يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

3D Flipwell Engineering لتطوير أنظمة غير متزامنة للعلاجات السمية والمناعية في الخلايا البكتيرية والأمعاء والمناعة

649 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

أكتوبر 17, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

في هذه المقالة

ملخص

توفر هذه المقالة بروتوكولا مفصلا مع الخطوات الرئيسية لتوجيه هندسة 3D Flipwell واستخدامها. نصف ونوضح كيفية تجميع أكوام إدراج الثقافة المشتركة واستخدامها في الزراعة المشتركة للطبقات الطبقية من بكتيريا الأمعاء وظهارة الأمعاء والبلاعم لنمذجة البيئة المخاطية للأمعاء.

الملخص

لدراسة أدوار الإفرازات البكتيرية في استقطاب الخلايا المناعية والتوازن المخاطي للأمعاء ، قمنا بتطوير نموذج ثقافة مشتركة ثلاثي الأبعاد باستخدام إدخالات متاحة تجاريا بتنسيق مكدس متتالي. أطلقنا على هذا النظام 3D Flipwells ، ونجحنا في زراعة البكتيريا ، وظهارة القولون ، والخلايا المناعية في طبقات طبقية لتلخيص البيئة المكروية للغشاء المخاطي للأمعاء. يتيح نظام الزراعة المشتركة هذا بذر الخلايا الظهارية للقولون على جانب واحد من الغشاء والخلايا الوحيدة غير الملتصقة غير المتمايزة من الجانب الآخر ، مما يسمح بالتقدم المتزامن للاستقطاب الظهاري للقولون ، وتكوين المخاط ، وتمايز واستقطاب الخلايا الأحادية والبلاعم داخل ثقافة مشتركة واحدة دون الحاجة إلى فصل وإعادة طلاء البلاعم المتمايزة مسبقا. هذا النظام سهل البناء ولا يتطلب سوى عدد قليل من المواد والأدوات المتاحة بسهولة. اختبرنا فائدته من خلال تحليل استجابات مكونات الزراعة المشتركة للسياببترين (SEP) ، السلائف الداخلية ل BH4 (tetrahydrobiopterin) - وهو عامل مساعد لسينسيز أكسيد النيتريك (NOS). لقد أثبتنا أن علاج SEP ل 3D Flipwell ناتج عن تكوين الأغشية الحيوية بواسطة بكتيريا الأمعاء ، وإنتاج المخاط بواسطة ظهارة القولون ، والاستقطاب المناعي للبلاعم. يشير هذا إلى أن SEP أدى إلى تنشيط آلية الدفاع المخاطي من خلال الحديث المتبادل بين المكونات الخلوية المختلفة. هناك حاجة إلى مزيد من التجارب للتحقيق في دور الاتصالات المخاطية التي تؤدي إلى إعادة برمجة الخلايا المناعية وتقييم فائدة نظام الزراعة المشتركة هذا للكشف عن العلاجات المناعية الجديدة.

المقدمة

يؤثر الحديث المتبادل بين ميكروبيوم الخلايا والأمعاء المناعية بشكل كبير على فعالية علاجات الأمراض المختلفة. يتم تعديل مثل هذا الحديث المتبادل بشكل ملحوظ عن طريق المحفزات الخارجية ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر تشوهات التمثيل الغذائي المضيف ، والتغيرات الغذائية ، ومظاهر المرض ، والعلاج الدوائي. يمكن أن تؤدي هذه التغييرات إلى اختلال التوازن في تكوين البكتيريا ، وهي حالة تسمى dysbiosis1،2،3.

لفهم التفاعلات بين الميكروبات والخلايا المناعية المضيفة في الأمعاء بشكل أفضل ، تم تطوير أنظمة زراعة مشتركة متقنة من قبل مجموعات مختلفة في محاولة لتلخيص البيئة المخاطية للأمعاء. من نظام القناة الهضمية على الرقاقة الذي طوره Kim et al.4 إلى تجميع أكثر تعقيدا باستخدام ركيزة ماصةمتخصصة 5 ، فإن أنظمة الزراعة المشتركة هذه ليست سهلة البناء وغير قادرة على الاحتفاظ بمجموعة كاملة من المكونات المفرزة بسبب امتصاصها بواسطة ركيزة الزراعة المشتركة. نويل وآخرون وهكذا طور نظام بديل للثقافة المشتركة لنمذجة الغشاء المخاطي للأمعاء الذي يسهل تصنيعهنسبيا 6. يستخدم هذا النظام الجديد مزرعة واحدة مع خلايا ظهارية القولون المزروعة على جانب واحد من الغشاء والضامة المتمايزة مسبقا على الجانب الآخر6. ومع ذلك ، فإن بذر البلاعم المتمايزة مسبقا يتطلب تمايزها مسبقا في مكان آخر وتفكيكها وإعادة طلاءها في ثقافة مشتركة ، مما قد يؤثر على سلامتها الخلوية وصلاحيتها للحياة.

من خلال دمج التحسينات على هذه الأنظمة السابقة ، قمنا بتطوير نظام ثقافة مشترك جديد ثلاثي الأبعاد (3D) متعدد الطبقات أطلقنا عليه اسم نظام 3D Flipwell7،8. يتكون هذا النظام من إدخالات زراعة الخلايا مكدسة متتالية ، مما يسمح بالتقدم المتزامن للاستقطاب الظهاري للقولون ، وتكوين المخاط ، وتمايز البلاعم ، والاستقطاب داخل ثقافة مشتركة واحدة. يمكننا هذا النظام من فحص التغيرات في البيئة المخاطية للأمعاء والتفاعلات بين بكتيريا الأمعاء والخلايا الظهارية والخلايا المناعية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام لفحص آثار المنبهات الخارجية ، بما في ذلك نواتج الأيض البكتيرية والسموم والعناصر الغذائية والمستحضرات الصيدلانية على الغشاء المخاطي للأمعاء وبقية الجسم7،8.

من خلال استخدام نظام إدخال الزراعة المشتركة الجديد ، قمنا بفحص استجابات المكونات الخلوية المختلفة للسياببترين (SEP) ، السلائف الداخلية ل BH4 (رباعي هيدروبيوبترين) - عامل مساعد لسينسيز أكسيد النيتريك (NOS). لقد أظهرنا سابقا أن SEP يمارس أنشطة مؤيدة للمناعة على البيئة المكروية لورم الثدي عن طريق إعادة برمجة البلاعم المرتبطة بالورم إلى النوع المناعي9،10،11،12. لقد أظهرنا أن SEP يحفز الأحداث المتزامنة لتكوين الأغشية الحيوية بواسطة بكتيريا الأمعاء ، وإنتاج المخاط بواسطة ظهارة القولون ، والاستقطاب المناعي للبلاعم في الثقافات المشتركة ، مما يشير إلى تنشيط آلية الدفاع عن الغشاء المخاطي7. تدعم هذه النتائج فائدة نظام الزراعة المشتركة الجديد هذا في نمذجة البيئة المكروية للغشاء المخاطيللأمعاء 7.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تقديم إرشادات خطوة بخطوة لبناء هذه الثقافة المشتركة الجديدة لبكتيريا الأمعاء وظهارة الأمعاء والمخاط والخلايا المناعية لنمذجة البيئة المخاطية للأمعاء. نوضح أيضا كيف يمكننا تصور الحديث المتبادل للخلايا المزروعة المشتركة تحت تأثير محفز خارجي ، على سبيل المثال ، علاج SEP. هناك حاجة إلى مزيد من البحث باستخدام نظام الاستزراع المشترك هذا لتحديد المكونات الخلوية المفرزة التي تسهل التفاعلات بين الخلايا المختلفة في الثقافة المشتركة ، وكذلك لاختبار فائدة نموذج الزراعة المشتركة هذا للفحص عالي الإنتاجية للعلاجات الجديدة. علاوة على ذلك ، لتحقيق الحالة الفسيولوجية للبيئة المخاطية للأمعاء ، سيتطلب نظام الاستزراع المشترك هذا مزيدا من التعديلات. على سبيل المثال ، لزراعة خلايا الثدييات الهوائية مع البكتيريا اللاهوائية ، يجب زراعة هذه البكتيريا بشكل منفصل في وسائط لاهوائية تزيل الأكسجين أو تتغطى بالبارافين السائل الذي يمنع دخول الأكسجين ، كما ورد في مكان آخر. مثل هذه المنفعة المتقدمة وتطبيق نظام الزراعة المشتركة هذا من شأنه أن يستدعي مزيدا من التحقيق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. 3D هندسة فليب ويل

