مقالة منهجية

اختبار تخفيف FRET لتحليل التبادل الديناميكي بين مجموعات البروتين

DOI:

10.3791/68678

⸱

سبتمبر 19, 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التنقية والوسم التساهمي للانعكاس A1 بالإضافة إلى مقايسة تخفيف FRET لتوصيف التبادل الديناميكي لبروتين الانعكاس بين مجموعات البروتين كدالة للعمر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باعتباره المحرك الجزيئي للتقزح القابل للضبط في رأسيات الأرجل ، لا يزال سلوك الطور القابل للضبط لبروتين الانعكاس A1 محور هندسة المواد الحيوية. يؤدي تعديل تركيز الملح وكثافة شحنة البروتين الصافية للانعكاس A1 إلى دفع البروتين لتشكيل تجميعات ديناميكية كوسيطة لفصل الطور السائل عن السائل. على الرغم من أن تجميعات الانعكاسات محدودة الحجم بمدى تحييد شحنة تنافر كولومبيك الكاتيوني للبروتين ، إلا أنها في البداية في تبادل ديناميكي مع المونومرات أو القلة من المحلول المحيط. تم استخدام مقايسة تخفيف جديدة لنقل طاقة الرنين الفلوري (FRET) ، جنبا إلى جنب مع تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ومقايسات تركيز البروتين ، لتوصيف التدفق ثنائي الاتجاه للبروتين بين مجموعات الانعكاس A1 والمرحلة المخففة كدالة لعمر التجميع. يميز اختبار تخفيف FRET هذا بين تدفق البروتين أحادي الاتجاه وثنائي الاتجاه داخل وخارج مجموعات البروتين ، وبالتالي يمكن تطبيقه أثناء تكوين التجميع. يعد التمييز بين مجموعات البروتين الديناميكية والتوقفت حركيا أمرا بالغ الأهمية لفهم أصولها الفيزيائية الحيوية ، ويمكن تكييف مقايسة تخفيف FRET الجديدة لتكملة التحقيقات الفيزيائية الحيوية لتجميعات البروتين الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التوسط في التقزح القابل للضبط في الحبار المذاقي بواسطة بروتينات الانعكاس في خلايا القزحية1،2،3. تحتوي الخلايا القزحية على غزوات غشائية واسعة ومنتظمة تشكل أكواما من صفائح براج كثيفة البروتين ، والتي تعكس الضوء بطريقة تعتمد على الزاوية والطول الموجي1،4،5،6. تتوج سلسلة الإشارة التي يتم تشغيلها بواسطة الأسيتيل كولين بفسفرة بروتينات الانعكاس الكاتيوني1،2

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. تنقية البروتين ووضع العلامات التساهمية

  1. التحول
    1. استنساخ ينعكس A1 وينعكس جينات A1 C232S (GenBank KF661517.1) في بلازميدات pj411.
    2. انقيض خلايا وردية 2 (DE3) مع البلازميدات باستخدام معالجة الصدمة الحرارية28.
    3. الخلايا المنقولة على أجار تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كانامايسين.
    4. حدد مستعمرة معزولة وأضفها إلى 5 مل من TB (مرق رائع) يحتوي على 50 ميكروغرام / مل كانامايسين واحتضن عند 37 درجة مئوية على شاكر عند 250 دورة في الدقيقة طوال الليل.
    5. عزل الب....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد تخفيف التجميعات الانعكاسية A1 التي تحتوي على كل من البروتين المسمى بالفلوروفور المتبرع والبروتين الحاصل على علامة الفلوروفور المتقبل مع مجموعات الانعكاس A1 غير المسمى ، لوحظ انخفاض أولي في انبعاث FRET عند 588 نانومتر بالنسبة للتجميعات غير المخففة (الشكل 2 أ). كان FRET للتجميعات التي يبلغ عمرها 0 دقيقة مشابها للتحكم الإيجابي ، وكان FRET للتجميعات التي يبلغ عمرها 1620 دقيقة (الوقت بين تكوين التجميع وخلط تجميعات الانعكاس غير المسماة والمصنفة) أقل من التحكم السلبي (الشكل.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النقطة الشائعة لفقدان البروتين أثناء التنقية هي إعادة التعليق غير المكتمل لكريات جسم التضمين لجميع الخطوات في بروتوكول تنقية الجسم ، وإعادة التعليق النهائي لأجسام التضمين المنقاة في 8 M اليوريا 5٪ v / v حمض الخليك. يمكن أن يستغرق إذابة جسم التضمين ما يصل إلى 24 ساعة من التحريك القوي باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي صغير في أنبوب مخروطي 40 مل. لتجنب فقدان البروتين بشكل كبير للمرشحات ، تم استبدال الترشيح الذي يسبق FPLC و HPLC بالطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 70 دقيقة لتوضيح المحلول.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث من قبل معهد التقنيات الحيوية التعاونية من خلال المنح W911NF-19-2-0026 و W911NF-23-1-0330 من مكتب أبحاث الجيش الأمريكي. ولا يعكس محتوى المعلومات بالضرورة موقف الحكومة أو سياستها، ولا ينبغي الاستدلال على أي تأييد رسمي.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 μ ماصة دقيقة بسعة L
2 μ ماصة دقيقة بسعة L
2- [(5-فلوريسسينيل) أمينوكربونيل] إيثيل ميثانيثيوسلفوناتسانتا كروز للتقنيات الحيويةإس سي -216155CAS  351330-42-2
20 μ ماصة دقيقة بسعة L
200 μ ماصة دقيقة بسعة L
3- (N-مورفولينو) حمض بروبان سلفونيك ، 4-حمض مورفولين بروبان سلفونيكسيجما ألدريتشم 1254سجل المستخلصات المحفوظة 1132-61-2
حمض الخليكسيجما ألدريتشأ 6283سجل الوصول 64-19-7
أسيتونيتريلسيجما ألدريتش34851-1 لترسجل المستخلصات الكيميائية 75-05-8
مسحوق أجاركارولينا بيولوجية842133سجل المستخلصات الكيميائية 9002-18-0
رقائق الألومنيوم
فلتر الطرد المركزي الفائق أميكون ، 10 كيلو دالتون MWCOميليبور سيجماUFC501008سعة 0.5 مل
فلتر الطرد المركزي الفائق أميكون ، 10 كيلو دالتون MWCOميليبور سيجماUFC901008سعة 15 مل
الميزان التحليلي
بنزونازميليبور سيجما70664-3سجل المستخلصات المحفوظة 9025-65-4
كاشف استخراج البروتين BugBusterميليبور سيجما70584-3
مطياف مضان كاري الكسوفكاري الكسوف
برنامج كاري الكسوف
أنابيب الطرد المركزي Corning 50 ملميليبور سيجماCLS430829
محاقن يمكن التخلص منها ، Luer-Lok 10 ملكول بارمرUX-12915-02
DMSOسيجما ألدريتشD8418سجل المستخلصات الكيميائية 67-68-5
الثلج الجاف
نظام FPLC مزدوج المضخة
نظام HPLC مزدوج المضخة
ايثانولميليبور سيجماEX0280-3سجل في الباب 64-17-5
دوار الطرد المركزي الأرضي سعة قارورة 500 مل
أجهزة طرد مركزي أرضية   ؛
الفريزر ، -80 درجة ؛ C
غطاء الدخان
هيدروكلوريد جوانيدينثيرمو ساينتفيكAAA135430B50-01-1
عمود كروماتوغرافيا تبادل الكاتيون HiTrap SP HPسيتيفا17115101
حمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتش258148-25 ملسجل مستخلصات النقع 7647-01-0
حاضنه
الأيزوبروبيل & بيتا ؛ -D-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدسيجما ألدريتشI6758-1G
كبريتات الكاناميسينسيجما ألدريتشك 1637سجل المستخلصات المعتمد 25389-94-0
التجميد
الليزوزيمثيرمو ساينتفيك90082
شريط التحريك المغناطيسي
لوحة التحريك المغناطيسي
قطب الأس الهيدروجيني الصغير S7ميتلر توليدو51343160
جهاز طرد مركزي دقيق مع التحكم في درجة الحرارة
مرشح حقنة Millex PVDFميليبورSLGVR33RS0.22 μ م ، قطر 33 مم.
مرشح Milli-Q Millipakميليبور سيجماMPGP002A1
نظام تنقية المياه Milli-Q UltraPureميليبور سيجما
كلوريد الصوديومثيرمو ساينتفيكAA12314A9سجل المستخلصات الثابتة 7647-14-5
زجاجات الطرد المركزي Nalgene ، طراز 3120ميليبور سيجماب 1283-4EAلتكوير البكتيريا
المختبر المداري  شاكر مع حاضنة
كمبيوتر شخصي
أطباق بتريسيجما ألدريتشص 5731-500EA
PJ411 البلازميدالحمض النووي 2.0
بروتين Lobind  أنابيب مخروطيةإيبندورفEP30108302سعة 5 مل
بروتين Lobind  أنابيب الطرد المركزي الدقيقإيبندورفEP022431102سعة 0.5 مل
قارورة بيركس محيرة 1,000 ملميليبور سيجماCLS44501لاحتضان الثقافات البكتيرية
أكواب بيركس جريفين 2,000 ملميليبور سيجماCLS10002Lلجميع المخزن المؤقت والحلول prep 
زجاجات تخزين وسائط دائرية من بيركس 1,000 ملميليبور سيجماCLS13951Lلتخزين جميع المخزن المؤقت وإعداد المحلول ، استخدمه مع مرشحات قارورة التفريغ
Qiaprep Spin Miniprep Kitكياجين27104
ثلاجة
روزيتا 2 (DE3) الخلايا المختصةنوفاجن71397-3
كاسيت غسيل الكلى Slide-a-lyzer 10K MWCOثيرمو ساينتفيكPI66383سعة 0.5 مل
أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدراتسيجما ألدريتشس 8625سجل المستخلصات 6131-90-4
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش567530-250 جرامسجل المستخلصات الكيميائية 1310-73-2
Steritop فراغ زجاجة فلتر علويميليبور سيجماS2GPT05RE0.22 μ مرشح م معقم
ميكروفيت فرعي ، سعة 50 ميكرولترخلايا ستارنا16.40F-Q-10/Z15
سلفورهودامين ميثانثيوسلفوناتسانتا كروز للتقنيات الحيويةSC-220172CAS  386229-71-6
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتش106232-25 جرامسجل المستخلصات الكيميائية 407-25-0
التربتونالطيف الكيميائي  تي 1333
يورياثيرمو ساينتفيكAAA123600Eسجل المستخلصات الكيميائية 57-13-6
مطياف الأشعة فوق البنفسجية - VIS
مستخلص الخميرةجيبكو211929

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

A1

مقالات ذات صلة