. البذور بكثافة قابلة للحياة من 6 × 10⁵ خلايا / مل لمدة 3 أيام ، مقسمة أو 3 × 10⁵ خلايا / مل لمدة 4 أيام. انقسام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
4. البذور 3 × 10⁶ خلايا / مل في 2.5 مل من كل بئر من صفيحة البئر بعمق 24 وقم بتغطية اللوحة بغطاء غشاء معقم.
5. قم بإعداد مزيج التعداء الثلاثي لكل بنية rAAV على النحو التالي:
  1. قم بإعداد مزيج الحمض النووي من البلازميدات الإنتاجية (pHelper ، pRep / Capsid ، pTransgene) بنسبة مولار 1: 1: 1 بكتلة نهائية تبلغ 600 نانوغرام DNA لكل 1 × 10⁶ خلايا قابلة للحياة.
  2. قم بإعداد المزيج في وسط ثقافة التعليق بحجم نهائي قدره 2.5٪ من حجم المزرعة المراد نقلها.
  3. قم بإعداد PEI-Mix في وسط ثقافة التعليق بحجم نهائي قدره 2.5٪ من حجم الاستزراع المراد نقله. استخدم كتلة نهائية تبلغ 1 نانوغرام PEI لكل 1 نانوغرام من الحمض النووي.
  4. اجمع بين كل من DNA-Mix و PEI-Mix عن طريق نقل الحجم الكامل لمزيج PEI-Mix الفردي إلى مزيج الحمض النووي المقابل ، مما ينتج عنه حجم مزيج تعداء بنسبة 5٪ من حجم الاستزراع.
  5. امزج عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    ملاحظة: لا تقم بتدوير مزيج تعداء بعد وقت الحضانة لتجنب تعطيل مجمعات PEI-DNA التي تشكلت أثناء الحضانة³².
  6. احتضان في RT لمدة 10 دقائق.
6. أضف خلطات التعداء بالتنقيط إلى الآبار المقابلة أثناء هز لوحة البئر العميقة بعناية.
7. أغلق اللوحة باستخدام فيلم حرير صناعي معقم قابل للتنفس وقم بتغطيته بالإضافة إلى غطاء الغشاء المقابل لتقليل التبخر.
8. تأكد من وضع اللوحة على صينية خلط مناسبة بئر عميق وقم بتثبيتها بإحكام.
9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 8٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 95٪ رطوبة و 225 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة.
  ملاحظة: تتطلب تنسيقات ألواح الآبار العميقة المختلفة تقييما فرديا لسرعة الاهتزاز لتمكين التبادل الفعال للغازات وزراعة الخلايا في تعليق متجانس دون أن تستقر الخلايا في القاع بمرور الوقت. يتطلب ذلك اختبارا أوليا يعتمد على معدات المختبر الفردية والإعداد ، بالإضافة إلى خطوط الخلايا المستخدمة في الإنتاج. ضع في اعتبارك بشكل خاص نصف قطر الاهتزاز وشكل اللوحة والشكل السفلي للحفاظ على تعليق الخلية متجانسا وتجنب استقرار الخلايا في الأسفل.
الحصاد والتحلل
1. حصاد الخلايا عن طريق نقل حجم المزرعة الكامل لكل بئر إلى أنابيب 5 مل المسماة بشكل فردي ، وأجهزة الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
2. استنشاق المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 550 ميكرولتر من Dulbecco's (D) PBS وانقل التعليق إلى أنبوب غطاء لولبي 1.8-2.0 مل لتجنب الهباء الجوي والسقوط عند فتح الأنابيب.
  ملاحظة: يمكن أيضا تخزين الكريات في هذه المرحلة لمتابعة عملية التنقية لاحقا. قم بتخزين الكريات المعلقة الملحية المخزنة بالفوسفات (DPBS) من Dulbecco عند -80 درجة مئوية وتأكد من مراعاة ذلك أثناء خطوات دورة التجميد والذوبان.
3. قم بإعداد المحللات عن طريق وضع الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة دقيقتين تقريبا ، ثم إذابتها في حمام مائي 37 درجة مئوية. كرر هذه الدورة 3-5x.
4. يتحلل جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1000 × جم عند 4 درجات مئوية. قم بتغطية دلاء أجهزة الطرد المركزي بأغطية محكمة الغلق.
5. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
  ملاحظة: يجب أن تكون المحللات واضحة وخالية من الحطام المرئي أو العكارة لتجنب انسداد الراتنج المستخدم في عملية التنقية. تجنب اهتزاز أو إزعاج الكريات. كرر خطوة الطرد المركزي في حالة عدم وضوح المواد الطافية. ضع في اعتبارك سرعة طرد مركزي أعلى أو مدة أطول في حالة العينات عالية التركيز أو العينات التي تحتوي على كميات كبيرة من الحطام.
تنقية rAAV عالية الإنتاجية القائمة على راتنج التقارب
1. في الدورق ، قم بإعداد Elution Buffer عن طريق إضافة 720 مجم من حامض الستريك إلى 50 مل من الماء عالي النقاء للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 75 ملي حامض الستريك.
2. قلب المخزن المؤقت حتى يذوب المسحوق تماما.
  ملاحظة: تأكد من أن حجم البئر كاف لاستيعاب أحجام المخزن المؤقت وأطراف الماصات دون انسكاب الآبار المجاورة أو المخاطرة بالتلوث المتبادل.
3. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 3.0 عن طريق إضافة 1 M حمض الهيدروكلوريك (HCl) مع التحريك المستمر للمخزن المؤقت والقياس باستخدام قطب الأس الهيدروجيني.
4. قم بتشغيل الترشيح المعقم على المخزن المؤقت باستخدام حجم مسام يبلغ 0.22 ميكرومتر.
5. قم بإعداد أعمدة من صفيحة بئر عميقة 96 بحجم بئر 2-2.2 مل للتنقية وفقا للمخطط الموضح في الجدول 1.
  ملاحظة: تم تنقية العينات هنا باستخدام إعداد ماصة إلكترونية متعددة القنوات. تتوافق العملية مع أنظمة معالجة السوائل الآلية ويمكن توسيع نطاقها للحصول على إنتاجية أعلى للعينة.
6. قم بتشغيل التنقية في خزانة السلامة الحيوية على RT باستخدام المعلمات الموضحة في مخطط التنقية (انظر الجدول 1) أو قم بتحسين المعلمات وفقا للمتطلبات الفردية ، اعتمادا على الراتنج أو حجم العينة ، والعيار المتوقع ، وما إلى ذلك.
7. بعد الشطف ، أضف 1/4 حجم شطف من Triggerization Buffer إلى كل عينة.
8. امزج عن طريق سحب 80٪ من الحجم 10x لأعلى ولأسفل.
9. قم بإعداد لوحات غسيل الكلى عن طريق إزالة أشرطة الغشاء وإضافة 1600 ميكرولتر من Dialysis Buffer إلى كل بئر.
  ملاحظة: تأكد من عدم ملامسة الأغشية للسائل قبل إجراء غسيل الكلى ، لأن إعادة التجفيف يمكن أن تضعف سلامة الغشاء ووظيفته.
10. انقل حجم العينة الكامل (300 ميكرولتر كحد أقصى) إلى كاسيت غسيل الكلى بتنسيق حجم مناسب وحجم مسام الغشاء (≥ 20,000 قطع الوزن الجزيئي (MWCO)). تأكد من تحميل الأغشية بشكل متجانس وعدم وجود فقاعات هواء.
11. ضع الكاسيت في الآبار المحملة للوحة غسيل الكلى وأغلق اللوحة بورق مانع للتسرب.
12. انقل لوحة غسيل الكلى إلى منصة اهتزاز واحتضنها عند 300 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
13. استبدل المخزن المؤقت لغسيل الكلى وكرر الحضانة عند 300 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
14. كرر التبادل المؤقت والحضانة 3x في المجموع.
15. نقل الحجم الكامل للعينات التي تم تشخيصها إلى أنابيب تخزين مصنفة وتخزينها عند 4 درجات مئوية إذا تم استخدامها لاحقا للتوصيف أو التجارب الأخرى.
16. يخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. تجنب دورات ذوبان الجليد لأن ذلك يمكن أن يؤثر على فاعلية AAVs ، وقم بإعداد كميات صغيرة إذا لزم الأمر.
المعايرة بالتحليل الحجمي للعيار الجينومي rAAV من المحللات الخام والتنقية القائمة على الراتنج باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR)
1. لتحديد العيار الجيني للمحللات الخام ، أي الجينومات الفيروسية لكل مل (vg / mL) ، قم بإذابة عينات النواقل المحصودة عند RT ثم ماصة 10 ميكرولتر في أنبوب.
  ملاحظة: تتوفر عدة طرق لتحديد عيار الجينوم الفيروسي (vg / mL) لمستحضر الناقل ، مع القياس الكمي المطلق يعتمد عادة على طريقتين رئيسيتين: الطريقة القائمة على القطرات أو المستحلب (ddPCR) ، والطريقة القائمة على الصفيحة الدقيقة ، ممثلة بتفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي (dPCR) ³³^،³⁴. بالإضافة إلى هذه الطرق الرقمية ، يمكن أيضا تحقيق القياس الكمي المطلق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR). في حين أن qPCR هي تقليديا طريقة قياس كمية نسبية ، إلا أنه يمكن تكييفها للقياس الكمي المطلق باستخدام منحنى قياسي بلازميد. يتضمن ذلك بلازميدا يحتوي على التسلسل المستهدف بتركيز معروف ، والذي يعمل كمرجع لاستقراء عيار الجينوم الفيروسي²¹^،³³. على الرغم من أن qPCR أسرع وأقل تكلفة من ddPCR أو dPCR ، إلا أنه أقل دقة ويعتمد بشكل كبير على دقة معيار البلازميد¹⁶. بغض النظر عن طريقة القياس الكمي ، يجب معالجة العينات مسبقا لإطلاق الجينومات الفيروسية من الجسيمات. يتبع هذا البروتوكول طريقة موصوفة سابقا من قبل Dobnik، D. et^{al 35}.
2. عالج عينات rAAV بنوكلياز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتحلل الحمض النووي البلازميد الحر من عملية التعدي.
  ملاحظة: اختياري ، اعتمادا على الإنزيم المستخدم: عينات تسخين إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعطيل الإنزيم وتحلل قفيصة الناقل.
3. بعد التبريد إلى RT ، أضف Proteinase K لمدة 15 دقيقة لهضم شظايا القفيصة.
4. لتعطيل البروتيناز K ، قم بتسخين العينات مرة أخرى إلى 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