  1. يجب أن يتم جميع الأعمال داخل خزانة زراعة الخلايا. ضع جميع المستلزمات داخل الخزانة.
  2. افتح غطاء طبق بتري واتركه جانبا. افتح شفرة المشرط من غلافها الواقي وضعها على حافة قاع طبق بتري. ضمان العقم.
    تنبيه: مطلوب التعامل الدقيق مع شفرة المشرط. استخدم قفازات مقاومة للقطع ومقواة بالألياف لحماية اليدين إذا لزم الأمر.
  3. افتح العبوة الواقية المعقمة للملحق التجاري المكون من 12 بئرا. ضمان العقم. خذ مجموعة من الملقط المعقم. أمسك الملحق برفق وقم بإزالته من العبوة.
  4. أمسك الملحق بحيث يكون الجزء السفلي متجها لأعلى. من ناحية أخرى ، خذ شفرة المشرط المعقمة وارفعها إلى الملحق.
  5. باستخدام حركة على شكل حرف C ، اخترق الغشاء عند الحافة وحرك شفرة المشرط برفق حول الجزء السفلي من الملحق ، مع البقاء بالقرب من الجدار البلاستيكي.
  6. اقطع غشاء PET واستخدم المجموعة الثانية من الملقط لإزالة الغشاء. تجاهل الغشاء.
  7. استخدم شفرة المشرط لكشط أي نشارة غشاء بيضاء لتنظيف حافة وحافة الملحق. أعد الملحق المعد حديثا بعناية إلى عبوته المعقمة الأصلية.
  8. بعد ذلك ، خذ الأنبوب اللاصق المصنوع من السيليكون واقطع طرف الفوهة بشفرة المشرط لعمل فتحة. يجب أن يكون عرض هذه الفتحة 3 مم.
  9. اختبر حجم الخرزة عن طريق الضغط على الغراء على المنشفة الورقية. يجب أن يكون سمك الخرزة 2-3 مم. اضبط الفوهة إذا كانت الخرزة أقل من 2 مم ويصعب عصرها خارج الأنبوب.
    1. هناك طريقة أخرى لتطبيق حبة الغراء ونشرها وهي استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر مع قطع طرفه. قم بقص 3-4 مم بالمقص واستخدم ملعقة لنشر الغراء حول حافة الملحق.
  10. قشر الغطاء الواقي من الملحق الثاني واتركه جانبا. التقط ملقطا معقما ، وامسك الملحق الثاني من عبوته بحيث يكون الغشاء متجها لأعلى.
  11. انشر برفق حبة رقيقة من السيليكون مقاس 2-3 مم على طول الجزء السفلي من الملحق ، مع الحرص على عدم لمس الغشاء.
  12. التقط المجموعة الثانية من الملقط المعقم وارفع الملحق الأول بعناية (بدون الغشاء) من عبوته الواقية.
  13. اجمع الإدخالين معا من أسفل إلى أسفل بحيث تتماشى الحواف السفلية. قد يتم إجبار الغراء الزائد على الخروج من المفصل. اترك الغراء حتى يجف. يمكن قطعه بعد تجفيف الغراء تماما (24-72 ساعة). هذا اختياري.
    ملاحظة: يجب أن تحتوي مكدس Flipwell Co-culture Insert (FCI) النهائي على غشاء PET واحد فقط في المنتصف. من الأفضل وضع المقابض على شكل حرف L للإدخالات التجارية بحيث تكون على بعد 180 درجة من بعضها البعض (عند الساعة 3 و 6). اتبع توصيات الشركة المصنعة لغراء السيليكون لوقت التجفيف ، والذي قد يكون من 24 إلى 72 ساعة حسب العلامة التجارية. بالنسبة لمعظم المواد اللاصقة القائمة على السيليكون ، يفضل وقت التجفيف لمدة 72 ساعة. يمكن أيضا تجفيف الغراء لمدة 24 ساعة فقط مع التعقيم بالأشعة فوق البنفسجية.
  14. عندما يتم لصق مكدس FCI ، ضعه داخل العبوة المعقمة الأصلية حتى يجف أو داخل طبق بتري عميق. استخدم الغطاء من أطباق بتري المحددة لتغطية مجموعة المكدس.
  15. لتعقيم مجموعات المكدس ، افتح غطاء طبق بتري. استخدم ملقطا معقما لتسليم كومة FCI على حافة حافة طبق بتري العميق المحدد.
  16. أغلق الوشاح الزجاجي لخزانة BSC. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ابتعد عن الخزانة من أجل السلامة وقم بتعقيم كل جانب من الغشاء 30 دقيقة -1 ساعة. أطفئ ضوء الأشعة فوق البنفسجية عند اكتمال كل دورة تعقيم.
  17. ضع غطاء طبق بتري (كما هو محدد) فوق طبق بتري مع أكوام الإدخال واتركه جانبا.

2. اختبار التسرب قبل طلاء الكولاجين

  1. قم بإزالة غطاء طبق بتري. أضف 500 ميكرولتر من PBS المعقم أو الماء المعقم منزوع الأيونات.
    ملاحظة: بالنسبة للمساعدة البصرية ، تم استخدام DMEM للمساعدة في تصور سلامة مكدسات FCI.
  2. غطي طبق بتر. دعها ترتاح طوال الليل. تحقق من سلامة FCI في الصباح. تجاهل FCI إذا تم اكتشاف تسرب. قم بعمل أكوام إدراج جديدة حسب الحاجة.
  3. استنشق السائل (PBS أو الماء) المستخدم للاختبار. غطي طبق بتري بغطاء.
  4. اترك الأكوام تجف (1-2 ساعة) داخل BSC. قم بتخزين FCIs في BSC حتى تصبح جاهزة للاستخدام أو استمر في تغطيتها بالكولاجين لبذر الخلايا الملتصقة.

3. طلاء الكولاجين لغشاء Flipwell

  1. قم بإعداد مخزون عمل من محلول الكولاجين عن طريق تخفيف محلول الكولاجين المزود بمعدل 3 مجم / مل إلى 1:30 تخفيف عند 100 ميكروغرام / مل. أضف 33 ميكرولتر من محلول الكولاجين المصنوع تجاريا إلى 1 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات في أنبوب طرد مركزي دقيق. امزج عن طريق الدوامة.
    ملاحظة: للحصول على حجم أكبر ، قم بتوسيع نطاق واستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 مل اعتمادا على عدد أكوام الإدخال المراد تغطيتها على جانبي الغشاء. اجعل هذا طازجا في كل مرة. لا تعيد استخدام مخزون العمل.
  2. افتح غطاء طبق بتري. دع Flipwell يتدلى من حافة طبق بتري. أضف بعناية 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين إلى جانب واحد من مكدس الإدخال.
  3. دعها تجلس 1 ساعة. استنشاق محلول الكولاجين. أضف 200 ميكرولتر من PBS المعقم. شفط PBS.
  4. غطي طبق بتري بغطاء واتركي الغشاء يجف لمدة 60 دقيقة داخل الخزانة. عندما يجف الغشاء ، خذ الملقط / الملقط المعقم واقلب Flipwell إلى الجانب الآخر واتركه يتدلى من حافة طبق بتري.
  5. أضف 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين إلى الجانب غير المطلي (العلوي الآن) من الغشاء. دعها تجلس 1 ساعة.
  6. استنشاق محلول الكولاجين. أضف 200 ميكرولتر من PBS المعقم. شفط PBS. غطي طبق بتري بغطاء واتركي الغشاء يجف لمدة 60 دقيقة داخل الخزانة. اترك كومة FCI تجف طوال الليل أو بذرها في نفس اليوم.
    ملاحظة: لم يتم اختبار سلامة طلاء الكولاجين في ظل ظروف التخزين الطويلة. بمجرد طلاء Flipwells مسبقا ، يجب استخدامها في غضون 24 ساعة.

