Method Article

3D Flipwell Engineering لتطوير أنظمة غير متزامنة للعلاجات السمية والمناعية في الخلايا البكتيرية والأمعاء والمناعة

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا مع الخطوات الرئيسية لتوجيه هندسة 3D Flipwell واستخدامها. نصف ونوضح كيفية تجميع أكوام إدراج الثقافة المشتركة واستخدامها في الزراعة المشتركة للطبقات الطبقية من بكتيريا الأمعاء وظهارة الأمعاء والبلاعم لنمذجة البيئة المخاطية للأمعاء.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة أدوار الإفرازات البكتيرية في استقطاب الخلايا المناعية والتوازن المخاطي للأمعاء ، قمنا بتطوير نموذج ثقافة مشتركة ثلاثي الأبعاد باستخدام إدخالات متاحة تجاريا بتنسيق مكدس متتالي. أطلقنا على هذا النظام 3D Flipwells ، ونجحنا في زراعة البكتيريا ، وظهارة القولون ، والخلايا المناعية في طبقات طبقية لتلخيص البيئة المكروية للغشاء المخاطي للأمعاء. يتيح نظام الزراعة المشتركة هذا بذر الخلايا الظهارية للقولون على جانب واحد من الغشاء والخلايا الوحيدة غير الملتصقة غير المتمايزة من الجانب الآخر ، مما يسمح بالتقدم المتزامن للاستقطاب الظهاري للقولون ، وتكوين المخاط ، وتمايز واستقطاب الخلايا الأحادية والبلاعم داخل ثقافة مشتركة واحدة دون الحاجة إلى فصل وإعادة طلاء البلاعم المتمايزة مسبقا. هذا النظام سهل البناء ولا يتطلب سوى عدد قليل من المواد والأدوات المتاحة بسهولة. اختبرنا فائدته من خلال تحليل استجابات مكونات الزراعة المشتركة للسياببترين (SEP) ، السلائف الداخلية ل BH4 (tetrahydrobiopterin) - وهو عامل مساعد لسينسيز أكسيد النيتريك (NOS). لقد أثبتنا أن علاج SEP ل 3D Flipwell ناتج عن تكوين الأغشية الحيوية بواسطة بكتيريا الأمعاء ، وإنتاج المخاط بواسطة ظهارة القولون ، والاستقطاب المناعي للبلاعم. يشير هذا إلى أن SEP أدى إلى تنشيط آلية الدفاع المخاطي من خلال الحديث المتبادل بين المكونات الخلوية المختلفة. هناك حاجة إلى مزيد من التجارب للتحقيق في دور الاتصالات المخاطية التي تؤدي إلى إعادة برمجة الخلايا المناعية وتقييم فائدة نظام الزراعة المشتركة هذا للكشف عن العلاجات المناعية الجديدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤثر الحديث المتبادل بين ميكروبيوم الخلايا والأمعاء المناعية بشكل كبير على فعالية علاجات الأمراض المختلفة. يتم تعديل مثل هذا الحديث المتبادل بشكل ملحوظ عن طريق المحفزات الخارجية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تشوهات التمثيل الغذائي المضيف ، والتغيرات الغذائية ، ومظاهر المرض ، والعلاج الدوائي. يمكن أن تؤدي هذه التغييرات إلى اختلال التوازن في تكوين البكتيريا ، وهي حالة تسمى dysbiosis1،2،3.

لفهم التفاعلات بين الميكروبات والخلايا المناعية المضيفة في الأمعاء بشكل أفضل ، تم تطوير أنظمة زراعة مشتركة متقنة من قبل مج....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D هندسة فليب ويل

  1. يجب أن يتم جميع الأعمال داخل خزانة زراعة الخلايا. ضع جميع المستلزمات داخل الخزانة.
  2. افتح غطاء طبق بتري واتركه جانبا. افتح شفرة المشرط من غلافها الواقي وضعها على حافة قاع طبق بتري. ضمان العقم.
    تنبيه: مطلوب التعامل الدقيق مع شفرة المشرط. استخدم قفازات مقاومة للقطع ومقواة بالألياف لحماية اليدين إذا لزم الأمر.
  3. افتح العبوة الواقية المعقمة للملحق التجاري المكون من 12 بئرا. ضمان العقم. خذ مجموعة من الملقط المعقم. أمسك الملحق برفق وقم بإزالته من العبوة.
  4. أمسك الملحق بحيث يكون الجزء السفلي متجها لأعلى. من ناحية أخرى ، خذ شفرة المشرط المعقمة وارفعها إلى الملحق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد الأهمية البيولوجية لمزارع Flipwell المشتركة لبكتيريا الأمعاء وظهارة القولون والبلاعم ، عالجنا الثقافات المشتركة باستخدام sepiapterin (SEP) ، وهو معدل لعملية التمثيل الغذائي للأرجينين ، لتعزيز إنتاج أكسيد النيتريك9،10،11 مقارنة ب DMSO الضابط. حددنا آثار معالجة SEP على كل مكون من مكونات المزارع المشتركة باستخدام المجهر الفلوري المناعي (IF) والفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM). أظهر التلوي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإعادة إنشاء بنية الغشاء المخاطي للأمعاء في المختبر ، قمنا بتصميم نظام ثقافة مشتركة بسيط يتكون من طبقات طبقية من بكتيريا الأمعاء والخلايا الظهارية القولونية المنتجة للمخاط والضامة. سمح لنا نظام الزراعة المشتركة متعدد هذا بدراسة آثار الحديث المتبادل بين الإفرازات البكتيرية وظهارة الأمعاء والبلاعم على تحفيز إعادة البرمجة المناعية وآليات الدفاع عن الغشاء المخاطي.

أحد التحذيرات المهمة لإنشاء 3D Flipwells هو أن التجميع يجب أن يتم في بيئة معقمة ، متبوعا بال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح. يخلي المؤلفون بموجب هذا مسؤوليتهم عن جميع الضمانات ، سواء كانت صريحة أو ضمنية ، إلى أقصى حد يسمح به القانون. لا يتحمل المؤلفون تحت أي ظرف من الظروف المسؤولية ، سواء بموجب أي قانون أو عقد أو ضرر أو أي نظرية قانونية أخرى ، عن أي أضرار خاصة أو عرضية أو غير مباشرة أو عقابية أو متعددة أو تبعية تنشأ عن أو تتعلق باستخدام الأدوات في بناء Flipwells ، واستخدام كواشف BSL ، وخطوط الخلايا ، والمزارع البكتيرية ، واستخدام نظام Flipwell في بيئة لاهوائية في غرفة لاهوائية. يشمل هذا الحد من المسؤولية، على سبيل المثال لا الحصر، أي طريقة غير محددة لاستخدام Flipwell غير موصوفة صراحة هنا.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرب المؤلف الرئيسي عن خالص امتنانه للدكتورة ساوري فوروتا لمهاراتها الإرشادية الرائعة ، والتوجيه والدعم المستمر عبر المسافات الطويلة ، وتصميم المشروع الماهر والمستمر الذي يعزز فرص التعلم الرائعة. يشكر المؤلفون أيضا الدكتورة فاندانا شارما على خبرتها وتوجيهها في علم الأحياء الدقيقة والدكتور فياني آر فرناندو على تحضير بلاعم THP-1.  بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون الدكتورين أندرو كلاينهينز وويليام تي غانينج في مرفق الفحص المجهري الإلكتروني ، وكاساندرا زامورا وكريستين كيرشباوم في مركز الأجهزة في جامعة توليدو على الاقتراحات البناءة للتصوير الكهرومغناطيسي. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء التشغيل من حرم جامعة توليدو للعلوم الصحية ، وكلية ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
نسبة PFA 0.4٪ (انظر الوصفة في المواد الكواشفة والمحلل)وصف في النص
ماصة مصلية بسعة 10 ملكورنينج4488
لوحة TC ذات 12 بئر,  Costarكورنينج3513
أنابيب مخروطية بحجم 15 مل، SpectraTubeالقلوية العلميةC2715
200 وميكرو؛ نصائح  يو إس إيه ساينتيفك1111-1700
إدخالات ب 24 بئر - إدخالات الزراعة لألواح 24 بئرا، PET 0.4 وميكرو؛ m براندتك ساينتيفك782710
فليب ويل ثلاثي الأبعاد جاهزة، معقمة بالأشعة فوق البنفسجية صنع في المختبر
4٪ PFA (انظر الوصفة في المواد المكتشفة والمحاليل)وصف في النص
مخزون سيبيبتيرين بسعة 50 ملليمتر (SEP، انظر الوصفة في قسم المواد المخلولة)المسيرة المهنية في شركة خنان للكيماوياتCAS#: 17094-01-8
أنابيب مخروطية بحجم 50 ملغرينر بيو-ون227261
ماصة مصلية بسعة 5 ملكورنينج4487
70-95٪ إيثانول (كحول إيثيل)مختبرات ديكون04-355-151
رقائق الألمنيومفيشر ساينتيفك01-213-100
إبر تغذية، عيار 20 عيار 1.5" الطول، الاستخدام الواحد  فيشر ساينتيفك01-208-87
مخزن تخفيف الأجسام المضادة (انظر الوصفة في المواد الكيميائية والمحلل)وصف في النص
غرفة خلايا أتوفلور ثيرموفيشر ساينتيفيكA7816
شريط المعقمفيشر ساينتيفك15-901-111
سلالات Bacillus subtilis wt (3A1T) في مخزون الجلسرول ()مركز الباكيليوس للمخزون الجيني (https:// bgsc. org/
قفازات BioGrip الخالية من بودرة النتريل الوردي الخالية من اللاتكسالتصنيع عالي الجودةP2810
مخزن الحظر (انظر الوصفة في مادة المواد المختصة والمحاليل - 10٪ مصل ماعز عادي في PBS)وصف في النص
مخزن الحظر (انظر الوصفة في المواد المختصة والمحاليل)وصف في النص
مجهر برايتفيلد (نيكون أو ما يعادله) إكليبس TS2نيكونTS2
خلايا كاكو-2ATCCHTB-37
حاضنة زراعة الخلايا، 37&00; C، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (Eppendorf CellXpert)إبندورف6734010015
الطرد المركزي (إبندورف، طرد المركزي 5804/5804 R أو ما يعادلهإبندورف22622501
أنابيب الطرد المركزي 50 مل SpectraTubeالقلوية العلميةC2750
إدخالات الزراعة للوحة ذات 12 بئر، PET، 0.4 وميكرو؛ م، معقمبراندتك ساينتيفك، إدراج براند 2 في 1، بيو-سيرت782730
وسيط تركيب DAPI VectaShieldمختبرات فيكتورH-1000
طبقات بتري عميقة، 100 × 25 مم طبق بتري قابل للتكديس من البوليسترين العميق، معقم وغير متقم;يو إس إيه ساينتيفك8609-0625
دروموند بيبيت إيد XPدروموند 4-000-101
جهاز طرد مركزي من نوع Eppendorf 5804 مع دوار دلو متحرك لأنابيب مخروطية بحجم 50 ملإبندورف22622501
ملقط، من الفولاذ المقاوم للصدأ، جهاز معقم معقم، مجموعات 2xVWR82027-438
ملقط، من الفولاذ المقاوم للصدأ، جهاز تعقيم معقم، مجموعات مرتين، ملقط عيناتVWR82027-438
قارورة زجاجية بحجم 500 ملكورنينغ 4980-500
مقياس الهيماسيتومتر (نويباور مع انزلاقات تغطية)ثيرمو فيشر العلمي50-312-90
خلايا HT-29-MTX-E12ميليبور سيغما12040401
قلم مناعي (اختياري)فيشر ساينتيفك4021761EA
قفازات مقاومة للقطع أو قفازات مقاومة للقطع (اختياري)متجر الأدوات أو أمازون
شريط المختبر أو شريط الشحنفيشر ساينتفيك 159015R
غطاء المحرك ذو التدفق الطبقي 1300 سلسلة A2 BSC الفئة IIثيرموفيشر ساينتيفيك1375
غطاء تدفق طبقي مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية SterilGARDشركة بيكرSG403A-HE
إثبات المذيب بعلامات العلامةVWR52877-310 أو 95042-566
وسائط خلايا Caco-2 (معتمدة على DMEM عالي الجلوكوز، انظر الوصفة في Reagents and Solutions)موضح في  نص
وسائط لخلايا HT-29 (DMEM عالي الجلوكوز، انظر الوصفة في المواد المختصة والمحاليل)وصف في النص
وسائط لخلايا THP-1 (RPMI، انظر الوصفة في الكواشف والمحلول)وصف في النص
أنبوب الطرد المركزي الدقيق، 1.7 مل، معقم القلوية العلميةC3017-ST
أنابيب الطرد المركزي الدقيقثيرمو فيشر3451
وسائط ميلر LB (انظر الوصفة في الكواشف والمحلل)سيغما-ألدرتش  L3522
كماشة بأنف الإبرة، مجموعتانمتجر الأدوات أو أمازون
قفازات خالية من مسحوق النيتريل من اللاتكس أورليا مذهلةميدسيكي92885
أغطية أطباق بيتري، طبق معقم من فالكون بتري بطراز 100x15 ممشركة كورنينج351029
أسيتات فوربول ميريستات (PMA) (100 ng/&mu؛ l، انظر الوصفة في Reagents and Solutions) إنفيفوجينTlrl-pma
أطراف بيبت (10 وميكرو؛ ل، 200 وميكرو؛ l، 1000 وميكرو؛ l) نقطة نقية أو ما يعادلهاAlkali Scientific ST1010-CS، ST1200-CS، ST1000-CS
بلاستيكيالبقاله
محلول كولاجناز بيوريكول يعمل (100 وميكرو؛ g/mL)مصفوفة حيوية متقدمة5005-100ML
انزلاقات الغطاء الدائري #1 أونصة (زجاج كورنينج فلويت أو فيشربراند)كورنينغ أو فيشربراند50143822 أو 12-546-2 25CIR-2
شفرات المشرط، معقمة، قابلة للتخلص من موبيك أو ريشة #10AJ136 أو 2975#10
سبيابترين (SEP، 100 وميكرو؛ M، انظر الوصفة في مادة الكواشف والمحلول)المسيرة المهنية في شركة خنان للكيماوياتCAS#: 17094-01-8
حاضنة الاهتزاز مضبوطة على 220 دورة في الدقيقة 37 درجة؛ Cإيبندورف نيو برونزويك العلميM12990080
سيليكون لاصق لوكتيت شفاف IDH أو شفاف سيليكون بحري 3M مع رأس أنفلوكتايت أو 3M1745658 أو PN08019
ماصة قناة واحدة Eppendorf Research Plus، 200 وميكرو؛ lإبندورف
الماصات أحادية القناة (10 وميكرو؛ ل، 200 وميكرو؛ l، 1000 وميكرو؛ l)إبندورف2231001122
مقياس الطيف الفوتومتري NanoDropOneCثيرمو فيشر العلمي13-400-519
ماء منزوع الأيونات المعقم    
السيرين المعقم الفوسفات المعقم (PBS) بدون الكالسيوم أو المغنيسيومفيشر ساينتيفك  BSS-PBS-1X6
حقنة 3 مل أو 5 مل مع رأس لور-لوكدينار بحريني309585 أو 309603
خلايا THP-1ATCCTIB-202
أنابيب نقل، معقمةفيشربراند13-711-20
ترايتون X-100ميليبور سيغماX100
محلول تريبان الأزرقVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0.25٪ثيرمو فيشر العلمي25200-056
مناديل كيميابس بروفيشنال مع لينت جارد Anti-Stat بوليشيلدكيمبرلي-كلارك34120
<الأجسام المضادة الأولية>قوية: 
القرص المعادي للإنسان CD163أبكام156769
CD68 المعادي للإنساننوفوس بيولوجيالزNB100-683-0.1 ملغ
CD80 المضاد للإنسان، E3Q9Vتقنيات الإشارات الخلوية15416
ضد الإنسان CK20 تقنيات الحياةPA5-82875
MUC2 المضاد للإنسان (996/1)ثيرموفيشرMA5-12345
<قوية>الأجسام المضادة الثانوية:
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (ل CD80 و CK20)ثيرموفيشرA11008
Alexa Fluor 594 Mag مضاد للفأر (ل-MUC2 و CD68 أو CD163)ثيرموفيشرA11005
Reagents and Solutions:   
<قوي>كاكو-2 متوسط:
DMEM مع ارتفاع الجلوكوز (4.5 جرام/لتر) و1٪ (v:v) جلوتا ماكس؛ثيرمو فيشر العلمي35050061
FBS 10٪ (v:v) معطل الحرارةسيغماF2242-500ML
الأحماض الأمينية غير الأساسية 1٪ لوسط كاكو-2ثيرمو فيشر العلمي11140076
التهاب العقدي بالقلم 1٪ (v:v)سيغماF2242-500ML
HT-29-MTX متوسط
DMEM مع ارتفاع الجلوكوز (4.5 جرام/لتر) و1٪ (v:v) جلوتا ماكس؛ثيرمو فيشر العلمي35050061
FBS 10٪ (v:v) معطل الحرارةسيغماF2242-500ML
HEPES (تركيز نهائي 10 مللي مول)ثيرمو فيشر العلمي15630080
التهاب العقدي بالقلم 1٪ (v:v)سيغماF2242-500ML
<قوي>THP-1 متوسط:
مصل البقر الجيني المعطل بالحرارة FBS (10٪ v:v)سيغما & nbsp;F2242-500ML
الجلوكوز (تركيز نهائي 4.5 جم/لتر)ثيرمو فيشر العلميA249001
غلوتا ماكس 1٪ (v:v)  تركيز نهائي 2 مللي مولثيرمو فيشر العلمي35050061
HEPES (تركيز نهائي 10 مللي مول)ثيرمو فيشر العلمي15630080
التهاب العقدي بالقلم 1٪ (v:v)سيغماF2242-500ML
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI)-1640 متوسطثيرمو فيشر العلمي11875119
بيروفات الصوديوم (تركيز نهائي 1 ملليمتر)ثيرمو فيشر العلمي11360070
<سترونغ>بيوريكول يعمل بمحلول كولاجناز (تخفيف إلى 1:30 100 وميكرو؛ g/ml):
بيوريكول 3 ملغ/مل 1:30 إلى 100 وميكرو؛ g/ml مصفوفة حيوية متقدمة5005-100ML
المياه غير المؤيدة المعقمة
<سترونغ>إل-سبيبتيرين (50 ملليمتر):
إل-سيبيبتيرين (SEP)المسيرة المهنية في شركة خنان للكيماوياتCAS#: 17094-01-8
<محلول أسيتات ميريستات قوي>فوربول (PMA، 5 ملغ/مل)إنفيفوجينTlrl-pma
BSA 1٪ مصل البقر ألبومين  سيغما-ألدرتش5470
DMSO سيغما & nbsp;D2650
ميلر LBسيغما-ألدرتش  L3522
المصل الطبيعي من نفس النوع الذي يحمل الجسم المضاد الثانويسيغما & nbsp;NS02L-1ML
بارافورمالدهيدسيغما-ألدرتش441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Co CultureFlipwell EngineeringGut Mucosal ModelBacterial SecretomeImmune Cell PolarizationColon Epithelial CellsMacrophage PolarizationBiofilm FormationSepiapterin TreatmentImmunofluorescent Staining

Related Articles