5. قم بإعداد الخلطات الرئيسية ddPCR أو dPCR باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
6. استخدم مجسات الحمض النووي المسماة لأنها توفر إشارة أكثر تحديدا من الأصباغ المقحمة. تصميم مجسات للربط "مركزيا" في الجينوم الفيروسي ، أي في الجين المعدل (انظر الملاحظة) ، بدلا من المروج أو ذيل polyA ، واختيار الفلوروفور مثل hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX) أو 6-carboxyfluorescein (FAM) المتوافق مع نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعني.
  ملاحظة: في الآونة الأخيرة ، تم استخدام ddPCR أو dPCR متعدد الإرسال ، باستخدام مجموعات التمهيدي / المسبار التي تستهدف مناطق مختلفة من الجينوم الفيروسي ، لتعزيز دقة تحديد العيار³⁶^،³⁷. يتيح هذا النهج القياس الكمي للجينومات السليمة من خلال تطبيق الصيغ الموضحة في الدراسات المشار إليها أو باستخدام حلول برمجية متكاملة.
7. قم بإجراء تخفيف تسلسلي بمقدار 10 أضعاف للعينات التي تمت معالجتها لاحقا في ddH₂O باستخدام ألواح 96 بئرا منخفضة ربط الحمض النووي. أخيرا ، قم بنقل 5.5 ميكرولتر (ل ddPCR) أو 2 ميكرولتر (ل dPCR) من القالب (التخفيفات 10⁴- و 10⁵) إلى لوحة ddPCR 96 بئر ، والتي تحتوي بالفعل على المزيج الرئيسي ddPCR / dPCR بما في ذلك التمهيدي / المجسات. اضبط نطاق التخفيف بناء على كفاءة الإنتاج للتركيبات الفردية لضمان وقوع القياسات ضمن نطاق الكشف الخطي.
  ملاحظة: نظرا لأن القياس الكمي ل dPCR / ddPCR هو طريقة حساسة للغاية ، فهناك حاجة إلى 10⁴ و¹⁰ 5 تخفيفات للعينات.
8. اتبع الخطوات الموضحة أدناه ل ddPCR.
  1. لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحسين ظروف الفحص ، بما في ذلك التعديلات على أوقات التلدين والتضخيم بناء على مجموعة (مجموعات) التمهيدي / المسبار المستخدمة. كان بروتوكول ركوب الدراجات القياسي المستخدم في هذه الدراسة على النحو التالي: التمسخ الأولي عند 9 درجات مئوية لمدة 10 دقائق (تصاعد درجة مئوية / ثانية) ؛ 35 دورة تمسخ عند 9 درجات مئوية لمدة 30 ثانية وتضخيم عند 6 درجات مئوية لمدة 60 ثانية ؛ تليها خطوة استطالة نهائية عند 9 درجات مئوية لمدة 10 دقائق (تصاعد درجة مئوية / ثانية).
  2. بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لأهداف الجينوم الفيروسي rAAV ، انقل اللوحة إلى قارئ القطرات واتبع تعليمات الشركة المصنعة لقياس شدة التألق في كل بئر. يتيح قارئ القطرات القياس الكمي المطلق لأرقام نسخ الجينوم الفيروسي تفاعل pe μL.
9. اتبع الخطوات الموضحة أدناه ل dPCR.
  1. كما هو موضح للقياس الكمي المستند إلى ddPCR ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحسين ظروف الفحص.
  2. كنقطة انطلاق ، اتبع المظهر الحراري المحدد مسبقا على جهاز dPCR ، والذي يتضمن خطوة تمسخ أولية عند 9 درجات مئوية لمدة دقيقتين ، تليها 40 دورة تمسخ عند 9 درجات مئوية لمدة 15 ثانية والتلدين / التمديد عند 5 درجات مئوية لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام معدلات المنحدرات الموصى بها وأحجام التفاعل المحددة من قبل الشركة المصنعة.
10. تحليل بيانات ddPCR و dPCR باستخدام حلول برمجية مختلفة ، يتم توفيرها عادة من قبل الشركة المصنعة للأداة (على سبيل المثال ، مدير QX و QIAcuity Software Suite 1.2 ، على التوالي). بالنسبة لكلتا الطريقتين ، حدد فقط تخفيفات العينات مع نسبة كافية من الأقسام / القطرات الموجبة إلى السالبة للقياس الكمي.
  ملاحظة: لتحديد عيار جسيمات rAAV (vp / mL ؛ vp = الجسيمات الفيروسية) من المحللات الخام والمواد المنقاة براتنج AAVX ، يمكن استخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).، تتوفر مجموعات ELISA القياسية المختلفة المتوفرة تجاريا لقياس AAV (المجموعات المستخدمة في هذا العمل مدرجة في جدول المواد). قم بإجراء الفحص وفقا لدليل (دليلات) الشركة المصنعة. تأكد من أن مجموعة ELISA المستخدمة متوافقة مع النمط المصلي AAV الذي يتم إنتاجه.
تحليل نسبة VP من rAAVs المنقاة
ملاحظة: لتحديد نسبة بروتين القفيصة الفيروسي (VP) لكل عينة من الآبار الفردية لإعداد 24 بئرا عميقا ، يمكن إجراء إما لطخة غربية قياسية أو بروتوكولات آلية قائمة على الشعيرات الدموية.
1. للكشف عن بروتينات القفيصة AAV2 VP1 و VP2 و VP3 ، استخدم جسما مضادا أحادي النسيلة الأساسي المضاد ل AAV VP1 / VP2 / VP3. تأكد من أن الجسم المضاد الأساسي يعمل مع النمط المصلي أو متغير القفيصة المعني.
2. استخدم عناصر تحكم إيجابية مناسبة ، مثل VP1 و VP2 و VP3 المؤتلف أو معيار مرجعي AAV.
3. قم بإعداد عنصر التحكم الإيجابي بنسبة جزيئية تبلغ 1: 1: 10 (VP1: VP2: VP3) لتقليد نسبة VP المتوقعة. ويعمل هذا أيضا كمرجع لتقدير نسبة VP باستخدام تكامل منطقة الإشارة.
4. حدد مجموعة شعرية ذات نطاق مناسب يشمل بروتينات القفيصة المراد اكتشافها ، بما في ذلك الأصغر (VP3 مع ~ 60 كيلو دالتون) والأكبر (VP1 مع ~ 82 كيلو دالتون). يمكن أن يختلف هذا اعتمادا على النمط المصلي ومتغير القفيصة المستخدم.
5. قم بإعداد الكواشف والسلم البيوتينيل الموجود في المجموعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
6. قم بإعداد سلسلة تخفيف من العينات (إما بناء على العيار الجيني بدءا من 1 × 10¹² فولت غرام / مل إلى 1 × 10¹⁰ فولت غرام / مل أو 1: 2 مخففات بدءا من العينة غير المخففة إلى 1: 64) في مخزن التخفيف المقدم للمجموعة لضمان نطاق كشف جيد لكل عينة.
7. قم بتخفيف الجسم المضاد الأولي في مخزن تخفيف الأجسام المضادة المقدم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو اعتمادا على الاختبار السابق. ابدأ ب 1: 100.
8. استخدم مجموعة أدوات الكشف المقابلة التي تعتمد على مصدر الجسم المضاد الأساسي.
9. قم بتحميل اللوحة وفقا للمخطط المرفق مع المجموعة.
10. تأكد من ملء الأعمدة الفارغة بالماء أو مخزن تخفيف العينة أيضا حتى لا تتلف الشعيرات الدموية للأداة عن طريق الجفاف.
11. قم بتغطية اللوحة بورق مانع للتسرب وجهاز طرد مركزي عند 1200 × جم ، 5 دقائق ، عند 4 درجات مئوية.
12. انقل اللوحة والشعيرات الدموية إلى الجهاز واستخدم الشروط القياسية المحددة مسبقا للجري.
13. قم بتحليل التشغيل باستخدام برنامج تحليل البيانات ، مثل Compass (الإصدار 6.3.0) ³⁸.
  ملاحظة: لتحليل سلامة الجسيمات ، والتشتت الأحادي ، والنقاء ، يوصى باستخدام المجهر الإلكتروني لنقل التلوين السلبي (ns-TEM). يمكن إجراء تحليل TEM كما هو موضح بواسطة Steininger et. ^{آل 25}. ومع ذلك ، يمكن أن توفر الطرق الأخرى ، مثل قياس الضوء الكتلي³⁹ و SEC-MALS⁴⁰ وتلوين الشظية⁴¹ أيضا قراءات تكميلية لتقييم جودة مستحضرات rAV.
التنبيغ بجزيئات فيروسية نقية
ملاحظة: لنقل الخلايا ذات النواقل الفيروسية المنقاة ، يجب تحديد تعدد العدوى (MOI). يتم تعريف وزارة الداخلية على أنها عدد الجينومات المحتوية على الجسيمات المضافة لكل خلية. من المهم ملاحظة أن هذه قيمة نظرية. يعتمد العدد الفعلي لجينومات rAAV التي يتم تسليمها لكل خلية على قدرة القفيصة على تحويل الخلايا المستهدفة بنجاح. لذلك ، يجب دائما تحديد وزارة الداخلية المثلى تجريبيا. في هذا القسم ، كان الهدف هو مقارنة مخزونين من النواقل الفيروسية ، والتي تم إنتاجها باستخدام طرق تنقية مختلفة (الطرد المركزي الفائق بكلوريد السيزيوم وراتنج تقارب AAVX). تحقيقا لهذه الغاية ، تم تحويل الثقافات العصبية المشتركة المشتقة من الإنسان مع المستحضرين ، وتم تقييم كفاءة التنبيغ باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
1. قم بتغطية لوحة سفلية بصرية سوداء 96 بئر ب 0.1٪ (Poly-L-Ornithine) PLO طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ≥ 1 ساعة.
2. في يوم البذر ، استنشق كاشف طلاء PLO وقم بتغطيته بمصفوفة غشاء الطابق السفلي ذات معامل النمو المنخفض واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ≥1 ساعة.
3. زراعة الخلايا العصبية الحركية مع الخلايا النجمية بنسبة 1: 6 أو لكل توصية من الموردين.
4. في 2 أيام في المختبر (DIV) ، قم بتحويل الثقافة المشتركة بوزارة الداخلية قدرها 50,000.
5. ذوبان الجليد الفيروسي عند 4 درجات مئوية.
6. تحضير وسائط التحويل (النواقل الفيروسية عند وزارة الداخلية المطلوبة بناء على الجينوم الفيروسي لكل خلية + وسائط زراعة الخلايا بأحجام مناسبة لاستبدال 50٪ من وسائط الاستزراع لكل بئر).
7. قم بإجراء تبادل الوسائط بنسبة 50٪ مع وسائط النقل.
8. في 5 DIV ، قم بإجراء تبادل كامل للوسائط الإعلامية مع وسائل الإعلام الثقافية العادية.
9. حافظ على الخلايا مع تبادل وسائط الاستزراع المنتظم كل 2-3 أيام أو وفقا لتوصية المورد.
10. راقب مستويات التعبير باستخدام مجهر تصوير حي مزود بالإثارة الصحيحة للجينات المعدلة وراثيا للمراسل. بالنسبة للخلايا العصبية المشتقة من الإنسان ، لوحظ التعبير عن الهضبة بين 10-14 يوما بعد التنبيغ (انظر الشكل 4 أ).

