مقالة منهجية

استكشاف تفاعلات البروتين والجليكان: التقدم في الرنين المغناطيسي النووي

849 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68674

⸱

أغسطس 26, 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

في هذه المقالة

ملخص

يبحث هذا البروتوكول المستند إلى الرنين المغناطيسي النووي في التفاعلات الضعيفة بين البروتين والجليكان باستخدام سيانوفيرين-N و D-مانوز. من خلال الجمع بين الطرق المكتشفة بالترابط والبروتين ، فإنه يرسم خرائط لمواقع الربط ، ويكتشف التأثيرات الخيفية ، ويحدد مجمعات المواجهة. يحدد النهج إعداد العينات وتحليل البيانات ، ويقدم رؤى هيكلية وديناميكية قيمة لآليات التشخيص والتعرف الخاصة بالجليكان.

الملخص

تعد تفاعلات البروتين والجليكان أساسية للعديد من العمليات البيولوجية ويتم التعرف عليها بشكل متزايد كأهداف واعدة لاستراتيجيات التشخيص في الأمراض المعدية والالتهابية والأورام. ومع ذلك ، فإن توصيف هذه التفاعلات ، خاصة عندما تكون ضعيفة وعابرة ، يظل يمثل تحديا تقنيا. يوفر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) مزايا فريدة لدراسة مثل هذه التفاعلات في ظل ظروف شبه فسيولوجية ، مما يوفر رؤى للدقة الذرية في كل من الجوانب الهيكلية والديناميكية. في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكول NMR متكامل مصمم للتحقيق في تفاعلات البروتين والجليكان منخفضة التقارب باستخدام الليكتين سيانوفيرين-N الخاص بالمانوز والسكريات الأحادية D-mannose كنظام نموذجي. يجمع البروتوكول بين مناهج الرنين المغناطيسي النووي القائمة على الترابط والبروتين لرسم خريطة لمواقع الربط بشكل شامل واكتشاف أحداث الارتباط الدقيقة ، بما في ذلك التأثيرات الخيفية المحتملة أو مجمعات المواجهة. تشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول إعداد العينات بعناية ، والتحكم الدقيق في التركيزات ، والتوحيد الطيفي لضمان استنساخ البيانات وموثوقيتها. يتيح الرنين المغناطيسي النووي في الحل اكتشاف التفاعلات العابرة التي غالبا ما يتعذر الوصول إليها بواسطة تقنيات أخرى. على الرغم من أن التفاعلات الضعيفة ضرورية للحياة ، إلا أن هناك تحيزا في الأدبيات تجاه المجمعات ذات التقارب الأعلى ، على الرغم من أن المجمعات ذات التقارب المنخفض ذات صلة بالعديد من الوظائف البيولوجية المهمة ، مثل نقل الإشارة والتواصل بين الخلية. توفر هذه التقنية منصة قوية للتحقيق في التعرف على البروتين والجليكان وقد تكون بمثابة أداة قيمة لتحديد علامات التشخيص الجديدة على أساس التفاعلات الخاصة بالجليكان.

المقدمة

تعد تفاعلات البروتين والجليكان أساسية لمجموعة واسعة من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك التعرف على الخلية الخلوية ، وتعديل الاستجابة المناعية ، والتفاعلات بين العامل الممرض والمضيف1،2. هذه التفاعلات الجزيئية محددة وديناميكية للغاية وتلعب أدوارا حاسمة في كل من الآليات الفسيولوجية والمرضية3،4،5. يحدث مثال كلاسيكي على هذه التفاعلات مع الليكتين ، والبروتينات التي تتعرف على وجه التحديد على الجليكان وترتبط بها. Cyanovirin-N (CVN) ، على سبيل المثال ، تمت دراسته على نطاق واسع كنموذج تجريبي بسبب قدرته على التفاعل في تقارب عال مع السكريات قليلة المانوزالعالية 5،6،7.

بالإضافة إلى الليكتين ، تلعب العديد من البروتينات التي تحتوي على الغليكوزيلات ، مثل الإنتجرينات ، أيضا أدوارا أساسية في التعرف والإشارات الخلوية. الإنتجرينات هي مستقبلات عبر الغشاء تخضع بشكل متكرر لعملية الارتباط بالجليكوزيل لوحداتها الفرعية ، مما يؤثر على استقرارها وتقاربها مع الروابط ، بما في ذلك الجليكان5،8،9،10. ومع ذلك ، فإن التوصيف الهيكلي لهذه التفاعلات لا يزال يمثل تحديا بسبب عدم التجانس والمرونة الجوهرية للجليكانات ، مما يعقد مناهج البيولوجيا الهيكلية التقليدية. في هذا السياق ، فإن تطوير منهجيات متقدمة قادرة على التقاط هذه التفاعلات في المحلول له قيمة كبيرة لهذا المجال ، لا سيما بالنسبة لعلم الأحياء السكرية11،12.

ظهر التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR) كأداة قوية للتحقيق في تفاعلات البروتين والترابط على المستوى الذري. على عكس التقنيات الأخرى ، مثل علم البلورات بالأشعة السينية والفحص المجهري الإلكتروني بالتبريد ، يسمح الرنين المغناطيسي النووي بدراسة التفاعلات الجزيئية الحيوية في ظل ظروف شبه فسيولوجية ، مما يوفر نظرة ثاقبة لكل من الهيكل والديناميكيات. تمكن هذه المرونة الباحثين من تعديل المعلمات البيئية مثل الأس الهيدروجيني (عادة بين 4.0-8.0) ، والقوة الأيونية (على سبيل المثال ، 0-500 ملي كلوريد الصوديوم) ، ودرجة الحرارة (بشكل عام 273-330 كلفن) ، وبالتالي تكييف الظروف مع خصوصيات مجمعات البروتين والجليكان. بالإضافة إلى ذلك ، يعد الرنين المغناطيسي النووي مفيدا بشكل خاص لتحليل التفاعلات العابرة والضعيفة ، والتي غالبا ما تكون مميزة لأحداث التعرف على البروتين والجليكان13،14.

تم استخدام العديد من تقنيات الرنين المغناطيسي النووي للتحقيق في تفاعلات البروتين والجليكان ، باستخدام كل من الأساليب القائمة على البروتين والترابط. من منظور البروتين ، يستخدم المعايرة بالتحليل الحجمي للتماسك الكمي الأحادي النووي غير المتجانس (HSQC) على نطاق واسع لرسم خريطة لمواقع الربط من خلال مراقبة اضطرابات التحول الكيميائي عند إضافة الترابط. تتيح تجارب تشتت الاسترخاء اكتشاف عمليات التبادل التوافقي والكيميائي التي تحدث على المقياس الزمني من الميكرو إلى المللي ثانية ، مما يوفر رؤى حول الجوانب الديناميكية للتعرف على الجليكان15،16. تتطلب هذه التقنيات القائمة على البروتين عادة تركيزات عينة في حدود 50 ميكرومتر إلى 2 ملي مولار ، اعتمادا على استقرار البروتين وكفاءة وضع العلامات17،18.

تقدم تقنيات الرنين المغناطيسي النووي القائمة على الترابط معلومات تكميلية من خلال التركيز على تغيرات الجليكان أثناء الربط. يعد فرق نقل التشبع (STD-NMR) مفيدا بشكل خاص لتحديد حواتم الجليكان المشاركة في التعرف ، لأنه يشبع بشكل انتقائي إشارات الرنين المغناطيسي النووي لمناطق الترابط التي على اتصال وثيق بالبروتين19،20. توفر الروابط المائية التي تمت ملاحظتها عن طريق التحليل الطيفي المتدرج (WaterLOGSY) 21،22 والتحليل الطيفي للتأثير المفرط النووي المنقول (Tr-NOESY) وسائل إضافية لتقييم التغيرات التوافقية والتوافقية أثناءالتفاعلات 23. علاوة على ذلك ، تساعد تجارب الاسترخاء Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) في تحديد التفاعلات الضعيفة والعابرة التي يصعب اكتشافها بالطرق التقليدية24. غالبا ما يتم إجراء التجارب القائمة على الترابط بتركيزات بروتين تتراوح من 10 إلى 50 ميكرومتر وقد تتطلب تحسين أوقات الخلط ومعلمات التشبع25. والجدير بالذكر أن هذه الطرق يمكن أن تكون محدودة بسبب قابلية الذوبان المنخفضة للجليكان أو ضعف نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند العمل مع الروابط الصغيرة.

توفر طرق الرنين المغناطيسي النووي هذه معا إطارا شاملا لتوضيح الخصائص الهيكلية والديناميكية لتفاعلات البروتين والجليكان. مع التقدم المستمر في استراتيجيات الحساسية ووضع العلامات النظيرية ، أصبحت هذه التقنية ضرورية بشكل متزايد في علم الأحياء السكرية ، حيث تقدم وجهات نظر جديدة حول آليات التعرف الجزيئي مع التطبيقات المحتملة في تطوير الأدوية واكتشاف المؤشرات الحيوية. ومع ذلك ، فإن نجاح هذه الأساليب يعتمد على عوامل مثل تجانس العينة ، وتعقيد الجليكان ، ووجود مناطق مرنة أو مضطربة قد توسع إشارات الرنين المغناطيسي النووي أو تعيق التفسير26. الرنين المغناطيسي النووي هو طريقة قوية لدراسة الأحداث العابرة ، وهو تحد كبير في علم الأحياء الهيكلي.

تتعرف CVN على بقايا المانوسيل المرتبطة α (1،2) الموجودة في السكريات قليلة السكاريد عالية المانوز مع الصلات النانوية27،28،29. ومع ذلك ، فإنه لا يتعرف بشكل سيئ على السكريات الأحادية D-mannose. في العمل الحالي ، درسنا تفاعل CVN مع D-mannose كطريقة لتوضيح مدى قوة الرنين المغناطيسي النووي في فهم التفاعلات العابرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على المزارع البكتيرية والمستحضرات العازلة وفقا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية. استخدم معدات الحماية الشخصية (PPE) ، وعند التعامل مع المزارع المفتوحة أو المواد الكيميائية ، اعمل في خزانة السلامة الحيوية أو غطاء الدخان الكيميائي إذا لزم الأمر.

1. التعبير عن Cyanovirin-N

  1. تحويل بكتريا قولونية خلايا BL21 باستخدام بلازميد يشفر جين CVN الذي تم إدخاله في ناقل pET26a.
  2. قم بزراعة الخلايا في 1 لتر من المرق الفائق (32 جم من التربتون ، 20 جم من مستخلص الخميرة ، 5 جم من كلوريد الصوديوم لكل لتر) ، مكمل بالكاناميسين (50 ميكروغرام / مل) ، 0.5٪ (وزن / حجم) جلوكوز ، و 1.6 ملي مولار MgSO4. احتضان تحت التحريض المستمر عند ~ 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. لإنتاج 15CVN المسمى N ، قم بزراعة الخلايا في وسط M9 البسيط المعدل باستخدام 15NH4Cl كمصدر وحيد للنيتروجين.
    1. قم بإعداد 1 لتر من الوسط الأدنى M9 عن طريق خلط 200 مل من محلول أملاح معقم 5x M9 يحتوي على 64 جم / لتر من Na2HPO4 ، 15 جم / لتر من KH2PO4 ، 2.5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، 5 جم / لتر من NH4Cl.
    2. أضف 2 مل من 1 M MgSO4 (0.22 ميكرومتر معقم بالترشيح) ، و 0.1 مل من 1 M CaCl2 (0.22 ميكرومتر معقم بالترشيح) ، و 4 جم من الجلوكوز (التركيز النهائي 0.4٪ ، مذاب في ماء مقطر معقم و 0.22 ميكرومتر معقم بالفلتر).
    3. اجعل الحجم النهائي يصل إلى 1 لتر بالماء المقطر المعقم.
      ملاحظة: يمكن إضافة المكملات الغذائية مثل الأحماض الأمينية أو الفيتامينات حسب الحاجة.
  4. راقب المزرعة حتى تصل إلى كثافة ضوئية (OD600) تبلغ حوالي 1.2. بعد ذلك ، أضف الأيزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوبيرانوزيد (IPTG) إلى التركيز النهائي البالغ 1.0 ملي مولار للحث على التعبير عن البروتين.
  5. احتضان لمدة 20 ساعة بعد الحث عند 37 درجة مئوية.
  6. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 7,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  7. اعزل الجزء المحيط بالبلازمية على النحو التالي:
    1. أعد تعليق كريات الخلية في 0.4 أحجام من 30 ملي مولار Tris-HCl عازلة (درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 20٪ سكروز و 1 ملي مولار EDTA واحتضانها في درجة حرارة الغرفة مع الرج لمدة 10 دقائق.
    2. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. أعد تعليق الكريات الناتجة في 0.4 كميات من الماء المقطر المثلج واحتضانها على الجليد مع الرج لمدة 10 دقائق.
    4. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    5. اجمع المادة الطافية ، التي تتوافق مع الجزء المحيط بالبلازمي ، لاستخراج البروتين.
      ملاحظة: يجب أن تحتوي جميع المخازن المؤقتة على كوكتيل مثبط للبروتياز لمنع تدهور البروتين.

2. تجارب الرنين المغناطيسي النووي

ملاحظة: تم الحصول على جميع التجارب عند 14.1 طن باستخدام مسبار الكشف العكسي بالرنين الثلاثي 1H / 15N / 13C (انظر جدول المواد) عند 298 كلفن.

  1. التجارب القائمة على الترابط
    1. تحضير العينة
      1. تحضير عينتين: واحدة تحتوي على CVN والأخرى بدون CVN (التحكم في الترابط فقط). تحتوي كل عينة على 600 ميكرولتر من 80 ميكرومولار CVN في مخزن فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) الذي يحتوي على 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم.
      2. أضف D-mannose إلى التركيز النهائي البالغ 4 ملليمتر.
      3. أضف 5٪ (حجم / حجم) D2O لكل عينة.
      4. انقل العينة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 5 مم.
      5. استخدم فائضا من المولار 50 ضعفا من الترابط بالنسبة للبروتين.
        ملاحظة: يوصى عادة بزيادة الترابط في حدود 10 أضعاف إلى 1000 أضعاف ، مع تفضيل تجاوزات أقل للبروتينات الصغيرة.
    2. الاقتناء الطيفي لتخصيص D-mannose
      1. الحصول على أطياف 2D TOCSY و 2D 1 H-13C HMBC باستخدام تسلسلات النبضات القياسية:
        2D TOCSY: التحليل الطيفي للارتباط الكلي الحساس للطور (TOCSY) مع نحت الإثارة لقمع الماء (DIPSI2ESGPPH).
        2D HMBC: 1 H-13C ارتباط متعدد الروابط غير المتجانسة مع اختيار التدرج والاكتساب غير المنفصل (HMBCGPNDQF).
        ملاحظة: تم إجراء هذه التجارب لغرض تعيين D-mannose ولكن لم يتم عرضها ، حيث أن تعيين التحول الكيميائي ليس ضمن نطاق هذه الدراسة.
    3. رسم خرائط ارتباط الترابط من خلال اضطراب التحول الكيميائي (CSP) للترابط
      1. لتحضير العينة واكتساب أطياف ¹H-¹³C HSQC ، قم بإعداد محلول 4 ملي مولار من D-mannose في محلول فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، مع 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم و 5٪ D2O. قسم المحلول إلى عينتين: واحدة تحتوي على 80 ميكرومولار CVN والأخرى بدون CVN (مرجع الترابط فقط).
        ملاحظة: سيتم استخدام هذه الأطياف لتحديد CSP ل D-mannose عند التفاعل مع CVN.
      2. لإعداد معلمات اكتساب H-13C HSQC ، استخدم تسلسل النبض القياسي HSQCETGPSI (اختيار التدرج وتحسين الحساسية 1 H-13C HSQC). قم بتعيين المعلمات التالية للاستحواذ:
        المجال الزمني (TD): 1024 × 128 نقطة معقدة (أبعاد ¹H × ¹³C)
        العرض الطيفي (SW): 10.0171 صفحة في الدقيقة (6009.615 هرتز) ل ¹H، 80 صفحة في الدقيقة (12069.106 هرتز) ل ¹³C
        ترددات الموجة الحاملة: 4.7 صفحة في الدقيقة لمدة ¹H، 75 صفحة في الدقيقة ل ¹³C
        - عدد عمليات الفحص: 448.
      3. احسب CSP باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-1
        حيث figure-protocol-2 وتمثل figure-protocol-3 اختلافات التحول الكيميائي بين D-mannose في وجود CVN (الشكل 1 أ ، المسمى باللون الأحمر) و D-mannose الحر (الشكل 1 ب).
    4. رسم خرائط ربط الترابط من خلال فرق نقل التشبع (STD)
      1. قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة وتكوين المعلمات لتجارب STD-NMR. ويمكن تطبيق استراتيجيتين تجريبيتين: (1) فحص ترددات التشبع المختلفة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ (1) فحص ترددات التشبع المختلفة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ (1) فحص ترددات التشبع المختلفة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء؛ (1) فحص ترددات التشبع المختلفة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. (ثانيا) تحديد تردد التشبع وتغيير وقت التشبع لتقييم التراكم.
      2. قم بإعداد تجارب الرنين المغناطيسي النووي 1D ¹H باستخدام تسلسل نبضات zgpr. اضبط مقياس الطيف ل ¹H ، وقم بإجراء اللمعة ، وقم بقياس نبضة صلبة 90 درجة (على سبيل المثال ، ~ 10 ميكرو ثانية عند توهين -10.6 ديسيبل ، أي ما يعادل ~ 11.482 واط).
      3. قم بتوسيط تردد الموجة الحاملة ¹H عند 4,7 جزء في المليون تقريبا، بما يتوافق مع إشارة الماء.
      4. حدد تسلسل نبضات STDDIFFESGP.3 وقم بتكوين معلمات الاكتساب على النحو التالي:
        اضبط العرض الطيفي وفقا لمتطلبات العينة.
        اضبط تأخير المسح البيني (d1) على 4 ثوان.
        حدد وقت التشبع (d20) بناء على التجربة المطلوبة.
        قم بتحميل FQ2LIST التي تحتوي على تردد التشبع خارج الرنين (-40 جزء في المليون) وترددات الرنين لتشبع إشارة البروتين فقط.
        ملاحظة: يجب أن تتوافق ترددات الرنين مع بروتونات البروتين ويجب أن تكون على بعد 1000 هرتز على الأقل من أي إشارة ترابط لتجنب التشبع المباشر.
      5. اختبر ترددات التشبع بالرنين التالية لتحديد الظروف المثلى: -0.59 جزء في المليون ، 0.73 جزء في المليون ، و 8.1 جزء في المليون (انظر الشكل 2 أ).
        ملاحظة: تم اختيار 0,73 جزء في المليون كتردد تشبع عند الرنين، حيث يوفر أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء. باستخدام هذا التردد ، تم قياس عامل تضخيم الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي (ASTD) كدالة لوقت التشبع. تحقيقا لهذه الغاية ، تم الحصول على أطياف الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي في أوقات تشبع مختلفة (0.5 ، 1 ، 1.5 ، 2 ، 2.5 ، 3 ، و 4 ثوان) لبناء منحنى تراكم الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي (الشكل 2 ب). ثم تم رسم قيم ASTD المقابلة كدالة لوقت التشبع (الشكل 2C) ، مما يسمح بتقييم كفاءة نقل التشبع ، والذي يتناسب مع وقت وقرب هيدروجين الترابط من البروتين. يعرف عاملالأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي على النحو التالي:
        figure-protocol-4
        ISTD هو الفرق في شدة الإشارة بين أطياف الرنين وخارجها ، I0 هي شدة الإشارة في طيف الرنين خارج الرنين ، [L] T هو تركيز الترابط الكلي ، و [P] هو تركيز البروتين. هذا التطبيع يفسر تأثيرات التركيز ويسمح بالمقارنة عبر الظروف التجريبية المختلفة. تعتمد الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي على انتشار الدوران والهبوط الجزيئي البطيء لنقل التشبع بكفاءة من البروتين إلى الترابط المرتبط. تسمح البروتينات الأكبر (الهبوط البطيء) بتشبع أكثر كفاءة وانتشار المغنطة داخل البروتين19،30،31،32.
      6. اضبط عدد عمليات المسح (ns) على 64 ومتوسط التجربة l4 (الحلقة 4) مرات.
      7. احسب العدد الإجمالي لعمليات الفحص على النحو التالي: إجمالي عمليات الفحص = ns × l4. استخدم 32,768 نقطة مركبة في البعد المباشر (TD) بعرض طيفي (SW) يبلغ 10.0171 صفحة في الدقيقة (6,009.615 هرتز).
      8. اضبط تأخير المسح البيني (d1) على 4 ثوان ووقت الاقتناء (AQ) على 2.7262976 ثانية. إجمالي تأخير الاسترخاء يساوي d1 + AQ.
      9. قم بتكوين نبضة التشبع على النحو التالي: المدة 50 مللي ثانية ؛ شكل غاوسي (ص 42) ؛ يتم التحكم فيها عبر برنامج على شكل 9 (SP9).
      10. استخدم متغير تسلسل نبضات STD الذي يتضمن مرشح T1ρ لقمع إشارات البروتين المتبقية. اضبط وقت قفل الدوران (d29) بناء على الوزن الجزيئي للبروتين. بالنسبة للبروتينات الأكبر حجما ، استخدم أوقات قفل الدوران الأصغر (~ 20 مللي ثانية) وللبروتينات الأصغر ، أكبر (> 40 مللي ثانية).
        ملاحظة: تم الحصول على جميع أطياف الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي عند 599,93 ميجاهرتز (BF1). يعد تعديل d29 أمرا بالغ الأهمية لتقليل خلفية البروتين مع الحفاظ على سلامة إشارة الترابط. قم بتحسين هذه المعلمة تجريبيا إذا لزم الأمر.
    5. رسم خرائط ربط الترابط عبر 1H-R2
      1. حدد برنامج CPMG_ESGP2D pulse من مكتبة Bruker القياسية. يعتمد هذا التسلسل على تجربة Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) ، والتي تتضمن نحت الإثارة لقمع المياه33.
      2. قم بتعيين التجربة على أنها اكتساب ثنائي الأبعاد.
        ملاحظة: هذه تجربة زائفة ثنائية الأبعاد يتم فيها استخدام البعد المباشر فقط لمعلومات التحول الكيميائي.
      3. قم بتكوين معلمات الاكتساب على النحو التالي:
        المجال الزمني (TD): 32,768 نقطة معقدة في البعد المباشر ¹H.
        (TD1): 2 نقطة.
        العرض الطيفي (SW): 7.9932 جزء في المليون (4,795.396 هرتز).
        تأخير Interscan (d1): 4 ثوان.
        تردد الموجة الحاملة (o1): 4.7 جزء في المليون (متمركزة على إشارة الماء).
        عدد عمليات المسح (ns): 8.
        عدد عمليات المسح الوهمية (ds): 4.
        تأخير CPMG (d20): ≤1 مللي ثانية (أي أقصر من 1⁄3 J_HH).
        عدد المتوسطات (TDav): 200.
      4. قم بتشغيل التجربة لمدة 200 دورة من 8 عمليات مسح لكل منها، مما أدى إلى تراكم إجمالي 1,600 عملية فحص. اضبط قائمة العدادات المتغيرة (vclist) وفقا للوقت الإجمالي المطلوب لدورة CPMG (TCPMG). هنا ، تم اختيار دورتين ل TCPMG = 8 مللي ثانية و 200 دورة ل TCPMG = 800 مللي ثانية.
      5. قم بإجراء تجربتين 1H-CPMG ، واحدة للعينة التي تحتوي على البروتين (4 ملي مولار D-mannose و 80 ميكرومتر CVN) والأخرى ل D-mannose الحر (4 ملي مولار D-mannose).
      6. ارسم أطياف 1H لكل TCPMGعبر الأمر efp (الضرب الأسي متبوعا بتحويل فورييه وتصحيح الطور) أو sinm (الضرب الجيبي المتحول بمقدار 90 درجة ، SSB = 2) متبوعا ب fp (تحويل فورييه وتصحيح الطور). اضبط وظيفة النافذة وفقا لأفضل استراتيجية معالجة.
        ملاحظة: في هذه التجربة تم استخدام sinm و fp. سيكونالمسلسل الأول هو الأطياف مع TCPMG من 8 مللي ثانية (الأول في vclist) ، وسيكونالمسلسل الثاني 800 مللي ثانية (الثاني في vclist). يتم رسم أطياف 1H المعالجة في الشكل 3.
      7. احسب حاصل CPMG (Q) عبر المعادلة 3.
        ​figure-protocol-5
  2. التجارب القائمة على البروتين
    1. تحضير العينة
      1. تحضير 600 ميكرولتر من عينة تحتوي على 436 ميكرومولار بشكل موحد 15CVN المسمى بالنيوتروجين في مخزن فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.4) مع 50 ملي مولار كلوريد الصوديوم و 5٪ أكسيد الديوتيريوم (D2O). قم بمعايرة D-mannose في العينة إلى تركيز نهائي يبلغ 60 ملليمتر. للمعايرة بالتحليل الحجمي ، استخدم أنبوب الرنين المغناطيسي النووي 5 مم.
    2. تعيين الرنين (خطوة التحقق الاختيارية)
      1. تأكد من تعيين CVN الحر في المحلول باستخدام قيم الإزاحة الكيميائية المبلغ عنهاسابقا 34. احصل على أطياف الرنين الثلاثي التالية: HNCO و HNCA و HNCACB و CBCACONH35،36،37.
        ملاحظة: تعمل هذه التجارب فقط على التحقق من صحة المهمة ولا يتم عرضها ، حيث أن تعيين الإزاحة الكيميائية ليس الهدف الأساسي لهذا البروتوكول.
    3. رسم خرائط ارتباط D-mannose على CVN عن طريق اضطراب التحول الكيميائي للبروتين
      1. احصل على أطياف 1 H-15N HSQC من 15CVN المسمى N عند 298 كلفن. قم بإجراء معايرة بالتحليل الحجمي عن طريق إضافة D-mannose للوصول إلى التركيزات النهائية التالية: 0 و1 و2 و5 و10 و20 و40 و60 ملليمتر.
      2. قم بإعداد تجربة 1 H-15N Fast-HSQC باستخدام تسلسل نبضات FHSQCF3GPPH الحساس للطور من مكتبة Bruker القياسية. استخدم المعلمات التالية:
        المجال الزمني (TD): 1024 × 140 نقطة معقدة في الأبعاد 1H و 15N.
        العرض الطيفي (SW): 16.0274 جزء في المليون (9615.385 هرتز) في البعد 1H و 34 جزء في المليون (2067.119 هرتز) في البعد 15نيوتن.
        تردد الموجة الحاملة: 4,7 جزء في المليون (1ساعة) و119 جزء في المليون (15نيوتن).
        عدد عمليات الفحص: 128.
      3. احسب اضطراب التحول الكيميائي (Δδ) باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-6
        أين figure-protocol-7 وهل figure-protocol-8 اختلافات التحول الكيميائي بين CVN في وجود وعدم وجود D-mannose (الشكل 4 أ).
        ملاحظة: يفسر العامل 10 الفرق في العرض الطيفي بين أبعاد البروتون والنيتروجين.
      4. احسب ثابت التفكك (KD) عن طريق رسم قيم CSP لكل بقايا كدالة لتركيز D-mannose. قم بملاءمة البيانات الناتجة مع متساوي الحرارة المرتبط في موقع واحد باستخدام المعادلة التالية (5).
        figure-protocol-9المعادلة 5
        حيث [PT] هو تركيز البروتين المستخدم في المعايرة بالتحليل الحجمي (CVN) ، [PT] هو تركيز الترابط (D-mannose) ، و CSPmax هو CSP عند تركيز التشبع للترابط و CSPmin في حالة عدم وجود الترابط.
    4. رسم خرائط ارتباط D-mannose ب CVN عبر موضع 15N-R 2 للبروتين.
      1. قم بقياس قيم 15N-R 2 للمخلفات الفردية ل CVN في غياب ووجود 60 ملي مولار D-mannose. قم بإجراء جميع التجارب عند 298 كلفن.
      2. قم بإعداد تجربة 15N-R 2 باستخدام HSQCT2ETF3GPSI3D تسلسل النبض المستند إلى CPMG الحساس للطور من مكتبة Bruker القياسية. استخدم المعلمات التالية:
        المجال الزمني (TD): 1024 × 128 نقطة معقدة في الأبعاد 1H و 15N ، مع 8 نقاط في البعد الزائف.
        العرض الطيفي (SW): 16.0274 جزء في المليون (1H؛ 9615.385 هرتز) و 34 جزء في المليون (15نيوتن ؛ 2067.119 هرتز).
        تردد الموجة الحاملة: 4,7 جزء في المليون (1ساعة) و119 جزء في المليون (15نيوتن).
        عدد عمليات الفحص: 32. (ت) قائمة العدادات المتغيرة: 1 و8 و2 و6 و3 و5 و4 و7، المقابلة لتأخيرات الاسترخاء (Trelax) البالغة 16.96 و135.68 و33.92 و101.76 و50.88 و84.96 و67.84 و118.72 مللي ثانية على التوالي.
      3. قم بمعالجة الأطياف الزائفة ثلاثية الأبعاد كسلسلة من أطياف استرخاء الارتباط 1H / 15N الشبيهة ب HSQC باستخدام NMRPipe38 ، باتباع البرنامج التعليمي (انظر جدول المواد للحصول على رابط إلى البرنامج التعليمي).
      4. استيراد الأطياف المعالجة إلى منصة مناسبة لتحليل الرنين المغناطيسي النووي (على سبيل المثال ، CCPNMR39). حدد جميع الأطياف وقم بتطبيق أداة "متابعة تغييرات الشدة". ارسم شدة كل ذروة متقاطعة كدالة ل Tالاسترخاء وتناسب الاضمحلال مع وظيفة أحادية الأسية لاستخراج 15قيمةN-R 2 لكل بقايا.
      5. احسب الخطأ التجريبي من نسبة الإشارة إلى الضوضاء للأطياف الشبيهة ب HSQC عند 67.84 مللي ثانية. قم بمعالجة منطقة من الطيف تحتوي على ضوضاء فقط وتحويلها إلى ملف نصي باستخدام الأمر التالي:
        pipe2txt.tcl ./PROCs / قدم / R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. حدد الانحراف المعياري لمنطقة الضوضاء باستخدام البرامج الإحصائية (على سبيل المثال ، Origin (Pro) ، الإصدار 2021). حدد هذه القيمة على أنها شدة الضوضاء Iالضوضاء.
      7. احسب الخطأ التجريبي لكل بقايا باستخدام المعادلة التالية:
        figure-protocol-10
        ملاحظة: من المهم استخدام الخطأ التجريبي بدلا من خطأ التركيب. يحدد الخطأ التجريبي حدود التفسير عند مقارنة 15N-R 2 في غياب ووجود D-mannose.

figure-protocol-11
الشكل 1: اضطراب التحول الكيميائي ل D-mannose في وجود CVN. (أ) 1 H-13C-HSQC طيف D-mannose في وجود CVN. (ب) 1طيف H-13C-HSQC من D-mannose الحر. تظهر الملصقات الموجودة في الأطياف كل من تعيينات التحول الكيميائي والتكوين الشاذ المعني (α أو β). الملصقات باللون الأحمر هي تلك المخصصة للتشكل المرتبط ، وتلك الموجودة باللون الأسود هي تلك المخصصة للتشكل الحر. (ج) تراكب أطياف 1 H-13C-HSQC في وجود (أخضر) وغياب (أزرق) ل CVN. (د) التركيب الكيميائي للمانوز α و β-D-mannose مع إبراز CSP المرصود، والذي تم حسابه وفقا للمعادلة (1). يتم تصوير قيم CSP أسفل الدوائر الخضراء. تمثل الدائرة الحمراء الهيدروجين β الشاذ الذي اختفى في وجود CVN. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-12
الشكل 2: أطياف فرق نقل التشبع (STD) ل D-mannose في وجود CVN. (أ) الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي المكتسبة بترددات تشبع مختلفة: -0.59 و 0.73 و 8.1 جزء في المليون. (ب) الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي المكتسبة في أوقات تشبع مختلفة: 0.5 و 1 و 1.5 و 2 و 2.5 و 3 و 4 س. (ج) عامل تضخيم الأمراض المنقولة بالاتصال الجنسي (ASTD) محسوب وفقا للمعادلة 2 كدالة لزمن التشبع. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-13
الشكل 3: 1H-R2 من D-mannose في وجود وغياب CVN. (أ) تمثيل أطياف D-mannose 1H-CPMG المتوقعة للرابط وغير المرتبط المكتسب بأوقات استرخاء R2 تبلغ 8 و 800 مللي ثانية في غياب (أسفل) ووجود (أعلى) CVN. تم حساب Q وفقا للمعادلة 3. في حالة عدم وجود تفاعل (Q ≈ 1) ، تظل شدة الإشارة متشابهة في كل من أوقات استرخاء الترابط مع البروتين أو بدونه. عند الارتباط (Q < 1) ، تنخفض شدة الإشارة مع زيادة الاسترخاء للعينة التي تحتوي على البروتين. (ب) التمثيل التخطيطي للتبادل الكيميائي بين الحالات الحرة والمقيدة ل D-mannose. اعتمادا على القيم النسبية لفرق التحول الكيميائي (Δω) وثابت سعر الصرف (kex = kon + koff) ، يقع النظام في أنظمة تبادل بطيئة أو متوسطة أو سريعة. (ج)1أطياف H NMR من D-mannose الحرة و D-mannose في وجود CVN ، تظهر اختلافات في شدة الإشارة عند أوقات استرخاء 8 ms و 800 ms. يتم عرض عوامل Q المحسوبة لهيدروجينات معينة (H6β ، H3β ، H5α ، H4β) ، مع قيم Q المنخفضة التي تشير إلى تفاعلات أقوى مع CVN وتحديد مناطق السكر المشاركة في الارتباط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-14
الشكل 4: تحليل اضطراب التحول الكيميائي (CSP) الذي يكشف عن بقايا CVN المشاركة في ربط D-mannose. (أ) مخططات شريط تظهر العمود الفقري أميد (15 N-1H) CSPs ل CVN عند المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام D-mannose بتركيزات 10 ملي مولار (أعلى) و 60 ملي مولار (أسفل). تشير الخطوط الأفقية إلى متوسط CSP بالإضافة إلى انحراف معياري واحد أو اثنين (av + sd ، av + 2 sd) ، والتي تم استخدامها كعتبات لتحديد المخلفات المضطربة بشكل كبير. (ب) رسم خرائط للمخلفات المضطربة بشكل كبير على هيكل CVN المركب مع ثنائي السكاريد Manα1-2Manα (معرف PDB: 1IIY40). يتم تمييز المخلفات التي تحتوي على CSPs أعلى من عتبة av + 2 sd باللون الأحمر ، وتلك الموجودة بين av + sd و av + 2 sd موضحة باللون الأزرق. يتم عرض جزيئات Manα1-2Manα ثنائية السكاريد باللون البرتقالي للإشارة إلى موقع ارتباطها. (ج) منحنيات الربط المختارة التي تمثل CSPs كدالة لتركيز D-mannose. تم تركيب البيانات وفقا للمعادلة 5 كنموذج ربط أحادي الموقع لتقدير KD ، مما يكشف عن مجموعة من الصلات ، حيث أظهر D44 أقوى تفاعل (KD = 1.1 ± 0.35 mM) و E41 الأضعف (KD = 35 ± 29 mM). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-15
الشكل 5: تحليل 15N-R2 ل CVN مجانا ومرتبطة ب D-mannose. (أ ، ب) معدلات الاسترخاء المستعرضة (15N-R 2) مقاسة لكل بقايا CVN في حالاتها الحرة (A) و (B) D-mannose-bound-state. (ج) الفرق في قيم R2 (ΔR2 = R2bound −R 2مجانا) مرسومة لكل بقايا. يمثل الخطان الأزرق والأحمر انحرافا معياريا واحدا واثنين من المتوسط (av ± sd و av ± 2 sd) ، على التوالي. يتم تصنيف المخلفات ذات القيم ΔR2 الهامة. (د) رسم خرائط لقيم ΔR2 لهيكل CVN المركب مع ثنائي السكاريد Manα1-2Manα (معرف PDB: 1IIY40). تظهر المخلفات التي تحتوي على ΔR2 أعلى أو أقل من av± 2 sd باللون الأحمر. تظهر تلك الموجودة بين AV ± SD و AV ± 2 SD باللون الأزرق. يتم عرض جزيئات D-mannose باللون البرتقالي للإشارة إلى موقع ربطها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في العمل الحالي ، قدمنا تجارب الرنين المغناطيسي النووي للتحقيق في تفاعلات البروتين والجليكان. يكمن التعرف الجزيئي للبروتين والجليكان على العديد من العمليات البيولوجية التي تنطوي على المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، بما في ذلك تنظيم التصاق الخلايا والهجرة والانتشار وأشكال أخرى مختلفة من الاتصالات الخلوية.

هنا ، اخترنا العمل مع السكريات الأحادية D-mannose ، والتي توصف بأنها مادة رابطة ضعيفة. كان الهدف هو وصف طرق قياس التفاعلات العابرة وتسليط الضوء على أهميتها في توضيح آليات الربط. تم استخدام ثلاثة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يمثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي نهجا متعدد الاستخدامات للتحقيق في تفاعلات البروتين والجليكان ، لا سيما بسبب قدرته على اكتشاف التفاعلات الضعيفة والعابرة ، مثل تلك التي لوحظت بين CVN و D-mannose. يجمع البروتوكول الموصوف هنا بين طرق الرنين المغناطيسي النووي القائمة على الترابط والبروتين ، مما يسمح بتوصيف أكثر شمولا لواجهة التفاعل.

تشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول إعداد العينة بعناية مع التحكم الدقيق في تركيزات البروتين والترابط ، وتوحيد المعلمات الطي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

نشكر المركز الوطني للإصلاح الماغنيتيكا النووي جيري جوناس (CNRMN) على استخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي. نحن ممتنون للدكتورة كارول بيولي لمشاركتها معنا مهام التحول الكيميائي ل CVN في مجمع مع Manα1-2Manα. كما نشكر وكالات التمويل FAPERJ و CNPq.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
13 درجة مئوية جلوكوزمختبر كامبريج للنظائر.سي إل إم -481
15N كلوريد الأمونيوممختبر كامبريج للنظائر.إن إم -467
كلوريد الكالسيومسيجما ألدريتشج 4901
كوكيتيل يمنع البروتيازسيجما ألدريتش4693159001
D2Oمختبر كامبريج للنظائر.دي إل إم -4
دي مانوزسيجما ألدريتشإم 2069-5 جي
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتشم 8266
NMRPipeرابط البرنامج التعليمي: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
كلوريد البوتاسيوم (K2HPO4)سيجما ألدريتشص 3786
كلوريد البوتاسيوم (KCl)سيجما ألدريتشص 3911
كلوريد البوتاسيوم (KH2PO4)سيجما ألدريتشص 0662
أنبوب شيجيميبروكرZ1Z10684A
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)سيجما ألدريتشS9625
فوسفات الصوديوم (Na2HPO4)سيجما ألدريتش567545
فوسفات الصوديوم (NaH2PO4)سيجما ألدريتشس 97263
مطياف بروكر 600 ميجاهرتزبروكر
مطياف بروكر 800 ميجاهرتزبروكر
تيامينسيجما ألدريتشتي 1270
مسبار TXI ثلاثي الرنينبروكر
التربتونسيجما ألدريتش93657
مستخلص الخميرةسيجما ألدريتشي1625

المراجع

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة