نقدم هنا طريقة لجمع كمية كبيرة من الدم من الخنازير باستخدام قنية عن طريق الجلد داخل القلب متصلة بمضخة تفريغ ، كإجراء نهائي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جمع الدم بكميات كبيرة من الخنازير للتطبيقات في المختبر : استخدام القنية داخل القلب ومضخة التفريغ كإجراء نهائي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مطلوب جمع الدم الروتيني في العديد من الدراسات البحثية الأساسية والتطبيقية. طرق متعددة لجمع دم الخنازير موصوفة جيدا. وتشمل هذه استخدام الأوردة الأذنية لجمع كميات الدم الصغيرة ، والأوردة الوداجية أو الوريد الأجوف القحفي لجمع كميات دم أكبر. تتطلب بعض التجارب كميات كبيرة من الدم من واحد في وقت واحد لتحليلها أو استخدامها في مزارع الخلايا الأولية ، والتي يمكن تحقيقها بشكل أفضل من خلال الاستئصال. يجب معالجة الدم الذي تم جمعه لزراعة الخلايا الأولية بشكل طازج وبعناية للحفاظ على سلامة الخلية. نصف طريقة لحصاد الدم من الخنازير تحت مستوى جراحي للتخدير ، باستخدام قسطرة داخل الأوعية الدموية ذات التجويف الكبير يتم إدخالها عن طريق الجلد في القلب ومضخة تفريغ ، وهي فعالة ، وتوفر عائدا كبيرا ، وتقلل من تحلل الخلايا. يتم تنفيذ هذه التقنية مرة واحدة على ، في مستوى جراحي للتخدير ، كإجراء نهائي ، مما يوفر الحد الأدنى من خطر الألم أو الضيق.
المقدمة
تم استخدام الخنازير في الأبحاث في دراسات تتراوح من دراسات القلب والأوعية الدموية إلى التئام الجروح وعلم السموم ، بالإضافة إلى البحوث الزراعية وعلم المناعة ودراسات الأمراض1. يمكن استخدام الدم الذي تم جمعه في الأبحاث لدراسة الأمراض وعلم الأدوية وعلم الوراثة وأبحاث الجهاز المناعي واكتشاف المؤشرات الحيوية. تعد زراعة الخلايا واحدة من أكثر الإجراءات الأساسية التي يتم إجراؤها في البحث وتسمح للباحثين بدراسة سلوك الخلية ووظيفتها ، بالإضافة إلى نماذج المرض وتطوير اللقاح2. وكثيرا ما تتم زراعة مسببات الأمراض المسببة للأمراض، مثل فيروس حمى الخنازير الأفريقية، في وسط استزراع محدد مسبقا في ظل ظروف معملية معقمة صارمة. يمكن أن يحدث انتشار المرض من خلال الغزو أو الانتشار أو التعلق ، مما يتطلب خلايا صحيةومستقرة 3. قد يكون لمسببات الأمراض التي تمت دراستها استحاءا خلويا محددا يمكن من خلاله تكاثرها ، وينتج عن وجود كمية كبيرة من الدم كميات أكبر من الخلايا لاستخدامها.
لتحقيق عائد مرتفع من الخلايا من فردي ، من أجل التمايز الخلوي ، يجب جمع كمية كبيرة من الدم برفق للحفاظ على سلامة الخلية قبل فصل الخلايا. في الخنازير ، يمكن حساب إجمالي حجم الدم عند 65 مل / كجم 4,5. من خلال تجربتنا باستخدام جمع كميات كبيرة ، يمكن استرداد حوالي نصف إجمالي حجم الدم من. لذلك ، في الخنازير الكبيرة البالغة ، التي يصل وزنها إلى 600 رطل (273 كجم) ، يمكن الحصول على عائد 6-8 لتر. في الخنازير ، يمكن جمع كميات كبيرة من الدم عن طريق الجلد من الوريد الأجوف القحفي ، أو الوريد الوداجي الخارجي ، أو الوريد الصافن عن طريق القنية ، أو القلب4،5،6. ومع ذلك ، فإن جمع الدم داخل القلب باستخدام قنية كبيرة التجويف يسمح بجمع أكبر حجم من الدم بكفاءة مع الحد الأدنى من مخاطر تحلل الخلايا. كإجراء نهائي ، يجب إجراء ذلك تحت مستوى جراحي للتخدير5. توضح هذه المقالة طريقة استخدام مضخة تفريغ لجمع عدة لترات من الدم من الخنازير باستخدام نهج عن طريق الجلد للقلب باستخدام نمط قسطرة وريدية كبيرة التجويف متصل بمضخة تفريغ 7,8.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام في الغرب الأوسط للخدمات البيطرية. نظرا لأن الطريقة الأساسية للقتل الرحيم المعتمدة من IACUC أثناء هذا الإجراء هي الاستئصال ، فمن المتوقع أن تصل بعض الخنازير إلى السكتة القلبية بسبب فقدان الدم. عندما يحدث هذا ، يتم إجراء طريقة القتل الرحيم الثانوية ، مثل بضع الصدر الثنائي. بعد جمع حجم الدم المطلوب ، إذا كان هناك نبضات قلب واضحة ، يتم إرفاق حقنة بمحلول القتل الرحيم بالمسرحة وتعطى داخل القلب كطريقة القتل الرحيم الأولية ، متبوعة بطريقة فيزيائية ثانوية. يتم الحفاظ على الخنازير وفقا لدليل رعاية الزراعية واستخدامها في البحث والتعليم ، ودليل رعاية واستخدام المختبر ، وقانون رعاية ، حسب الاقتضاء.
1. تحضير المواد (جدول المواد والشكل 1A-C)
- قم بتجميع الأنبوب في قش من الفولاذ المقاوم للصدأ وقم بتوصيل نهاية الخرطوم بأنبوب الفقاعة.
- قم بتوصيل الأنبوب بزجاجة الأسطوانة باستخدام سدادة مطاطية مع قشتين معدنيتين غير مستويتين وزجاجة زجاجية.
ملاحظة: يمنع الزجاج انهيار الحاوية الناتجة عن مضخة التفريغ ، ولكن يمكن استخدام أي مادة لا تنهار تحت الضغط. - قم بغرس 10 مل من هيبارين الصوديوم (1,000 USP/mL) من خلال أنبوب الشفط ونمط القسطرة لمنع التخثر. أضف 50 مل من هيبارين الصوديوم (1,000 USP / مل) في كل زجاجة أسطوانية لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 50 وحدة دولية / مل في كل لتر من الدم ومنع تخثر الدم أثناء التجميع. تأكد من ضبط مضخة التفريغ على ما لا يزيد عن 7 أرطال من السحب لمنع تلف الخلايا.
2. التخدير وتحديد المواقع الحيوانية
- وزن قبل الإجراء بمدة لا تزيد عن 24 ساعة لحساب الجرعة المطلوبة من أدوية التخدير المركبة.
- حقن التيلازول (3.0-5.0 مجم / كجم) ، والكيتامين (8-12 مجم / كجم) ، والزيلازين (4.0-6.0 مجم / كجم) في العضل في الرقبة ، أو بطن العضلات الكبيرة الأخرى (مثل العضلات اللحمية )، باستخدام مجموعة تمديد 30 بوصة وإبرة 18 جم × 1.5 بوصة للحث على التخدير العميق.
ملاحظة: في الخنازير الكبيرة ، الحد الأقصى الموصى به لحجم الحقن العضلي هو 10 مل ، لذلك قد يكون تغيير المواقع بعد كل 10 مل من الإعطاءضروريا 9. بينما اخترنا هذا الكوكتيل ، يمكن إجراء هذا الإجراء بموجب أي بروتوكول تخدير معتمد من IACUC ينتج مستوى تخدير جراحي. - بمجرد التأكد من أن في مستوى جراحي للتخدير (~ 5-8 دقائق) ، ولا يظهر أي منعكس جفن ، ونغمة فك فضفاضة ، ولا تستجيب لمحفزات الألم ، ضع الخنزير على طاولة رفع أو أرضية أو أي سطح مستو آخر ، في الاستلقاء الجانبي الأيمن.
- قص الشعر على الصدر الموجود فوق القلب ، إذا لزم الأمر ، بالقرب من الفراغ الوربي الرابع والخامس ، فقط الذيلية إلى نقطة الكوع.
- إذا كان ذلك متاحا ، استخدم الموجات فوق الصوتية (الشكل 2 أ) لتحديد البطين الأيسر. إذا لم يكن متاحا ، يقع البطين الأيسر بالقرب من الفضاء الوربي الإنسي الرابع أو الخامس إلى نقطة الدافع الأقصى8.
- افرك المنطقة بشكل معقم باستخدام إسفنج شاش مقاس 4 بوصات × 4 بوصات مبلل في مقشر الكلورهيكسيدين بنسبة 2٪ وإسفنج شاش 4 بوصات × 4 بوصات مبلل في 70٪ كحول الأيزوبروبيل. قم بإعداد الجلد عن طريق الفرك بطريقة دائرية ، بدءا من نقطة الحقن والدوران للخارج ، لمدة 3 مرات على الأقل ، بالتناوب بين المطهرين.
3. جمع الدم داخل القلب
- تحقق من بقاء في مستوى جراحي للتخدير عن طريق فحص منعكس الجفن ونغمة الفك وانعكاس الدواسة.
ملاحظة: تحقق من عمق التخدير ، وكذلك معدلات ضربات القلب والجهاز التنفسي ، طوال الإجراء لضمان بقاء في مستوى التخدير الجراحي. - قم بإزالة النمط من القسطرة الوريدية. ضع النمط فوق البطين الأيسر وادفعه بشكل عمودي على الجلد لإدخال النمط في البطين الأيسر (الشكل 2 ب). عندما يبدأ الدم في الخروج من النمط ، قم بتوصيله بموصل نهاية خرطوم أنبوب الفقاعات المتصل بزجاجة الأسطوانة ثم قم بتشغيل مضخة التفريغ (الشكل 1 أ والشكل 2 ج).
- تأكد من أن الدم يتدفق في تيار مستمر. عندما يتم سحب الدم إلى زجاجة الأسطوانة ، قم بتدوير الزجاجة برفق للسماح بخلط الدم مع مضاد التخثر لمنع تكون الجلطة.
- بمجرد جمع 1 لتر من الدم ، استخدم مرقئ لتثبيت أنبوب الفقاعة بالقرب من زجاجة الأسطوانة. افصل السدادة المطاطية وقم بتطبيقها على زجاجة الأسطوانة التالية. قم بإزالة الإرقاء واترك الدم يتدفق بحرية أثناء تحريك زجاجة الأسطوانة برفق.
- استمر في هذه العملية حتى يتم جمع الدم المطلوب. بمجرد الانتهاء ، قم بتثبيت الأنبوب لمنع انسكاب الدم الزائد وإيقاف تشغيل المضخة.
- قم بإزالة موصل الأنبوب من نمط القسطرة وقم بتوصيل حقنة البنتوباربيتال الصوديوم بالمصفوف. اسحب المحقنة للتأكد من وجود وميض من الدم ثم حقن محلول القتل الرحيم. تأكيد الموت بسبب غياب ضربات القلب والتنفس وتوتر العضلات وردود الفعل. بمجرد تأكيد الوفاة ، قم بإزالة الإبرة من القلب وضعها في وعاء الأدوات الحادة.
- تخلص من أنابيب الفقاعات في حاوية نفايات بيولوجية. قم بإزالة الدم الإجمالي من العناصر المتبقية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (على سبيل المثال ، المصاصات المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، وموصلات نهاية الخرطوم) باستخدام فرشاة أنبوبية ثم الأوتوكلاف للاستخدام في المستقبل.
- ضع السدادات المطاطية التي تم تنظيفها ، والقش ، وموصلات نهاية الخرطوم ، ومرقئ الدم في كيس الأوتوكلاف الجديد وقم بتعقيمه قبل الاستخدام التالي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قبل جمع الدم ، تم فحص الخنازير مسبقا بحثا عن الميكوبلازما الرئوية ، وفيروس الخنازير الغدية ، وفيروس الخنزير الصغير ، وفيروسات الخنازير (التهاب المعدة والأمعاء المعدي المعدي ، والإسهال الوبائي للخنازير) ، والتهاب الدماغ والنخاع الدموي ، ومتلازمة الخنازير التناسلية والتنفسية ، ومجموعة الأنفلونزا A ، والفيروس الدائري 1 و 2 ، وفيروس سينيكا A. لقد كررنا هذا الإجراء عدة مرات في أنثى بذار يوركشاير المتقاطعة التي تزن 300-600 رطل. أسفر جمع الدم عن ما بين 3 لتر من الخنازير الأصغر إلى 8 لت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف الإجراء هنا مجموعة من القسطرة إلى مضخة التفريغ لجمع كمية كبيرة من الدم لمرة واحدة من قلب البذور. نظرا لاحتمالية حدوث الألم والضيق ، يجب إجراء هذا الإجراء فقط في الموجودة في مستوى التخدير الجراحي. يسمح الجمود الناتج عن التخدير بتعلم هذا الإجراء من قبل المبتدئين وإتقانه بسرعة. يمكن استخدام الأوردة المتعددة لجمع الدم من. الطرق الأكثر شيوعا والتي يمكن الوصول إليها هي الأوردة الوداجية ، والوريد الأجوف القحفي ، ووريد الأذن ، مع كون الوريد الذيل أو الوريد الفخذي أو الوريد الرأسي إمكانيات إض...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر بشكل خاص فرع الموارد الحيوانية لمركز بلوم آيلاند للأمراض الحيوانية ، كل من تقنيات صحة ورعاية على المساعدة الفنية الممتازة. تم توفير تمويل المشروع في منظمة الأبحاث التعاقدية من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، ARS ، وحدة الموارد الحيوانية في NBAF.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مضخة الحجاب الحاجز موديل مختبر بقوة 1/8 حصان & 115 فولة تيار متردد، 60 كحد أقصى لكل بوصة مربعة | مركز إمداد القاعدة | 80058845 | |
| 10 G × 6 في القسطرة فوق الإبرة | كوفيتروس نورث أمريكان بيطري مستلزمات | 024616 | |
| حقنة 50 مل، قفل لوير | فيشر ساينتفيك | 13-689-8 | |
| جل الموجات فوق الصوتية Aquasonic 100 أزرق | ميدويست بيترينري سبلاي | 001.02109.2 | |
| أنابيب الفقاعات الأرجيل، غير موصلة (¼؛ ") | فيشر ساينتفيك | NC2282605 (كتالوج البائع # 8888280412) | |
| كلورهكسيدين Q سكرب 2٪ | ميدويست بيترينري سبلاي | 562.30804.3 | |
| زجاجات كورنينج القابلة للتخلص من الأسطوانات. | فيشر ساينتفيك | 06-413 | |
| زجاج Corning PYREX ضيق الفم ثقيل من قارورة Erlenmeyer أو ما شابه يخلق شفطا | فيشر ساينتفيك | 10-040F | |
| فرشاة أنابيب اختبار نايلون من Eisco | فيشر ساينتفيك | S13962 | |
| سدادات مطاطية ذات ثقبتين من فيشربراند | فيشر ساينتفيك | يعتمد على الحجم و... | |
| كيتامين (10 ملغ/مل) | ميدويست بيترينري سبلاي | 275.22100.3 | |
| MLL إلى نهاية خرطوم 6 مم (الفولاذ المقاوم للصدأ) | كادينس ساينس | 6547IND | |
| نهاية الخرطوم من MLL إلى 8 مم (الفولاذ المقاوم للصدأ) | كادينس ساينس | 6549IND | |
| إسفنجة شاش MVet غير منسوجة 4 × 4 رباعي طبقات؛ | ميدويست بيترينري سبلاي | 000.30156.2 | |
| كحول الأيزوبروبيل MVet 70٪ | ميدويست بيترينري سبلاي | 000.50054.3 | |
| ملقط كيلي الهيموستاتيك المستقيم 5.5" | ميدويست بيترينري سبلاي | 000.36800.2 | |
| الصوديوم هيبارين (1000 وحدة شروب/مل) | ميدويست بيترينري سبلاي | 191.46701.3 | |
| الصوديوم بنتوباربيتال (390 ملغ/مل) | ميدويست بيترينري سبلاي | 749.20000.3 | |
| قشات من الفولاذ المقاوم للصدأ | هوبي لوبي | 1893635 | |
| تيلازول (100 ملغ/ملتر) | ميدويست بيترينري سبلاي | 275.40000.3 | |
| زيلازين (100 ملغ/مل) | ميدويست بيترينري سبلاي | 310.01150.3 |
المراجع
- Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
- Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
- Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
- Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
- Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
- Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