4. بناء إدراج البكتيري للثقافات البكتيرية

  1. ضع مجموعتين من الملقط المعقم وإدخالات 24 بئرا داخل BSC. افتح الإدخالات بعناية واتركها داخل عبواتها المعقمة.
  2. باستخدام ملاقط معقمة ، ارفع الملحق من عبوته المعقمة. باستخدام المجموعة الثانية من الملقط / الملقط ، اقطع الأقدام البلاستيكية الصغيرة في الجزء السفلي من الملحق.
  3. اختبر ملحق 24 بئرا عن طريق تركيبه داخل أحد أكوام FCI المعقمة أو إدخالات 12 بئرا أصلية.
  4. إذا لم ينزلق الملحق في البئر ، فاستخدم الملقط مرة أخرى لفصل المزيد من المواد البلاستيكية عن الحافة حيث تلتقي الحافة والقدمين.
  5. اختبر الملاءمة مرة أخرى حتى يتمكن الملحق المكون من 24 بئرا من الانزلاق داخل بئر الإدخال المكون من 12 بئرا. ضع الملحق إما داخل عبوته المعقمة أو داخل طبق بتري معقم.
  6. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم أو الإيثانول إدراج (اختياري). قم بتغطية العبوة احتياطيا أو قم بتغطيتها بغطاء طبق بتري حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

5. بناء إبرة

  1. أحضر الأدوات وجميع المستلزمات داخل BSC. امسك إبرة بعناية باستخدام كماشة الأنف.
  2. قم بقياس موقع كل انحناء على الإبرة باستخدام المسطرة. باستخدام المجموعة الثانية من كماشة الأنف ، أمسك الإبرة في الموقع المحدد وثني الإبرة.
  3. قم بإنشاء الانحناء الثاني. لتحريف الإبرة ، أمسك الإبرة بكماشة في القاعدة وعند الانحناء على شكل حرف U وقم بلفها في الاتجاه المعاكس لإنشاء تطور 4-5 مم. هذه الخطوة ضرورية لإدخال الإبرة بسهولة داخل Flipwell لإزالة فقاعات الهواء.
  4. ألصق الإبرة بحقنة معقمة مقاس 3 أو 5 مم. تعقيم الإبرة وقاعدة المحقنة في 20 مل من 70٪ -95٪ إيثانول داخل أنبوب مخروطي 50 مل.
  5. اسحب الإيثانول من خلال الإبرة والمحقنة لضمان تعقيم الإبرة وقاعدة المحقنة.
  6. أخرج المحقنة والإبرة من الأنبوب المخروطي مع الإيثانول واتركها تجف في الهواء عن طريق الراحة على طبق بتري. تطهير الإبرة بالهواء حتى تجف واتركها تجف لبضع دقائق.

6. بذر خطوط خلايا Caco-2: HT29-MTX-E12 الظهارية للقولون

  1. ابدأ في زراعة خطوط خلايا Caco-2 و HT29-MTX قبل 2-3 أسابيع من التجربة في أطباق منفصلة مغلفة ب TC مقاس 100 مم في وسائط النمو الخاصة بها.
    1. بالنسبة لوسائط HT-29-MTX ، استخدم 440 مل من DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 جم / لتر) و 1٪ (v: v) وسائط Glutamax مع 50 مل من 10٪ (v: v) FBS المعطلة بالحرارة ، و 5 مل من 1٪ (v: v) Pen Strep ، و 5 مل من HEPES 10 mM تركيز نهائي.
    2. بالنسبة لوسائط Caco-2 ، استخدم 440 مل من DMEM مع ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 جم / لتر) و 1٪ (v: v) وسائط Glutamax مع 50 مل من 10٪ (v: v) FBS المعطلة بالحرارة ، و 5 مل من 1٪ (v: v) Pen Strep ، و 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية.
      ملاحظة: تحديد كثافة البذر لخط خلايا Caco-2 باستخدام آبار صفيحة 12 بئرا مطلية بزراعة الأنسجة. احسب عدد الأيام حتى التقاء 100٪ اعتمادا على كثافة البذر الأولية. نحن نقدم كثافة البذر كمبدأ توجيهي. ومع ذلك ، سيختلف ذلك باختلاف صياغة وسائط النمو والبائع و FBS المستخدمة. هذه الخطوة ضرورية لضمان وجود طبقة أحادية للجانب الظهاري للأمعاء من Flipwell بعد طلاء خلايا THP-1 وإجراء العلاجات البكتيرية / SEP.
  2. لتمرير خلايا Caco-2 و HT-29 ، استنشاق وسائط الاستزراع. يغسل ب 10 مل من PBS.
  3. قم بتهريب الخلايا بإضافة 2 مل من 0.25٪ من التربسين-EDTA. احتضان 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  4. أضف 7 مل من وسائط النمو المناسبة للخلية إلى الألواح. نقل الخلايا لفصل الأنابيب المخروطية المعقمة سعة 15 مل.
  5. بيليه بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة. استنشاق المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسائط HT-29 المستندة إلى DMEM التي تم تسخينها مسبقا. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا.
  7. اجمع بين نوعي الخلايا Caco-2: HT-29 بنسبة 9: 1 في أنبوب مخروطي جديد 15 مل أو 50 مل ، اعتمادا على عدد الخلايا اللازمة للعدد المطلوب من Flipwells.
  8. استخدم Flipwells المطلي بالكولاجين للخطوات أدناه. قم بتعليق أكوام FCI المطلية بالكولاجين من حافة طبق بتري العميق.
  9. بذرة 500 ميكرولتر من 7.5 × 104 خلايا لكل سم2 (2.6 × 105 خلايا / 12 بئر إدخال) لكل جانب قمي ل Flipwell. احسب عدد الخلايا الأولية استنادا إلى عدد المكدسات المستخدمة. سيشمل ذلك كلا النوعين من الخلايا بنسبة 9: 1.
  10. قم بتغطية التجميعات بغطاء طبق بتري. احتضن عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 طوال الليل حتى تلتصق الخلايا. تبدأ الخلايا في إنتاج المخاط حوالي 7-10 أيام في الثقافة. قم بتغيير وسائل الإعلام كل يومين للحفاظ على الثقافات.
    ملاحظة: يجب حساب إجمالي أيام المزرعة مع العلاجات مسبقا. يعتمد الوجه وكثافة البذر الأولية على تلك المدة.

7. تقليب 3D Flipwell استعدادا لبذر خلايا THP-1

  1. عندما تلتصق خلايا Caco-2: HT-29 وتبدأ في التكاثر (يجب تقدير التقاء الدقيق بناء على الوسائط / FBS المستخدمة ومدة الثقافة) ولكنها ليست عند التقاء بنسبة 100٪ ، اقلب Flipwell لبذور خلايا THP-1 على الجانب الآخر من الغشاء.
    ملاحظة: يجب توسيع خلايا THP-1 في مزرعة منفصلة بحلول هذه المرحلة ، وسيتم تقدير أرقام الخلايا المطلوبة بالضبط بناء على عدد مكدسات FCI المستخدمة.
  2. افتح غطاء الطبق البتري واسحب وسائط DMEM من الجانب القمي (ظهاري الأمعاء) من مكدس FCI.
  3. باستخدام ملقط معقم ، التقط Flipwell بعناية بواسطة الخطاف وقم بتدويره 180 درجة. مع المجموعة الثانية من الملقط المعقم ، أمسك كومة FCI من الخطاف الآخر الذي يواجه الآن لأعلى.
  4. اخفض التجميع مرة أخرى في طبق بتري وقم بتعليق الخطاف فوق حافة طبق بتري. إذا لم تكن جاهزا لزرع خلايا THP-1 ، فأضف ما يكفي من الوسائط إلى طبق Petri العميق لرفع مستوى الوسائط إلى أعلى الغشاء فقط.
    ملاحظة: يجب أن يكون Flipwell مستقرا في هذا الموضع ، ويجب النظر في البذر باستخدام خلايا THP-1 وإضافة الوسائط على الفور الآن. تتم هذه الخطوات بسرعة. يجب عد خلايا THP-1 وجاهزة للطلاء. تم زرع خلايا THP1 أولا لتخفيف كبار مكدس FCI لمزيد من الاستقرار والوزن النهائي. ثم تمت إضافة وسائط DMEM إلى طبق بتري العميق لرفع مستوى الوسائط إلى الجانب السفلي من الغشاء. ثم تم استخدام الإبرة المصنوعة حسب الطلب لإزالة فقاعة الهواء ، مما أدى إلى استقرار مكدس FCI وسمح بتعديلات الحجم النهائية.
  5. استخدم الإبرة لإزالة فقاعة الهواء كما هو موضح في الخطوة التالية.

8. إزالة فقاعات الهواء

  1. قم بتعقيم الإبرة والمحقنة في الإيثانول وجففها في الهواء قبل الاستخدام (انظر الخطوة 5). اغمر مكبس المحقنة.
  2. أمسك كومة FCI من الذراع بملقط معقم. قم بخفض الإبرة بعناية داخل وتحت مجموعة الإدخال وضع برفق شديد طرف إبرة التزقيم الناعم حتى فقاعة الهواء.
  3. اسحب مكبس المحقنة بعناية وببطء شديد وشاهد فقاعة الهواء تختفي ببطء. توقف عندما يبلغ قطر فقاعة الهواء حوالي 2 مم ، وهو ما يكفي للاحتفاظ بتغطية جيدة ل DMEM للخلايا الظهارية في القولون.
  4. قم بإزالة الإبرة والمحقنة بعناية من فليب ويل. انتقل إلى مجموعة الإدخال الأخرى في طبق بتري العميق.

9. بذر THP-1 وعلاج PMA

  1. اصنع وسائط THP1 مع 420 مل من معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) -1640 متوسط ، 50 مل من 10٪ (v: v) FBS المعطلة بالحرارة ، 5 مل من Glutamax 1٪ (v: v) ، 5 مل من HEPES (10 جم تركيز نهائي) ، 11 مل من الجلوكوز (4.5 جم / لتر تركيز نهائي) ، و 5 مل من Pen-Strep (1٪ v: v).
    ملاحظة: يجب زراعة خلايا THP-1 في وسط ثقافة قائم على RPMI لعدة أيام قبل البذر في الإدخالات. قم بإجراء حسابات عدد الخلايا قبل البذر وتوسيع نطاقها بناء على عدد مكدسات FCI التي سيتم استخدامها.
  2. قم بإعداد تعليق الخلية بناء على حجم 500 ميكرولتر وعند 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من وسائط THP-1. إذا كانت هناك حاجة إلى استخدام PMA للتمايز والاستقطاب ، فقم بإضافته إلى وسائط RPMI عند 100 نانوغرام / ميكرولتر.
    1. لصنع PMA ، أعد تكوين 5 مجم من أسيتات البوربول ميريستات (PMA) في 1 مل من DMSO لصنع محلول مخزون 5 مجم / مل. امزج عن طريق الدوامة. أليكوت في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 20 ميكرولتر لكل منها وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    2. لاستخدام PMA ، قم بعمل مخزون عامل عند 50 ميكروغرام / مل عن طريق تخفيف 1 ميكرولتر من مخزون 5 مجم / مل في 99 ميكرولتر (1: 100) من وسائط النمو الكاملة. أضف 1 ميكرولتر من مخزون العمل إلى 500 ميكرولتر من الوسائط ، أو 20 ميكرولتر من مخزون العمل إلى 10 مل من الوسائط.
  3. أجهزة الطرد المركزي THP-1 خلايا في 94 × جم لمدة 5 دقائق في RT إلى الحبيبات. أعد التعليق في 5-10 مل من وسائط RPMI. عد خلايا THP-1 بأي طريقة عد مفضلة.
  4. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 94 × جم لمدة 5 دقائق في RT. أعد التعليق عند 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من وسائط THP-1.
  5. أضف 500 ميكرولتر من معلق الخلية THP-1 إلى الجانب القمي من مكدس إدراج الزراعة المشتركة. اضبط وسائط HT-29 للخلايا الظهارية للقولون عن طريق إضافة وسائط إلى طبق بتري البئر العميق.
  6. قم بإزالة فقاعة الهواء بإبرة التزقيم وفقا للخطوة 8 ، إذا لزم الأمر. قم بزراعة كلا النوعين من الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، رطوبة 100٪ حتى تلتصق خلايا THP-1 (بين عشية وضحاها) وتتكاثر لمدة 1-2 أيام.
  7. استعد إما لإجراء علاجات باستخدام SEP أو أدوية أخرى أو الاستعداد للإدخال البكتيري (انظر الخطوة 4). ابدأ في زراعة البكتيريا قبل يوم واحد من قلب مكدس FCI التالي.

10. Flipwell Flip الثاني وإزالة فقاعات الهواء لإدخالات SEP والبكتيريا

  1. افتح غطاء طبق بتري. شفق وسائط RPMI من الجانب القمي. أمسك Flipwell من ذراعه بملاقط معقمة وارفع المكدس.
  2. قم بتدوير المكدس رأسا على عقب. باستخدام المجموعة الثانية من الملقط ، أمسك مجموعة المكدس بالذراع المتاحة.
  3. اخفض المكدس في طبق بتري جديد معقم بئر عميق على الحافة. أضف 500 ميكرولتر من وسائط DMEM إلى الجانب الظهاري الظهاري الآن/الأمعاء.
  4. أضف ما يكفي من وسائط RPMI إلى طبق بتري العميق حتى تصبح الوسائط في الجزء العلوي من الغشاء. قدر حجم RPMI بحوالي 40-55 مل ، لكنه سيتغير اعتمادا على عدد أكوام FCI المستخدمة لكل طبق Petri عميق.
  5. قم بإزالة فقاعة الهواء باستخدام الخطوة 8 مع ترك فقاعة 2-3 مم. اضبط وسائط RPMI إذا لزم الأمر. غطي الطبق.
  6. الثقافة حتى تبدأ الخلايا الظهارية في القولون في إنتاج المخاط. قم بتغيير الوسائط جزئيا كل يومين.
    ملاحظة: إذا تم استزراع الخلايا الظهارية في القولون لفترة كافية وأنتجت بالفعل مخاطا ، فيمكنها الانتقال إلى الإدخال البكتيري أو العلاجات. لا تسمح للوسائط الموجودة في الحجرة السفلية بالوصول إلى أسفل الجانب السفلي لغشاء الملحق. أضف المزيد من وسائط DMEM للحفاظ على مستوى الوسائط عند الغشاء. الطريقة المثالية لتغيير الوسائط هي إزالة نصف الوسائط من الحجرة القاعدية الجانبية وترك كمية صغيرة من الوسائط في الحجرة القمية لمنع تسرب الهواء.
  7. بالنسبة لعلاجات SEP ، أضف SEP إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكرومتر إلى الآبار في هذا الوقت إذا لم يتم استخدام المزرعة البكتيرية. إذا تم استخدام الثقافة البكتيرية والإدخال ، أضف SEP إلى المزرعة البكتيرية. للثقافة البكتيرية ، انظر الخطوة 11.
    1. لجعل SEP, إضافة 100 ملغ لسيبابترين إلى 84.3 مل من DMSO واخلطها عن طريق دوامة. Aliquot في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 100 ميكرولتر لكل منها. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية. استخدم حصص SEP عند 1 ميكرولتر لكل 500 ميكرولتر من الوسائط لكل مجموعة إدراج (التركيز النهائي 100 ميكرومتر).

11. بدء الثقافة البكتيرية (اختياري)

  1. لدراسة تأثير المستقلبات البكتيرية على الخلايا المناعية والمخاط وظهارة القولون ، أضف ملخلا بكتيريا إلى الجانب القمي من مجموعة الإدخال. لبناء الإدخال البكتيري ، اتبع الخطوة 4. قمنا بزراعة Bacillus subtilis في اليوم السابق لاستخدام الإدخال البكتيري.
  2. اصنع وقم بتعقيم Miller LB قبل يومين من استخدام الإدخال البكتيري. لصنع LB ، امزج 6.25 جم من Miller LB مع 250 مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة زجاجية سعة 500 مل. غطيها بورق الألمنيوم. الأوتوكلاف ، تبرد إلى RT. يمكن تخزين LB معقم إما عند 4 درجات مئوية أو RT.
  3. بدء في زراعة بكتيريا Bacillus subtilis من مخزون الجلسرين في اليوم السابق لاستخدام إدراج البكتيريا.
  4. لبدء الثقافة البكتيرية ، قم بتلقيح 10 مل من Miller LB باستخدام Bacillus subtilis من مخزون الجلسرين المجمد داخل أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. لا تدع مخزون الجلسرين يذوب.
  5. باستخدام طرف معقم 200 ميكرولتر ، اختر كمية صغيرة من البكتيريا من مخزون الجلسرين. أخرج الطرف إلى 10 مل من LB في الأنبوب المخروطي المعقم 50 مل.
  6. في حالة استخدام SEP ، ابدأ العلاج ب 20 ميكرولتر من مخزون SEP (يجب أن يكون التركيز النهائي 100 ميكرومتر). أضف مباشرة إلى المزرعة البكتيرية 10 مل في مزرعة بدء الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
  7. ثقافة Bacillus subtilis لمدة 8 ساعات في حاضنة اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. أضف العلاج الثاني ل SEP في نهاية اليوم - أضف 20 ميكرولتر من SEP إلى التركيز النهائي البالغ 100 ميكرومتر إلى 10 مل من LB مع البكتيريا.
  8. الثقافة بين عشية وضحاها عند 220 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية. أضف العلاج الثالث من 20 ميكرولتر من SEP إلى 10 مل من LB مع Bacillus subtilis في صباح اليوم التالي واستمر في الرج حتى يصبح جاهزا للقيام بالإدخالات البكتيرية.

12. إضافة ملحق بكتيري إلى Flipwell (اختياري)

  1. قم بإجراء بناء إدراج بكتيري كما هو موضح في الخطوة 4. قم بإجراء الزراعة البكتيرية كما هو موضح في الخطوة 11.
    ملاحظة: إذا كانت خزانة زراعة الخلايا منفصلة متوفرة ، فسيعمل ذلك بشكل أفضل. خلاف ذلك ، قسم منطقة العمل داخل خزانة زراعة الخلايا إلى نصفين. الحفاظ على الثقافات البكتيرية والخلايا متباعدة. لا ينبغي إعادة مزارع الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلية. سيحتاج BSC إلى التعقيم والتعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة 24 ساعة أو أكثر بعد تنفيذ هذه الطريقة.
  2. استخدم زوجين من الملقط المعقم للخطوات أدناه. يجب القيام بجميع الخطوات أدناه في BSC.
  3. باستخدام الملقط ، ارفع الملحق المعقم المكون من 24 بئرا من عبوته. ضع الملحق داخل طبق بتري معقم وقم بتغطية الغطاء.
  4. كرر عدد الحشوات البكتيرية المطلوبة. انقل طبق بتري مع Flipwells من الحاضنة إلى BSC واتركه جانبا على الجانب الآخر من الطبق مع إدخالات بكتيرية.
  5. أخرج 300 ميكرولتر من وسائط DMEM من الجانب القمي (العلوي) من Flipwell للسماح بالإدخال البكتيري. اترك حوالي 200 ميكرولتر في الجانب العلوي من مكدس FCI. ضع غطاء طبق بتري فوق مجموعات الإدخال.
  6. أضف 50-100 ميكرولتر من مزرعة B.subtilis إلى الحشوات البكتيرية المكونة من 24 بئرا. احرص على عدم انسكاب أو تلويث الجدار الخارجي وحافة الحشوة البكتيرية. يمكن أخذ OD600 لمراقبة مرحلة نمو الثقافة.
  7. باستخدام ملقط معقم ، ارفع الملحق البكتيري بالثقافة وأدخله بعناية داخل الجانب العلوي من Flipwell. قم بتدوير الذراع وقم بتعليقه من حافة مكدس FCI. امسك المكدس بالمجموعة الثانية من الملقط المعقم.
  8. كرر مع بقية مكدسات FCI. غطي طبق بتري واتركيه داخل BSC 3 ساعات. لا تحضر داخل الحاضنة.
  9. بعد 3 ساعات ، استخدم ملقطا معقما لإزالة الملحق البكتيري من فليب ويل. كرر ذلك لبقية مجموعات الإدراج. تخلص من الحشوات البكتيرية.
    ملاحظة: تخلص من البكتيريا وإدراج البكتيريا وفقا لسياسات التخلص من النفايات الخطرة بيولوجيا وإرشادات السلامة والصحة الخاصة بالمؤسسة. لم يتم فحص المكونات البكتيرية أو البكتيريا نفسها.
  10. لتحليل التغييرات في المقصورات الخلوية المخاطية والظهارية والمناعية ، انتقل إلى غسل الأغشية وإعدادها للتصوير.
  11. استنشق وسائط DMEM من أعلى Flipwell. يغسل ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم. باستخدام الملقط ، ارفع كومة FCI من طبق بتري وانقله إلى طبق بتري جديد.
  12. اقلب Flipwell وعلقه على حافة طبق بتري. اغسل الغشاء ب 500 ميكرولتر من PBS المعقم.
  13. إذا كان التخزين مطلوبا ، فقم بتخزين أكوام FCI على المدى القصير (30 دقيقة طوال الليل) في PBS معقم داخل أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    ملاحظة: من المهم تحديد طريقة التصوير التي سيتم استخدامها بعد ذلك وما إذا كان سيتم قطع الغشاء إلى النصف لكل من المجهر الإلكتروني ووضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية.

13. تفكيك Flipwell للفحص المجهري الإلكتروني (SEM)

ملاحظة: لفحص التغيرات المورفولوجية في الخلايا الظهارية للقولون والضامة بعد علاجات SEP / البكتيرية ، قمنا بتثبيت الأغشية في مخزن مؤقت للتثبيت ثم قمنا بتفكيك Flipwells للفحص المجهري الإلكتروني (SEM). تم استخدام PFA كمثبت. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام الجلوتارالديهايد. من المهم التشاور مع Microscopy Core حول مخزن التثبيت المفضل لديهم ، وخطوات الجفاف المحددة ، وتركيزات التثبيت المؤقت الأولية. يمكن تخزين الأغشية في المخزن المؤقت للتثبيت إذا كان التخزين ضروريا. يمكن القيام بالعمل خارج BSC. إذا كان قلب التصوير سيقوم بلصق الغشاء لأسفل ، فيمكن قصه إلى نصفين ووضعه لتصوير كلا الجانبين بشكل منفصل.

  1. باستخدام علامة مقاومة للمذيبات ، قم بتسمية الجوانب البلاستيكية لمكدس FCI بترميز رمز لنوع الخلية المستخدمة. بدلا من ذلك ، قم بتسمية الغشاء مباشرة إما بنقطة أو علامة اختيار أو x لتسمية نوع الخلية المستخدمة.
  2. ضع Flipwell داخل أنبوب مخروطي سعة 50 مل بدون تفكيك. أضف 4٪ PFA كافية لغمر المكدس. يحفظ في 4٪ PFA طوال الليل.
    1. لعمل 4٪ PFA (خال من الميثانول) ، قم بإذابة 40 جم من بارافورمالديهايد في 800 مل من 1x PBS. لصنع 0.4٪ PFA ، قم بإذابة 4 جم من البارافورمالديهايد في 800 مل من 1x PBS أو قم بتخفيف 4٪ PFA 1:10 مع 1x PBS عن طريق إضافة 100 مل من 4٪ PFA إلى 900 مل من 1x PBS.
  3. استبدل PFA بنسبة 0.4٪ لتخزين أطول. استشر Microscopy Core لمعرفة مدة التخزين والمخازن المؤقتة.
  4. لتفكيك Flipwell ، أمسكها بكلتا يديك وقم بلف كل جزء لاصق من المكدس. سيتم تفكيك المكدس إلى قسمين: جزء واحد سيكون للغشاء والآخر سيكون الإدخال بدون الغشاء. تخلص من الملحق بدون الغشاء.
  5. قم بتدوير الملحق مع الغشاء وضعه مع توجيه الغشاء لأعلى. يمكن تسمية الغشاء بنقطة صغيرة أو x على حافة الغشاء لمعرفة الجانب الذي يحتوي على نوع الخلية.
  6. امسك الملحق من الحائط بملقط. اقطع الغشاء بعناية بشفرة مشرط وضعه داخل أنبوب سعة 1.7 مل أو زجاجة زجاجية صغيرة مع 500 ميكرولتر -1 مل من محلول PFA 0.4٪ -4٪.
  7. خضع إلى قلب الفحص المجهري لخطوات الجفاف والتصوير. تم وصف خطوات الجفاف في Beamer et al7.
  8. تخلص من PFA أو المثبتات الأخرى وفقا لسياسات التخلص من النفايات الخطرة الموصوفة للمؤسسة وإرشادات الصحة والسلامة.

14. طريقة قطرات كبيرة لتفكيك Flipwell للفحص المجهري متحد البؤر

ملاحظة: تم إنشاء طريقة جديدة لتلطيخ الأغشية وتصويرها. تم الحفاظ على مكدس إدخال الزراعة المشتركة سليمة مع خطوات التثبيت الأولي والنفاذية والحجب التي تم إجراؤها داخل أنبوب مخروطي 50 مل. تم استخدام الملصقات المناعية والفحص المجهري متحد البؤر لتصوير جانبي الغشاء. تم استخدام طريقة اللوحة المكونة من 12 بئرا التي تسمى حديثا لخطوات الحضانة الليلية ، وتم استخدام طريقة قطرات كبيرة لتلطيخ الجزء السفلي من الملحق المفكك. تم استخدام مكدس Z متحد البؤر لتصوير كلا الجانبين بالغشاء. تم وضع الأغشية الملطخة بين غطاءين زجاجيين دائريين ، وتم وضع المجموعة المحصورة في المنتصف بين حلقتين معدنيتين من الغرفة المستديرة المصنوعة تجاريا للصورة. تم استخدام المجهر متحد البؤر للمسح بالليزر متعدد الفوتون مع برامج التصوير التجارية.

  1. لغسل الغشاء ، ضع كومة إدراج الزراعة المشتركة مباشرة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وأضف 15 مل من PBS المعقم أو اغسل كل جانب على حدة (موضح أدناه).
  2. استنشاق DMEM وأضف 300 ميكرولتر من PBS المعقم إلى الجانب القمي. استنشاق PBS وقم بإزالة المكدس بعناية من طبق بتري.
  3. اقلب Flipwell وأضف 300 ميكرولتر من PBS إلى RPMI المواجه الآن لأعلى لمكدس FCI. استنشاق برنامج تلفزيوني.
  4. باستخدام علامة مقاومة للمذيبات ، قم بتسمية الجانب العلوي والسفلي للمكدس لمعرفة الجانب الذي يحتوي على نوع الخلية.
  5. ضع Flipwell داخل أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. أضف 15 مل من PFA المعقم بنسبة 4٪ كمخزن مؤقت للتثبيت الأولي لمدة 10 دقائق. إذا كانت هناك حاجة إلى حضانة ليلية ، فاستبدل 15 مل من 0.4٪ PFA في PBS ، وقم بتغطيتها واتركها طوال الليل.
  6. للمضي قدما في التلوين المناعي ، قم بتوفير مساحة مقعد لطريقة القطرات الكبيرة.
    قم بتمزيق قطع 10 × 14 بوصة من الغلاف البلاستيكي وقم بتثبيتها على المقعد في الزوايا لإنشاء سطح أملس.
  7. باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، قم بإنشاء قطرة كبيرة تحتوي على 200 ميكرولتر من PBS. قم بلف مجموعة الإدخال لفصلها في الإدخالات.
  8. باستخدام علامة مقاومة للمذيبات ، ضع نقطة صغيرة بالقرب من حافة جانب واحد من الغشاء لمعرفة نوع الخلية المستخدم في التلوين والتصوير.
  9. قم بإزالة أي حشية سيليكون متبقية من قاع الإدخال إذا كان الملحق مع الغشاء لا يزال يحتوي على أي غراء متبقي. يتم ذلك للتأكد من بقاء الملحق في وضع مستقيم للخطوات أدناه.
  10. ضع بعناية مكدس FCI (مع خلايا THP-1) فوق قطرة كبيرة 200 ميكرولتر من PBS. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية إلى الجانب العلوي مع الخلايا الظهارية للقولون واحتفظ بها لمدة 10 دقائق.
    1. لتحضير المخزن المؤقت للنفاذية ، استخدم 0.1٪ v / v Triton-X100 في PBS.
  11. شفط وإضافة 200 ميكرولتر من PBS. كرر هذا الغسيل 2x. قم بإنشاء قطرة جديدة مع 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر.
    1. لعمل مخزن مؤقت للحجب ، أضف 250 ميكرولتر من مصل الماعز العادي في 5 مل من 1x PBS (مصل 5٪ نهائي). أضف 15 ميكرولتر من Triton-X100 (النهائي 0.3٪ v: v). تخلط جيدا وتخزن في درجة حرارة 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام.
  12. ضع الملحق أعلى المخزن المؤقت للحظر. كتلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنشق PBS من الجانب القمي وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحجب إلى الجزء العلوي من الملحق. كلا جانبي الغشاء جاهزان الآن لتلطيخ الأجسام المضادة بين عشية وضحاها.

15. تلطيخ الفلورسنت المناعي (IF)

ملاحظة: يتم التلوين طوال الليل باستخدام طريقة صفيحة 12 بئر أو على مقاعد البدلاء باستخدام طريقة قطرات كبيرة.

  1. قم بإعداد الأجسام المضادة اللازمة لاستخدامها لتلطيخ جانبي الغشاء طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو على المقعد عند RT. قم بتخفيف جميع الأجسام المضادة 1: 100 في 1٪ BSA في PBS. بدلا من ذلك ، اتبع توصيات الشركة المصنعة وقم بتحسين التلوين لتحديد التركيزات المثالية ومخزن تخفيف الأجسام المضادة.
  2. طريقة القطرات الكبيرة
    1. قم بإنشاء مستطيل كبير باستخدام غلاف بلاستيكي أعلى المقعد وقم بلصق الزوايا لأسفل. ماصة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة فوق البلاستيك لتكوين قطرة كبيرة. ضع غشاء الإدخال لأسفل فوق القطرة الكبيرة.
    2. أضف 200 ميكرولتر من Ab الأساسي إلى الجزء العلوي من الملحق. احتضان في RT لمدة 2 ساعة.
  3. طريقة لوحة 12 بئر
    1. إذا كنت تستخدم طريقة لوحة 12 بئرا طوال الليل ، أضف 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي إلى الجزء العلوي من الملحق.
    2. أضف 300 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي إلى بئر لوحة 12 بئرا. ضع الملحق داخل اللوحة المكونة من 12 بئر جيدا فوق القطرة. غطي الطبق بغطاء وضعيه على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  4. عند اكتمال التلوين ، اغسل جانبي الغشاء باستخدام PBS. باستخدام ماصة وطرف 200 ميكرولتر ، اشطف بعناية الجانب السفلي من الملحق 3x ب 200 ميكرولتر من PBS. بالنسبة للجزء العلوي من الملحق ، اغسل بإضافة 200 ميكرولتر من PBS إلى الأعلى ، والشفط ، وتكرار الغسيل 3x.
  5. قم بإعداد جميع الأجسام المضادة الثانوية (يرجى الاطلاع على جدول المواد للأجسام المضادة المحددة المستخدمة) وفقا لتوصيات الشركة المصنعة أو تخفيف 1: 1000 في 1٪ BSA في PBS أو غيرها. يجب أن يتم تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية في الظلام. استخدم صندوقا من الورق المقوى أو درجا من الخزانة لخلق بيئة خالية من الضوء.
  6. باستخدام طريقة قطرات كبيرة أو طريقة لوحة 12 بئرا ، قم بإعداد طبق معقم جديد. احتضان لمدة 2 ساعة في RT في بيئة مظلمة. اغسل كما هو موضح في 15.4.

16: التحضير للتصوير متحد البؤر

  1. إذا لم يتم تسمية الغشاء بعد كما هو موضح في الخطوة 14 ، فقم بتسميته لمعرفة موقع نوع الخلية. ضع علامة صغيرة (نقطة ، x ، فحص ، إلخ) بعلامة مقاومة للمذيبات في أي مكان (يفضل الحافة).
  2. قم بإزالة زلات الغطاء المستديرة بعناية من حاوية التخزين وضعها برفق على سطح المقعد.
  3. تمييع DAPI في برنامج تلفزيوني عند تخفيف 1: 100. لتوزيع DAPI مع موزع القطرات ، أضف 1-3 قطرات إلى منتصف شريحة الغطاء. خلاف ذلك ، قم بماصة 1-3 قطرات من DAPI في منتصف زلة الغطاء.
  4. امسك الملحق بملقط. اقطع الغشاء بعناية بشفرة مشرط بحركة دائرية على طول الطريق حول الحافة / الحافة السفلية. لا تدع الغشاء يسقط على المقعد. ضع الملحق البلاستيكي على المقعد وأمسك الغشاء بملقط أثناء قطع الألياف النهائية بشفرة المشرط.
  5. ضع الملحق لأسفل أعلى DAPI. قم بتوزيع 1-3 قطرات من DAPI (تخفيف 1: 100) إلى الجزء العلوي من الغشاء بحيث يحتوي جانبي الغشاء على DAPI.
  6. ارفع غطاء الجولة الثانية بالأصابع (ارتد معدات الوقاية الشخصية). لا تستخدم الملقط لأن انزلاق الغطاء هش للغاية.
  7. قم بمحاذاة انزلاق الغطاء الثاني فوق زلة الغطاء الأولى وخفضه بعناية أعلى الغشاء.
  8. باستخدام علامة مقاومة للمذيبات ، قم بتسمية جانب انزلاق الغطاء بعناية إذا لزم الأمر لترميز نوع الخلية / الاتجاه (اختياري). إذا تم تصنيف الغشاء ، فتخط هذه الخطوة.
  9. اعتمادا على عدد الأغطية المراد تصويرها وعدد الحلقات المعدنية المتاحة ، قم إما بتركيب الأغطية بين الحلقات المعدنية المصنوعة تجاريا لتثبيت الأغطية المستديرة معا للتصوير أو تخزينها في الظلام حتى التصوير.
  10. للتصوير ، قم بتركيب زلة الغطاء مع الغشاء بين الحلقات المعدنية لغرفة الخلية وضعها في حامل المجهر متحد البؤر. اتصل بنواة الفحص المجهري متحد البؤر قبل معرفة الحامل الذي قد يكون مطلوبا لتصوير زلات الغطاء المستديرة.
  11. عندما تكون جاهزا للتصوير ، لف كل شطيرة بورق الألمنيوم واصطحبها إلى المنشأة.
  12. باستخدام ميزة Z-stack ، قم بمسح كل جانب من غشاء على حدة باستخدام الطول الموجي المناسب اعتمادا على الفلوروفورات المستخدمة. اقلب وصورة الجانب الثاني. لتخزين الأغطية ، احتفظ بها في الظلام عند 4 درجات مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحديد الأهمية البيولوجية لمزارع Flipwell المشتركة لبكتيريا الأمعاء وظهارة القولون والبلاعم ، عالجنا الثقافات المشتركة باستخدام sepiapterin (SEP) ، وهو معدل لعملية التمثيل الغذائي للأرجينين ، لتعزيز إنتاج أكسيد النيتريك9،10،11 مقارنة ب DMSO الضابط. حددنا آثار معالجة SEP على كل مكون من مكونات المزارع المشتركة باستخدام المجهر الفلوري المناعي (IF) والفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM). أظهر التلوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لإعادة إنشاء بنية الغشاء المخاطي للأمعاء في المختبر ، قمنا بتصميم نظام ثقافة مشتركة بسيط يتكون من طبقات طبقية من بكتيريا الأمعاء والخلايا الظهارية القولونية المنتجة للمخاط والضامة. سمح لنا نظام الزراعة المشتركة متعدد هذا بدراسة آثار الحديث المتبادل بين الإفرازات البكتيرية وظهارة الأمعاء والبلاعم على تحفيز إعادة البرمجة المناعية وآليات الدفاع عن الغشاء المخاطي.

أحد التحذيرات المهمة لإنشاء 3D Flipwells هو أن التجميع يجب أن يتم في بيئة معقمة ، متبوعا بال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح. يخلي المؤلفون بموجب هذا مسؤوليتهم عن جميع الضمانات ، سواء كانت صريحة أو ضمنية ، إلى أقصى حد يسمح به القانون. لا يتحمل المؤلفون تحت أي ظرف من الظروف المسؤولية ، سواء بموجب أي قانون أو عقد أو ضرر أو أي نظرية قانونية أخرى ، عن أي أضرار خاصة أو عرضية أو غير مباشرة أو عقابية أو متعددة أو تبعية تنشأ عن أو تتعلق باستخدام الأدوات في بناء Flipwells ، واستخدام كواشف BSL ، وخطوط الخلايا ، والمزارع البكتيرية ، واستخدام نظام Flipwell في بيئة لاهوائية في غرفة لاهوائية. يشمل هذا الحد من المسؤولية، على سبيل المثال لا الحصر، أي طريقة غير محددة لاستخدام Flipwell غير موصوفة صراحة هنا.

شكر وتقدير

يعرب المؤلف الرئيسي عن خالص امتنانه للدكتورة ساوري فوروتا لمهاراتها الإرشادية الرائعة ، والتوجيه والدعم المستمر عبر المسافات الطويلة ، وتصميم المشروع الماهر والمستمر الذي يعزز فرص التعلم الرائعة. يشكر المؤلفون أيضا الدكتورة فاندانا شارما على خبرتها وتوجيهها في علم الأحياء الدقيقة والدكتور فياني آر فرناندو على تحضير بلاعم THP-1.  بالإضافة إلى ذلك ، يشكر المؤلفون الدكتورين أندرو كلاينهينز وويليام تي غانينج في مرفق الفحص المجهري الإلكتروني ، وكاساندرا زامورا وكريستين كيرشباوم في مركز الأجهزة في جامعة توليدو على الاقتراحات البناءة للتصوير الكهرومغناطيسي. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء التشغيل من حرم جامعة توليدو للعلوم الصحية ، وكلية الطب وعلوم الحياة ، وقسم بيولوجيا السرطان إلى SF ؛ منحة إعادة البحث عن السرطان في أوهايو (المشروع #: 5017) إلى S.F ؛ جائزة جمعية البحوث الطبية (مؤسسة توليدو ، # 206298) إلى SF ؛ منحة باحث جمعية السرطان الأمريكية (RSG-18-238-01-CSM) إلى S.F ؛ ومنحة أبحاث المعهد الوطني للسرطان (R01CA248304) إلى SF.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نسبة PFA 0.4٪ (انظر الوصفة في المواد الكواشفة والمحلل)وصف في النص
ماصة مصلية بسعة 10 ملكورنينج4488
لوحة TC ذات 12 بئر,  Costarكورنينج3513
أنابيب مخروطية بحجم 15 مل، SpectraTubeالقلوية العلميةC2715
200 وميكرو؛ نصائح  يو إس إيه ساينتيفك1111-1700
إدخالات ب 24 بئر - إدخالات الزراعة لألواح 24 بئرا، PET 0.4 وميكرو؛ m براندتك ساينتيفك782710
فليب ويل ثلاثي الأبعاد جاهزة، معقمة بالأشعة فوق البنفسجية صنع في المختبر
4٪ PFA (انظر الوصفة في المواد المكتشفة والمحاليل)وصف في النص
مخزون سيبيبتيرين بسعة 50 ملليمتر (SEP، انظر الوصفة في قسم المواد المخلولة)المسيرة المهنية في شركة خنان للكيماوياتCAS#: 17094-01-8
أنابيب مخروطية بحجم 50 ملغرينر بيو-ون227261
ماصة مصلية بسعة 5 ملكورنينج4487
70-95٪ إيثانول (كحول إيثيل)مختبرات ديكون04-355-151
رقائق الألمنيومفيشر ساينتيفك01-213-100
إبر تغذية، عيار 20 عيار 1.5" الطول، الاستخدام الواحد  فيشر ساينتيفك01-208-87
مخزن تخفيف الأجسام المضادة (انظر الوصفة في المواد الكيميائية والمحلل)وصف في النص
غرفة خلايا أتوفلور ثيرموفيشر ساينتيفيكA7816
شريط المعقمفيشر ساينتيفك15-901-111
سلالات Bacillus subtilis wt (3A1T) في مخزون الجلسرول ()مركز الباكيليوس للمخزون الجيني (https:// bgsc. org/
قفازات BioGrip الخالية من بودرة النتريل الوردي الخالية من اللاتكسالتصنيع عالي الجودةP2810
مخزن الحظر (انظر الوصفة في مادة المواد المختصة والمحاليل - 10٪ مصل ماعز عادي في PBS)وصف في النص
مخزن الحظر (انظر الوصفة في المواد المختصة والمحاليل)وصف في النص
مجهر برايتفيلد (نيكون أو ما يعادله) إكليبس TS2نيكونTS2
خلايا كاكو-2ATCCHTB-37
حاضنة زراعة الخلايا، 37&00; C، 5٪ ثاني أكسيد الكربون (Eppendorf CellXpert)إبندورف6734010015
الطرد المركزي (إبندورف، طرد المركزي 5804/5804 R أو ما يعادلهإبندورف22622501
أنابيب الطرد المركزي 50 مل SpectraTubeالقلوية العلميةC2750
إدخالات الزراعة للوحة ذات 12 بئر، PET، 0.4 وميكرو؛ م، معقمبراندتك ساينتيفك، إدراج براند 2 في 1، بيو-سيرت782730
وسيط تركيب DAPI VectaShieldمختبرات فيكتورH-1000
طبقات بتري عميقة، 100 × 25 مم طبق بتري قابل للتكديس من البوليسترين العميق، معقم وغير متقم;يو إس إيه ساينتيفك8609-0625
دروموند بيبيت إيد XPدروموند 4-000-101
جهاز طرد مركزي من نوع Eppendorf 5804 مع دوار دلو متحرك لأنابيب مخروطية بحجم 50 ملإبندورف22622501
ملقط، من الفولاذ المقاوم للصدأ، جهاز معقم معقم، مجموعات 2xVWR82027-438
ملقط، من الفولاذ المقاوم للصدأ، جهاز تعقيم معقم، مجموعات مرتين، ملقط عيناتVWR82027-438
قارورة زجاجية بحجم 500 ملكورنينغ 4980-500
مقياس الهيماسيتومتر (نويباور مع انزلاقات تغطية)ثيرمو فيشر العلمي50-312-90
خلايا HT-29-MTX-E12ميليبور سيغما12040401
قلم مناعي (اختياري)فيشر ساينتيفك4021761EA
قفازات مقاومة للقطع أو قفازات مقاومة للقطع (اختياري)متجر الأدوات أو أمازون
شريط المختبر أو شريط الشحنفيشر ساينتفيك 159015R
غطاء المحرك ذو التدفق الطبقي 1300 سلسلة A2 BSC الفئة IIثيرموفيشر ساينتيفيك1375
غطاء تدفق طبقي مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية SterilGARDشركة بيكرSG403A-HE
إثبات المذيب بعلامات العلامةVWR52877-310 أو 95042-566
وسائط خلايا Caco-2 (معتمدة على DMEM عالي الجلوكوز، انظر الوصفة في Reagents and Solutions)موضح في  نص
وسائط لخلايا HT-29 (DMEM عالي الجلوكوز، انظر الوصفة في المواد المختصة والمحاليل)وصف في النص
وسائط لخلايا THP-1 (RPMI، انظر الوصفة في الكواشف والمحلول)وصف في النص
أنبوب الطرد المركزي الدقيق، 1.7 مل، معقم القلوية العلميةC3017-ST
أنابيب الطرد المركزي الدقيقثيرمو فيشر3451
وسائط ميلر LB (انظر الوصفة في الكواشف والمحلل)سيغما-ألدرتش  L3522
كماشة بأنف الإبرة، مجموعتانمتجر الأدوات أو أمازون
قفازات خالية من مسحوق النيتريل من اللاتكس أورليا مذهلةميدسيكي92885
أغطية أطباق بيتري، طبق معقم من فالكون بتري بطراز 100x15 ممشركة كورنينج351029
أسيتات فوربول ميريستات (PMA) (100 ng/&mu؛ l، انظر الوصفة في Reagents and Solutions) إنفيفوجينTlrl-pma
أطراف بيبت (10 وميكرو؛ ل، 200 وميكرو؛ l، 1000 وميكرو؛ l) نقطة نقية أو ما يعادلهاAlkali Scientific ST1010-CS، ST1200-CS، ST1000-CS
بلاستيكيالبقاله
محلول كولاجناز بيوريكول يعمل (100 وميكرو؛ g/mL)مصفوفة حيوية متقدمة5005-100ML
انزلاقات الغطاء الدائري #1 أونصة (زجاج كورنينج فلويت أو فيشربراند)كورنينغ أو فيشربراند50143822 أو 12-546-2 25CIR-2
شفرات المشرط، معقمة، قابلة للتخلص من موبيك أو ريشة #10AJ136 أو 2975#10
سبيابترين (SEP، 100 وميكرو؛ M، انظر الوصفة في مادة الكواشف والمحلول)المسيرة المهنية في شركة خنان للكيماوياتCAS#: 17094-01-8
حاضنة الاهتزاز مضبوطة على 220 دورة في الدقيقة 37 درجة؛ Cإيبندورف نيو برونزويك العلميM12990080
سيليكون لاصق لوكتيت شفاف IDH أو شفاف سيليكون بحري 3M مع رأس أنفلوكتايت أو 3M1745658 أو PN08019
ماصة قناة واحدة Eppendorf Research Plus، 200 وميكرو؛ lإبندورف
الماصات أحادية القناة (10 وميكرو؛ ل، 200 وميكرو؛ l، 1000 وميكرو؛ l)إبندورف2231001122
مقياس الطيف الفوتومتري NanoDropOneCثيرمو فيشر العلمي13-400-519
ماء منزوع الأيونات المعقم    
السيرين المعقم الفوسفات المعقم (PBS) بدون الكالسيوم أو المغنيسيومفيشر ساينتيفك  BSS-PBS-1X6
حقنة 3 مل أو 5 مل مع رأس لور-لوكدينار بحريني309585 أو 309603
خلايا THP-1ATCCTIB-202
أنابيب نقل، معقمةفيشربراند13-711-20
ترايتون X-100ميليبور سيغماX100
محلول تريبان الأزرقVWR97063-702
Trypsin-EDTA 0.25٪ثيرمو فيشر العلمي25200-056
مناديل كيميابس بروفيشنال مع لينت جارد Anti-Stat بوليشيلدكيمبرلي-كلارك34120
<الأجسام المضادة الأولية>قوية: 
القرص المعادي للإنسان CD163أبكام156769
CD68 المعادي للإنساننوفوس بيولوجيالزNB100-683-0.1 ملغ
CD80 المضاد للإنسان، E3Q9Vتقنيات الإشارات الخلوية15416
ضد الإنسان CK20 تقنيات الحياةPA5-82875
MUC2 المضاد للإنسان (996/1)ثيرموفيشرMA5-12345
<قوية>الأجسام المضادة الثانوية:
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (ل CD80 و CK20)ثيرموفيشرA11008
Alexa Fluor 594 Mag مضاد للفأر (ل-MUC2 و CD68 أو CD163)ثيرموفيشرA11005
Reagents and Solutions:   
<قوي>كاكو-2 متوسط:
DMEM مع ارتفاع الجلوكوز (4.5 جرام/لتر) و1٪ (v:v) جلوتا ماكس؛ثيرمو فيشر العلمي35050061
FBS 10٪ (v:v) معطل الحرارةسيغماF2242-500ML
الأحماض الأمينية غير الأساسية 1٪ لوسط كاكو-2ثيرمو فيشر العلمي11140076
التهاب العقدي بالقلم 1٪ (v:v)سيغماF2242-500ML
HT-29-MTX متوسط
DMEM مع ارتفاع الجلوكوز (4.5 جرام/لتر) و1٪ (v:v) جلوتا ماكس؛ثيرمو فيشر العلمي35050061
FBS 10٪ (v:v) معطل الحرارةسيغماF2242-500ML
HEPES (تركيز نهائي 10 مللي مول)ثيرمو فيشر العلمي15630080
التهاب العقدي بالقلم 1٪ (v:v)سيغماF2242-500ML
<قوي>THP-1 متوسط:
مصل البقر الجيني المعطل بالحرارة FBS (10٪ v:v)سيغما & nbsp;F2242-500ML
الجلوكوز (تركيز نهائي 4.5 جم/لتر)ثيرمو فيشر العلميA249001
غلوتا ماكس 1٪ (v:v)  تركيز نهائي 2 مللي مولثيرمو فيشر العلمي35050061
HEPES (تركيز نهائي 10 مللي مول)ثيرمو فيشر العلمي15630080
التهاب العقدي بالقلم 1٪ (v:v)سيغماF2242-500ML
معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI)-1640 متوسطثيرمو فيشر العلمي11875119
بيروفات الصوديوم (تركيز نهائي 1 ملليمتر)ثيرمو فيشر العلمي11360070
<سترونغ>بيوريكول يعمل بمحلول كولاجناز (تخفيف إلى 1:30 100 وميكرو؛ g/ml):
بيوريكول 3 ملغ/مل 1:30 إلى 100 وميكرو؛ g/ml مصفوفة حيوية متقدمة5005-100ML
المياه غير المؤيدة المعقمة
<سترونغ>إل-سبيبتيرين (50 ملليمتر):
إل-سيبيبتيرين (SEP)المسيرة المهنية في شركة خنان للكيماوياتCAS#: 17094-01-8
<محلول أسيتات ميريستات قوي>فوربول (PMA، 5 ملغ/مل)إنفيفوجينTlrl-pma
BSA 1٪ مصل البقر ألبومين  سيغما-ألدرتش5470
DMSO سيغما & nbsp;D2650
ميلر LBسيغما-ألدرتش  L3522
المصل الطبيعي من نفس النوع الذي يحمل الجسم المضاد الثانويسيغما & nbsp;NS02L-1ML
بارافورمالدهيدسيغما-ألدرتش441244

المراجع

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الاستزراع المشترك ثلاثي الأبعادنموذج المخاطية المعويةالسيكريتوم البكتيرياستقطاب الخلايا المناعيةخلايا الظهارة القولونيةاستقطاب الخلايا البلعميةتشكل الغشاء الحيويالعلاج بالسيبياپتيرينالتلوين المناعي الفلوري
3D Flipwell Engineering لتطوير أنظمة غير متزامنة للعلاجات السمية والمناعية في الخلايا البكتيرية والأمعاء والمناعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.