درج	العازلة / المواد	حجم البئر [μL]	حجم العمل [ميكرولتر]	دورات	معدل التدفق [ميكرولتر / دقيقة]
1. التوازن	التوازن/ اغسل I عازلة	1100	950	2	500
2. تحميل / التقاط	عينة طافية	550	500	4
3. اغسل أنا	التوازن/ اغسل I عازلة	1100	950	2
4. اغسل II	Wash II Buffer	1100	950	2
5. الشطف	المخزن المؤقت للشطف	70 ميكرولتر (أطراف راتنج 20 ميكرولتر) 250 ميكرولتر (80 ميكرولتر من أطراف الراتنج)	60 ميكرولتر (أطراف راتنج 20 ميكرولتر) 240 ميكرولتر (80 ميكرولتر من أطراف الراتنج)	4
6. التحييد	المخزن المؤقت للتحييد	أضف 1/4 من حجم الشطف مباشرة إلى كل عينة عينة 70 ميكرولتر → إضافة 17.5 ميكرولتر عينة مفائحة 250 ميكرولتر → أضف 62.5 ميكرولتر		-	-

الجدول 1: تخطيط اللوحة ومعلمات التنقية لتنقية راتنج التقارب ل rAAVs.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في السنوات الأخيرة ، زاد الطلب على إنتاج ناقلات AAV على نطاق المختبر بشكل كبير ، مما أدى إلى إنشاء العديد من منظمات البحث التعاقدية التي تقدم هذا كخدمة⁴². نظرا للتكاليف المرتفعة والجداول الزمنية المتأخرة التي غالبا ما ترتبط بالاستعانة بمصادر خارجية ، يظل إنتاج rAAV الداخلي خيارا جذابا. على وجه الخصوص ، تعتبر البروتوكولات عالية الإنتاجية التي تقلل من استهلاك المواد وساعات العمل مع دمج خطوات التنقية مفيدة للغاية في خط أنابيب تطوير الأدوية.

يحدد هذا البروتوكول إعدادين عالي الإنتاجية لإنتاج rAAV: نهج micro-6-well باستخدام الخلايا الملتصقة وبروتوكول mini-HT24 للخلايا المعلقة (انظر نظرة عامة في الشكل 1). يستخدم إعداد micro-6-well خلايا HEK293T ملتصقة لإنتاج rAAV بتنسيق 6 آبار. تم استخدام هذه المادة لتقييم تأثيرات اثنين من كواشف تعداء PEI المتوفرة تجاريا وكلوريد الصوديوم (NaCl) على إنتاج rAAV2 (الشكل 2 أ). هنا ، تمت مراقبة معلمات مختلفة في نفس الوقت: (أنا) قابلية الخلية المنتجة للحياة وكفاءة تعداء باستخدام جين GFP المعدل (الشكل 2 ب والشكل التكميلي 1) ، و (ثالثا) النسبة المئوية للخلايا الإيجابية GFP (GFP +) بعد التنبيغ باستخدام المحللات الخام (الشكل 2 ج). كانت تجربة التحويل بمثابة قراءة غير مباشرة غير مكلفة وسريعة للعيارات والوظائف المتجهة. ومن المثير للاهتمام ، أن النسب المنخفضة من كاشف التعداء إلى الحمض النووي كانت كافية لتعزيز إنتاج النواقل الفعال (الشكل 2 ب) مع الحفاظ على بقاء الخلية الجيدة. علاوة على ذلك ، بدت إضافة 150 ملي كلوريد الصوديوم مفيدة ، خاصة عند استخدام كاشف PEIpro. قدم إجراء هذه التجربة على نطاق صغير العديد من المزايا: (أنا) سير عمل سريع ، مع اكتمال بذر الخلايا ، والتعداء ، وحصاد النواقل في غضون أسبوع واحد. (2) التوافق مع المقايسات التحليلية القياسية النهائية؛ و (ثالثا) قابلية تطبيق واسعة على جميع الأنماط المصلية AAV.

بالنسبة للتطبيقات التي تتطلب كميات أكبر من نواقل rAAV ، مثل التجارب في الجسم الحي أو الدراسات الحركية في المختبر (حيث يتم تطبيق نطاق أعلى أو أوسع من سبل الداخليات) ، من الضروري توسيع النطاق. لإنشاء بروتوكول mini-HT24 يوفر مادة كافية للتنقية عالية الإنتاجية ، تم استخدام خلايا التعليق. بالمقارنة مع الخلايا الملتصقة ، توفر مزارع التعليق قابلية توسع أفضل وأكثر كفاءة في المساحة ، لأنها غير مقيدة بمساحة السطح. نظرا لأن الخلايا المعلقة تنمو بحرية في الوسط ، فإنها يمكن أن تشغل حجم المزرعة بالكامل ، مما يجعل التوسع في ثلاثة أبعاد أكثر وضوحا. يتيح ذلك تحقيق كثافة خلايا أعلى مقارنة بمزارع الطبقات. بالإضافة إلى ذلك ، يسهل صيانة أنظمة التعليق ومعالجتها حيث لا توجد حاجة إلى خطوات انفصال أثناء المرور أو الحصاد. تم تقييم توحيد إنتاج rAAV بتنسيق 24 بئرا من خلال تحليل ثلاث معلمات رئيسية عبر اللوحة (الشكل 3): (أ) عيار الجسيمات (vp / mL) ؛ (ب) نسبة نائب الرئيس في القفيصة؛ (ج) العيار الجيني (vg / mL) و (D) نسبة الفراغ إلى المكتمل.

بينما لوحظ بعض التباين عبر هذه المعلمات ، إلا أنها ظلت إلى حد كبير ضمن نطاق مزدوج ، وهو ضمن هامش خطأ القياس. تم تقييم تعبير بروتين VP أيضا باستخدام تحليل اللطخة الغربية الآلي (الشكل 3E). أخيرا ، يتم تقديم مقارنة بين إجمالي الغلة التي تم الحصول عليها من إنتاج micro-6-well و mini-HT24 ومتوسط الحجم (قارورة اهتزاز) لتوجيه اختيار المقياس المناسب بناء على المتطلبات التجريبية والاحتياجات التحليلية النهائية (الشكل 3F).

أحد الجوانب الحاسمة في أي بروتوكول تنقية AAV هو تقييم نقاء النواقل وفعاليتها. هنا ، تمت مقارنة النواقل المنقاة بالراتنج جنبا إلى جنب مع تلك التي تم تنقيتها باستخدام طريقة الطرد المركزي الفائق (UC) القائمة على كلوريد السيزيوم (CsCl) المكونة من خطوتين (الشكل 4). لوحظت فعالية مماثلة بين المستحضرين عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، كما يتضح من التنبيغ الناجح للخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية (الشكل 4 أ). كشف التحليل المجهري الإلكتروني عن عدم وجود اختلافات ذات دلالة إحصائية في شكل الجسيمات أو حالة التجميع. ومع ذلك ، كان هناك اتجاه طفيف يشير إلى أن تنقية CsCl أسفرت بشكل أكثر اتساقا عن مستحضرات أنظف (الشكل 4 ب).

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على طرق إنتاج وتحضير rAAV. يوضح هذا الشكل طرق إنتاج rAAV ، بدءا من قوارير الاهتزاز متوسطة الحجم إلى مزارع التعليق المصغرة HT24 والثقافات الملتصقة بالبئر الصغيرة. تتيح هذه الأساليب توليد rAAV على نطاقات مختلفة ، باستخدام استراتيجيات مختلفة لتحلل الخلايا وتنقية النواقل. عادة ما يتضمن التوصيف النهائي ل rAAVs qPCR / dPCR لقياس الجينوم الفيروسي (vg / mL) ، و ELISA لتحديد عيار القفيصة (vp / mL) ، ومقايسات نقل الخلية لتقييم النشاط البيولوجي. تم إنشاؤه في BioRender. أولاند ، ب. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحسين بروتوكول التعداء لإنتاج rAAV micro-6-well. (أ) نظرة عامة تخطيطية للتجربة مع المعلمات المختبرة والقراءات التحليلية. (ب) تم زرع HEK293T الخلايا في ألواح من 6 آبار بكثافة 0.5 × 10⁶ خلايا / بئر قبل 24 ساعة من التعدي. تم اختبار كميات مختلفة من الحمض النووي وأنواع PEI (Pro أو Max) والنسب وتركيزات كلوريد الصوديوم. (ج) النسبة المئوية للخلايا إيجابية GFP (GFP +) HEK293A بعد 72 ساعة من التحويل بأحجام متساوية من المحللات من اللوحة A (10 ميكرولتر لكل منهما). من أجل البساطة ، يتم عرض حالة الحمض النووي التي أدت إلى أعلى عوائد ناقلات (2650 نانوغرام) فقط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التوصيف التحليلي ل rAAV المنتج في إعداد mini-HT24 ومقارنة العيار عبر مقاييس مختلفة. (أ) تحليل ELISA لعيار قفيصة rAAV المنقى في كل بئر. يتم تمثيل القيم على أنها اختلافات أعلى من متوسط عيار الجسيمات للصفيحة بعد التنقية. تعتمد العيار المتوقع على قفيصة AAV المستخدمة والجينات المحورة المعبأة. تراوحت عيار الجسيمات لنواقل AAV المختلفة بين 10¹¹ منخفض إلى مرتفع^{10 12} VP / مل. (ب) تحليل نسبة VP بواسطة WES ل rAAV المنقى من الآبار المشار إليها. تم استخدام AAV2 المؤتلف VP1 و VP2 و VP3 كعناصر تحكم إيجابية بنسبة مولية تبلغ 1: 1: 10. (ج) تحليل dPCR ل rAAV المنقى من كل بئر. تظهر القيم على أنها اختلافات أعلى من متوسط العيار الجيني للوحة بعد التنقية. تعتمد العيار المتوقع على قفيصة AAV المستخدمة والجينات المحورة المعبأة. تراوحت العيار الجيني لنواقل AAV المختلفة بين 10¹⁰ منخفض (rAAV2) إلى مرتفع^{10 11} vg / mL (rAAV9 ، غير موضح هنا). (د) نسبة الفراغ إلى الممتلئ (E/F) للآبار المشار إليها، استنادا إلى النتائج الجينومية وعيار الجسيمات من اللوحتين A و C. يتم تطبيع القيم إلى متوسط اللوحة. متوسط E / F بتنسيق mini-HT24 ل rAAV2 الموضح هو 10.6٪ ± 3.0٪ بعد تنقية راتنج التقارب AAVX. (ه) تحليل اللطخة الغربية الشعرية لبروتينات VP في عينات rAAV2 المنقاة من كل بئر. (و) مقارنة إجمالي غلة الجينوم الفيروسي مع الأخذ في الاعتبار أحجام العينة النهائية وتركيز كل طريقة. يتم عرض البيانات على أنها متوسط فرق الطية على أصغر تنسيق (micro-6-well) ، مع أشرطة خطأ تشير إلى الانحراف المعياري (SD) عن التكرارات البيولوجية. لإنتاج 24 بئرا عميقة عالية الإنتاجية مع تنقية راتنج التقارب AAVX ، SD = ±0.176 (ن = 24) ؛ للصوتنة micro-6-well. SD = ±0.349 (ن = 6) ؛ وللإنتاج القياسي على نطاق متوسط مع تنقية التدرج CsCl ، SD = ±134.70 (ن = 2). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مقارنة الفاعلية والنقاء بين rAAV المنقى بالراتنج عالي الإنتاجية (HT) والعينات القياسية المنقاة من CsCl. (أ) تم تحويل الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية المشتقة من الإنسان بنفس بنية rAAV التي تعبر عن مراسل التألق mRuby3 تحت محفز المشبك البشري كمراسل في وزارة الداخلية تبلغ 50,000. تم التقاط صور الفحص المجهري الفلوري على مجهر التصوير المباشر بعد سبعة أيام من التحويل (DPT). تم تنقية rAAVs باستخدام طريقة التدرج القياسية CsCl (أعلى) أو النهج القائم على طرف راتنج التقارب HT AAVX (أسفل). تعرضت العينات المنقاة من CsCl لدورة تجميد ذوبان إضافية واحدة قبل إجراء التحويل ومقارنتها ب rAAVs المنقاة بالراتنج. (ب) تحليل المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للمتغيرات القائمة على النمط المصلي rAAV2 المنقاة عبر طرق التدرج CsCl (الأعلى) وطرف راتنج HT (أسفل). يمكن مقارنة دفعتين من عينات منقاة من راتنج HT من rAAV2 بدون غسيل الكلى (أسفل اليسار) ومع غسيل الكلى (أسفل اليمين). تم تحديد النسب الفارغة إلى الكاملة (E / F) باستخدام TEM لتكون ممتلئة بنسبة 90٪ > للعينات المنقاة بالطرد المركزي الفائق التدرج CsCl و < 40٪ ممتلئة للعينات المنقاة من راتنج التقارب AAX. شريط المقياس = 100 نانومتر. تعرض اللوحة B صورا تمثيلية للدفعات المنقاة باستخدام الطرق المشار إليها. يرجى ملاحظة أن هذه الصور لا تنتمي إلى نفس المستحضرات المستخدمة في تجارب التحويل الموضحة في اللوحة A. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل التكميلي 1: تعداء خلايا HEK293T لإنتاج rAAV2-GFP باستخدام إعداد micro-6-well. تم استخدام كميات مختلفة من الحمض النووي ، وتركيزات كلوريد الصوديوم (بالمللي مولار) ، ومنتجات PEI ، ونسب PEI إلى DNA للتعداء (كما هو موضح في الشكل 2). تم التقاط الصور بعد 72 ساعة من التعداء باستخدام نفس وقت التعريض الضوئي (320 مللي ثانية). يتم عرض صور المجال الساطع والفحص المجهري الفلوري التمثيلية في هذا الشكل. التكبير: 10X. شريط المقياس غير معروض ؛ الصورة لأغراض توضيحية وتقييم نوعي فقط. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح ورقة البروتوكول هذه طرقا فعالة لإنتاج rAAV في إعدادات عالية الإنتاجية وصغيرة الحجم باستخدام كل من الخلايا الملتصقة والخلية المعلقة. تعالج هذه المنهجيات الطلب المتزايد على عمليات إنتاج rAAV القابلة للتطوير والمرنة التي تدعم الأبحاث قبل السريرية مع تقليل الوقت والتكلفة واستهلاك الموارد.

