مقالة منهجية

اختبار تخفيف FRET لتحليل التبادل الديناميكي بين مجموعات البروتين

DOI:

10.3791/68678

⸱

سبتمبر 19, 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التنقية والوسم التساهمي للانعكاس A1 بالإضافة إلى مقايسة تخفيف FRET لتوصيف التبادل الديناميكي لبروتين الانعكاس بين مجموعات البروتين كدالة للعمر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باعتباره المحرك الجزيئي للتقزح القابل للضبط في رأسيات الأرجل ، لا يزال سلوك الطور القابل للضبط لبروتين الانعكاس A1 محور هندسة المواد الحيوية. يؤدي تعديل تركيز الملح وكثافة شحنة البروتين الصافية للانعكاس A1 إلى دفع البروتين لتشكيل تجميعات ديناميكية كوسيطة لفصل الطور السائل عن السائل. على الرغم من أن تجميعات الانعكاسات محدودة الحجم بمدى تحييد شحنة تنافر كولومبيك الكاتيوني للبروتين ، إلا أنها في البداية في تبادل ديناميكي مع المونومرات أو القلة من المحلول المحيط. تم استخدام مقايسة تخفيف جديدة لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، جنبا إلى جنب مع تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ومقايسات تركيز البروتين ، لتوصيف التدفق ثنائي الاتجاه للبروتين بين مجموعات الانعكاس A1 والمرحلة المخففة كدالة لعمر التجميع. يميز اختبار تخفيف FRET هذا بين تدفق البروتين أحادي الاتجاه وثنائي الاتجاه داخل وخارج مجموعات البروتين ، وبالتالي يمكن تطبيقه أثناء تكوين التجميع. يعد التمييز بين مجموعات البروتين الديناميكية والتوقفت حركيا أمرا بالغ الأهمية لفهم أصولها الفيزيائية الحيوية ، ويمكن تكييف مقايسة تخفيف FRET الجديدة لتكملة التحقيقات الفيزيائية الحيوية لتجميعات البروتين الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التوسط في التقزح القابل للضبط في الحبار المذاقي بواسطة بروتينات الانعكاس في خلايا القزحية1،2،3. تحتوي الخلايا القزحية على غزوات غشائية واسعة ومنتظمة تشكل أكواما من صفائح براج كثيفة البروتين ، والتي تعكس الضوء بطريقة تعتمد على الزاوية والطول الموجي1،4،5،6. تتوج سلسلة الإشارة التي يتم تشغيلها بواسطة الأسيتيل كولين بفسفرة بروتينات الانعكاس الكاتيوني1،2،7 ، مما يقلل من التنافر الكهروستاتيكي داخل البروتين وبين البروتين ويدفع تكثيف الانعكاسات في صفائح براج من جزيئات نصف قطرها الهيدروديناميكية 10-50 نانومتر إلى مكثفات سائلة كثيفة3،8،9. يشكل Reflectin A1 في المختبر مجموعات نصف قطرها 10+ نانومتر مستقرة الحجم يتم ضبط أحجامها بدقة بواسطة كثافة شحن صافية للبروتين10،11،12 ، وقد حظي هذا السلوك الغروي القابل للضبط بالكثير من اهتمام الهندسة الحيوية في تصميم مواد ضوئية حيوية قابلة للضبط قائمة على الانعكاسات13،14،15،16،17،18. لقد ثبت مؤخرا أن كلوريد الصوديوم يقود انعكاسا في مجموعة A1 و LLPS (فصل الطور السائل عن السائل) عن طريق زيادة المساهمة النشطة للتأثير الكارهة للماء بشكل إنتروبي وفحص الشحنات المثيرة للاشمئزاز للروابط الموجبة المتناوبة19.

بالنسبة للمكثفات الشبيهة بالسائل كثيفة البروتين ، يمكن تحليل التبادل الديناميكي بين المرحلة الكثيفة والمرحلة المخففة بسهولة باستخدام FRAP كامل القطرات (استعادة التألق بعد التبييض الضوئي) 20 ؛ هناك حاجة إلى اختبار مماثل لتجميعات البروتين على نطاق النانومتر. اقترحت التقارير الحديثة لتجميعات البروتين ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية كوسيطة ل LLPS19،21،22 الحاجة إلى طرق مكافئة لاستجواب ديناميكيات التجميع والتبادل الديناميكي بين التجميعات ومرحلة التخفيف المتعايشة. يمكن أن تشتمل مجموعات البروتين على غرويات شبيهة بالزجاج تم إيقافها حركيا الناتجة عن تحلل الشوكي الموقوف ، وتجمعات التوازن الديناميكي التي تتبادل المونومرات أو القلة القليلة من الطور المخفف ، والمجموعات شبه المستقرة23،24،25،26،27. لذلك فإن ديناميكيات تجميع البروتين المعتمدة على العمر هي المفتاح لفهم العمليات الفيزيائية التي تقود تكوين مجموعات البروتين في سياق سلوك الطور الأكثر تعقيدا.

تم استخدام الأساليب القائمة على FRET التي تحلل التفاعل بين مجموعات البروتين المسمى بالفلوروفور من المتبرعين وتجميعات البروتين المسمى بالفلوروفور لتوصيف ديناميكيات مجموعات البروتين غير المستقرة21. عند خلط هذه المجموعات ، يوضح ظهور FRET تبادل البروتين ونقله إلى المجموعات21. ومع ذلك ، بالنسبة لبعض البروتينات ، مثل reflectin A1 ، تتشكل المجموعات وتنمو باستمرار على مدار مدة التجربة19. بالنسبة لمثل هذه البروتينات ، هناك حاجة إلى نهج يفكك نقل البروتين في اتجاه واحد إلى مجموعات ، كما قد يحدث أثناء التكوين المستمر للعناقيد المتوقفة ديناميكيا ، والنقل ثنائي الاتجاه للبروتين بين التجميعات.

يحقق نهج تخفيف FRET ذلك عن طريق تخفيف الفلوروفور (الشكل 1) ، حيث يشير الانخفاض في FRET إلى النقل ثنائي الاتجاه للبروتين بين التجميعات. تم تحضير مجموعات البروتين من بروتين الانعكاس التي تحتوي على كميات متساوية من البروتين المسمى إما بالفلوروفور المتقبل أو الفلوروفور المتبرع. تم تخفيف مجموعات الانعكاس ذات العلامات المشتركة بمحلول يحتوي على تجميعات انعكاسات غير مصنفة ، وتم تحليل التبادل الديناميكي للبروتين بين التجميعات كدالة لعمر التجميع. تميز هذه الطريقة التكوين المستمر لمجموعات البروتين الموقوف حركيا عن المجموعات الديناميكية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر العناقيد غير المستقرة ، والمجموعات التي تنمو بسبب نضج أوستوالد أو عمليات الخشونة المماثلة ، والعناقيد التي تنمو عن طريق الاندماج ، والمجموعات التي ليست وسيطة ل LLPS. إنه لا يميز فقط بين هذه الآليات المختلفة للتبادل الديناميكي ، الأمر الذي يتطلب طرقا متعامدة مثل تشتت الضوء الديناميكي ، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، ومقايسات برادفورد19،21. يصف هذا البروتوكول طرق تنقية الانعكاس A1 من النوع البري والمتحور المفرد المحتوي على السيستين A1-C232S ، ووضع العلامات التساهمية ل A1-C232S ، وتحليل تخفيف FRET.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تنقية البروتين ووضع العلامات التساهمية

  1. التحول
    1. استنساخ ينعكس A1 وينعكس جينات A1 C232S (GenBank KF661517.1) في بلازميدات pj411.
    2. انقيض خلايا وردية 2 (DE3) مع البلازميدات باستخدام معالجة الصدمة الحرارية28.
    3. الخلايا المنقولة على أجار تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كانامايسين.
    4. حدد مستعمرة معزولة وأضفها إلى 5 مل من TB (مرق رائع) يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كانامايسين واحتضن عند 37 درجة مئوية على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة طوال الليل.
    5. عزل البلازميدات باستخدام بروتوكول مجموعة عزل البلازميد للتسلسل.
  2. تعبير البروتين والتحلل وتنقية الجسم
    1. أضف 5 مل من المزرعة إلى 1 لتر رطل (مرق ليسوجيني) مع 50 ميكروغرام / مل كانامايسين ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية أثناء الرج. عند A600 من 0.6-0.7 ، قم بتحفيز التعبير عن طريق إضافة IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) إلى تركيز نهائي قدره 5 ملي مولار.
    2. بعد 16 ساعة ، تم طرد خلايا الحبيبات عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق. صب الكريات الطافية وتجميد الخلايا في ثلاجة -80 درجة مئوية.
    3. تحلل الخلايا وتنقية أجسام التضمين باستخدام كاشف تنقية جسم التضمين لكل بروتوكول الشركة المصنعة ، بما في ذلك معالجة لمدة 20 دقيقة ب 1 ميكرولتر (25-29 وحدة) من البنزوناز و 3-5 كيلو كيو من الليزوزيم لكل مل من كاشف تنقية جسم التضمين بعد إعادة التعليق الأولي لحبيبات الخلية. ستظهر أجسام التضمين المنقاة على شكل كريات بنية داكنة.
  3. FPLC (كروماتوغرافيا البروتين السائل السريع)
    1. تحضير 2 لتر من 8 أمتار يوريا: 5٪ محلول حمض الخليك (العازلة أ) و 1 لتر من 8 موتري من هيدروكلوريد الجوانيدينيوم: 5٪ محلول حمض الخليك (العازلة ب). قم بتصفية كلاهما باستخدام مرشح قارورة فراغ 0.22 ميكرومتر.
      تنبيه: تجنب الاستنشاق والعين والجلد مع هيدروكلوريد جوانيدينيوم وارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة عند التعامل معها. تخلص منها في حاوية نفايات مخصصة.
    2. أعد تعليق كريات الجسم المشمولة في 8 M اليوريا: محلول حمض الأسيتيك 5٪ عن طريق التقليب القوي باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي. سيبدو الحل عكرا. جهاز طرد مركزي مسبق للتبريد إلى 4 درجات مئوية ، وجهاز طرد مركزي عند 18,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 70 دقيقة ، وجمع الطافق ل FPLC. سيظهر الطافي بنيا وشفافا.
    3. باستخدام معدل تدفق يبلغ 2 مل/دقيقة لجميع الخطوات التالية، قم بموازنة 10 مل من عمود التبادل الكاتيوني مع 5 أحجام أعمدة (CVs) بنسبة 95٪ Buffer A و 5٪ Buffer B، وقم بتحميل العينة. اغسل العينة غير المنضمة ب 5 CVs ، ثم قم بتنفيذ تدرج الخطوة: 5 CVs من 94٪ Buffer A / 6٪ Buffer B ، ثم 5 CVs 10٪ Buffer B. Reflectin A1 يبتعد عند 10٪ Buffer B.
    4. قم بتقييم نقاء الكسور المقابلة لتغيير الخطوة الأولى إلى 10٪ Buffer B بواسطة SDS-PAGE وتجميعها إذا كانت متشابهة. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا إلى 4 درجات مئوية وتركيز الكسور إلى الحجم النهائي من 4-5 مل باستخدام مكثف دوران MWCO سعة 15 مل 10 كيلو دالتون.
  4. HPLC (كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء)
    1. تحضير 2 لتر من الماء سعة 18 مللي أوم مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) و 2 لتر من الأسيتونيتريل مع 0.1٪ TFA. قم بتصفية كلاهما باستخدام مرشح قارورة فراغ 0.22 ميكرومتر.
      تنبيه: TFA هو حمض دخان قوي. مقبض في غطاء دخان ، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، وانقله فقط باستخدام الزجاج. تجنب الاستنشاق والعين والجلد مع الأسيتونيتريل ، وارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل معها. تخلص منها في حاوية نفايات مخصصة.
    2. باستخدام معدل تدفق 1 مل / دقيقة لجميع الخطوات التالية ، قم بموازنة عمود C4 مع 5 CVs من 85٪ 18 mΩ ماء ، و 0.1٪ TFA ، و 15٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ TFA.
    3. ابدأ التدفق وحقن العينة. تدفق 2 CVs ، ثم ابدأ التدرج الثابت إلى 80٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ TFA على 5 CVs. عادة ما يكون Reflectin A1 مسطحا بنسبة 73٪ أسيتونيتريل.
    4. كسور تجميد القشرة التي تحتوي على بروتين انعكاس في أنابيب سعة 5 مل باستخدام حمام الإيثانول والثلج الجاف. التجميد ، وتخزينه في درجة حرارة - 80 درجة مئوية. سيظهر البروتين على شكل صفائح بيضاء رقيقة.
  5. تحضير مخزون البروتين غير المسمى
    1. تحضير 4 لترات من الأس الهيدروجيني 4 ، 25 ملي مولار من حمض الأسيتيك (21.05 ملي مولار حمض الخليك ، 3.95 ملي أمبير أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدرات) باستخدام حمض الخليك الجليدي وثلاثي هيدرات أسيتات الصوديوم. اضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر باستخدام 4 ميجا حمض الهيدروكلوريك أو 4 ميجا هيدروكلوديوم الهيدروكسيدان. قم بالتصفية باستخدام مرشح فراغ 0.22 ميكرومتر.
      تنبيه: تعامل مع الأحماض / القواعد القوية مرتدية معدات الوقاية الشخصية المناسبة. لا تقم أبدا بإضافة الماء إلى حمض أو قاعدة قوية مركزة.
    2. قم بإذابة الأنبوب الذي يحتوي على بروتين انعكاس مجفف بالتجميد ، ومع الأنبوب في حمام جليدي ، قم بإذابة الرقم الهيدروجيني 4 ، 25 ملي مولار من محلول حمض الخليك. سيظهر محلول البروتين القابل للذوبان تماما عديم اللون بدون تعكر أو راسب مرئي.
      1. باستخدام كاسيت غسيل الكلى المقطوع بالوزن الجزيئي 10 كيلو دالتون ، قم بتحليل بروتين الانعكاس القابل للذوبان في حجم عينة 1000x من الأس الهيدروجيني 4 ، 25 ملي مولار من حمض الخليك المبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية باستخدام تغييرين لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بتخفيف العينة باستخدام محلول حامض الأسيتيك 4 ، 25 ملي مولار للحصول على تركيز بروتين نهائي يبلغ 100 ميكرومتر وحجم نهائي لا يقل عن 150 ميكرولتر. باستخدام مطياف UV-VIS ، قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر واستخدم معامل الامتصاص المولي29 من الانعكاس A1 (123،685 م -1 سم -1) لتحديد تركيز البروتين.
    4. انقل مخزون البروتين العاكس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بغطاء 0.5 مل وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى 7 أيام. مباشرة قبل التجارب ، انعكاس جهاز الطرد المركزي في مخزون البروتين عند 4 درجات مئوية في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا عند 18,000 × جم لمدة 15 دقيقة. قم بإعداد مخزون الانعكاس A1 C232S بالمثل باستخدام معامل الامتصاص المولي البالغ 123،540 م -1 سم -1.
  6. وضع العلامات على البروتين
    1. قم بإعداد مخزون 10 ملغم/مل بشكل منفصل من FMTS (فلوريسسين-ميثان إيثيوسلفونات) و SRMT (سلفورهودامين ميثان إيثيوسلفونات) عن طريق إضافة 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد الجاف (DMSO) إلى قارورة تحتوي على 10 مجم من مسبار الفلورسنت وخلط الماصات.
      تحذير: تجنب الاستنشاق والعين وملامسة الجلد لكواشف ميثان إيثيوسلفونات.
    2. أضف 7.7 ميكرولتر من مخزون FMTS 10 مجم / مل أو 10.4 ميكرولتر من مخزون SRMT 10 مجم / مل إلى المخزن المؤقت لحمض الأسيتيك 4 ، 25 ملي مولار إلى الحجم النهائي 150 ميكرولتر والتركيز النهائي 500 ميكرومتر FMTS أو SRMT. سيبدو الحل عكرا. قم بتجميد ما تبقى من مخزون مسبار الفلورسنت عند -80 درجة مئوية.
    3. يمزج مع 150 ميكرولتر من مخزون البروتين العاكس 100 ميكرومتر ومزيج الماصة جيدا. تركيز البروتين النهائي هو 50 ميكرومتر ، وتركيز مسبار الفلورسنت النهائي هو 500 ميكرومتر. سوف تنخفض تعكر المحلول.
    4. لفها بورق القصدير ، واحتضنها في وضع مستقيم مع التحريك المداري اللطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات ، ثم طوال الليل عند 4 درجات مئوية. لا ينبغي أن تتغير تعكر المحلول.
    5. في حالة وجود أي راسب ، أعد تعليقه عن طريق خلط الماصة بقوة. سيكون الحل عكرا. تركيز الانعكاس باستخدام مرشح الطرد المركزي MWCO 10,000 كيلو دالتون إلى الحجم المستهدف 100 ميكرولتر وتركيز 150 ميكرومتر.
    6. استخدم نفس طريقة HPLC والتجميد كما هو الحال في تنقية البروتين لإزالة مسبار الفلورسنت غير المرتبط وتخزين البروتين عند - 80 درجة مئوية ملفوفة بورق الألمنيوم. قم بإعادة إذابة البروتين المسمى باستخدام نفس الطريقة للبروتين غير المسمى. تحديد درجة وضع العلامات.
      ملاحظة: سيظهر بروتين الانعكاس الفلوري القابل للذوبان باللون الأصفر والأخضر (C199-F) أو الأحمر الداكن (C199-R) بدون تعكر أو هطول الأمطار.
  7. تحضير مخزون البروتين ذو العلامات المشتركة
    1. أضف 27 ميكرولتر من مخزون بروتين A1 100 ميكرومتر إلى جهاز طرد مركزي دقيق بغطاء مفاجئ سعة 0.5 مل.
    2. أضف 1.5 ميكرولتر من العاكس المسمى بالفلورسين A1-C232S (يشار إليه باسم C199-F للدلالة على موضع الأحماض الأمينية للفلورسين) إلى نفس الأنبوب.
    3. أضف 1.5 ميكرولتر من الانعكاس المسمى بالسلفورهودامين A1-C232S (يشار إليه باسم C199-R للدلالة على موضع الأحماض الأمينية للفلورسين) إلى نفس الأنبوب. التركيزات النهائية هي 90 ميكرومتر A1 و 5 ميكرومتر C199-F و 5 ميكرومتر C199-R.
    4. لفها بورق القصدير واحفظها في درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى 7 أيام.

2. سلسلة زمنية FRET

  1. تحضير المخازن المؤقتة والترشيح
    1. تحضير 500 مل من 25 ملي مولار 3- (N-مورفولينو) حمض بروبان سلفونيك (MOPS). اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7 عن طريق إضافة 4 M من هيدروكسيد الصوديوم ببطء. قم بتصفية 10 مل باستخدام حقنة سعة 10 مل وفلتر حقنة 0.22 ميكرومتر.
  2. بروتين الطرد المركزي
    1. جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة يبرد مسبقا إلى 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي غير المسماة وذات العلامات المشتركة ينعكس A1 مخزون 18,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  3. إعداد مجموعات A1 المسمى
    1. لتحضير ثلاث نسخ مكررة، قم بسحب الماصة 9.6 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS (درجة الحموضة 7، 25 مللي مولار) في ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات غطاء مفاجئ سعة 0.5 مل.
    2. أضف 0.4 ميكرولتر من مخزون البروتين المسمى إلى كل أنبوب يحتوي بالفعل على 9.6 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS إلى تركيز بروتين نهائي يبلغ 4 ميكرومتر.
    3. لفها على الفور بورق القصدير وضعها في الحاضنة عند 25 درجة مئوية. يفتقر هذا المحلول وجميع الحلول التالية للتجميعات إلى العكارة أو هطول الأمطار الواضح قبل أو بعد الحضانة.
  4. إعداد تجميعات A1 غير المسماة
    1. لتحضير ثلاث نسخ مكررة، قم بتعبئة الماصة 38.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS في ثلاثة أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات غطاء سريع سعة 0.5 مل.
    2. أضف 1.6 ميكرولتر من مخزون بروتين الانعكاس A1 إلى كل أنبوب يحتوي بالفعل على 38.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS إلى تركيز بروتين نهائي يبلغ 4 ميكرومتر. اخلط الماصة ببطء مرتين عن طريق شفط حجم العينة بالكامل وتوزيعه.
    3. لفها على الفور بورق القصدير وضعها في الحاضنة عند 25 درجة مئوية.
  5. توقيت وخلط مجموعات A1 ذات العلامات المشتركة وغير المسماة
    1. اطلب إعداد التجميعات على النحو التالي: قم بإعداد تجميعات تجريبية ذات علامة مشتركة وواحدة تجريبية غير مسماة بالتجميعات المصنفة بشكل فردي. كرر الخطوتين 2.3 و 2.4.
    2. امزج عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من مجموعة A1 التجريبية غير المسماة إلى 10 ميكرولتر من مزيج الماصة التجريبي المشترك والمزج بلطف عن طريق شفط الحجم بالكامل وتوزيعه مرتين. سيتم إجراء القياسات بعد 24 ساعة من هذه الخطوة.
    3. الوقت بين قيادة تجميع الانعكاس A1 عن طريق التخفيف في مخزن مؤقت MOPS (درجة الحموضة 7 ، 25 ملي مولار) وخلط التجميعات المصنفة وغير المسماة هو عمر التجميع. كانت أعمار التجمعات المستخدمة لهذه البيانات 0 دقيقة ، 1 دقيقة ، 10 دقائق ، 30 دقيقة ، 60 دقيقة ، 120 دقيقة ، 180 دقيقة ، 540 دقيقة ، 1080 دقيقة و 1620 دقيقة.
  6. عناصر التحكم
    1. التحكم الإيجابي
      1. من مخزون البروتين A1 والمسمى ، قم بإعداد 20 ميكرولتر من مخزون البروتين الذي يبلغ 80 ميكرومتر A1 و 20 ميكرومتر من مخزون البروتين المشترك المسمى بنفسك.
      2. أضف 38.4 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء المفاجئ سعة 0.5 مل ، ثم أضف 1.6 ميكرولتر من مزيج البروتين والماصة المسمى ب 80 ميكرومتر A1/20 ميكرومتر مرتين عن طريق الشفط ببطء وتوزيع الحجم بالكامل. غطيها على الفور بورق القصدير وضعيها في الحاضنة عند 25 درجة مئوية. كرر ليصبح المجموع 9 عينات.
    2. التحكم السلبي
      1. أضف 0.4 ميكرولتر من المخزون الملصق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ذو غطاء مفاجئ سعة 0.5 مل يحتوي بالفعل على 9.6 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS. امزج الماصة ببطء مرتين عن طريق شفط حجم العينة بالكامل وتوزيعه.
      2. أضف 40 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS ومزيج الماصة مرتين عن طريق شفط حجم العينة بالكامل وتوزيعه. غطيها على الفور بورق القصدير وضعيها في الحاضنة عند 25 درجة مئوية. كرر ليصبح المجموع 9 عينات.
  7. كوفيت وعازلة فارغة
    1. اضبط مقياس الفلور على الإثارة عند 488 نانومتر وسجل أطياف مستمرة من 520-700 نانومتر.
    2. املأ كوفيت مقياس الفلور النظيف من الكوارتز بمقدار 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت MOPS (الرقم الهيدروجيني 7 ، 25 ملم) وقم بقياسه.
    3. إزالة المخزن المؤقت.
  8. إجراء تجريبي
    ملاحظة: يجب تسجيل جميع التجارب بعد 24 ساعة من خلط مجموعات الانعكاسات A1 ذات العلامات المشتركة وغير المسماة. ضع ماصة 50 ميكرولتر من المحلول التجريبي برفق في الكوفيت وقم بقياسها.
    1. قم بإزالة العينة ، واشطفها بمحلول 500 ميكرولتر من حمض الأسيتيك ، ثم ب 500 ميكرولتر 0.22 ميكرومتر من الماء المفلتر 18 ملي أوم. قم بإجراء المخزن المؤقت الفارغ.
  9. عناصر التحكم
    1. قم بالقياس عند 1440 دقيقة و 1960 دقيقة و 3060 دقيقة بعد إعداد عناصر التحكم (المقابلة لأعمار التجميع 0 دقيقة و 520 دقيقة و 1620 دقيقة). تختتم هذه القياسات الجزء التجريبي من البروتوكول.

3. تحليل البيانات

  1. اطرح أطياف المخزن المؤقت الفارغ من الأطياف التجريبية.
  2. حدد نسبة EM588 / EM520.
  3. لكل تكرار ، ثم حدد المتوسط والانحراف المعياري لكل مجموعة من ثلاثة مكررات. قطعة أرضEm 588 / Em520 كدالة لعمر التجميع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تخفيف التجميعات الانعكاسية A1 التي تحتوي على كل من البروتين المسمى بالفلوروفور المتبرع والبروتين الحاصل على علامة الفلوروفور المتقبل مع مجموعات الانعكاس A1 غير المسمى ، لوحظ انخفاض أولي في انبعاث FRET عند 588 نانومتر بالنسبة للتجميعات غير المخففة (الشكل 2 أ). كان FRET للتجميعات التي يبلغ عمرها 0 دقيقة مشابها للتحكم الإيجابي ، وكان FRET للتجميعات التي يبلغ عمرها 1620 دقيقة (الوقت بين تكوين التجميع وخلط تجميعات الانعكاس غير المسماة والمصنفة) أقل من التحكم السلبي (الشكل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقطة الشائعة لفقدان البروتين أثناء التنقية هي إعادة التعليق غير المكتمل لكريات جسم التضمين لجميع الخطوات في بروتوكول تنقية الجسم ، وإعادة التعليق النهائي لأجسام التضمين المنقاة في 8 M اليوريا 5٪ v / v حمض الخليك. يمكن أن يستغرق إذابة جسم التضمين ما يصل إلى 24 ساعة من التحريك القوي باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي صغير في أنبوب مخروطي 40 مل. لتجنب فقدان البروتين بشكل كبير للمرشحات ، تم استبدال الترشيح الذي يسبق FPLC و HPLC بالطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 70 دقيقة لتوضيح المحلول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث من قبل معهد التقنيات الحيوية التعاونية من خلال المنح W911NF-19-2-0026 و W911NF-23-1-0330 من مكتب أبحاث الجيش الأمريكي. ولا يعكس محتوى المعلومات بالضرورة موقف الحكومة أو سياستها، ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 μ ماصة دقيقة بسعة L
2 μ ماصة دقيقة بسعة L
2- [(5-فلوريسسينيل) أمينوكربونيل] إيثيل ميثانيثيوسلفوناتسانتا كروز للتقنيات الحيويةإس سي -216155CAS  351330-42-2
20 μ ماصة دقيقة بسعة L
200 μ ماصة دقيقة بسعة L
3- (N-مورفولينو) حمض بروبان سلفونيك ، 4-حمض مورفولين بروبان سلفونيكسيجما ألدريتشم 1254سجل المستخلصات المحفوظة 1132-61-2
حمض الخليكسيجما ألدريتشأ 6283سجل الوصول 64-19-7
أسيتونيتريلسيجما ألدريتش34851-1 لترسجل المستخلصات الكيميائية 75-05-8
مسحوق أجاركارولينا بيولوجية842133سجل المستخلصات الكيميائية 9002-18-0
رقائق الألومنيوم
فلتر الطرد المركزي الفائق أميكون ، 10 كيلو دالتون MWCOميليبور سيجماUFC501008سعة 0.5 مل
فلتر الطرد المركزي الفائق أميكون ، 10 كيلو دالتون MWCOميليبور سيجماUFC901008سعة 15 مل
الميزان التحليلي
بنزونازميليبور سيجما70664-3سجل المستخلصات المحفوظة 9025-65-4
كاشف استخراج البروتين BugBusterميليبور سيجما70584-3
مطياف مضان كاري الكسوفكاري الكسوف
برنامج كاري الكسوف
أنابيب الطرد المركزي Corning 50 ملميليبور سيجماCLS430829
محاقن يمكن التخلص منها ، Luer-Lok 10 ملكول بارمرUX-12915-02
DMSOسيجما ألدريتشD8418سجل المستخلصات الكيميائية 67-68-5
الثلج الجاف
نظام FPLC مزدوج المضخة
نظام HPLC مزدوج المضخة
ايثانولميليبور سيجماEX0280-3سجل في الباب 64-17-5
دوار الطرد المركزي الأرضي سعة قارورة 500 مل
أجهزة طرد مركزي أرضية   ؛
الفريزر ، -80 درجة ؛ C
غطاء الدخان
هيدروكلوريد جوانيدينثيرمو ساينتفيكAAA135430B50-01-1
عمود كروماتوغرافيا تبادل الكاتيون HiTrap SP HPسيتيفا17115101
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش258148-25 ملسجل مستخلصات النقع 7647-01-0
حاضنه
الأيزوبروبيل & بيتا ؛ -D-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدسيجما ألدريتشI6758-1G
كبريتات الكاناميسينسيجما ألدريتشك 1637سجل المستخلصات المعتمد 25389-94-0
التجميد
الليزوزيمثيرمو ساينتفيك90082
شريط التحريك المغناطيسي
لوحة التحريك المغناطيسي
قطب الأس الهيدروجيني الصغير S7ميتلر توليدو51343160
جهاز طرد مركزي دقيق مع التحكم في درجة الحرارة
مرشح حقنة Millex PVDFميليبورSLGVR33RS0.22 μ م ، قطر 33 مم.
مرشح Milli-Q Millipakميليبور سيجماMPGP002A1
نظام تنقية المياه Milli-Q UltraPureميليبور سيجما
كلوريد الصوديومثيرمو ساينتفيكAA12314A9سجل المستخلصات الثابتة 7647-14-5
زجاجات الطرد المركزي Nalgene ، طراز 3120ميليبور سيجماب 1283-4EAلتكوير البكتيريا
المختبر المداري  شاكر مع حاضنة
كمبيوتر شخصي
أطباق بتريسيجما ألدريتشص 5731-500EA
PJ411 البلازميدالحمض النووي 2.0
بروتين Lobind  أنابيب مخروطيةإيبندورفEP30108302سعة 5 مل
بروتين Lobind  أنابيب الطرد المركزي الدقيقإيبندورفEP022431102سعة 0.5 مل
قارورة بيركس محيرة 1,000 ملميليبور سيجماCLS44501لاحتضان الثقافات البكتيرية
أكواب بيركس جريفين 2,000 ملميليبور سيجماCLS10002Lلجميع المخزن المؤقت والحلول prep 
زجاجات تخزين وسائط دائرية من بيركس 1,000 ملميليبور سيجماCLS13951Lلتخزين جميع المخزن المؤقت وإعداد المحلول ، استخدمه مع مرشحات قارورة التفريغ
Qiaprep Spin Miniprep Kitكياجين27104
ثلاجة
روزيتا 2 (DE3) الخلايا المختصةنوفاجن71397-3
كاسيت غسيل الكلى Slide-a-lyzer 10K MWCOثيرمو ساينتفيكPI66383سعة 0.5 مل
أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدراتسيجما ألدريتشس 8625سجل المستخلصات 6131-90-4
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش567530-250 جرامسجل المستخلصات الكيميائية 1310-73-2
Steritop فراغ زجاجة فلتر علويميليبور سيجماS2GPT05RE0.22 μ مرشح م معقم
ميكروفيت فرعي ، سعة 50 ميكرولترخلايا ستارنا16.40F-Q-10/Z15
سلفورهودامين ميثانثيوسلفوناتسانتا كروز للتقنيات الحيويةSC-220172CAS  386229-71-6
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتش106232-25 جرامسجل المستخلصات الكيميائية 407-25-0
التربتونالطيف الكيميائي  تي 1333
يورياثيرمو ساينتفيكAAA123600Eسجل المستخلصات الكيميائية 57-13-6
مطياف الأشعة فوق البنفسجية - VIS
مستخلص الخميرةجيبكو211929

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A1

مقالات ذات صلة