Method Article

إنتاج الخلايا البثنية المتوسطة المعتمدة على التثبيت المعتمدة على المفاعلات الدقيقة المهيأة لمتلازمة الضيق التنفسي الحاد

DOI:

10.3791/68650

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف بروتوكول لإنتاج الخلايا المعتمدة على التثبيت بمفاعل ميكروبيولوجي من خلال الحاملات الدقيقة كعلاجات محتملة قائمة على الخلية. من خلال استهداف حالة استخدام متلازمة الضيق التنفسي الحاد، يتم توضيح إنتاج الخلايا المماثل والتعبير الجيني المواتي مقارنة بظروف العمليات المعتمدة على القارورة. يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل خلايا أخرى تعتمد على التثبيت ومؤشرات الهدف.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج القائم على الخلايا هو نهج علاجي ناشئ لمجموعة من الحالات الصحية. ومع ذلك، لا يزال إنتاج كميات كافية من الخلايا عالية الجودة تحديا علميا وتقنيا نشطا. لا يمكن تعقيم المنتج النهائي للخلية؛ لذلك، فإن اعتبارات التعقيم والجودة حسب التصميم أمران أساسيان. بالنسبة للخلايا التي تعتمد على الثبات، لا يزال التوسع القائم على القارورة يستخدم على مقاييس التطور والصناعة، مما يتطلب بصمة فيزيائية كبيرة، مما يحد من التحكم في البيئة الكيميائية الحيوية (الحموضة، ثاني أكسيد الكربون2 و2، تدرجات الانتشار للمغذيات والمستقلبات)، ويوفر إشارات فيزيائية يمكن أن تؤثر على جودة الخلية النهائية. هذه التحديات دفعت إلى تبني أساليب تصنيع قائمة على المفاعلات الحيوية، لكن هذه الأساليب عادة ما تسير على مقاييس حجمية تخلق تحديات وقد تكون مكلفة جدا للأبحاث الاستكشافية أو تطوير العمليات. تم الإبلاغ عن إنتاج علاج الخلايا الحاملة بالمفاعل الميكروبيولوجي لتوفير تحكم كيميائي حيوي أثناء الزراعة لحالة اختبار من نوع مصدر الخلية - الخلايا البثوضية الميزنكيمية. للتقييم الأولي لجودة الخلايا في المختبر، تم النظر في متلازمة الضيق التنفسي الحاد كحالة استخدام محتملة. النهج الموضح هنا يتيح تطور العمليات السريع على نطاق الطاولة بسبب الحجم الصغير (2 مل) والتحكم الكيميائي الصارم في المفاعل الحيوي الدقيق. لتحقيق ذلك لنوع خلية تعتمد على التثبيت مثل الخلايا البمثيرة الميزنشيمية، كان من الضروري تعديل كبير في عملية المفاعل الحيوي الميكروي واستخدمت منصة حاملة جيلاتين تم إنتاجها داخليا من خلال عملية ميكروفلويدية. هنا، يتم توضيح تفاصيل إضافية للطريقة ومعايير العملية المستخدمة لزراعة مثل هذه الخلايا المعتمدة على التثبيت في المفاعل الحيوي الدقيق، بهدف تمكين باحثين آخرين من تكييف هذه الممارسات لتناسب حالات استخدامهم وأنواع مصادر الخلايا الخاصة بهم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد برز استخدام الخلايا الحية كمنتج علاجي مؤخرا كخيار علاج جديد واعد للعديد من التحديات الصحية. على سبيل المثال، جلبت خلايا T المستقبلات المستضدة الكيميرية (CAR) شفاء دائما لأولئك الذين يعانون من ما يسمى بالسرطانات السائلة — اللوكيميا، واللمفوما، والورم النخاعي المتعدد — التي كانت مقاومة لجميع العلاجات المتاحةسابقا 1. مؤخرا، تمت الموافقة على منتج خلية جذعية/عضلية متوسطة الميزنكيا (MSC) (ريونسيل) لعلاج الأطفال المصابين بمرض الطعم ضد المضيف الحاد المقاوم للستيرويدات (SR-aGvHD)، وهي حالة بنسبة وفيات > 50٪2. لكن التمديد لاحتياجات سريرية أخرى غير ملباة يتطلب تطويرا مكثفا لكل من العلاج والوسائل لتطوير وتصنيع ذلك المنتج.

يمكن العثور على إحدى هذه الاحتياجات السريرية غير الملباة لدى الأفراد الذين يعانون من متلازمة ضيق الجهاز التنفسي الحاد (ARDS). تمت مناقشة ARDS هنا لتقديم حالة استخدام محددة لتوضيح الطريقة والنتائج ومناقشة إمكانية الامتداد لأهداف مرضية أخرى. يعد ARDS مؤشرا حرجا (تقدما من ساعات إلى أيام)، وشائعا (> 200,000 حالة سنويا في الولايات المتحدة)، وخطير (27٪-46٪ وفيات، حسب شدة العرض)، وقد جذب ARDS اهتماما متجددا وواسع النطاق خلال جائحة كوفيد-19 كآلية نموذجية للوفاة للمرضى المصابين بفيروس SARS-CoV-2 3,4. يتميز ARDS بزيادة نفاذية الأوعية الدموية الرئوية مما يؤدي إلى وذمة بين الوريد، وغمر السنيخين، وتسلل مكونات الخلايا، بما في ذلك العدلات وخلايا الدم الحمراء، إلى الحجرة السنخية5. في المرحلة الإخلافية الأولى من متلازمة ARDS، يدفع الالتهاب الفطري الذي يبوسه الخلايا المناعية هذه النتائج الممرضة من خلال إضرار بسلامة الحاجز البطاني والظهاري وتعزيز تجنيد وتنشيط الخلايا المناعية من خلال إفراز السيتوكينات الالتهابية؛ الشفاء الناجح للاستجابة الالتهابية، وإصلاح سلامة الحاجز، وتجنب التليف المفرط أمر بالغ الأهمية للبقاء على قيد الحياة3. بينما أظهرت العلاجات المضادة للفيروسات مثل ريمديسيفير وعدا في مكافحة متلازمة ARDS التي يسيطرون عليها SARS-CoV-2، لا توجد حاليا تدخلات دوائية معتمدة تقلل من الوفيات5.

قد تقدم الخلايا الميثودية العضلية نهجا واعدا لعلاج متلازمة الحساسية المزمنة للرئة (ARDS)، نظرا لتأثيرها السطحي الخاص بالرئة عند الحقن الجهازي وقدرتها على إفراز إشارات باراكرين معدلة المناعة إلى البيئة الدقيقة المحيطةبها 6,7. أشارت الدراسات الميكانيكية إلى تورط في تعبير عوامل باراكرين مثل الإنترلوكين-10 (IL-10)8، الإندوليامين 2,3-ديوكسيناز 1 (IDO1)9، البروستاجلاندين E2 (PGE2)10، وغيرها، في دفع القوة العلاجية المفترضة ل MSC لمؤشرات متعددة، بما في ذلك إصابة الرئة الحادة (ALI)/ARDS11؛ لذلك، تمثل مستويات التعبير لهذه المنتجات الجينية سمات جودة حرجة محتملة (pCQAs) قد تتنبأ بالفعالية السريرية، مما يوفر معايير إطلاق قابلة للحل للمنتج الخلوي النهائي أثناء التصنيع. ومع ذلك، فإن إنتاج كميات كافية من الخلايا للوصول إلى جرعة علاجية فعالة يعد تحديا؛ على سبيل المثال، يوصى بريونسيل بجرعة 2 × 106 خلايا/كجم من كتلة المريض، تعطى مرتين أسبوعيا لمدة 4 أسابيعو12 أسبوعا. بالنسبة لمريض يزن 80 كجم، يعادل هذا > 1.2 مليار مركز MSC لدورة علاج واحدة، مما يتطلب وجود مساحة جسدية كبيرة لاستيعاب مساحة سطحية كافية لهذه الحالة النموية ثنائية الأبعاد. نظرا لأن هذا المنتج الخلوي الحي لا يمكن تعميمه قبل إعطاء المريض دون الإضرار بالإمكانات العلاجية للخلايا، فإن استخدام إرشادات ممارسات التصنيع الجيدة الحالية للإنتاج بطريقة معقمة أمر بالغ الأهمية، مما يزيد من تعقيد تصنيع الخلايا اللوجستية وبالتالي إلى تكلفة السلع13.

علاوة على ذلك، أظهرت دراسات سابقة أدلة على أن إنتاج الخلايا العضلية المغناطيسية النموذجي في قوارير البوليسترين (TCPS) في زراعة الأنسجة يساهم في ظهور التباين الظاهري داخل السكان. لبعض الاستخدامات النهائية، يجعل جهود مراقبة الجودة بين الدفعات تحديا في البحث والترجمة السريرية14، 15، 16، 17. يشتهم أن التحكم الكيميائي المحدود المتاح في قوارير TCPS، بما في ذلك تدرجات الانتشار للغازات والمغذيات ومنتجات النفايات الأيضية، وتنظيم الرقم الهيدروجيني الضعيف، وغيرها، تساهم في هذه التحديات.

تحفز هذه القضايا اعتماد الزراعة القائمة على المفاعل البيولوجي للاستفادة من التنظيم الكيميائي الحيوي المتفوق وكثافة الخلايا المتاحة في نمط نمو ثلاثي الأبعاد متحكم به مع خلط ديناميكي18. ومع ذلك، فإن معالجة أو تصنيع المفاعل البيولوجي تأتي مع مجموعة من التحديات: باعتبارها نوعا من الخلايا المعتمدة على التثبيت، تحتاج الخلايا الصلبة إلى نوع من الركيزة لتنمو عليها في المفاعل الحيوي، مما يستلزم إضافة حاملات دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، تعمل العديد من المفاعلات الحيوية المتاحة تجاريا على مقاييس حجم تتطلب موارد ضخمة للغاية (> 3 لترات من وسط النمو) لنوع الأبحاث الاستكشافية اللازمة لتحديد وتحسين معلمات العمليات غير المعروفة التي تؤثر على التعبير عن مؤشرات جودة الخلايا القابلة للقياس. توصف هذه الميزات بأنها سمات جودة حرجة محتملة أو pCQAs19.

أفاد كروبشاك وآخرون سابقا باتباع نهج المفاعل الميكروي الحامل-الميكروبي الذي أنتج MSCs مع تعبير محسن عن pCQA لمتلازمة ARDS، مع اقتصار التقييمات المخبرية 20. جمع هذا النهج بين استخدام منصة حاملة جيلاتين قابلة للذوبان تنتج داخليا مع منصة مفاعل ميكروبيولوجي متاحة تجاريا، وهي مفاعل موبيوس بريز الميكروبيولوجي21. يستخدم هذا المفاعل الميكروبيولوجي غرف مفاعلات ذات استخدام واحد بسعة 2 مل ويحتوي على العديد من الميزات المرغوبة لتحسين التحكم الكيميائي الحيوي، بما في ذلك تنظيم درجة الحرارة، الرقم الهيدروجيني،ثاني أكسيد الكربون 2،و2 الأكسجين في نظام مخلوط ديناميكيا ومغلق الحلقة يغذى بالتروية، لكنه لم يصمم مع وضع الخلايا المعتمدة على التثبيت مثل الخلايا المكروية الصلبة في الاعتبار. في الواقع، القنوات الميكروفلويدية القياسية المستخدمة لحقن محتويات المفاعل صغيرة جدا بحيث لا تسمح بمرور الحاملات الدقيقة، مما يتطلب تكيفا كبيرا لتمكين إنتاج ناجح لمركبات MSC في هذه المنصة.

هنا، يتم وصف بروتوكول مفصل وتوضيحه لغرض تكييف هذا المفاعل الميكروبي الحيوي لزراعة الخلايا الجذرية المعتمدة على التثبيت (MSCs). تم تحديد معايير العملية المبلغ عنها هنا بهدف إثراء تطوير وتصنيع الخلايا الصلبة الصلبة للتقييم العلاجي قبل السريري في المختبر. ومع ذلك، من حيث المبدأ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتطبيقات المستخدمين النهائيين الأخرى، والحالات الالتهابية أو المعدلة المناعية الأخرى، وأنواع الخلايا الأخرى المعتمدة على التثبيت التي يمكن أن تستفيد من تحسين التحكم الكيميائي الحيوي في بيئة على نطاق المطبخ. يوضح الشكل 1 البروتوكول الموضح في الفيديو المرفق، ويوضح الشكل 2 والشكل 3 والشكل 4 النتائج الرئيسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد وتحضير المفاعل الميكروبيولوجي

  1. تحضير العدد المطلوب من المواد الاستهلاكية للمفاعلات الدقيقة
    1. تأكد من أن خزانة السلامة البيولوجية (BSC) مفعلة ومعقمة. قم بإزالة كيس رقائق الألمنيوم الذي يغطي المادة الاستهلاكية الجديدة عن طريق ثقب الجزء العلوي من الكيس والاحتفاظ بكيس الرقاق حتى انتهاء هذه التجربة (لتسجيل تفاصيل المجموعة# في حالة وجود عيب). افتح التغليف الخارجي المصنوع من البثور وتخلص من عبوة الترطيب الموجودة بداخلها. تخلص من تغليف القشرة الخارجية.
    2. رش عبوة البثور الداخلية بإيثانول بنسبة 70٪ وأدخلها إلى مركز البكاء. افتح التغليف الداخلي المصنوع من البثور وارم اللعبة.
    3. باستخدام حقنة معقمة، قم بإزالة المكبس وتوصيل الفوهة بفلتر معقم بحجم 0.22 ميكرومتر. صب 50 مل من الماء فائق النقي غير المعقم في فوهة المحقنة. أثناء حمل الحقنة فوق أنبوب معقم بسعة 50 مل منتظر، أعد إدخال المكبس في الحقنة وحقن الماء المصفى المعقم في أنبوب الجمع المنتظر.
    4. أزل الغطاء البلاستيكي الشفاف المتصل بالزجاجة LL من رف الزجاجات. باستخدام حقنة معقمة جديدة بسعة 50 مل، أزل المكبس ووصل الفوهة بزجاجة LL. صب الماء المصفى المعقم في برميل الحقنة وحقنه في الزجاجة LL.
      ملاحظة: قد تعلق منافذ التوصيل بدون إبر أثناء عملية التعقيم التي يقوم بها المصنع، لذا قد تحتاج إلى توصيل وفصل الحقنة عدة مرات لكسر ختم الزجاجة وحقن المحتويات بنجاح. بدلا من ذلك، يمكنك استخدام لحام أنابيب لتوصيل زجاجة المصدر بالأنبوب القابل للحام بطريقة معقمة للزجاجة المناسبة.
    5. باستخدام نفس الإجراء، املأ الزجاجة L ب 25 مل من محلول DMEM منخفض الجلوكوز غير المكمل، والزجاجة R ب 25 مل من PBS المعقمة، وزجاجة R ب 8 مل من محلول الغسيل المضاد للالتصاق. استخدم حقنة معقمة جديدة لكل سائل.
    6. كرر هذا الإجراء لعدد من المواد الاستهلاكية المطلوبة في التجربة.
  2. قم بإجراء اختبار ذاتي ل POD في كل نقطة نقطة مستخدمة لهذا التجربة.
    ملاحظة: يجب أن يكتمل الاختبار الذاتي بدون مشاكل؛ إذا فشل أحد مكونات الاختبار الذاتي، يعالج الفشل قبل الاستمرار.
  3. أزل أشرطة الاختبار الذاتي إلى أكياس التخزين المحمية من الضوء.
  4. ثبت المادة المستهلكة في المفاعل الحيوي كما هو موضح أدناه.
    1. أزل الشريط الأخضر من صمامات المادة الاستهلاكية وركبها في مكانها في نقطة الاستخدام. أعد تركيب المشابك وتأكد من عدم سماع صوت غاز أو هواء أثناء خروجه.
    2. قم بتوصيل خط حساس ضغط رف الزجاجة الأبيض، وخط ضغط الهواء الأحمر، وخط الفراغ الأزرق بين المواد الاستهلاكية ومحطة القاعدة/نقطة الشحن. تأكد من إغلاق منفذ الحقن الجانبي بمشبك دمعة أبيض.
    3. اتبع خطوات البرنامج لبدء تجربة جديدة. تتوج هذه الميزة بميزة البرمجة التلقائية والمعايرة، والتي تستغرق ~4-5 ساعات ويمكن تشغيلها طوال الليل.
  5. ضع ملصقات على كل رف زجاجة بموقع POD الخاص به حتى يكون من السهل التمييز إلى أي نقطة تعيد المستهلك بعد إزالته من المفاعل الحيوي. استخدم الشريط الملون للدلالة على الموقع: Pod0 = أحمر، Pod1 = برتقالي، Pod2 = أصفر، Pod3 = أخضر. اكتب اسم التجربة والتاريخ على الشريط.
  6. اترك المواد الاستهلاكية للمعايرة طوال الليل. تأكد من أن الوسائط يمكنها دخول المفاعل والخروج إلى خط النفايات.
  7. إذا كنت تخطط لاستخدام خلايا مخزنة في النيتروجين السائل، قم بإذابة وتغليف الخلايا بحيث تستغرق > 24 ساعة للتعافي من التخزين بالتجميد قبل الحقن.

2. إعادة المعايرة وتحضير الحاملات الدقيقة

  1. تأكد من إكمال خطوات التمهيد التلقائي والمعايرة بنجاح.
    1. إذا لم يتم إكمال المعايرة بنجاح، حدد وأصلح أي مشاكل جذرية ثم حاول إعادة المعايرة. تشمل المشاكل الشائعة إهمال إزالة مشبك رف الزجاجات الأبيض، أو إزالة الشريط الأخضر من المادة الاستهلاكية قبل وضعها في البود، وعدم وجود حجم وسائط كاف في زجاجة الوسائط.
  2. تأكد من استقرار حساسات الأكسجين المذاب.
    1. ما يقارب 10٪ من المواد الاستهلاكية ستظهر انحراف في المستشعر في حساس DO بعد المعايرة. قم بإجراء التصحيح المفضل، وهو إعادة تشغيل المعايرة الكاملة. إذا لزم الأمر، قم بأحد الخطوات التالية.
      1. تأكد من عدم وجود هواء في الكاسيت، ثم قم بإلغاء تحديد مربع Display plots لعرض التحكمات، ثم اضغط على معايرة DO ورقم الهيدروجينات تلقائيا.
        1. إذا كان الهواء موجودا في المفاعل عند الحاجة لإعادة معايرة، عد إلى الصفحة الأولى من لوحة تحكم MBS بالنقر على السهم الأزرق الأيسر في الزاوية العلوية اليسرى من النافذة للنقطة المحددة المعنية. انقر على الزر لتفعيل العمليات اليدوية. حدد مربع جاهز أنبوب النفايات وأدخل W في مربع إدخال النص لاختيار زجاجة النفايات. انقر على زر الإخراج والغسيل ، ثم اضغط نعم في نافذة المنبثقة. هذا سيفرغ غرف المفاعل ويعيد ملئها بالوسائط من زجاجة مصدر الوسائط.
  3. جهز العدد الصحيح من الحاملات الدقيقة في أنابيب مخروطية بحجم 15 مل، واحدة لكل حالة.
    ملاحظة: عدد الحاملات الدقيقة، ومساحة سطح التجميع، وكثافة بذور الخلايا سيعتمد على تطبيقك. لهذا البروتوكول، ينصح بحقن عدد مطلق من الحاملات الدقيقة بحيث يكون 75 سممربع من مساحة نمو الحاملات الدقيقة المتاحة للمقارنة مع قارورة T75.
  4. السماح للحاملات الدقيقة بالاستقرار في الأنبوب؛ استنشق أكبر قدر ممكن من الفائق الفائق دون إزالة الحاملات الدقيقة لإفساح المجال للخلايا والوسائط الطازجة.

3. حقن الخلايا والحاملات الدقيقة

  1. تأكد من أن ميزات التمهيد التلقائي والمعايرة قد اكتملت بنجاح.
  2. انقر عبر نافذة البرنامج كما لو أن المفاعل يتم تطعيمه وفقا لسير عمل خلايا التعليق القياسي.
  3. أدخل ملاحظة في نافذة المنبثقة تشير إلى أنه لم يتم حقن الخلايا حتى هذه المرحلة.
  4. شغل العمليات اليدوية لإيقاف خلط المفاعل وإضافة مشبك C أبيض إلى خطوط رفوف الزجاجة.
  5. أزل كل مادة استهلاكية وانقلها إلى BSC. أزل الوسائط المستهلكة من النفايات وزجاجات التروية ورم المواد.
    1. تأكد من إزالة جميع النفايات من زجاجة التروية الكبيرة وكذلك الأنبوب الأصغر بسعة 1.5 مل الموجود داخل زجاجة التروية إذا كنت تخطط لجمع وسط مكيف في أي وقت من الدراسة.
  6. أزل وسط النمو غير المكملة بالمصل من زجاجة L وتخلص منه. اشطف زجاجة L ب ~20 مل من PBS المعقمة ورمها. أضف 25 مل من وسط النمو المدعم بالمصل إلى الزجاجة.
  7. أعد المواد الاستهلاكية إلى نقاط الجذب الخاصة بها. ضع زجاجات مصدر الوسائط على الثلاجة لبقية مدة التجربة. جدد الثلج يوميا.
    ملاحظة: يمكن إضافة الثلج الرطب إلى عبوات الفريزر لإطالة مدة التحكم في درجة الحرارة.
  8. اغسل المفاعلات ب PBS واغسل الخطوط.
    1. انقر على زر تدفق الزجاجات ، وفعل زر الراديو للزجاجة L، ثم اختر الإخراج إلى نفايات، ثم اضغط على بدء التدفق MSCserum.
      ملاحظة: هذا سيدفع وسائط hMSC المضافة حديثا عبر الخط لضمان عدم دخول أي وسائط غير مكملة ل FBS إلى المفاعل.
    2. اضغط على زر تدفق الزجاجات مرة أخرى، اختر زر الراديو لإعادة تشغيل الزجاجات، وابدأ بالتنظيف. هذا سيغسل محلول الشطف المضاد للالتصاق عبر الخط ويضمن جاهزه للدخول إلى المفاعل.
    3. في نافذة محتويات الزجاجة، أشر في البرنامج إلى أن MSCserum موجود في الزجاجة R، والتي تحتوي فعليا على PBS.
    4. اذهب إلى العمليات اليدوية ونفذ ثلاث دورات إخراج وغسل على زجاجة النفايات.
  9. أضف محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى المفاعل.
    1. ارجع إلى نافذة محتويات الزجاجة وأشر إلى أن MSCserum موجود في Bottle RR، والذي يحتوي فعليا على محلول شطف مضاد للالتصاق.
    2. اذهب إلى العمليات اليدوية وقم بدورة واحدة من الخروج والغسل على زجاجة النفايات.
      ملاحظة: كان الغسيل السابق من PBS يهدف إلى منع أي مكونات في DMEM من التداخل مع الغسيل المضاد للالتصاق؛ الآن، يجب أن يكون المفاعل مليئا بمحلول مضاد للالتصاق مع متلازمة زبدة زبدة زائدة (PBS) ضئيلة.
  10. بعد مرور 30 دقيقة مع وجود محلول مضاد للالتصاق، اشطف المادة المستهلكة باستخدام PBS.
    1. في نافذة محتويات الزجاجة، أشر في البرنامج إلى أن MSCserum موجود في الزجاجة R، والتي تحتوي فعليا على PBS.
    2. اذهب إلى العمليات اليدوية ونفذ ثلاث دورات إخراج وغسل على زجاجة النفايات.
    3. ارجع إلى نافذة محتويات الزجاجة وأشر في البرنامج إلى أن MSCserum موجود في الزجاجة L، التي تحتوي على وسائط hMSC.
  11. أفرغ المفاعل لانتظار حقن الخلية والحاملة الدقيقة. في لوحة العمليات اليدوية، اضغط على إعادة التلقيح واترك النظام عند المرحلة التي تشير فيها لوحة القيادة إلى تحصين المفاعل.
    ملاحظة: هنا، مصطلح "ملقح" يعني ببساطة حقن الخلايا المخصصة للتمدد في المفاعل الحيوي الدقيقي.
  12. أضف المقاومات الإضافية لتعديل سرعة الخلط بما يتماشى مع مقاومة R0 الافتراضية.
  13. ارفع الخلايا من قارورتها وعدها على جهاز قياس الدم. قم بجميع العمليات المفتوحة في جهاز BSC لضمان التعقيم.
    1. استنشق الوسط، ثم اغسله ب 5-10 مل من PBS المسخن مسبقا. استنشق PBS وأضف 5 مل من التريبسين + EDTA إلى القارورة.
    2. حضن الخلايا عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى ترفع جميع الخلايا بشكل واضح عن سطح القارورة.
    3. أضف 10 مل من وسط hMSC المسخن مسبقا لتعادلية نشاط التريبسين. اسحب محتويات السائل ووضعها في أنبوب طرد مركزي بسعة 15 مل.
    4. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق حبيبات الخلية في حجم مناسب من وسائط hMSC للعد. بالنسبة لقارورة T75 متلاطمة بالكامل، يكون الحجم المناسب عادة 2-4 مل، مما يعطي تركيز خلوي ~1-2E6 خلية لكل مل.
    5. اخلط عينة من الخلايا المعلقة مع صبغة Trypan Blue ذات القابلية للحياة بنفس القدر وتحميل الخليط في جهاز قياس الدم للعد. عد الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  14. احسب حجم محلول الخلية اللازم للوصول إلى 150,000 خلية وقم بإدخال هذا الكمية إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل يحتوي على حاملات دقيقة لكل حالة. قم بزيادة حجم الصوت في الأنبوب ليصبح بين 2.2 - 2.5 مل باستخدام وسائط hMSC الطازجة والدافئة.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم كل مخروطي بحجم 15 مل أكبر قليلا من 2 مل بحيث يؤدي الحقن إلى حالة مفاعل ممتلئة قليلا لتجنب الفقاعات، والتي سيتم معادلتها في خطوة لاحقة.
  15. أضف الحجم المناسب من الخلايا إلى وحدة التحكم في قارورة T75.
  16. عند العمل مع واحد أو اثنتين من المواد الاستهلاكية في كل مرة، أزل المواد الاستهلاكية من نقطة التحميل وأدخلها إلى مركز المستهلك.
  17. سحب الخلايا والحاملات الدقيقة في حقنة 5 مل باستخدام إبر خضراء بطول 4 إنش. حقن الخلايا والحاملات الدقيقة في المفاعل.
  18. أعد المادة الاستهلاكية إلى المحطة الأساسية وكرر العملية حتى يتم حقن جميع المواد الاستهلاكية.
  19. انقر عبر نوافذ البرمجيات للإشارة إلى أن التطعيم قد تم الآن. عندما يعود البرنامج إلى الصفحة الرئيسية العادية، قم بإزالة المشبك الأبيض من خطوط الإخراج الاستهلاكية.
  20. ادخل العمليات اليدوية وقم بوظيفة إخراج فائض مع ضبط منفذ الإخراج على P للتروية. شغل وضع المزج الثابت، باستخدام تشغيل 1680 ثانية و120 ثانية مطفأة. حافظ على تردد الخلط عند 5 هرتز للخلط الثابت.
  21. أوقف قياس الكثافة البصرية المرجعية.
    1. افتح عميل MBS واضغط على الاتصال. أدخل الأمر التالي الموجود في علامات الاقتباس: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. انقر على إرسال، وانتظر تأكيد إرسال الأمر بنجاح، وأغلق عميل MBS.
  22. بعد 24 ساعة، قم بتعطيل وضع المزج الثابت وإعادة تفعيل المزج العادي. قلل تردد الخلط إلى 1.5 هرتز.

4. تشغيل المفاعل الميكروبيولوجي

  1. راقب المفاعل الميكروبيولوجي يوميا لضمان عدم وجود مشاكل في تعطيل التجربة. تأكد من أن زجاجات مصدر الوسائط تحافظ على >5 مل من الوسائط ليتم تفيثم المفاعل بنجاح دون مشاكل.
  2. قم بتغيير دلاء الثلج حسب الحاجة للحفاظ على التحكم في حرارة زجاجة مصدر الوسائط. حافظ على الغطاء الواقي من الضوء فوق مقدمة المفاعل الحيوي الميكروي لمنع التحلل الناتج عن الضوء لمكونات الوسائط المتطايرة.
  3. تأكد من عدم إدخال فقاعات إلى المفاعل. لا تنس تغيير الوسائط بشكل دوري في وحدة التحكم في قارورة TCPS.

5. حصاد المفاعل الحيوي الميكروبي

  1. تأكد من أن جهاز BSC معقم وجاهز للعمل.
    1. سخن المواد الكيميائية المطلوبة التالية في خرزة أو حمام ماء حتى درجة حرارة 37 درجة مئوية: ~25 مل من وسط hMSC الدافئ، 10 مل من PBS الدافئ، و1.5 مل من 10 ملغ/مل من Pronase اللازمة للحصاد.
  2. جهز رف الزجاجات للحصاد.
    1. شغل وضع العمليات اليدوية لكل نقطة نقطة في البرنامج.
    2. ثبت خطوط الإدخال الاستهلاكية باستخدام مشبك C أبيض على الجزء الشفاف من الخط.
    3. أزل المواد الاستهلاكية إلى BSC. أزل محتويات زجاجة النفايات وتخلص منه.
    4. اشطف زجاجة النفايات ب ~20 مل من PBS ثم تخلص منه. قيم الحجم المتبقي في زجاجة الوسائط وقم بتعبئة كمية hMSC الطازجة (الباردة) إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: هنا، > 4 مل من الوسائط مطلوبة لإكمال ثلاث دورات قذف-غسل ضرورية للحصاد.
    5. بطن زجاجة النفايات بحجم ~5 مل من وسائط hMSC الباردة لتبطين السائل المستخرج.
  3. احصد الخلايا من المفاعل الحيوي الدقيق.
    1. باستخدام حقنة بسعة 1 مل، قم بسحب 200 ميكرولتر من 10 ملغ/ملتر من برونازي إلى الحقنة و~300-400 ميكرولتر من الهواء.
    2. قم بفك غطاء أنبوب الحقن الجانبي ورش موصل الصمام بدون إبرة بنسبة 70٪ إيثانول. أزل الشريط الذي يثبت أنبوب حقن المنفذ الجانبي المعقود وفك العقدة. فك مشبك الدمعة الأبيض.
    3. قم بتوصيل حقنة 1 مل وحقن البروناز بلطف في المفاعل. اتبع السائل عبر خط الحقن مع الهواء لضمان توصيل جميع محتويات السائل إلى المفاعل.
    4. أعد تشغيل مشبك قطرة الدمعة وأعد تغطية أنبوب حقن المنفذ الجانبي. أعد المادة الاستهلاكية إلى نقطة التحميل الخاصة بها، وأعد توصيل جميع الخطوط، وأزل المشبك الأبيض C، واستأنف الخلط.
    5. تأكد من أن زجاجة النفايات وزجاجة مصدر الوسائط محفوظة على الثلج. ابدأ مؤقتا لمدة 5 دقائق ودع البروناز يهضم الحاملات الدقيقة داخل المفاعل.
    6. بعد 5 دقائق، تحقق مما إذا كانت الحاملات الدقيقة قد تدهورت من خلال التأكد من أنها لم تعد موجودة بشكل ظاهر في المفاعل. إذا كانت الحاملات الدقيقة لا تزال مرئية، امنح دقيقة إضافية للهضم. إذا لم تكن هناك حاملات دقيقة مرئية، تابع.
    7. احصد الخلايا. شغل وضع العمليات اليدوي، اضبط # الدورات على 3، ومنفذ الإخراج على W للهدر، ثم اضغط على Eject Wash.
    8. بعد اكتمال دورات الغسيل بالقاذف، قم بإزالة المادة الاستهلاكية إلى جهاز التخزين البحري وسحب محتويات زجاجة النفايات باستخدام حقنة بسعة 10 أو 20 مل.
    9. قم بتوزيع محتويات زجاجة النفايات في أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 x g لمدة 5 دقائق، ثم استنشق السوبرناتان، وقيم حجم الحبيبات الخلية.
    10. أعد تعليق حبيبات الخلية في 1-5 مل من وسط نمو أو PBS وعد الخلايا على جهاز قياس الهيموسيتوميتر. كرر هذه الخطوة لجميع المواد الاستهلاكية.
  4. احصد حالة القارورة باستخدام بروتوكولات زراعة الخلايا العادية لديك. تم وصف بروتوكول نموذجي لمراكز MSC في الإصدار 3.13.

6. تحليل الخلايا من ظروف المفاعل الحيوي الدقيقي وظروف القارورة للتطبيق في المراحل النهائية

ملاحظة: الأساليب التحليلية المستخدمة لإنتاج النتائج المميزة موضحة أدناه وموصوفة بمزيد من التفصيل في كروبتشاك، فاروجيو، وفان فليت (2024)20.

  1. التحكم البيئي: استخدم واجهة المستخدم الرسومية التي يوفرها المفاعل الحيوي للوصول إلى البيانات وعرضها من كل مستشعر مدمج في كل مادة استهلاكية خلال فترة الزراعة. يتم توفير هذه البيانات في برنامج Breez Explorer الذي يأتي مثبتا في اللابتوب المرفق مع المفاعل الحيوي الدقيق.
  2. إنتاجية الخلايا: احصد الخلايا الصلبة المغناطيسية كما هو موضح أعلاه وقم بإزالة الحبيبات على الخلايا بقوة 300 × جرام لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق الحبيبات الخلوية جيدا في حجم مناسب من وسائط PBS أو hMSC (1-2 مل). خذ عينة من خليط الخلية المعلقة وامزج مع نفس الحجم من صبغة تريبان بلو. قم بعمل ميكروبايبت لخليط العينة المصبوغ إلى شريحة مقياس الدم وقياس عدد الخلايا وقابليتها على جهاز قياس الدم الآلي أو اليدوي.
  3. تحقق من التعبير الجيني من خلال تفاعل بوليميراز متسلسل كمي من خطوتين للنسخ العكسي كما هو موضح أدناه.
    1. تنقية الحمض النووي الريبي: استخدم مجموعة RNeasy Mini لعزل وتنقية الحمض النووي الريبي من كل عينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، قم بتحليل الخلايا، وانقل محتويات الخلية إلى أنبوب تنقية دوراني، وغسل العينات مع كل مخزن لإزالة المكونات الخلوية غير الضرورية، والأحماض النووية، والبروتينات التي قد تتداخل مع PCR اللاحق.
    2. تحويل cDNA: استخدم مجموعة نسخ عكسي عالية السعة وجهاز تدوير حراري لتحويل الحمض النووي الريبي المنقى إلى حمض DNA مكمل (cDNA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. باختصار، قم بإذابة مكونات المجموعة وأنشئ مزيجا رئيسيا عن طريق دمج المكونات بالحجم المناسب لعدد العينات التي تناسبك. قم بتحميل أجزاء متساوية من الحمض النووي الريبي المنقى وخليط الماستر المحضر (10 ميكرولتر لكل منهما) في كل بئر من صفيحة PCR، مع الحفاظ على الحرص على تتبع مواقع كل وحدة عينة. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة في جهاز الدورة الحرارية لإكمال تفاعل النسخ العكسي.
    3. qPCR: باستخدام بادئات محددة بتسلسل ممتدة للسلسلة وتم التحقق منها لتجنب دايمر البرايمر، قم بتحميل صفيحة qPCR ببئر 384 بئر مع برايمر أمامي، وبرايمر عكسي، وcDNA قالب، وماء خال من النوكليز، وخلطة رئيسية في أحجام مناسبة (عادة 1 ميكرولتر، 1 ميكرولتر، 1 ميكرولتر، 7 ميكرولتر، 10 ميكرولتر على التوالي) باستخدام عدة آبار تقنية مكررة لكل جين وعينة. قسم المحتويات على عدة ألواح إذا لزم الأمر لالتقاط جميع أهداف الجينات. تأكد من تحميل جميع العينات لهدف جين معين على نفس اللوحة لتجنب التفاوت بين الطبقات في النتائج، وأن كل لوحة تحتوي على جين مناسب للتنظيف المنزلي وضوابط بدون قالب. قياس شدة التألق على جهاز qPCR مناسب واستخدام طريقة ΔΔCt للقياس النسبي لحساب التعبير الجيني.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مكن المفاعل الميكروبيولوجي من مراقبة وتنظيم العوامل البيئية على مدى حوالي 10 أيام في الزراعة. تم قياس العوامل البيئية، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني (الشكل 2A)، ودرجة الحرارة (الشكل 2B)، والأكسجين المذاب (الشكل 2C)، وثاني أكسيد الكربون (الشكل 2D)، بدقة والحفاظ عليها في ظروف المفاعل الحيوي الدقيق، ولكن ليس في ظروف القارورة، خلال فترة الزرا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، يتم وصف طريقة لتوسيع وتجهيز وحصاد الخلايا باستخدام نهج الحامل-المفاعل الحيوي الدقيق. تمكن هذه العملية الخلايا المعتمدة على التثبيت مثل الخلايا الصلبة من زيادة عدد الخلايا تحت التحكم الكيميائي الحيوي المتفوق لمنصة المفاعل الحيوي (مقارنة بقوارير TCPS التقليدية) على نطاق الطاولة، وذلك المناسب لتطوير العمليات السريع. علاوة على ذلك، ثبت أن إنتاج المفاعل الميكروبيولوجي الحامل الدقيق للكربون الصلبة المغناطيسي يؤدي إلى نمط خلوي مهيأ قد يظهر فعالية علاجية محسنة لعلاج ARDS.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يكشف المؤلفون عن اتفاقية تعاون مع شركة تصنيع المفاعلات الدقيقة الحيوية، ميليبورسيغما.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر منشأة Genomics Core (وايل كورنيل ميديسن) على المشورة في تحليل qPCR وحل المشكلة. نشكر بكل امتنان المساعدة التي قدمها إيفان غيتس وإريك شيوي (ميليبورسيغما) في الدعم الفني للمفاعل الميكروبيولوجي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
محلول الشطف المضاد للالتصاقتقنيات الخلايا الجذعية7010
خزانة السلامة الحيوية
مفاعل بريز الميكروبيولوجيميليبورسيغما
الطرد المركزي
أنبوب مخروطي، 15 مل
أنبوب مخروطي، 50 مل
نسر المعدل من دولبيكو متوسط ومنخفض الجلوكوزجيبكو11885084
الإيثانول
مصل الأبقار الجنينيجيبكوA5670701
مقياس الدم
شريط المختبر
الحاملات الدقيقة
أنبوب الطرد المركزي الدقيق، 1.5 مل
المجهر
إبرة، غير حادة، 4"، عيار 18أمازونB0D663ZR6D
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتكورنينغ21-040-CM
بروناز، من Streptomyces griseusميليبورسيغما10165921001
ماصبة مصلية، 10 ملVWR75816-100
المياه غير المؤيدة المعقمة
فلتر الحقنة، 0.22 أم، معقممنتجات سيلتريت العلمية229762
حقنة، 1 ملBD309628
حقنة، 20 ملBD302830
حقنة، 5 ملBD309646
حقنة، 50 ملBD309653
قارورة بوليستيرين لزراعة الأنسجة، T75ثيرمو فيشر العلمي130190
تريبان بلوسيغما ألدريتشT8154-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sin, W. X., et al. A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1571-1591 (2024).
  2. US Food and Drug Administration. FDA Approves First Mesenchymal Stromal Cell Therapy to Treat Steroid-refractory Acute Graft-versus-host Disease. , (2024).
  3. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med. 377 (6), 562-572 (2017).
  4. Torres Acosta, M. A., Singer, B. D. Pathogenesis of COVID-19-induced ARDS: implications for an ageing population. Eur Respir J. 56 (3), 200249(2020).
  5. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 18(2019).
  6. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27 (10), 2614-2623 (2009).
  7. Gnecchi, M., et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 20 (6), 661-669 (2006).
  8. Doron, G., Temenoff, J. S. Culture Substrates for Improved Manufacture of Mesenchymal Stromal Cell Therapies. Adv Healthc Mater. 10 (15), e2100016(2021).
  9. Noronha, N. C., et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 131(2019).
  10. Hezam, K., et al. Superior protective effects of PGE2 priming mesenchymal stem cells against LPS-induced acute lung injury (ALI) through macrophage immunomodulation. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 48(2023).
  11. Zhang, X., et al. Mesenchymal stromal cells alleviate acute respiratory distress syndrome through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 307(2022).
  12. Full Prescribing Information - Ryoncil. , https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf (2024).
  13. Kumar, A., Starly, B. Large scale industrialized cell expansion: producing the critical raw material for biofabrication processes. Biofabrication. 7 (4), 044103(2015).
  14. Rennerfeldt, D. A., Raminhos, J. S., Leff, S. M., Manning, P., Van Vliet, K. J. Emergent heterogeneity in putative mesenchymal stem cell colonies: Single-cell time lapsed analysis. PLoS One. 14 (4), e0213452(2019).
  15. Mets, T., Verdonk, G. In Vitro Aging of Human Bone Marrow Derived Stromal Cells. Mech Ageing Dev. 16, 81-89 (1981).
  16. Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7841-7845 (2001).
  17. Tremain, N., et al. MicroSAGE Analysis of 2,353 Expressed Genes in a Single Cell-Derived Colony of Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cells Reveals mRNAs of Multiple Lineages. Stem Cells. 19 (5), 408-418 (2001).
  18. Klein, S. G., et al. A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices. Nat Biomed Eng. 5 (8), 787-792 (2021).
  19. Bellani, C. F., et al. Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells. Front Nutr. 7, 575146(2020).
  20. Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome. J Transl Med. 22 (1), 614(2024).
  21. Ng, E. X., et al. Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells. Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbioreactor ProductionMesenchymal Stromal CellsAnchorage Dependent CellsCell Therapy ManufacturingGelatin MicrocarriersAcute Respiratory DistressEnvironmental MonitoringCell HarvestingCell Quality ControlBiochemical Environment Control

Related Articles