توفر كل من أنظمة الخلايا الملتصقة والمعلقة مزايا وتحديات مميزة لإنتاج rAAV على نطاق صغير. أنظمة الخلايا الملتصقة ، مثل HEK293T الخلايا²⁸ المزروعة في تنسيقات الألواح متعددة الآبار ، مناسبة بشكل خاص لتصميم ناقلات المراحل المبكرة والدراسات المقارنة. يتيح توافقها مع بروتوكولات الزراعة والتعداء المعمول بها التنفيذ المباشر في معظم المختبرات. على سبيل المثال ، Grosse et al. تستخدم الإنتاج على نطاق صغير في ألواح ذات 6 آبار للتحقيق في وظائف AAP ، وهو بروتين حاسم لتجميع القفيصة الفيروسية²². Drittanti et al. أنتج نواقل rAAV في 96 صفيحة بئر لتقييم حركية تكرار rAAV واختبار تأثيرات مساعدي الفيروس الغدي المختلفين على إنتاج rAAV²³. والجدير بالذكر أنه في الدراسة الأخيرة ، تم وصف فحص النسخ المتماثل باستخدام خلايا HeLa المتخصصة التي تعبر عن AAV Rep و Cap لتضخيم الإشارة بشكل أكبر. في الآونة الأخيرة ، Quan et al. طبق بروتوكول إنتاج عالي الإنتاجية 384 بئرا في سياق شاشة siRNA ، حيث أبلغ عن عيارات نسبية²⁴. ومع ذلك ، نظرا للكمية المحدودة من المواد ، لا يزال من غير المؤكد عدد المقايسات والقراءات التي يمكن إجراؤها ، أو ما إذا كان يمكن تحقيق سبل مختلفة كافية في تجارب نقل الخلايا بما يتجاوز قياس البروتينات الفلورية ، مما قد يؤثر على قابلية التكاثر.

في هذا العمل ، تم استخدام الإنتاج القائم على البئر الصغير 6 في خلايا HEK293T الملتصقة لتحسين ظروف الاستزراع ل rAAV2 (الشكل 1 والشكل 2). تماشيا مع الدراسات السابقة والتقارير الفنية⁴³^،⁴⁴ ، أثر انخفاض نسب PEI إلى DNA وإضافة كلوريد الصوديوم أثناء التعداء بشكل إيجابي على إنتاج rAAV. انعكس هذا بشكل غير مباشر في كفاءات التنبيغ للنواقل المنتجة في خلايا HEK293A. تعزى الاختلافات المذهلة التي لوحظت مع انخفاض نسب PEI: DNA بشكل أساسي إلى الإجهاد الخلوي ، كما يتضح من انخفاض قابلية الخلية للبقاء ، خاصة مع PEIpro. على الرغم من أن التأثيرات كانت أقل وضوحا في ظل ظروف PEImax ، إلا أن الصور المجهرية كشفت عن مناطق خالية من الخلايا في الطبقة الخلوية ، مما يشير إلى الإجهاد أو انفصال الخلية (الشكل التكميلي 1).

الأهم من ذلك ، أن هذه النتائج لم تكن قابلة للتطبيق بشكل مباشر على إنتاج النواقل في مزارع التعليق ، مع التأكيد على أن الظروف التجريبية التي تعزز إنتاج rAAV في خلايا HEK293T الملتصقة قد لا تترجم دائما إلى خلايا معلقة ، حتى عندما يظل نوع الخلية الأساسية كما هو. يمكن أن يعزى هذا التناقض إلى الاختلافات على مستويات النسخ والبروتينية بين هذين النظامين⁴⁵. وبالتالي ، فإن التوافق الوثيق مع عمليات الإنتاج السريرية قد يتطلب استخدام مزارع التعليق في مراحل التطوير المبكرة. بناء على هذه الملاحظات وميزة تحقيق كثافة خلايا أعلى في التعليق ، تم اعتماد نظام بئر بعمق 24 لإنتاج rAAV في مزارع التعليق المصغرة (mini-HT24). خضع هذا النظام للتحقق من صحة مكثفة ، مما أظهر عيارات متسقة من vg / mL و vp / mL عبر اللوحة ، جنبا إلى جنب مع تعبير ونسب بروتين VP موحدة (الشكل 3A-E). في الواقع ، أدت كثافات الخلايا الأعلى التي تم تحقيقها في إعداد mini-HT24 (3 × 10⁶ خلايا / مل) مقارنة بتنسيق micro-6-well (5 × 10⁵ خلايا لكل بئر) إلى ارتفاع عيار rAAV ، كما هو موضح في الشكل 3F. هذا يسلط الضوء على ميزة رئيسية للأنظمة القائمة على التعليق ، والتي لا تقتصر على مساحة سطح سفينة الاستزراع. ومع ذلك ، فإن تنفيذ مثل هذه الأنظمة يتطلب معدات متخصصة قد لا تكون متوفرة في جميع المختبرات. أخيرا ، يوصى بالتحقق من صحة جزيئات الرصاص المحددة أو ظروف الزراعة الفائقة من نظام mini-HT24 باستخدام أنظمة المفاعلات الحيوية الصغيرة مثل AMBR15 أو AMBR250 ، حيث ثبت أن هذه الأنظمة تحاكي ظروف الإنتاج بشكل وثيق في المفاعلات الحيوية الكبيرة⁴⁶^،⁴⁷.

يلعب اختيار مستوى التنقية دورا مهما في تحديد مدى ملاءمة مستحضرات rAAV لتطبيقات محددة في اتجاه مجرى النهر. توفر المحللات الخام ، المشتقة من كل من المزارع الملتصقة (micro-6-well) والتعليق (mini-HT24) ، خيارا سريعا وفعالا في استخدام الموارد لفحوصات الفحص الأولية. تحتوي هذه المحللات على مزيج من الجسيمات الفيروسية والحطام الخلوي ومكونات الوسائط ، وهو أمر مقبول لتطبيقات مثل عيار الجينوم / الجسيمات الناقلة ، وفحص كفاءة التنبيغ ، وتحليل اللطخة الغربية. ينطبق بشكل خاص في الدراسات التي تتناول الأسئلة البيولوجية الأساسية (كما هو موضح أعلاه في التحقيق في وظائف AAP) ، وتحسين حالة زراعة الخلايا ، وفحص واختيار المرشحين قبل السريريين. ومع ذلك ، فإن وجود الشوائب قد يتطلب تخفيفات أعلى ، مما يؤدي إلى انخفاض حساسية الفحص. بالإضافة إلى ذلك ، قد تؤثر الشوائب سلبا على صلاحية أنواع الخلايا الحساسة ، مثل الخلايا الأولية.

على عكس المحللات الخام ، فإن المستحضرات المنقاة بالراتنج ذو التقارب AAVX ، المستخدمة حصريا في البروتوكول القائم على التعليق ، تحقق مستوى أعلى من النقاء عن طريق عزل القفيصة السليمة بشكل انتقائي. يتغلب هذا على قيود محللات الخلايا الخام ، مما يجعل هذه المستحضرات أكثر ملاءمة للتطبيقات مثل الدراسات في الجسم الحي ، بالإضافة إلى التحليلات التفصيلية في المختبر لحركية التعبير الجيني ، والقراءات الوظيفية الدقيقة ، والتي غالبا ما تتطلب كميات أكبر من المواد (انظر مقارنة العائد في الشكل 3F). بالنسبة للتطبيقات في المختبر ، كانت عوائد نواقل rAAV المنتجة في إعداد mini-HT24 كافية عادة لغالبية القراءات ، اعتمادا على عدد الخلايا ووزارة الداخلية المطلوبة. في المقابل ، تتطلب التطبيقات في الجسم الحي عادة إنتاجا بمقاييس قارورة متوسطة الاهتزاز أو أكبر ، اعتمادا على الجرعة ومسار الإدارة والنموذج الحيواني. على الرغم من زيادة التكلفة والوقت اللازمين للتنقية ، فإن اتساق وموثوقية المواد الناتجة غالبا ما يبرران الاستثمار في حالات الاستخدام الحرجة. والجدير بالذكر أن النتائج الموضحة في الشكل 4 توضح أن نواقل rAAV التي تم تنقيتها باستخدام طرق راتنج التقارب تعمل بشكل مماثل لتلك التي يتم تنقيتها عن طريق الطرد المركزي الفائق التقليدي لكلوريد السيزيوم (CsCl). يتماشى هذا مع الملاحظات السابقة بأن القفيصات الفارغة إما ليس لها أي تأثير على التنبيغ أو قد تعززها ، اعتمادا على أنواع AAV الموجودة⁴⁸. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أنه تم استخدام وزارة عمل واحدة فقط ونقطة زمنية واحدة في هذه التجربة ، ويجب تحديد الظروف المثلى بشكل فردي لكل نوع من أنواع الخلايا. في حين أن تنقية CsCl تنتج بشكل عام خلفية أنظف ، فإن AAVs المنقاة بطرف راتنج HT تظهر تباينا أكبر في النقاء (انظر صور TEM في الشكل 4). بشكل جماعي ، تدعم هذه النتائج أيضا اعتماد مهام سير عمل عالية الإنتاجية وصغيرة النطاق.

يوفر استخدام الأطراف المملوءة بالراتنج على نطاق صغير في التنقية عالية الإنتاجية حلا عمليا للفحص السريع للتعافي ، ولكن العديد من الجوانب الفنية تتطلب الاهتمام لضمان نتائج موثوقة. نظرا لحجم طبقة الراتنج المحدود ، فإن هذه النصائح معرضة بشكل خاص للانسداد ، خاصة عند معالجة المحللات الخام. ومن ثم ، فإن توضيح المحللات عن طريق الطرد المركزي عالي السرعة ضروري لإزالة الحطام الخلوي قبل التحميل ، حيث يمكن أن يقلل التوضيح غير الكافي من معدلات التدفق ويعرض العائد للخطر. لإعداد mini-HT24 ، يوصى بتحسين بروتوكولات التعداء والحفاظ على حجم عمل أقصى يتراوح بين 2.5-3 مل لكل بئر. عند العمل مع العديد من الأنماط المصلية أو مكتبات القفيصة ، ينصح باختبار أنواع مختلفة من راتنجات التقارب ، حيث قد تختلف كفاءة الربط والاسترداد اعتمادا على بنية القفيصة⁴⁹. يتيح نظام سحب العينات الإلكتروني متعدد القنوات المحمول باليد سهولة دمج سير العمل هذا في المختبرات الصغيرة، مما يوفر المرونة دون الحاجة إلى التشغيل الآلي. ومع ذلك ، يمكن أن يؤدي المناولة اليدوية إلى التباين والاختلافات من الكثير إلى الدفعة. لمزيد من الاتساق ، قد تكون منصات معالجة السوائل الآلية مفيدة. يجب إيلاء اهتمام دقيق لتجنب التلوث المتبادل أثناء إضافة العينة والعازلة ، ويعد استخدام تنسيقات الألواح المناسبة ذات حجم البئر المناسب أمرا ضروريا لمنع الفائض. من خلال معالجة هذه الاعتبارات، بما في ذلك توضيح العينة، وتحسين البروتوكول، واختيار الراتنج، والسحب الدقيق، يمكن للباحثين تقليل المشكلات الفنية وتعزيز المتانة وقابلية التكرار لسير عمل تنقية التقارب عالي الإنتاجية وصغير النطاق.

في الختام ، يوفر الجمع بين طرق إنتاج rAAV عالية الإنتاجية والصغيرة الحجم مع استراتيجيات التنقية الخاصة بالتطبيق منصة متعددة الاستخدامات للنهوض بأبحاث العلاج الجيني. تعالج هذه البروتوكولات الطلب المتزايد على سير العمل الفعال من حيث التكلفة والفعال مع الحفاظ على المرونة لتلبية المتطلبات التجريبية المتنوعة. من خلال موازنة المقايضات بين النقاء وقابلية التوسع واستهلاك الموارد ، يمكن للباحثين تسريع التطوير قبل السريري وتسهيل الانتقال إلى التطبيقات السريرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعرب جوليا فخيري عن امتنانها للدعم من خلال زمالة روش لما بعد الدكتوراه. تم الحصول على بيانات المجهر الإلكتروني في منشأة Roche cryo-EM Nautilus. نشكر موريتز كلاسين ولوبومير كوفاسيك على مساهمتهما في تشغيل المنشأة ودعمها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.9٪ محلول ملحي غير مخزن	ب. براون، ميلسونغن، ألمانيا	7647-14-5	المخزن المؤقت للغسل II
1 م حمض Hydrochlocirc	ميرك ميليبور ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية	1099700050	تعديل الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة
10x DNase I Buffer	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	AM8170G	DDPCR / dPCR
1 متر تريس-حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 9.0	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	J60707. ا ف ب	المخزن المؤقت للتحييد
24 بئر عميقة microplates	Enzyscreen ، هيمستيد ، هولندا	CR1424cl	معدات زراعة التعليق
250 مل قارورة بولي كربونات Erlenmeyer مع غطاء تنفيس	كورنينج، نيويورك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية	431144	معدات زراعة التعليق
66 - 440 كيلو دالتون فصل خراطيش 8x25 شعرية	BioTechne ، مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية	SM-W008	طقم لطخة غربي آلي
96 بئر 2.2 مل بولي بروبيلين ديب ويل ؛	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	AB0661	لوحة معالجة العينات وتخزينها
96 بئر أسود / لوحة سفلية واضحة ، سطح TC	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	165305	فحوصات التنبيغ
AAV2 VP1 ، بروتين مؤتلف	بروجين ، هايدلبرغ ألمانيا	640823	كاشف ويس
AAV2 VP2 ، بروتين مؤتلف	بروجين ، هايدلبرغ ألمانيا	640824	كاشف ويس
AAV2 VP3 ، بروتين مؤتلف	بروجين ، هايدلبرغ ألمانيا	640825	كاشف ويس
AAV2 اكبرس إليسا	بروجين ، هايدلبرغ ألمانيا	PRAAV2XP	تستخدم للعينات المنقاة من راتنج HT.
وحدة الكشف عن الماوس ل Wes	BioTechne ، مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية	مارك - 002	طقم لطخة غربي آلي
فحص / قالب التمهيدي إلى الأمام الخاص	تقليد	تقليد	DDPCR / dPCR
فحص / مسبار محدد للقالب	تقليد	تقليد	DDPCR / dPCR
التمهيدي العكسي الخاص بالفحص / القالب	تقليد	تقليد	DDPCR / dPCR
BalanCD HEK293 - سائل	شركة فوجي فيلم إيرفين العلمية ، سانتا آنا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة	NC1192689	وسيط لزراعة الخلايا المعلقة
مصل الأبقار الألبومين	SERVA Electrophoresis، هايدلبرغ، ألمانيا	cBovine مصل الألبومين	مكمل غذائي لوسط الخلية الملتصقة
فيلم رايون قابل للتنفس ، معقم ؛	VWR International LLC ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	391-1262	معدات زراعة التعليق
C1000 جهاز التدوير الحراري	مختبرات بيو راد ، هرقل ، الولايات المتحدة الأمريكية	1851096	دي دي بي سي آر
مجموعة ELISA CaptureSelec AAVX Ligand Leakage	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	8113522000	اليسا
محلل Cedex HiRes	روش القابضة AG ، بازل ، سويسرا	5650216001	عداد الخلية
صفيحة ميكرو لثقافة الخلية ، 96 جيدا	غرينر بيو ون ، كريمسم ü. nster, النمسا	655162	معدات زراعة الخلايا الملحقة
حامض الستريك	سيجما ألدريتش، سانت لويس، ميسوري، الولايات المتحدة الأمريكية	5949-29-1	كاشف التنقية أنذر
CMOS القائمة على كاميرا TEM TVIPS XF416 ؛	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH ، Gilching ، ألمانيا	XF416	نظام معالجة الفيديو والصور
برنامج البوصلة (الإصدار 6.3.0)	BioTechne ، مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية		برنامج WES
ألواح آبار متعددة معالجة ب TC من Costar 6-well	كورنينج، نيويورك، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية	3516	معدات زراعة الخلايا الملحقة
زيت مولد قطرات ddPCR	مختبرات بيو راد ، هرقل ، الولايات المتحدة الأمريكية	#1864110	كاشف ddPCR
زيت قارئ قطرات ddPCR	مختبرات بيو راد ، هرقل ، الولايات المتحدة الأمريكية	#1863004	كاشف ddPCR
ddPCR Supermix للمجسات (بدون dUTP)	مختبرات بيو راد ، هرقل ، الولايات المتحدة الأمريكية	#1863023	كاشف ddPCR
DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوز	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	11960044	وسيط لزراعة الخلايا الملتصقة
DMEM ، انخفاض الجلوكوز	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	11885084	وسيط لزراعة الخلايا الملتصقة
ربط الحمض النووي المنخفض 96 لوحة بئر	إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا	30129504	DDPCR / dPCR
أنابيب ربط منخفضة الحمض النووي	إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا	30108051	DDPCR / dPCR
DPBS	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	14190094	عازلة الغسيل
شبكات EM (T600H-Cu 698 لتر / بوصة. شريط رقيق شبكة. EMS)	علوم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	FFTH600-النحاس UL	تحليل المجهر الإلكتروني
نظام التصوير EVO M5000	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	AMF5000	مجهر التصوير الحي لمقايسات التنبيغ
حزمة EZ القياسية 3	BioTechne ، مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية	PS-ST03EZ-8	طقم لطخة غربي آلي
فالكون 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية	فيشر العلمية ، شويرتي ، ألمانيا	11507411	تجهيز العينات
فالكون 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية	فيشر العلمية ، شويرتي ، ألمانيا	10203001	تجهيز العينات
Geltrex LDEV خالية من عامل النمو المنخفض مصفوفة غشاء الطابق السفلي	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	A1413201	طلاء لوحة الثقافة
الملحق جلوتاماكس (L-Alanyl-L-Glutamine)	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	35050061	مكمل غذائي لوسط الخلية الملتصقة
HEK293A	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	R70507	فحوصات التحويل (الاستخدام البحثي فقط)
HEK293T	ATCC ، ماناساس ، فيرجينيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	CRL-3216	مزرعة الخلايا الملحقة ، وتستخدم لإنتاج rAAV (الاستخدام البحثي فقط)
محلول HEPES، 1 متر	ميرك ، دارمشتات ، ألمانيا	#H0887	مكمل غذائي لوسط الخلية الملتصقة
HL-Salt Active Nuclease ، SAN (25 U/µ L)	تقنيات ArcticZymes ، Troms ø ؛ ، النرويج	70910-202	DDPCR / dPCR
غسالة HydroSpeed Microplate	تيكان ، م &أومل. nnedorf, سويسرا	30190101	اليسا
طقم الخلايا النجمية iCell ، 01434	شركة فوجي فيلم للديناميكيات الخلوية ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية	راند 1092	فحوصات التنبيغ
طقم الخلايا العصبية الحركية iCell ، 01279	شركة فوجي فيلم للديناميكيات الخلوية ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكية	R1051	فحوصات التنبيغ
إنفينيت 200 برو	تيكان ، م &أومل. nnedorf, سويسرا	30213617	اليسا
JEM-1400Plus هو مجهر إلكتروني ناقل الحركة	JEOL Ltd. ، أكيشيما ، طوكيو ، اليابان	JEM-1400Plus	المجهر الإلكتروني الناقل
غطاء شطيرة منخفض التبخر مع دبابيس	Enzyscreen ، هيمستيد ، هولندا	CR1224 ج	معدات زراعة التعليق
قارئ الصفيحة الدقيقة سبيكترا ماكس i3	الأجهزة الجزيئية ، سان خوسيه ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية	i3x	اليسا
أنيتي الماوس - AAV2 VP1 / VP2 / VP3 الجسم المضاد أحادي النسيلة	بروجين ، هايدلبرغ ألمانيا	690058	كاشف ويس
مياه خالية من النوكلياز ؛	شركة روش ديايجانوستكس GmbH ، مانهايم ، ألمانيا	3036430103	DDPCR / dPCR
Opti-MEM ، مصل متوسط منخفض ؛	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	#31985070	وسيط لتشكيل مركب PEI-DNA
برنامج تلفزيوني	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	#10010023	عازلة الغسيل
PEI-MAX، بولي إيثيلينامين، مخزون 1 ملغ/مل	Polysciences Europe, Hirschberg an der Bergstraß ه ، ألمانيا	24765 أو 24765	كاشف تعداء
بيبرو	بوليبلس، إيلكيرش غرافنستادن، فرنسا	101000033 / 10 مل	كاشف تعداء
لوحة غسيل الكلى المجهري بيرس، 96 بئر، 0.3 مل، 20 كيلو ميجا دبليو كو	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	أ 50472	معدات التنقية
بولوكسامر 188	سيجما ألدريتش، سانت لويس، ميسوري، الولايات المتحدة الأمريكية	P5556-100 مل	كاشف ثقافة الخلية; أنذر
محلول بولي إل أورنيثين (0.01٪)	سيجما ألدريتش	أ 004 م	فحوصات التنبيغ
محلول البروتيناز K (20 مجم / مل)	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	25530049	DDPCR / dPCR
بروتين بسيط " ويس"	BioTechne ، مينيابوليس ، مينيسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية	004-600	جهاز للطخة الغربية الأوتوماتيكية
نظام QIAcuity ثماني منصات	Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا	911052	dPCR
QIAcuity Nanoplate 8.5k 96 بئر	Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا	250021	DDPCR / dPCR
طقم QIAcuity Probe PCR	Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا	250101 أو 250102 أو 250103	DDPCR / dPCR
مجموعة برامج QIAcuity 1.2	Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا		برنامج dPCR
مدير QX	مختبرات بيو راد ، هرقل ، الولايات المتحدة الأمريكية		برنامج ddPCR
قارئ قطرات QX200	مختبرات بيو راد ، هرقل ، الولايات المتحدة الأمريكية	1864003	دي دي بي سي آر
أنبوب صغير بغطاء لولبي ، 1.5 مل ، تم اختبار أداء PCR	سارستيدت ، ن ü. mbrecht, ألمانيا	72.703.416	معدات زراعة التعليق
غطاء لولبي ، DNA Lobind ، 5.0 مل	إيبندورف، هامبورغ، ألمانيا	30122348	معدات زراعة التعليق
شاكر حاضنة	Infors AG ، بوتمينغن ، سويسرا	ملتي ترون	معدات زراعة التعليق
بيروفات الصوديوم (100 ملم)	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	11360070	وسيط لزراعة الخلايا الملتصقة
نظام القرن الصوتية Microplate	كيوسونيكا ، نيوتاون ، كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية	Q700MPXC	Sonicator المستخدمة لتوليد المحللة الخام
روح			رابط إلى قاعدة بيانات SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html
Steriflip-GP وحدة تصفية علوية لأنبوب الطرد المركزي المعقمة	ميرك ميليبور ، برلنغتون ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية	SCGP00525	معدات تحضير العازلة
T-175 ، قارورة زراعة الخلايا ، 550 مل ، 175 سم ² ؛	غرينر بيو ون ، كريمسم ü. nster, النمسا	660175	معدات زراعة الخلايا الملحقة
التربسين / EDTA 0.025٪	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	R001100	كاشف زراعة الخلايا
خلايا إنتاج الفيروسات 2.0 (VPC2.0)	ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، الولايات المتحدة الأمريكية	A49784 أو A51218	إنتاج rAAV
		J63596. ك 2	تمييع 1:10 لحل العمل PBST

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Singh, N. Drug discovery and development: Introduction to the general public and patient groups. Front. Drug Discov. 3, 1201419(2023).
Thakur, G., Mink, S., Bak, H., Tustian, A. D. Improving process efficiency to reduce cost-of-goods per dose in manufacturing of recombinant AAVs. Cell Gene Ther. Insights. 10 (3), 479-499 (2024).
Reid, C. A., Hörer, M., Mandegar, M. A. Advancing AAV production with high-throughput screening and transcriptomics. Cell Gene Ther. Insights. 10 (6), 821-840 (2024).
Matsunaga, R., Tsumoto, K. Accelerating antibody discovery and optimization with high-throughput experimentation and machine learning. J. Biomed. Sci. 32 (1), 46(2025).
Pereira, D. A., Williams, J. A. Origin and evolution of high-throughput screening. Br. J. Pharmacol. 152 (1), 53-61 (2007).
Aldewachi, H., Al-Zidan, R. N., Conner, M. T., Salman, M. M. High-throughput screening platforms in the discovery of novel drugs for neurodegenerative diseases. Bioengineering. 8 (2), 30(2021).
Liu, H., et al. Producing high-quantity and high-quality recombinant adeno-associated virus by low-cis triple transfection. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 32 (2), 101230(2024).
Blessing, D., et al. Scalable production of AAV vectors in orbitally shaken HEK293 cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 13, 14-26 (2019).
Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
Strobel, B., et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum. Gene Ther. Methods. 30 (1), 23-33 (2019).
Rumachik, N. G., et al. Methods matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).
Merten, O. W. AAV vector production: State of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Ther. Insights. 2 (5), 521-551 (2016).
Trivedi, P. D., et al. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 24, 154-170 (2022).
Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
Wada, M., et al. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 30 (7-8), 641-648 (2023).
Kronenberg, S., Böttcher, B., von der Lieth, C. W., Bleker, S., Kleinschmidt, J. A. A conformational change in the adeno-associated virus type 2 capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini. J. Virol. 79 (9), 5296-5303 (2005).
Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
Shiraishi, Y., Adachi, T., Cacicedo, J. M., Ido, Y. Development of a high-yield, high-quality purification process for adeno-associated virus vectors that can be used in vivo without ultracentrifugation: Application to a lung endothelial cell-targeted adeno-associated virus. FASEB J. 36 (12), e22653(2022).
Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
Grosse, S., et al. Relevance of assembly-activating protein for adeno-associated virus vector production and capsid protein stability in mammalian and insect cells. J. Virol. 91 (20), (2017).
Drittanti, L., Rivet, C., Manceau, P., Danos, O., Vega, M. High throughput production, screening and analysis of adeno-associated viral vectors. Gene Ther. 7 (11), 924-929 (2000).
Quan, D. N., Shiloach, J. rAAV production and titration at the microscale for high-throughput screening. Hum. Gene Ther. 33 (1-2), 94-102 (2022).
Steininger, T., et al. Improved recombinant adeno-associated viral vector production via molecular evolution of the viral Rep protein. Int. J. Mol. Sci. 26 (3), 1319(2025).
Fisher, K., et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 33 (1), 101412(2025).
Chen, K., et al. Advanced biomanufacturing and evaluation of adeno-associated virus. J. Biol. Eng. 18 (1), 15(2024).
DuBridge, R. B., et al. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7 (1), 379-387 (1987).
Börner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Mol. Ther. 28 (4), 1016-1032 (2020).
Weinmann, J., et al. Identification of broadly applicable adeno-associated virus vectors by systematic comparison of commonly used capsid variants in vitro. Hum. Gene Ther. 33 (21-22), 1197-1212 (2022).
Westhaus, A., et al. High-throughput in vitro, ex vivo, and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction. Hum. Gene Ther. 31 (9-10), 575-589 (2020).
Yang, S., Shi, H., Chu, X., Zhou, X., Sun, P. A rapid and efficient polyethylenimine-based transfection method to prepare lentiviral or retroviral vectors:useful for making iPS cells and transduction of primary cells. Biotechnol. Lett. 38 (9), 1631-1641 (2016).
Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Adeno-associated virus vectors, design and delivery. Methods Mol. Biol. 1950, 51-83 (2019).
Wang, G., et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int. J. Mol. Sci. 25 (10), 5149(2024).
Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front. Microbiol. 10, 1570(2019).
Duong, T., Firmo, M., Li, C. T., Gu, B., Wang, P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci. Rep. 15 (1), 2154(2025).
Tereshko, L., et al. A novel method for quantitation of AAV genome integrity using duplex digital PCR. PLOS ONE. 18 (12), e0293277(2023).
Sormunen, A., et al. Comparison of automated and traditional Western blotting methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
Hiemenz, C., et al. Characterization of virus particles and submicron-sized particulate impurities in recombinant adeno-associated virus drug product. J. Pharm. Sci. 112 (8), 2190-2202 (2023).
McIntosh, N. L., et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci. Rep. 11 (1), 3012(2021).
Su, Q., Sena-Esteves, M., Gao, G. Analysis of recombinant adeno-associated virus (rAAV) purity using silver-stained SDS-PAGE. Cold Spring Harb. Protoc. (8), pdb.prot095679(2020).
Capra, E., Gennari, A., Loche, A., Temps, C. Viral-vector therapies at scale: Today's challenges and future opportunities . , McKinsey & Company. https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities (2022).
Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J. Virol. Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
Development of a novel cell culture medium for AAV production with multiple HEK293 lineages and process optimization. , Merck. https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/gene-therapy-manufacturing/development-of-novel-cell-culture-medium-aav-production (2025).
Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: Systems biology of HEK293 cell line development. Sci. Rep. 10 (1), 18996(2020).
Warr, S. R. C. Animal cell biotechnology, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 2095, 43-67 (2019).
Manahan, M., et al. Scale-down model qualification of ambr 250 high-throughput mini-bioreactor system for two commercial-scale mAb processes. Biotechnol. Prog. 35 (6), e2870(2019).
Wang, Q., et al. Syngeneic AAV pseudo-particles potentiate gene transduction of AAV vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 4, 149-158 (2017).
Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 146-159 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Recombinant AAV High Throughput Production Gene Therapy AAV Vector Production Microscale AAV Miniscale AAV HEK 293T Cells Cell Transduction Assay Vector Genome Titration Western Blot

تقليص التأثير الكبير: إنتاج مبسط للفيروسات المؤتلفة المرتبطة بالغدة عالية الإنتاجية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة