مقالة منهجية

تحسين وتقييم الرسم اليدوي والغزل الرطب لإنتاج ألياف حرير العنكبوت المؤتلف

DOI:

10.3791/68714

⸱

يوليو 29, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, 2Department of Chemistry, Dalhousie University, 3School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر البروتوكول المقدم مجموعة متنوعة من الطرق لتحسين إذابة بروتينات الحرير المؤتلفة للغزل. اختبار قابلية الدوران عن طريق الرسم اليدوي ؛ إنتاج ألياف طويلة ومستمرة مع الغزل الرطب الآلي ؛ وتقييم التشكل والمحاذاة الجزيئية والسلوك الميكانيكي والمحتوى الهيكلي الثانوي للبروتين للألياف أو داخلها نسبيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشتهر حرير العنكبوت بخصائصه الميكانيكية ، مع القوة العالية المميزة ، أو قابلية التمدد العالية ، أو مزيج من هذه الأشياء يؤدي إلى صلابة عالية. تنتج أنثى العنكبوت النموذجية التي تنسج الجرم السماوي سبعة أنواع مختلفة من الحرير ، يتم نسج كل منها عادة من بروتين (بروتينات) نوع خاص ومصمم ميكانيكيا لوظيفة بقاء مميزة. يوفر إنتاج حرير العنكبوت المؤتلف طريقا واعدا للحصول على هذه المواد ، والتحايل على التحديات في الحصول على كميات كبيرة من الحرير الطبيعي وتوفير مزايا في السماح بتخصيص البروتين ، على سبيل المثال ، من خلال الطفرات الموجهة بالموقع أو بناء البروتين الانصهاري.

في البروتوكول المقدم ، نحدد منهجية لتقييم ملاءمة البروتين للغزل من خلال كل من أساليب الرسم اليدوي والغزل الرطب. بدءا من مسحوق البروتين المجفف بالتجميد المنقى بشكل مناسب ، يتم تفصيل طرق تحسين حالة البروتين المذاب الأولية لتوفير حالة "مخدر الغزل" عالية التركيز. بعد ذلك ، تتم مقارنة أساليب الرسم اليدوي والغزل الرطب ، بما في ذلك مناقشة طرق تعديل سلوك الألياف باستخدام سحب ما بعد الدوران كجزء من عملية الغزل. ثم يتم تفصيل سير العمل النموذجي لتوصيف ألياف الحرير الناتجة واتخاذ قرار بشأن ظروف الغزل التي من المرجح أن تكون مثمرة ، بما في ذلك الفحص المجهري البصري لتقييم قطر الألياف وتوحيدها ؛ الفحص المجهري الضوئي المستقطب لتقدير درجة المحاذاة الجزيئية (أعلاه) التي يتم تحقيقها داخل الألياف ؛ اختبار الشد لتقييم القوة والقابلية للتمدد ومعامل يونغ والمتانة ؛ والفحص الطيفي بالأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) لتقييم الهيكلة الثانوية للبروتين داخل الألياف.

أثبت هذا البروتوكول أنه مناسب للعديد من بروتينات حرير العنكبوت المؤتلف المختلفة بناء على المجالات المتكررة وغير المتكررة من الحرير الأسيني (التغليف). الحرير الكمثري وبروتينات الاندماج التي تشتمل على الحرير الأسيني فورم و / أو الكمثري و / أو الحرير الكبير (خط السحب). يتم توفير قابلية تطبيق أوسع من خلال العديد من الخطوات المميزة التي يمكن من خلالها تغيير الظروف والمعلمات لتناسب سلوك البروتين الفردي ولتحقيق الاختلافات في النتائج الوظيفية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنتج العناكب الحرير لمختلف المهام المتخصصة ، بما في ذلك بناء الويب ، والتقاط الفريسة ، وحماية البيض1. يظهر حرير العنكبوت خصائص ميكانيكية رائعة تتجاوز تلك الموجودة في معظم المواد الطبيعية والاصطناعيةالمعروفة 2 ، مما يدفع إلى بذل جهود كبيرة نحو إنتاج مواد حرير العنكبوت الهندسية والمحسنة للتطبيقات الصناعية والطبية الحيوية المتنوعة. يتكون Spidroin ، البروتين الذي يشكل حرير العنكبوت ، من مجال كبير نسبيا ومتكرر يحده مجالات N-terminal و C-terminal غير المتكررة3 ، مع ربط الخصائص الميكانيكية الفريدة لبعض أنواع الحرير بتكرار الزخارف القصيرة داخل المجال المتكرر4،5،6. على عكس دودة القز التوت المزروعة تجاريا (Bombyx mori) ، والتي تنتج كميات كبيرة من الحرير في شكل شرنقة متسقة مناسبة للحصاد ، فإن العناكب هي بطبيعتها كائنات أكل لحوم البشر والإقليمية التي تنتج الحرير بكميات محدودة ، مما يشكل تحديا للإنتاج الزراعي والجمعالزراعي 7. بالنظر إلى هذه القيود ، تم تطوير إنتاج حرير العنكبوت المؤتلف كبديل أكثر جدوى واستدامة للحصول على كميات كافية من حرير العنكبوت للتطبيق بشكل يمكن التحكم فيه.

يتطلب إنتاج حرير العنكبوت المؤتلف اختيار مضيف مناسب للتعبير عن البروتين. تم التعبير عن حرير العنكبوت في أنظمة مضيفة مختلفة ، بما في ذلك البكتيريا8،9 ، والخمائر10،11 ، وخلايا الحشرات12 ، والنباتات13،14 ، وخلايا الثدييات15،16 ، مع كون الإشريكية القولونية هي النظام المضيف الأكثر استخداما. تمثل الأوزان الجزيئية العالية للسبيدروينات ، والتي يمكن أن تصل إلى 700 كيلو دالتون7 ، تحديات كبيرة للتعبير عن التركيبات كاملة الطول. لإنتاج حرير العنكبوت المؤتلف بخصائص قابلة للمقارنة أو محسنة بالنسبة لتلك الموجودة في حرير العنكبوت الطبيعي ، فإن الإستراتيجية الأساسية المستخدمة هي التعبير عن المتغيرات المقطوعة ، مثل التركيبات ذات عدد محدود من وحدات التكرار (مع أو بدون مجالات غير متكررة) ، والوهم المكون من مجموعات من أنواع مختلفة من الحرير ، والحرير الهجين المدمجة مع البروتينات غير الحريرية. على سبيل المثال ، تم التعبير عن سبيدروين أمبولات رئيسي مؤتلف (284.9 كيلو دالتون) بنجاح في بكتريا قولونية معدلة تمثيل غذائي، وأظهر الحرير الناتج خصائص ميكانيكية مماثلة لتلك الموجودة في الحرير الطبيعي الرئيسي9. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت ألياف الحرير المصممة هندسيا المكونة من وحدتين متكررتين من spidroin الكمثري ووحدتين متكررتين من spidroin aciniform قابلية تمدد فائقة لأي من الحرير الكمثري أو الحرير الأسيني المكون ، مقارنة بالحرير الطبيعي17.

يتيح إنتاج البروتين المؤتلف أيضا الدمج المباشر للببتيد الوظيفي أو شرائح البروتين في بروتينات الحرير ، مما يتيح تصنيع المواد الحيوية ذات الخصائص المصممة خصيصا لتطبيقات محددة. على سبيل المثال ، أدى الاندماج الجيني والكيميائي لأشكال ربط الخلايا RGD مع حرير معدل وراثيا مشتق من سبيدروينات أمبولات رئيسية إلى أفلام عززت بشكل كبير التصاق الخلايا الليفيةوتكاثرها 18. في دراسة منفصلة ، تم إثبات أن بنية الحرير الهجين المكونة من شكل ربط عامل نمو الأعصاب β(NGF) مدمج ببروتين خيميري يتألف من وحدتين متكررتين من أسينيفورم سبيدروين والمجال الطرفي C لسبيدروين أمبولات رئيسي لدعم نمو الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية والتمايز19.

نظرا للتعبير الناجح عن بروتين الحرير المؤتلف وتنقيه ، يمكن معالجته بعد ذلك إلى أشكال مختلفة مثل الهلاميات المائية والأفلام والألياف والجسيمات النانوية والرغوة والإسفنج ، اعتمادا على التطبيق المقصود20،21. لتمكين إنتاج ألياف الحرير الاصطناعية ، تم تطوير طرق الغزل التي تحاكي جوانب معينة من عملية غزل الألياف الطبيعية المعقدة للغاية والمنظمة بإحكام للعناكب. في الحرير الضخم الطبيعي ، يتم إنتاج السبيدروينات بواسطة الخلايا الظهارية في الغدة الطموحة الرئيسية ويتم تخزينها في حالة قابلة للذوبان داخل التجويف بتركيزات عالية (تصل إلى 50٪ (وزن / حجم))22 ، مما يشكل مخدر دوارة مائية. عندما يتحرك المخدر الدوار عبر قناة الغزل ، فإنه يواجه تغيرات في الأس الهيدروجيني وتركيز الأيونات ومحتوى الماء وقوى القص من كل من تضييق القناة وعملية البولتروزيون الليفية ، مما يؤدي إلى تحويل بروتينات الحرير السائل إلى ألياف صلبة23،24. وبالتالي ، فإن تحديد مذيب مناسب يمكنه إذابة أو تعليق بروتينات الحرير المؤتلفة بتركيز عال لتشكيل مخدر غزل هو خطوة أولى حاسمة في عملية غزل الألياف الاصطناعية.

تم استخدام مجموعة واسعة من المذيبات لصياغة مخدرات الغزل لبروتين الحرير ، وقد ثبت أن اختيار المذيب يؤثر على تكوين الألياف والخصائص الميكانيكية25،26. وبالتالي ، فإن النظر بعناية في اختيار مذيبات المنشطات أمر ضروري لتحسين خصائص الألياف الناتجة. يمكن صياغة المنشطات الغزلية باستخدام مذيبات عضوية أو مائية ، مثل 1،1،1،3،3،3-سداسي فلورو إيزوبروبانول (HFIP) 27 ، سداسي فلورو أسيتون (HFA) 28 ، مخاليط حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) و 2،2،2-ثلاثي فلورو إيثانول (TFE) 26 ، حمض الفورميك29 ، وفوسفات الصوديوم / عازلةتريس 30. نظرا لأن قابلية ذوبان البروتين تتأثر عادة بعوامل مثل الأس الهيدروجيني والقوة الأيونية والتركيز ، فإن تحديد مذيب المنشطات المناسب ينطوي عموما على تقييم منهجي للمذيبات المختلفة ، وتحسين تركيزات الأس الهيدروجيني والبروتين ، وفي بعض الحالات ، استخدام مخاليط المذيبات والماء لتحديد ظروف المنشطات المثلى للغزل. علاوة على ذلك ، تعد لزوجة المنشطات الدوارة معلمة مهمة يجب تقييمها قبل عملية الغزل لأن محلول المنشطات عالي اللزوجة قد يعيق تدفق السوائل أثناء الدوران ، في حين أن المنشطات غير اللزجة بشكل كاف لن تكون مناسبة عادة لتكوين الألياف31،32. وتجدر الإشارة إلى أن استخدام ظروف المنشطات القاسية قد يغير بنية البروتين عند التعرض لفترات طويلة. لذلك ، يظل تطوير مذيبات المنشطات الصديقة للبيئة مجالا نشطا للبحث.

الرسم اليدوي والغزل الرطب طريقتان شائعتان لغزل ألياف الحرير المؤتلف. تعتمد الخواص الميكانيكية للألياف المنتجة باستخدام كل طريقة بشكل كبير على ظروف الغزل نفسها وعلى معالجة ما بعد الدوران. الرسم اليدوي ، الذي يشار إليه أيضا باسم الغزل بالسحب ، هو طريقة بسيطة لإنتاج الألياف يتم فيها سحب الألياف من محاليل البروتينات المنقاة ، وعادة ما تستخدم طرف ماصة أو ملقط أو ملاقط ، متبوعا بتجفيف الهواء وتوصيفه33،34،35،36،37. في حين أن الرسم اليدوي يوفر نهجا ممتازا لفحص مجموعة متنوعة من ظروف تكوين ألياف الحرير بسرعة وتصنيف السلوك الميكانيكي للألياف الناتج بشكل عام ، فإن هذه التقنية ليست قابلة للتطوير بسهولة إلى ألياف مستمرة طويلة (أي بطول متعدد الأمتار). كبديل ، نستخدم الغزل الرطب ، والذي يطبق البثق المستمر لمخدر الغزل بسرعة ثابتة في حمام التخثر ، وعادة ما يكون مذيبا مائيا أو عضويا يتكون من خليط من الماء والإيثانول أو الميثانول9،15،31،38،39،40. يؤدي غمر المنشطات الدوارة في حمام التخثر إلى حدوث تلف سريع للبروتين ، مما يؤدي إلى تكوين ألياف مستمرة24. بعد ذلك ، يتم سحب الألياف من حمام التخثر بسرعة ثابتة ، إما مطابقة لمعدل البثق لتوفير ألياف مغزولة (AS) أو تخضع لسحب ما بعد الدوران لتوفير ألياف ما بعد الغزل (PS) التي عادة ما تكون لها خصائص ميكانيكية محسنة. عادة ما يتضمن سحب ما بعد الدوران تمدد الألياف إلى نسبة 2-8 أضعاف طولها الأصلي في الهواء ، في مذيب ، أو بعد غمر المذيبات ، مع مساهمة كل معلمة في خصائص ميكانيكية محددة15،17،31،38.

بينما يركز هذا البروتوكول على طرق الرسم اليدوي والغزل الرطب ، فمن المهم وضع هذه الأساليب في سياقها. تم الإبلاغ عن طرق الغزل الكهربائي لحرير العنكبوت المؤتلف من كل من الظروف المائية والعضوية ، مما يتيح إنتاج حصائر الألياف والألياف المحاذاة والخيوط ، مع وجود الألياف عادة على مقياس نانومتر في قطر41. يوفر هذا الميزة المحتملة للألياف النانوية ، والتحدي المقابل إذا كانت الألياف على نطاق ميكرون مطلوبة ، عادة مع متطلبات إجراء معالجة ما بعد الدوران للحث على التحول إلى هيكل β صفائح لتحسين الميكانيكا والتوافق مع المياه. تم الحصول على شرائط حرير العنكبوت المؤتلفة متعددة الأمتار بعرض وسمك على نطاق ميكرون عن طريق الغزل الجاف من المذيب العضوي42 ، مع إثبات حديث أن دمج أيون المعادن في مرحلة المنشطات الدورانية يحسن الميكانيكا43. الغزل القائم على Microfluidics44 ، بما في ذلك مزيج حديث من تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد مع مغازل الإبرة الدقيقة المصممة لتقليد المغزل الطبيعي45 ، مناسب لغزل ألياف الحرير المؤتلف التي يمكن التحكم فيها بدرجة عالية. على الرغم من التنوع الكبير في الطرق التي تم الإبلاغ عنها على أنها مناسبة لإنتاج ألياف الحرير (أو الشبيهة بالحرير) ، فإن البروتوكول الحالي يفصل إنتاج ألياف الحرير المؤتلفة عن طريق الرسم اليدوي والغزل الرطب حيث أثبتت هذه الأساليب أنها قابلة للترجمة إلى العديد من أنواع الحرير المؤتلف المختلفة في أيدينا وتوفر نقطة انطلاق قابلة للتتبع لتطوير المواد الحيوية والتقييم المقارن.

بعد غزل الألياف وجمعها ، يتم استخدام مزيج من التقنيات البصرية والميكانيكية والطيفية بشكل روتيني لتوصيف الخصائص بعد الغزل. توفر كل طريقة رؤى رئيسية حول عملية تكوين الألياف وارتباطها بأداء المواد. هنا ، نركز على مجموعة فرعية من هذه الأساليب ، مع ملاحظة أن هناك العديد من المنهجيات الأخرى التي توفر معلومات أساسية حول خصائص ألياف الحرير وأدائها. يستخدم الفحص المجهري البصري لتقييم مورفولوجيا الألياف ، مما يسمح بمقارنة أقطار الألياف المغزولة في ظل ظروف متطابقة ومتغيرة17،31،38،46. هذه التقنية مهمة أيضا لتحديد والقضاء على أجزاء الألياف التي بها عيوب أو شذوذ قبل التوصيف اللاحق. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفحص المجهري الضوئي المستقطب لتقييم درجة المحاذاة الجزيئية داخل الألياف ، حيث ترتبط المستويات الأعلى من المحاذاة عادة بالخصائص الميكانيكية المحسنة17،26،47. يتم إجراء التوصيف الميكانيكي من خلال اختبار الشد ، حيث يتم قياس منحنيات الإجهاد والإجهاد واستخدامها لتحديد المعلمات مثل قوة الشد ، وقابلية التمدد ، ومعامل يونغ ، والمتانة ، مما يوفر المعلومات الأساسية لتقييم ملاءمة الألياف في التطبيقات الهيكلية أو الطبيةالحيوية 17،33،48. يتم تطبيق التقنية النهائية التي يتم تناولها هنا ، التحليل الطيفي للأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه (FTIR) ، للتحقيق في التركيب الثانوي للبروتين ، لا سيما درجة تكوين β الألواح ، حيث يلعب هذا دورا مهما في استقرار الألياف والقوة الميكانيكية17،46،49. توفر هذه التقنيات معا فهما شاملا للتشكل والهيكل والسلوك الميكانيكي لألياف الحرير المنتجة بشكل مؤتلف.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، نفترض أن نقطة البداية هي مسحوق بروتين الحرير المجفف بالتجميد. عادة ما يكون هذا بروتين حرير العنكبوت المؤتلف في عملنا. يتم توفير نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1 ، مع كل خطوة من الخطوات الخمس التالية المفصلة أدناه: (1) تحضير المنشطات الدوارة وتحسينها. (2) الرسم اليدوي من ألياف الحرير أو الغزل الرطب ؛ (3) قطر الألياف والتقييم المورفولوجي بواسطة الفحص المجهري البصري ؛ (4) التقييم الميكانيكي عن طريق اختبار الشد ؛ و (5) تقييم الهيكل الثانوي بواسطة التحليل الطيفي FTIR.

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الخطوات الرئيسية في بروتوكول إنتاج ألياف بروتين حرير العنكبوت المؤتلف وجمعها وتوصيفها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تحضير المنشطات الغزلية وتحسينها

ملاحظة: لتحسين محلول مخدر الغزل الليفي ، حاول إذابة تركيزات متفاوتة من بروتين حرير العنكبوت المؤتلف في مذيبات مختلفة لتحضير محاليل المنشطات (الجدول 1). يجب استخدام المذيبات التي تذيب البروتين فقط ، مما يعطي محلول مخدر خال من الرواسب وواضح ، في محاولات غزل الألياف.

  1. تحضير المذيبات
    1. لصنع 8: 1: 1 TFA / TFE / H2O ، قم بقياس 800 ميكرولتر من TFA ، و 100 ميكرولتر من TFE ، و 100 ميكرولتر من الماء فائق النقاء من النوع 1 في أنبوب زجاجي داخل غطاء الدخان. تخلط جميع المكونات جيدا. قم بتغطية الأنبوب الزجاجي وقم بتغطيته بالبارافيلم لمنع تبخر المكونات المتطايرة.
      ملاحظة: قم دائما بإعداد محلول جديد لغزل الألياف.
      تنبيه: تعامل مع TFA و TFE بعناية ، TFA شديد التآكل ومتطاير ، في حين أن TFE قابل للاشتعال وسام. ارتد معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك القفازات ومعاطف المختبر ونظارات السلامة ، لمنع ملامسة الجلد وفرصة الاستنشاق.
    2. لصنع 3: 1: 1 TFA / TFE / H2O ، داخل غطاء الدخان ، قم بنقل 300 ميكرولتر من TFA ، و 100 ميكرولتر من TFE ، و 100 ميكرولتر من الماء عالي النقاء من النوع 1 إلى أنبوب زجاجي وخلط المكونات. قم بتغطية الأنبوب الزجاجي وقم بتغطيته بالبارافيلم لتقليل تبخر المكونات المتطايرة.
      ملاحظة: قم دائما بإعداد محلول جديد لغزل الألياف.
    3. لصنع 7: 3 HFIP / H2O ، امزج 700 ميكرولتر من 1،1،1،3،3،3-hexafluroro-2-propanol (HFIP) مع 300 ميكرولتر من النوع 1 ماء فائق النقاء لصنع محلول 1 مل. تحضير المحلول طازجا عند الحاجة.
      تنبيه: تعامل مع HFIP داخل غطاء الدخان وتجنب الاستنشاق أو ملامسة الجلد.
    4. لعمل 50 ملي مولار من فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، خذ 800 مل من الماء منزوع الأيونات في دورق وقم بإذابة 1.199 جم من فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2PO4- MW. 136. 09 جم / مول) و 7.173 جم من فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K2HPO4- MW. 174.18 جم / مول) فيه. امزج جميع المكونات جيدا واضبط درجة الحموضة في المحلول باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك ، قم بتعبئة الحجم إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
    5. لعمل 10 ملي مولار من المخزن المؤقت Tris-Cl (الرقم الهيدروجيني 8.0) ، قم بإذابة 1.21 جم من Tris-hydrochloride (MW. 157.60 جم / مول) في 800 مل من الماء منزوع الأيونات. اضبط الرقم الهيدروجيني باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وقم بتعبئة الحجم النهائي إلى 1 لتر بالماء منزوع الأيونات. قم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة.
    6. لعمل 20 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.0) ، في 450 مل من الماء منزوع الأيونات ، قم بإذابة 0.55 جم من أسيتات الصوديوم (MW. 82.03 جم / مول) و 0.02 م (6 مل) حمض الخليك. قم بتعبئة الحجم إلى 500 مل بالماء منزوع الأيونات وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
    7. لعمل 1 M coutrate phosphate buffer (درجة الحموضة 7.0) ، قم بإذابة 11.69 جم من فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na2HPO4- MW. 141.96 جم / مول) و 1.85 جم من حامض الستريك (MW. 192.12 جم / مول) في 400 مل من الماء منزوع الأيونات. اضبط درجة الحموضة في المحلول باستخدام حمض الهيدروكلوريك أو هيدروكسيد الصوديوم ، واضبط الحجم النهائي على 500 مل باستخدام الماء منزوع الأيونات.
    8. لصنع محلول حمض الفورميك - CaCl2 بنسبة 98٪ ، قم بتخفيف حمض الفورميك إلى 98٪ عن طريق خلط 98 مل من حمض الفورميك مع 2 مل من الماء منزوع الأيونات ليصبح المجموع 100 مل من المحلول. الآن ، أضف 4 جم من CaCl2 إلى 100 مل من محلول حمض الفورميك بنسبة 98٪ لتحضير 4٪ وزن / حجم من محلول حمض الفورميك CaCl2 . قم بتخزين المحلول في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: انظر الجدول 1. يجب استخدام المذيبات التي تذيب البروتين فقط ، مما يعطي محلول مخدر خال من الرواسب وواضح ، في محاولات غزل الألياف.
  2. تحضير محلول مخدر الغزل الليفي
    1. قم بوزن بروتين حرير العنكبوت المجفف بالتجميد وفقا للتركيز المطلوب (على سبيل المثال ، 10 مجم لمحلول 10٪ (وزن / حجم) في 100 ميكرولتر من المذيب) واخلطه مع الحجم المناسب من المذيب (على سبيل المثال ، 100 ميكرولتر لتركيز 10٪ (وزن / حجم)).
    2. دوامة الخليط حتى يذوب مسحوق البروتين تماما في المذيب.
    3. نظرا لأن قابلية ذوبان بروتين حرير العنكبوت تختلف باختلاف نوع المذيب والبروتين ، ابدأ بتركيز منخفض من البروتين (10٪ وزن / حجم) وقم بزيادة التركيز تدريجيا (25-30٪ وزن / حجم) حسب الحاجة.
    4. بعد الذوبان الكامل للبروتين ، قم بتقييم لزوجة محلول المنشطات نوعيا. إذا بدا محلول المنشطات غير لزج بدرجة كافية ، فقم بزيادة تركيز البروتين تدريجيا حتى يتم الحصول على محلول شفاف ولزج. استخدم الماء كمعيار مرجعي.
المذيباتتركيز البروتين (٪ - وزن / حجم)مرجع
8: 1: 1 TFA / TFE / H2O10 – 2519
3: 1: 1 TFA / TFE / H2O10 – 3026
7:3 HFIP/H2O15 – 3031
50 ملي مولار عازلة فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 7.5)10 – 2550
10 ملي مولار المخزن المؤقت Tris-Cl (الرقم الهيدروجيني 8.0)10 – 2034
20 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (درجة الحموضة 5.0)10 – 2549
1 M عازلة فوسفات سترات (درجة الحموضة 7.0)10 – 2551
98٪ حمض الفورميك - CaCl220 – 2552

الجدول 1: المذيبات الموصى بها وتركيزات البروتين لتحضير مخدرات الغزل الليفية.

2. غزل الألياف وجمعها

ملاحظة: ارجع إلى الشكل 2 للحصول على تصوير تخطيطي للرسم اليدوي والشكل 3 لتكوينات أجهزة الغزل الرطب المختلفة المفصلة أدناه.

figure-protocol-2
الشكل 2: الرسم اليدوي لألياف حرير العنكبوت. (أ) يتم إعداد إطار ورقي على شكل حرف C وتثبيته بشريحة زجاجية بشريط شفاف على اليسار وشريط على الوجهين على اليمين لتمكين سحب الألياف من اليسار إلى اليمين. (ب) توضع قطرة من مخدر الغزل على الشريط الشفاف، وتسحب ألياف واحدة يدويا إلى الشريط على الوجهين عبر فتحة الإطار على شكل حرف C باستخدام طرف ماصة بلاستيكية. (ج) يتم تثبيت الألياف على الإطار الورقي على الشريحة الزجاجية باستخدام شريط لاصق على الجانبين الأيسر والأيمن. (د ، ه) عرض توضيحي لعملية الرسم اليدوي التمثيلية (D) لحرير العنكبوت المؤتلف الذي يتم إذابته بشكل فعال في مخدر تدور و (E) الألياف الناتجة قبل تثبيتها بشريط لاصق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-3
الشكل 3: الغزل الرطب لألياف حرير العنكبوت. في جميع الحالات ، يتم وضع المنشطات الدوارة في حقنة زجاجية محكمة الإغلاق ويتم بثقها بمعدل ثابت باستخدام مضخة حقنة من خلال إبرة معدنية غير حادة (أي المغزل) في حمام تخثر (على سبيل المثال ، 95٪ إيثانول). (أ) يتم تجميع الألياف المغزولة على الأسطوانة 1 ، وتدور تحت تحكم الكمبيوتر بسرعة تتوافق مع معدل البثق. (ب) يتم التمدد بعد الدوران في الهواء عن طريق توجيه الألياف عبر الأسطوانة 1 وتجميعها على الأسطوانة 2 ، والتي تدور بمضاعفات سرعة الأسطوانة 1 (على سبيل المثال ، مضاعفة السرعة لنسبة سحب 2x). وبالمثل ، يمكن إنتاج الألياف (C) بعد غمر المذيبات (على سبيل المثال ، 40٪ من الإيثانول والماء وما إلى ذلك حسب المناسبة لحرير معين) عن طريق توجيه الألياف من الأسطوانة 1 إلى الأسطوانة 3 (مغمورة في حمام مذيب وتدور بنفس معدل الأسطوانة 1) قبل توجيهها إلى الأسطوانة 2 (الدوران بمضاعفات سرعة الأسطوانة 1 و 3) ؛ أو (D) في المذيب عن طريق توجيه الألياف من الأسطوانة 1 إلى الأسطوانة 3 (مغمورة في حمام مذيب وتدور بنفس معدل الأسطوانة 1) ثم إلى الأسطوانة 4 (مغمورة أيضا في المذيب وتدور بمضاعفات سرعة الأسطوانة 1 و 3) قبل التجميع على الأسطوانة 2 (السرعة المطابقة لسرعة الأسطوانة 4). يعني التكوين المعياري أنه يمكن اختبار التباديل المختلفة في ظروف غزل الألياف بسهولة ، وبالتأكيد لا تقتصر على الأربعة الموضحة بشكل تخطيطي هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الرسم اليدوي
    1. قم بإعداد إطار ورقي على شكل حرف C بنافذة مقاس 1 سم × 0.5 سم (الطول × العرض) وضعه على شريحة زجاجية (الشكل 2). قم بتثبيت الجزء العلوي من إطار الورق بالشريحة الزجاجية باستخدام شريط لاصق. قم بلصق شريط شفاف على ذراع واحد من إطار الورق لإنشاء سطح كاره للماء لترسيب محلول المنشطات وإرفاق شريط على الوجهين بالذراع المعاكس لتأمين الألياف.
    2. قم بإيداع 10-20 ميكرولتر من محلول المنشطات الدوارة على الشريط الشفاف في درجة حرارة الغرفة (22 ± 2 درجة مئوية).
    3. اغمر طرف ماصة بلاستيكية سعة 200 ميكرولتر في قطرة محلول المنشطات واسحبها عموديا من المحلول بسرعة ثابتة (~6 مم/ثانية)، مما يسمح بسحب الألياف من المحلول.
    4. قم بتوجيه الألياف المسحوبة يدويا عبر نافذة الإطار وقم بتثبيتها على الشريط على الوجهين. جفف الألياف بالهواء في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتأمين طرفي الألياف بشريط إضافي.
    5. ركز على جزء الألياف الممتد على إطار الورق للتوصيف اللاحق.
  2. الغزل الرطب
    1. قم ببناء جهاز الغزل الرطب ، مع الجهاز المفصل هنا بقدرات تحكم محسنة في المحرك بالنسبة للتكرارات السابقة31،38.
      1. قم بتصنيع لوحة تثبيت معدنية صلبة يتم تثبيتها عموديا وتشكيلها بتكوين مناسب لإرفاق مجموعة من المحركات المتدرجة (انظر الشكل 3). يتطلب كل تركيب للمحرك ثقوبا محفورة للسماح بالتثبيت الآمن لمحركات السائر في الجزء الخلفي من لوحة التثبيت (أي أربعة ثقوب متباعدة وذات حجم مناسب) وثقب خامس للسماح لعمود المحرك بالمرور.
      2. اختر محركات متدرجة ثنائية القطب بخطوة 1.8 درجة ، تحمل عزم دوران يبلغ 45 نيوتن سم ، وطول 24 مم ، وعمود قطره 5 مم مع قطع "D" بطول 15 مم ، وجسم 39 مم ، وتيار مقنن 1.50 أمبير ، ومقاومة 2.3 طور.
      3. قم بتطوير نظام للتحكم في السرعة واتجاه الدوران لكل محرك مثل النظام المستخدم سابقا لمجموعة متنوعة من أنواع ألياف الحرير17،53،54 ، والذي يستخدم واجهة مستخدم رسومية (GUI) مشفرة بلغة Python ل Raspberry Pi متصلة بالعديد من وحدات التحكم في المحركات المتدرجة كما هو مفصل في https://github.com/raineylab/MotorController.git.
      4. للغزل ، قم بتوصيل كل محرك يتم استخدامه في تكوين دوارة معين بأسطوانة معدنية آلية (قطر 6 سم ، طول 8 سم لمن هم في الموضعين 1 و 2 في الشكل 3 ، بكرات مخددة بقطر 9 سم في أي من الطرفين مستدق بقطر 6 سم في وسط الأسطوانة ، طول 7 سم في الموضعين 3 و 4 في الشكل 3 ؛ انظر ، على سبيل المثال ، الشكل 4 لتكوين العينة).
      5. بالنسبة للمغزل (الشكل 3) ، استخدم حقنة زجاجية سعة 0.25 مل بإبرة معدنية متصلة بشكل دائم بنهاية غير حادة (القطر الداخلي 0.127 مم) مثبتة في مضخة حقنة تقوم ببثق مخدر الدوران بمعدل متحكم فيه في حمام التخثر.
    2. الطرد المركزي محلول المنشطات عند 20,000-21,000 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع المادة الطافية لغزل الألياف.
      ملاحظة: قم بإزالة الجسيمات المتبقية لمنع انسداد إبرة البثق أثناء الدوران الرطب.
    3. قم بتحميل 50-80 ميكرولتر من محلول المنشطات الدوار في المحقنة التي تعمل كمغزل.
    4. قم بتأمين المحقنة في مضخة حقنة واضبط البثق على معدل 600 ميكرولتر / ساعة.
      ملاحظة: اضبط معدل البثق وقم بتحسينه لتمكين تكوين الألياف لحالة مخدر غزل البروتين المعينة.
    5. تحضير حمام التخثر (95٪ إيثانول / 5٪ ماء منزوع الأيونات ، حجم / حجم).
    6. ضع مضخة الحقنة بحيث يتم غمر إبرة المحقنة التي تحتوي على محلول المنشطات في حمام التخثر.
    7. قم بتوصيل الأسطوانة (الأسطوانات) بجهاز الغزل ، واضبط سرعة الأسطوانة باستخدام برنامج التحكم في المحرك ، وقم بتشغيل المحرك (المحرك) المطلوب لتكوين دوران معين.
      ملاحظة: قم بمطابقة معدل دوران الأسطوانة 1 مع معدل البثق. تتوافق معدلات البثق البالغة 400 ميكرولتر / ساعة أو 600 ميكرولتر / ساعة مع 6 دورة في الدقيقة أو 9 دورة في الدقيقة للأسطوانة 1. إذا تم نقل سحب ما بعد الدوران ، فيجب ضبط واحدة أو أكثر من البكرات 2-4 للدوران بشكل أسرع.
    8. ابدأ تشغيل مضخة الحقنة واستخدم الملقط لتوجيه الألياف التي تتشكل في حمام التخثر بإحدى الطرق التالية.
      1. لجمع ألياف AS ، قم بتوجيه الألياف المتكونة في حمام التخثر إلى الأسطوانة الأولى (السرعة التي تساوي معدل البثق) للتجميع.
      2. لأداء التمدد بعد الدوران في الهواء ، اضبط معدل دوران الأسطوانة 2 على مضاعف الأسطوانة 1. قم بتوجيه الألياف من التخثر فوق الأسطوانة 1 دون الالتفاف حول الأسطوانة 1 وجمعها على الأسطوانة 2.
        ملاحظة: تتطلب نسبة السحب بعد الدوران البالغة 2x أن يكون معدل دوران الأسطوانة 2 ضعف معدل الأسطوانة 1 ؛ 3x ، ثلاثي ؛ وهكذا دواليك.
      3. لإجراء تمدد ما بعد الدوران بعد الغمر في المذيب ، املأ حمام المذيبات بالمذيب المطلوب (على سبيل المثال ، الماء منزوع الأيونات ؛ 2: 3 v / v الإيثانول / H2O ؛ إلخ) وقم بتوجيه الألياف من حمام التخثر حول الأسطوانة 1 (معدل الدوران المطابق لمعدل البثق) ، حول الأسطوانة 3 (معدل الدوران يساوي الأسطوانة 1) في حمام المذيبات ، وجمع الألياف على الأسطوانة 2 في الهواء (تدور بمعدل أسرع من الأسطوانات 1 و 3).
        ملاحظة: سيحدد معدل دوران الأسطوانة 2 بالنسبة للبكرات 1 و 3 نسبة سحب ما بعد الدوران كما في الخطوة 2.2.8.2.
      4. لأداء تمدد ما بعد الدوران في المذيب ، املأ حمام المذيبات بالمذيب المطلوب (على سبيل المثال ، الماء منزوع الأيونات ؛ 2: 3 فولت / فولت الإيثانول / H2O ؛ إلخ) وقم بتوجيه الألياف من حمام التخثر حول الأسطوانة 1 (معدل الدوران المطابق لمعدل البثق) ، حول الأسطوانة 3 (معدل الدوران يساوي الأسطوانة 1) في حمام المذيبات ، حول الأسطوانة 4 في حمام المذيبات (معدل الدوران مضاعف للبكرات 1 و 3) وجمعها الألياف الموجودة على الأسطوانة 2 في الهواء (معدل الدوران مطابق للأسطوانة 2).
        ملاحظة: سيحدد معدل دوران الأسطوانات 2 و 4 بالنسبة إلى الأسطوانات 1 و 3 نسبة سحب ما بعد الدوران كما في الخطوة 2.2.8.2.
        اجمع الألياف في ظروف بيئية خاضعة للرقابة لتجنب تأثير الرطوبة ودرجة الحرارة على سلوك الألياف. نستهدف الرطوبة النسبية ~ 28.2 ± 2.4٪ ودرجة الحرارة ~ 28.0 ± 2.2 درجة مئوية.

figure-protocol-4
الشكل 4: الخطوات الرئيسية في الغزل الرطب لألياف حرير العنكبوت. (أ) بثق المنشطات في حمام التخثر متبوعا بجمع الألياف (يسلط المستطيل الأحمر على اليسار الضوء على الإبرة المستخدمة في بثق المنشطات ؛ مستطيل أحمر على اليمين هو مسار ألياف الحرير المغزولة الرطبة. (ب) رسم توضيحي للألياف التي تتعرض لتمدد ما بعد الدوران في الهواء (مستطيل أحمر لتوجيه العين). (ج) رسم توضيحي لتمدد الألياف بعد الدوران بعد الغمر في الماء (مستطيل أحمر لتوجيه العين). (د) ألياف الحرير المؤتلفة المستمرة التي يتم جمعها على أسطوانة (على سبيل المثال ، الألياف التخزين المؤقت عند السهم الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. التقييم المجهري البصري للألياف

  1. تركيب الألياف
    1. قم بإنشاء حامل ورق على شكل حرف C عن طريق قص مربع 1 × 1 سم من قطعة من الورق المستطيلة مقاس 3 × 2 سم (الشكل 5).
    2. قم بتوصيل الحامل على شكل حرف C بشريحة مجهر زجاجي باستخدام شريط لاصق.
    3. قم بلصق قطعتين من الشريط على الوجهين على جانبي الفجوة البالغة 1 سم لحامل الورق على شكل حرف C.
    4. قم بإزالة الألياف من الأسطوانة التي تم جمعها عليها وقطع قطعة بطول 2 سم تقريبا.
      ملاحظة: تجنب استخدام القوة المفرطة عند التعامل مع الألياف لمنع تشوه المواد أو أي تغيير آخر في الخصائص.
    5. ضع الجزء الليفي في الجزء العلوي من الشريط على الوجهين ، مع التأكد من محاذاة المحور الطويل للألياف بالتوازي مع الحافة السفلية للحامل (الشكل 5).
    6. قم بتأمين الألياف بشريط لاصق أعلى شريط لاصق على الوجهين على كلا الجانبين.
    7. قم بتوصيل قطعة إضافية من الشريط اللاصق لتثبيت الجزء السفلي من حامل الورق بإحكام بالشريحة الزجاجية لمنع حركة الألياف حتى الاستخدام.
    8. قم بتخزين الألياف المثبتة في صندوق تخزين منزلق حتى يتم استخدامها للتصوير واختبار الشد.
  2. تحديد القطر وتقييم العيوب
    1. افحص الألياف المركبة باستخدام الفحص المجهري البصري. أولا ، قم بفحص طول الألياف بالكامل بحثا عن عيوب مرئية ، مثل العنق أو الالتواء أو الانتفاخ أو الألياف المزدوجة. إذا لوحظت أي عيوب ، فاستبعد تلك الألياف من الاختبار الميكانيكي.
    2. بالنسبة للألياف التي تبدو خالية من العيوب ، خذ ثلاث صور مجهرية بتكبير 10 أضعاف على طول المحور الطويل للألياف ، واحدة في المنتصف وواحدة بالقرب من كل طرف من طرفي الألياف.
    3. قم بقياس قطر الألياف باستخدام برنامج ImageJ55 :
      1. في ImageJ ، انتقل إلى قائمة التحليل وحدد تعيين المقياس (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S1). اضبط المقياس وفقا لإعدادات معايرة المجهر واضبط وحدة القياس على ميكرومتر (ميكرومتر) (ملف تكميلي 1 - الشكل التكميلي S2).
      2. باستخدام أداة الخط ، ارسم خطا مستقيما عموديا على المحور الطويل للألياف الممتد من حافة واحدة من الألياف إلى الحافة الأخرى.
      3. لكل صورة مجهرية ، قم بقياس قطر الألياف في ست مناطق مختلفة على طول الألياف.
      4. بعد رسم كل سطر ، انقر فوق قياس في قائمة التحليل لعرض قطر الألياف (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S3).
  3. التقييم النوعي للمحاذاة الجزيئية من خلال المجهر الضوئي المستقطب
    1. استخدم الفحص المجهري الضوئي المستقطب لتقييم المحاذاة الجزيئية داخل الألياف بعد تقييم القطر والعيوب بواسطة الفحص المجهري البصري.
      1. افحص الألياف باستخدام مجهر بصري مقلوب مزود بمرحلة قابلة للدوران ، ومنزلق محلل ثابت ، ومستقطب قابل للدوران بزاوية 90 درجة.
      2. ضع الألياف عند حوالي 45 درجة بالنسبة للضوء المستقطب الساقط لزيادة السطوع بسبب الانكسار الثنائي ، مما يعزز رؤية التركيب الجزيئي.
      3. التقط صورة للألياف في ظل هذه الظروف لتقييم انكسارها.
        ملاحظة: يشير الانكسار العالي إلى بنية جزيئية محاذاة جيدا ، بينما يشير الانكسار المنخفض أو المعدوم إلى بنية غير متبلورة أو عشوائية التوجيه.

figure-protocol-5
الشكل 5: تركيب ألياف الحرير العنكبوتية على شريحة زجاجية تتيح التحليل المصب باستخدام حامل ورق على شكل حرف C وسلسلة من طبقات الشريط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. اختبار الشد

ملاحظة: يمكن إنتاج جهاز اختبار الشد المناسب للتقييم الدقيق لألياف الحرير بسهولة بتكلفة منخفضة نسبيا25،56. باختصار ، قم بتصنيع زوج من المشابك المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ للسماح بإمساك قوي لكل طرف من طرفي كل ألياف في إطار على شكل حرف C يتم اختباره (على سبيل المثال ، الشكل 6). قم بتوصيل أحد هذه المشابك بوزن يوضع على ميزان تحليلي والآخر بمضخة حقنة. يجب تكوين مضخة الحقنة للسماح بالسحب المستمر بمعدل إجهاد محدد. يجب ربط الميزان التحليلي بجهاز كمبيوتر لجمع بيانات الوزن/الكتلة المسجلة كدالة للوقت.

figure-protocol-6
الشكل 6: رسم تخطيطي يوضح الخطوات التحضيرية لاختبار الشد. (أ) يتم فصل حامل الورق المزود بالألياف (انظر الشكل 5 للتكوين) عن الشريحة الزجاجية وتثبيته عموديا باستخدام مشبك متصل بالثقل. (ب) يتم وضع هذا المشبك المرجح على الميزان التحليلي، ويتم تثبيت الجزء العلوي من حامل الورق بمشبك متصل بقضيب مثبت بإحكام في مضخة حقنة. يتم قطع حامل الورق أفقيا في المنتصف قبل بدء اختبار الشد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. الحصول على بيانات منحنى الإجهاد والإجهاد
    1. بعد قياس قطر الألياف ، قم بإجراء اختبار الشد على نفس الألياف باستخدام جهاز محلي الصنع (الشكل 6).
      1. افصل الإطار الورقي على شكل حرف C الذي يحمل الألياف من الشريحة الزجاجية وثبته بمشبك متصل بوزن (الشكل 6 أ).
      2. قم بتوصيل الميزان التحليلي ببرنامج تسجيل البيانات / التحكم وانتقل إلى Workbench (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S4).
      3. قم بإعداد التجربة في برنامج التحكم في التوازن بالنقر فوق الزر "ابدأ". أدخل اسم التجربة عندما يطلب منك ذلك (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S5).
      4. تأكد من أن الميزان التحليلي فارغ وضع المشبك المرجح مع الألياف عليه.
      5. قم بتوصيل الجزء العلوي من إطار الورق بمشبك متصل بمضخة الحقنة وقم بقص جانب واحد من حامل الورق للسماح للألياف بالتحرك بحرية (الشكل 6 ب).
        ملاحظة: تأكد من أن كلا المشابك متوازية مع بعضهما البعض وأن الألياف متمركزة داخل المشبك بطول مقياس 10 مم.
      6. قم بتفريغ الميزان لصفر كتلة الوزن والمشبك واضغط على زر التشغيل في مضخة الحقنة وانقر فوق موافق في برنامج التحكم في الميزان (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S6).
      7. عندما تنكسر الألياف ، اضغط على إيقاف على مضخة الحقنة والزر نعم في برنامج التحكم في الميزان (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S7) لتسجيل الوزن المقاس كدالة للوقت.
      8. نقل البيانات إلى جدول بيانات أو حزمة برامج معالجة بيانات أخرى مناسبة للمعالجة. انسخ سجل بيانات الوزن مقابل الوقت إلى الحافظة والصقه في جدول بيانات الاختبار الميكانيكي المتوفر (الملف التكميلي 2) أو عن طريق تصدير البيانات كملف نصي واستيرادها باستخدام التحليل المناسب.
  2. معالجة بيانات منحنى الإجهاد والإجهاد
    ملاحظة: يستند البروتوكول التالي إلى جدول بيانات الاختبار الميكانيكي المنسق للاستخدام في Microsoft Excel (الملف التكميلي 2).
    1. تأكد من صحة المعلمات التجريبية (العمود C).
    2. أضف التسجيلات الجماعية كدالة للوقت إلى جدول البيانات ("صافي الكتلة" في العمود F). إذا كانت هناك قيم كتلة مسجلة قبل بدء التمدد ، فقم بإزالة هذه القيم عن طريق حذف الخلايا المقابلة مع إزاحة البيانات لأعلى. إذا كانت هناك قيم كتلة مسجلة بعد فواصل الألياف ، فاحذف خلايا البيانات هذه.
    3. التعبئة التلقائية لقيم الفهرس في العمود E من خلال إضافة زيادات قدرها 1 بحيث يتطابق العدد الإجمالي للمؤشرات مع العدد الإجمالي لقيم الكتلة المقاسة في العمود F.
    4. أعد قياس الكتلة الصافية بحيث تبدأ عند 0 جم وتزداد أثناء تجربة التمدد عن طريق طرح الكتلة الصافية الأولية من كل قيمة كتلة صافية وضرب هذا الفرق في -1 (العمود G).
    5. احسب التغير في طول الألياف في كل قياس بضرب مؤشر القياس في معدل سحب مضخة الحقنة والفارق الزمني بين قياسات الكتلة المسجلة (العمود H).
    6. احسب الإجهاد الهندسي بقسمة التغير في طول الألياف على الطول الأصلي (العمود الأول).
      ملاحظة: يعطي هذا الحساب الإجهاد الهندسي بالملم / مم. لتحويل قيم الإجهاد الهندسي إلى ٪ ، اضرب القيم الموجودة في العمود I بنسبة 100٪.
    7. سجل قابلية التمدد كقيمة الحد الأقصى للانفعال الهندسي (الخلية T3).
    8. احسب القوة (بالنيبران) المطلوبة لتحقيق كل تغيير مسجل في الطول عن طريق تحويل الكتلة من g إلى kg وضربها في الجاذبية القياسية (9.81 m/s2; العمود J).
    9. احسب الإجهاد الهندسي (بالباسكال) بقسمة القوة المحددة عند درجة معينة من التمدد على مساحة المقطع العرضي للألياف واضرب في 10-6 للتحويل إلى ميجا باسكال (العمود K).
    10. سجل الحد الأقصى للضغط المرصود على أنه الإجهاد النهائي (الخلية U3) والضغط عند الكسر كقيمة الإجهاد النهائية المسجلة قبل كسر الألياف (الخلية V3).
    11. احسب المساحة الواقعة تحت منحنى الإجهاد والإجهاد للحصول على المتانة باستخدام قاعدة شبه منحرفة لحساب المساحة الواقعة أسفل المنحنى بعد كل قياس (العمود L). اجمع هذه المناطق لإيجاد المتانة (الخلية W3).
    12. احسب معامل يونغ (بالميجا باسكال) عن طريق تحديد ميل المنطقة الخطية الأولية لمنحنى الإجهاد والإجهاد باستخدام الدالة LINEST. قم بالتحويل إلى GPa بالضرب في 103 (الخلية X3).

5. التحليل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء بتحويل فورييه (FTIR)

  1. قم بإعداد عينة ل FTIR عن طريق لصق شريحة زجاجية ثانية في أسفل شريحة معدة للفحص المجهري البصري.
  2. الصورة البصرية والمجموعة الطيفية FTIR
    1. املأ الكاشف ديوار بالنيتروجين السائل لتبريد الكاشف.
    2. افتح برنامج التحكم في أداة FTIR.
    3. في نافذة العرض والتجميع (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8) افتح علامة التبويب المجموعة ، واضبط وضع التجميع على ATR والكاشف على مبرد (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S9).
    4. ضع الشريحة في حامل الشريحة وضع الحامل على المسرح.
    5. اضبط الإضاءة العلوية على 100 وفتحة العدسة والإضاءة السفلية على 0.
    6. ركز مركز مجال الرؤية لصورة المجهر البصري للعينة على الألياف باستخدام عصا التحكم المادية أو عصا التحكم الرقمية في البرنامج للتحكم في موضع مركز مجال الرؤية والمستوى البؤري.
    7. اضبط وضع التجميع على الخريطة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8).
    8. حدد المنطقة المراد تصويرها وقياسها باستخدام طريقة عرض الخريطة - أداة المنطقة. انقر فوق المؤشر واسحبه لتحديد المنطقة التي سيتم الحصول على الأطياف لها في معاينة الرسم المجهري (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8). تمثل كل دائرة على الصورة طيفا واحدا مكتسبا في هذا الموضع. إذا لزم الأمر، قم بتغيير حواف هذا المربع عن طريق تمرير المؤشر فوق حافة مربع معينة ثم النقر والسحب إلى الموقع المطلوب. قم بترجمة المربع بأكمله بالنقر والسحب داخل المستطيل. قم بتعديل مساحة المربع وعدد نقاط البيانات ضمن المرحلة وفتحة العدسة والعرض (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S10).
    9. انقر بزر الماوس الأيمن على معاينة الرسم المجهري وحدد التقاط الفسيفساء لحفظ الصورة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8).
    10. اضبط ضغط ATR بالنقر فوق القائمة المنسدلة ملف تعريف الضغط الحالي . بالنسبة لألياف البروتين ، استخدم ضغط 2٪ (أي أقل ضغط ATR ممكن) لتقليل الضرر الذي يلحق بالألياف (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8).
    11. أدخل طرف ATR FTIR.
    12. انقر فوق الزر "جمع " (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S8) للحصول على طيف الخلفية ثم الطيف في كل نقطة من النقاط المحددة. بعد اكتمال الجمع ، سيتم عرض البيانات في نافذة جديدة.
  3. إعداد البيانات لتحليل المصب
    1. انقر بزر الماوس الأيسر على الخريطة الحرارية أو الصورة المجهرية لعرض الطيف الذي تم الحصول عليه في الموضع المقابل (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S11).
    2. انقر بزر الماوس الأيمن على الطيف المراد تحليله وحدد نسخ (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S11).
    3. انقر بزر الماوس الأيمن في شريط Windows أعلى الشاشة وحدد نافذة جديدة (ملف تكميلي 1 - الشكل التكميلي S11).
    4. انقر فوق الزر لصق في الجزء العلوي من الشاشة عند فتح النافذة الجديدة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S11).
    5. استخدم نفس الأسلوب لنسخ ولصق أي أطياف أخرى مرغوب فيها للتحليل في هذه النافذة.
    6. قم بتمييز طيف أو أطياف بالضغط على Ctrl أثناء النقر فوق كل طيف مرغوب فيه أو عن طريق تمييز الأطياف المطلوبة في القائمة المنسدلة.
    7. انقر فوق حفظ باسم... واحفظ الملفات كملفات .spa لتحليل البيانات في برنامج التحكم في مقياس الطيف أو ك.csv لتحليل البيانات في حزمة برامج أخرى (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S12).
  4. تحليل المشتقات الثانية باستخدام برمجيات خاصة بالأداة
    1. افتح الأطياف المراد تحليلها في حزمة برامج المعالجة والتحليل الطيفي الخاصة بالجهاز.
    2. للتحويل بين وضعي النفاذية النسبة المئوية والامتصاص ، استخدم Ctrl + A (النسبة المئوية للنفاذية إلى الامتصاص) أو Ctrl + T (الامتصاص إلى النسبة المئوية للنفاذية).
    3. حدد منطقة الاهتمام بالنقر فوق عرض | حدود العرض (أو Ctrl + D) (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S13A). لعرض نطاقي Amide I (1,700-1,600 cm-1) و amide II (1,600-1,500 cm-1) ، على وجه التحديد ، قم بتعيين حدود المحور X للبدء والنهاية على أرقام الموجات المناسبة. في حالة تحليل أكثر من طيف واحد، حدد تطبيق على كل الأطياف. انقر فوق موافق (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S13B).
    4. لرسم المشتق الثاني، انقر فوق عملية | مشتق... واختر الثاني من القائمة المنسدلة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S14A). حدد مشتق نوريس بطول مقطع 5 وفجوة بين الأجزاء من 5 (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S14B). يتزامن الحد الأدنى للطيف المشتق الثاني مع قمم المكونات داخل طيف الامتصاص الأصلي.
      1. إذا كان الطيف صاخبا جدا لتقييم الحد الأدنى ، فقم بتنعيم الطيف بالنقر فوق عملية > سلس تلقائي (ملف تكميلي 1 - الشكل التكميلي S15). ثم احسب المشتق الثاني وابحث عن الحد الأدنى.
    5. اربط الأرقام الموجية في الحد الأدنى للمشتق الثاني بمواضع النطاق المميزة للهياكل الثانوية باستخدام جدول مرجعي (على سبيل المثال ، الجدول 2) لاكتساب نظرة ثاقبة على البنية الثانوية للبروتين.
  5. ذروة الالتفاف باستخدام برنامج تحليل خاص بأداة
    1. قم بتعيين منطقة العرض على المنطقة المراد فك الالتفاف كما في الخطوة 5.4.3. هذه المنطقة فقط سيتم فك التعقيد.
    2. خط الأساس يصحح المنطقة الطيفية المحددة باستخدام إحدى الطرق التالية:
      1. انقر فوق عملية | خط الأساس التلقائي الصحيح (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S16) ؛ أو
      2. انقر فوق عملية | خط الأساس صحيح (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S17A) ثم حدد خطي من القائمة المنسدلة وحدد المنطقة الطيفية المراد تصحيحها على طيف الموضع عن طريق النقر فوق النقطتين اللتين تحددان الحدود السفلية والعليا للمنطقة المراد تصحيحها لأغراض الالتفاف. بعد ذلك ، حدد إضافة إلى النافذة في القائمة المنسدلة الثانية وانقر فوق الزر "إضافة " (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S17B).
    3. مع تحديد الطيف الأساسي المصحح، انقر فوق تحليل | ذروة العزم ... لفتح نافذة Peak Resolve (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S18).
    4. حدد الأطياف والمنحنيات المراد تحليلها باستخدام شريط التحديد على الجانب الأيسر من الشاشة.
    5. اختر Gaussian / Lorentzian مع إعداد الحساسية منخفض وإعداد FWHH 2 في علامة التبويب Find Peaks ثم انقر فوق الزر Find Peaks (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S19).
    6. انقر فوق الزر Peaks لفتح جدول يصف القمم.
      1. إذا تم اختيار قمم أكثر مما هو معقول ماديا ، فانقر فوق حذف الذروة حتى يتم الحصول على العدد الصحيح من القمم للتحليل (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S20). على سبيل المثال ، بالنسبة لمنطقة أميد I ، يتم الإبلاغ عادة عن 5-11 ذروة في الأدبيات (الجدول 2).
      2. للتأكد من أن جميع القمم موجبة بعد التركيب، انقر فوق تحرير الذروة وقم بتعيين الحد الأدنى للارتفاع إلى 0. ثم انقر فوق التالي وكرر لكل ذروة متبوعة بموافق لإغلاق نافذة التحرير (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S21).
      3. إذا كانت هناك أرقام موجية محددة يجب أن تكون موجودة في التفكيك النهائي، فانقر فوق تحرير الذروة وقم بتثبيت مركز الذروة إلى الرقم الموجي المحدد في المربع القيمة عن طريق تحديد ثابت أو توفير نطاق باستخدام المربعين الحد المنخفض والحد العالي. انقر فوق موافق لتطبيق هذه الإعدادات على الذروة المحددة.
        ملاحظة: في هذه الخطوة ، من الأفضل استخدام مواضع الذروة الموجودة أثناء تحليل المشتقات الثاني أو القمم من جدول مرجعي للهياكل الثانوية FTIR ، المشروحة بشكل مثالي لنوع عينة حرير مماثل (على سبيل المثال ، الجدول 2).
    7. انقر فوق الزر Fit Peaks (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S22).
      1. إذا لم تتقارب خوارزمية تركيب الذروة بنجاح، فانقر فوق Fit Peaks مرة أخرى للاستمرار بشكل متكرر في احتواء القمم.
    8. انقر فوق الزر Peaks... للحصول على معلومات حول الموضع والارتفاع و FWHH ومساحة جميع القمم المناسبة.
      1. يمكن نسخ هذه القمم إلى الحافظة بالنقر فوق الحافظة للسماح بلصقها في نافذة أو ملف آخر (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S23).
      2. انسخ القمم والأطياف إلى نافذة أخرى عن طريق تحديد الوجهة في القائمة المنسدلة لاختيار النافذة بجوار الزر إضافة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S24).
      3. انقر فوق الزر تحديد الكل واستخدم ملف | حفظ باسم لحفظ القمم والأطياف كملفات .spa و / أو .csv (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S25).
    9. ربط كل ذروة مكون بهيكل ثانوي باستخدام جدول مرجعي. توفر المساحة النسبية للقمم (القروة) المقابلة لهيكل ثانوي معين فيما يتعلق بالمساحة الإجمالية لجميع القمم المخصصة نسبة البروتين الذي يحتوي على هذا الهيكل الثانوي.
  6. إعداد البيانات للتحليل النهائي باستخدام برامج الجهات الخارجية
    1. افتح مصنفا وقم بتحميل البيانات الطيفية في برنامج المعالجة والتحليل الطيفي التابع لجهة خارجية عن طريق تحديد البيانات | الاتصال بالملف | عنصر قائمة النص / CSV (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S26). حدد الملف المطلوب في مستكشف الملفات وانقر فوق فتح.
    2. رسم الطيف عن طريق تمييز الأعمدة المراد رسمها وتحديد المؤامرة | أساسي 2D | عنصر قائمة السطر (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S27).
    3. انقر نقرا مزدوجا فوق المحور x واستخدم علامة التبويب مقياس لضبط النطاق ليناسب ذروة Amide I (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S28).
    4. إذا كانت البيانات صاخبة جدا ، فقم بتنعيم المنحنى باختيار التحليل | معالجة الإشارة>سلس >فتح مربع الحوار... عنصر القائمة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S29A).
      1. اضبط خيار إعادة الحساب على تلقائي ، والطريقة إلى Savitzky-Golay ، ونقاط النافذة إلى 5 ، وشرط الحدود إلى لا شيء ، وترتيب متعدد الحدود إلى 2 (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S29B).
      2. انقر فوق موافق للمعالجة.
  7. تحليل المشتقات الثانية باستخدام برامج الطرف الثالث
    1. حدد التحليل | الرياضيات | التفريق | افتح مربع الحوار... عنصر القائمة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S30).
    2. اضبط خيار إعادة الحساب على تلقائي ، واضبط الترتيب المشتق على 2 ، وحدد خيار منحنى مشتق الرسم ، وانقر فوق موافق (ملف تكميلي 1 - الشكل التكميلي S31).
    3. إذا كان منحنى المشتق الثاني الناتج صاخبا جدا ، فاتبع الخطوات 5.7.1. و 5.7.2 ، تحديد Savitzky-Golay Smooth في علامة التبويب Smooth في مربع الحوار Differentiate .
    4. كما في 5.4.5 ، اربط الأرقام الموجية عند الحد الأدنى للمشتق الثاني بالهياكل الثانوية.
  8. ذروة التفكيك باستخدام برامج الطرف الثالث
    1. بعد النقر فوق مخطط طيف امتصاص أميد I ، حدد ملف تحليل | القمم وخط الأساس | محلل الذروة | افتح مربع الحوار... عنصر القائمة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S32).
    2. في مربع الحوار الهدف - احتواء القمم (Pro)، قم بتعيين الخيار إعادة الحساب إلى تلقائي، وحدد احتواء القمم، وانقر فوق التالي. (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S33A).
    3. في مربع الحوار وضع الأساس ، قم بتعيين المعلمة وضع خط الأساس إلى خط مستقيم وانقر فوق التالي (ملف تكميلي 1 - الشكل التكميلي S33B).
    4. في مربع الحوار معالجة الأساس ، حدد طرح تلقائي للخط الأساسي، وانقر فوق الزر Subtract Now ، ثم انقر فوق Next (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S33C).
    5. في مربع الحوار Find Peaks ، قم بتعطيل تمكين البحث التلقائي وانقر فوق Add.
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق النافذة التي تحتوي على مخطط الطيف مع القمم المناسبة.
      2. حدد القمم بناء على الحد الأدنى الذي لوحظ في المشتق الثاني (الخطوة 5.7.4) أو الجداول المرجعية (على سبيل المثال ، الجدول 2).
      3. انقر فوق تم ثم انقر فوق التالي (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S33D).
    6. في مربع الحوار Fit Peaks (Pro)، حدد Generate Report from Current Fitting Result وانقر فوق Fit. متبوعا بالنهاية (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S33E).
    7. قم بتقييم علامة التبويب PeakProperties1 في المصنف لرؤية المركز والمنطقة المتكاملة و FWHM لكل ذروة (الملف التكميلي 1 - الشكل التكميلي S34). كما في الخطوة 5.5.9 ، قم بربط كل ذروة مكون بنوع هيكل ثانوي وقم بتقييم النسبة المئوية لبنية البروتين مع هذا الهيكل الثانوي.
نطاق الرقم الموجي (سم -1)مهمة
1605−1615سلاسل جانبية Tyr / خيوط β مجمعة
1616−1621خيوط β مجمعة / صفائح β داخل الجزيئات [ضعيف]
1622−1627صفائح β بين الجزيئات [قوية]
1628−1637صفائح β داخل الجزيئات [قوي]
1638−1646ملف عشوائي / سلاسل ممتدة
1647−1655ملف عشوائي
1656−1662α الهليكوبية
1663−1696يتحول
1697-1703صفائح β بين الجزيئات [ضعيفة]

الجدول 2: تعيينات النطاق الاهتزازي لمنطقة Amide I لحير Bombyx mori بناء على التقييم المقارن للعديد من الدراسات التي أجراها Hu et al.57.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

محلول المنشطات المثالي القابل للغزل هو محلول شفاف وخالي من الرواسب ولزج ، مما يشير إلى انحلال البروتين الكامل (الشكل 7 أ). على العكس من ذلك ، ينتج عن الذوبان غير المكتمل إما تعليق حليبي أو رواسب مرئية (الشكل 7 ب ، ج). يختلف الوقت اللازم لحل البروتين بالكامل كدالة للمذيب ، مع بعض المذيبات ، مثل مخاليط TFA / TFE / H2O ، التي عادة ما تذوب البروتين تماما خلال فترة زمنية مدتها 30 دقيقة ، بينما قد يتطلب البعض الآخر ، مثل HFIP ، تحريضا بين عشية وضحاها جنبا إلى جنب مع الدوامة العرضية.

figure-results-1
الشكل 7: تحسين حل المنشطات الغزلية. (أ) يعطي المذيب القادر على إذابة البروتين بالكامل محلول مخدر شفاف ولزج قابل للغزل. قد يؤدي الذوبان الجزئي أو تعليق البروتين عن طريق اختيار مذيب غير مثالي إلى (ب) حالة مفرطة اللزوجة ، عادة مع راسب مرئي أو (ج) معلق حليبي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح الشكل 2E ألياف تمثيلية مرسومة يدويا بينما يوضح الشكل 4D ألياف مبللة مغزولة بكرة. قبل أي تحليل نهائي ، يعد الفحص المجهري البصري ضروريا لتقييم جودة الألياف. تظهر في الشكل 8 صور مصغرة بصرية تمثيلية لألياف الحرير المؤتلفة المغزولة الرطبة المناسبة للتحليل المصب والمغزولة باستخدام شرطين مختلفين (انظر الشكل 3 للحصول على عينة من تكوينات الغزل الرطب) في الشكل 8. من خلال الفحص المجهري البصري (الشكل 8 أ) ، من الواضح أن هذه الألياف تظهر قطرا موحدا ، مع انخفاض القطر الواضح عند تطبيق سحب ما بعد الدوران (على سبيل المثال ، كما هو مغزل (AS) مقابل ممتد بعد الغزل بنسبة 4x في 40٪ من الإيثانول (4x-EtOH)). تتوافق الدرجة الأكبر من الانكسار الثنائي الذي ينتج عنه تباين أكبر في الفحص المجهري الضوئي المستقطب (الشكل 8 ب) مع المحاذاة الجزيئية المحسنة في الألياف نتيجة لعملية السحب بعد الدوران. أخيرا ، تجدر الإشارة إلى أنه من المرجح ملاحظة العيوب في جزء من الألياف التي تم تقييمها ، مما يجعل جزءا معينا من الألياف غير مناسب للتحليل النهائي. يظهر مثالان من هذا القبيل في الشكل 9.

figure-results-2
الشكل 8: صور مجهرية بصرية تمثيلية لألياف حرير العنكبوت المؤتلفة المغزولة الرطبة. يتم توضيح الألياف في حالة AS وبعد امتداد 4x بعد الدوران في الإيثانول (EtOH) لبناء حرير كيميري الكمثري الأسيني الشكل (Py2W2) الذي لوحظ بواسطة الفحص المجهري البصري (العمود الأيسر) والفحص المجهري الضوئي المستقطب (العمود الأيمن). يتم استنساخ الصور بإذن من Ghimire et al.17. أشرطة المقياس = 30 ميكرومتر. الاختصارات: AS = كما نسج; EtOH = الإيثانول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 9: مثال على عيوب الألياف المحتملة التي يمكن ملاحظتها باستخدام الفحص المجهري البصري. (أ) مثال على عيب "منتفخ". (ب) مثال على عيب "العنق". أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بعد التأكد من عدم وجود عيوب في جزء ألياف معين وبعد تحديد القطر (قسم البروتوكول 3.2) ، يمكن إجراء اختبار الشد (على سبيل المثال ، الشكل 6). تظهر منحنيات الإجهاد والإجهاد التمثيلية التي تم الحصول عليها لحرير العنكبوت المؤتلف الخيالي المغزول باستخدام ظروف مختلفة في الشكل 10. اعتمادا على ظروف الغزل ، تتراوح الألياف الناتجة من الهشاشة (حالة AS) إلى شديدة التمدد بقوة مماثلة لحالة AS (حالة 2x-air) إلى ألياف أقوى بكثير وأقل قابلية للتمدد (حالة 4x-EtOH). وتجدر الإشارة إلى أنه يجب تقييم شرائح الألياف المتعددة ودفعات الألياف المغزولة لتقييم السلوك الميكانيكي بشكل لا لبس فيه وصارم.

figure-results-4
الشكل 10: منحنى الإجهاد والإجهاد التمثيلي للألياف المغزولة من ظروف مختلفة. تم تحليل الألياف إما في حالة الدوران (AS) أو من خلال الإنتاج باستخدام التمدد الآلي بعد الدوران (نسبة السحب وحالة التمدد (الهواء مقابل المذيب) المشار إليها). الشكل مقتبس بإذن من Ghimire et al. (2024) 17. الاختصار: AS = كما نسج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، يمكن تقييم الهيكل الثانوي للحالة الليفية باستخدام التحليل الطيفي ATR-FTIR. سيكون لأطياف ألياف الحرير النموذجية المكتسبة من خلال هذه المنهجية (الشكل 11 أ ، ب) نطاقات بروتينية مميزة ، بما في ذلك أميد عريض ذروة (تتمحور حول ~ 3,300 سم -1) ، وقمة أميد I (~ 1,600-1,700 سم -1) وقمة أميد II (~ 1,500-1,600 سم -1). هنا ، نركز على تقييم منطقة الأميد I (على سبيل المثال ، الشكل 11C ، D). يعد تحليل المشتقات الثاني مفيدا كوسيلة لتحديد المكونات الرئيسية لذروة الأميد الأول (الشكل 11E ، F) ، مما يوفر مصداقية لتفكيك الذروة الكمي (الشكل 11G-J) الذي يسمح بتقييم ومقارنة نسب نوع الهيكل الثانوي الذي لوحظ في ألياف الحرير المغزولة في ظل حالة معينة.

figure-results-5
الشكل 11: أطياف FTIR وتحليل الهيكل الثانوي. (أ ، ب) أطياف FTIR لألياف Py2W2 الناتجة عن الغزل الرطب في حالة (A) كما يتم غزلها (AS) و (B) دمج 4 امتداد ما بعد الدوران في الإيثانول. (ج، د) مناطق Amide I من أطياف FTIR الموضحة في A و B ، على التوالي. (E-F) المشتق الثاني لمنطقتي الأميد I المبين في C و D ، على التوالي ، محسوبا باستخدام رزمة البرامج المشار إليها. (جي جي) تم إجراء فك الالتفاف Amide I الذروة باستخدام حزم برامج Omnic أو (H و J) OriginPro ، مع كون اللوحات G و I هي التفكيك المقابل ل C و H و J إلى D . الاختصارات: FTIR = تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء. AS = كما نسج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بتجاوز التقنيات الفردية ، عادة ما يكون الارتباط بين الهيكلة الثانوية والأداء الميكانيكي وبيانات التوجيه الجزيئي (أعلاه) ضروريا لفهم تأثيرات معلمات الغزل المختلفة على المادة الناتجة والتحسين العقلاني لعملية الغزل. في الالتفافات FTIR الموضحة في الشكل 11 ، على سبيل المثال ، مقارنة AS بظروف 4×-EtOH للحرير الخيالي ، تكون مساهمات β الألواح الكبيرة في نطاق الأميد I واضحة لكلا الحالتين ولكنها تشكل نسبة أكبر من إجمالي الهيكل الثانوي للحالة الممتدة بعد الغزل بالنسبة لحالة AS ، بغض النظر عن طريقة التفكيك (على سبيل المثال ، الشكل 11G ، H مقابل الشكل 11I ، J). يتوافق هذا مع كل من القوة الأعلى بكثير التي لوحظت لحالة 4×-EtOH من حالة AS (الشكل 10) والتحسن في المحاذاة الجزيئية في حالة 4×-EtOH بالنسبة لحالة AS (الشكل 9). تم الإبلاغ سابقا عن التوصيف والتحليل التفصيلي ، الذي يغطي مجموعة الظروف الموضحة في الشكل 10 ،17. لذلك لم نقم بتلخيص التحليل بأكمله هنا ، وبدلا من ذلك استخدمنا هذه المقارنة الزوجية كدليل على الطريقة التي تكون بها هذه الفئات الثلاث من البيانات مكملة لبعضها البعض وتمكن من تطوير فهم أكثر شمولا لسلوك الألياف من أي تقنية واحدة بمعزل عن بعضها البعض.

الملف التكميلي 1: ملف يحتوي على الأشكال التكميلية S1-S34 التي تصور قياس قطر الألياف ، ومعالجة البيانات الميكانيكية ، والحصول على بيانات FTIR ومعالجتها. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: جدول بيانات يتيح تحديد الخصائص الميكانيكية الرئيسية (أي الإجهاد والإجهاد ومعامل يونغ والمتانة) من بيانات الكتلة مقابل الوقت. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح إنتاج البروتين المؤتلف الإمكانات المثيرة لتصنيع المواد في مجموعة متنوعة من الأشكال ، مع التطورات الحديثة التي تشير إلى أن هذه المواد القائمة على البروتين تقترب من الاستخدام الصناعي على نطاقواسع 58. هنا ، ركزنا على إنتاج الألياف من الحرير المؤتلف لأن هذا هو شكل الحرير المؤتلف المرتبط مباشرة بحرير العنكبوت الليفي الأصلي. تم وصف ألياف الحرير بأنها لها العديد من التطبيقات المحتملة بسبب الخصائص الميكانيكية الشهيرة لحرير العنكبوت الطبيعي وبسبب القدرة على إنتاج ألياف عالية الأداء بشكل مستدام32. تتراوح التطبيقات المقترحة من المنسوجات عالية الأداء إلى المواد الماصة للطاقة إلى منتجات العناية الشخصية إلى استخدام الرعاية الصحية58،59. كما أن الأجهزة والمواد القائمة على حرير العنكبوت في الأشكال القابلة للارتداء أو في سياقات أخرى حيث يتم تعزيز التوصيل الكهربائي تخضع أيضا للاستكشاف النشط لكل من الطب الحيوي والتطبيق الأوسع60. وبالتالي ، هناك اهتمام واسع بتطوير وتحسين وتخصيص المواد القائمة على حرير العنكبوت. في هذا البروتوكول ، نحدد سلسلة من الإجراءات التي تستهدف الإنتاج السريع للألياف إما بعد تحضير بروتين حرير مؤتلف جديد أو لتعديل خصائص المواد للحرير المؤتلف الذي تم تحديده بالفعل ليكون قابلا للغزل.

بغض النظر عن طريقة الغزل المستخدمة ، من الأهمية بمكان تحديد الظروف التي تمكن من إنتاج المنشطات الدورانية من خلال فحص ظروف المذيبات / العازلة وتركيز البروتين ، كما هو مفصل هنا. الهدف النهائي هو إذابة البروتين بتركيز عال بما فيه الكفاية لتمكين التحويل السريع إلى ألياف دون التجميع الذاتي خارج المسار إلى مجاميع أو أنواع أخرى غير قابلة للذوبان تمنع الغزل "المنتج". عادة ما يكون هذا محلولا شفافا ولزجا نسبيا ، ومن المرجح أن يشتمل على أنواع مجمعة ذاتيا مثل المذيلات / الجسيمات النانوية26،61 و / أو فصل الطور السائلعن السائل 62. لا يفصل هذا البروتوكول طرقا لتقييم حالة مخدر الدوران بشكل شامل ، حيث يمكن تحقيق غزل الألياف الناجح من خلال التقييم التكراري لمختلف منشطات الدوران وتكوينات الغزل. يمكن تحقيق نظرة جزيئية وفوق جزيئية مفصلة لحالة المنشطات الدورانية من خلال تقنيات مثل قياس اللزوجة ، وتشتت الضوء ، والتحليل الطيفي ثنائي اللون الدائري للأشعة فوق البنفسجية البعيدة ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي ، و / أو المجهر الإلكتروني26. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه يمكن تعديل البروتين المؤتلف نفسه لتعزيز سلوكه في الغزل ، مع إدراج المجالات الكروية غير المتكررة N- و C- الطرفية كمثال على طريقة لزيادة قابلية ذوبان spidroin32. باختصار ، بدون تحديد مناسب لمخدر الدوران ، لا يمكن المضي قدما في الاختبار المقارن لظروف الغزل.

بمجرد تحديد حالة واحدة أو أكثر من حالات المنشطات الدورانية ، يوفر الرسم اليدوي طريقا سريعا لتقييم خصائص ألياف الحرير. نظرا لأن كميات أقل بكثير من المنشطات مطلوبة للسحب اليدوي المنتج ، فإن هناك حاجة إلى كتل أقل بكثير من البروتين النقي ، مما يجعلها مقدمة ممتازة لأساليب الغزل الرطب الآلي. يوفر هذا أيضا طريقة سهلة التتبع ومباشرة لمقارنة خصائص الألياف لمختلف spidroins33 مباشرة ، مرة أخرى مع الاستفادة من أن إنتاج الألياف بسيط نسبيا مع كميات صغيرة من البروتين. هذا يعني أن تحسين بروتوكولات التعبير عن البروتين وتنقيتها للحصول على العوائد الأعلى اللازمة للغزل الرطب يمكن أن يركز على أكثر أنواع السبيدرونات الواعدة. الجانب السلبي ، بالطبع ، هو أن الرسم اليدوي غير قابل لإنتاج ألياف طويلة مستمرة أو كميات كبيرة من الألياف بطريقة مبسطة.

بالنظر إلى البروتين الكافي ، يوفر الغزل الرطب مزايا للإنتاج الانسيابي للألياف الطويلة والمستمرة32. ليس هذا فقط ، ولكن يمكن تعديل خصائص الألياف بسهولة من خلال عملية الغزل. يوفر اختيار ظروف المنشطات الدوارة ، على سبيل المثال ، طريقا واضحا لتحسين ميكانيكا الألياف. في حالة بروتين الحرير المؤتلف ~ 60 كيلو دالتون ، على سبيل المثال ، أدى التغيير من مخدر دوران إلى آخر مع بقاء جميع معلمات الغزل الأخرى ثابتة إلى تغييرات جذرية في قابلية تمدد الألياف26. كان هذا بدوره مرتبطا بالطريقة التي تم بها تجميع spidroin aciniform في مخدر الدوران قبل الدوران ، مع تحسين تجانس الجسيمات النانوية المجمعة ذاتيا في مخدر الدوران الذي يرتبط بميكانيكا الألياف المحسنة. دمج سحب ما بعد الدوران ، مع ملاحظة أنه يجب تحسين نسبة السحب لنوع معين من الألياف ، كما أنه عادة ما يحسن ميكانيكا ألياف الحرير من خلال مزيج من المحاذاة الجزيئية المحسنة والتحويل المعزز ، على سبيل المثال ، بلورات β صفائح تقوي الألياف32. أخيرا ، يوفر استخدام ظروف مختلفة خلال مرحلة ما بعد السحب وسيلة لتعديل خصائص الألياف. قد يؤدي التعرض للمذيبات إما قبل أو أثناء السحب مباشرة إلى تغيير الخصائص الميكانيكية والهيكلية للألياف بشكل كبير17،38 ، مع ملاحظة أن السبيدروين المختلفة سيكون لها تفضيلات وتفاوتات مختلفة للمذيبات (على سبيل المثال ، مع ألياف الأسينيفورم المؤتلفة المتوافقة بدرجة عالية مع الماء26،31 مقابل ألياف الكمثري المؤتلفة التي تخضع للانكماش في الماء38 مقابل ألياف البيريفورم الأسينيفورم الخيمري التي تظهر توافق الماء مع أسينيفورم سبيدروين على الرغم من أن هذا أقل من نصف البروتين بالكتلة17).

يوفر البروتوكول الموصوف نهجا قابلا للتخصيص بدرجة كبيرة ومتعدد الاستخدامات لتقييم وتحسين خصائص الدوران والألياف لحرير العنكبوت المؤتلف. في جميع الحالات ، يجب تحليل ومقارنة خصائص الألياف الناتجة باستمرار وقوية. هنا ، نقترح استخدام الفحص المجهري البصري ، بما في ذلك الفحص المجهري الضوئي المستقطب ، واختبار الشد ، والتحليل الطيفي FTIR ك "مجموعة أدوات قياسية" للتقنيات لهذا الغرض. يمكن تطبيق تقنيات توصيف الفيزياء الحيوية والمواد الإضافية لتوسيع فهم الألياف الناتجة ، ولكن هذه المجموعة من التقنيات توفر تغطية رائعة للخصائص الرئيسية للتشكل ، والمحاذاة / تباين الخواص داخل الليف ، والأداء الميكانيكي ، والهيكلة الثانوية للبروتين. على وجه الخصوص ، على الرغم من أن التحليل الطيفي FTIR يوفر وسيلة مباشرة نسبيا لتقييم الهيكلة الثانوية لألياف الحرير والفحص المجهري الضوئي المستقطب يسمح باستنتاجات حول درجة المحاذاة الجزيئية المحسنة التي تم تحقيقها ، ومنهجيات أخرى مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للحالة الصلبة63،64 ، وحيود الأشعة السينية64 ، والتحليل الطيفي رامان المستقطب65 ، و / أو الفحص المجهري البصري غير الخطي54 يجب النظر في ذلك من أجل تقييم التبلور والمحاذاة والهيكلة بشكل أكثر شمولا داخل ألياف الحرير لتوضيح العلاقة الكاملة بين الهيكل والميكانيكا. نظرا لملاءمة الغزل الرطب لأنواع أخرى من البروتينات66 ، نتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلا للتطبيق بشكل عام خارج الحرير المؤتلف.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أبلغ Jan K. Rainey عن علاقة مع شركة 3DBioFibR Inc. تتضمن الأسهم أو الأسهم ومنح التمويل. المؤلفون الآخرون ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان عنهم.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل منح اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) (RGPIN-2020-06083 إلى X-QL و RGPIN-2023-05912 إلى JKR) ، وملحق وزارة الدفاع الوطني / NSERC (DGDND-2023-05912 إلى JKR) ، ومنحة تحالف NSERC (ALLRP-578541-22 إلى JKR) بالشراكة مع 3DBioFibR Inc ، ومنح أدوات وأدوات البحث NSERC. حصلت AG على منحة الدراسات العليا على مستوى الدكتوراه في نوفا سكوشا (NSGS-D) ومنحة الدراسات العليا في كلية الطب في دالهوزي 2024 بدعم من المتبرعين Molly Appeal. HB حاصلة على منحة Vanier Canada للخريجين الممولة من NSERC ، ومنحة Killam لما قبل الدكتوراه (المستوى 2) و NSGS-D. و SE حاصلة على منحة NSERC للدراسات العليا للدكتوراه (PGS-D) ، وجائزة NSERC / وزارة الدفاع الوطني للتمويل التكميلي ، وزمالة Walter C. Sumner التذكارية. يعرب المؤلفون عن امتنانهم للدعم الفني من صوفي هافرستوك وإميلي سميث.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،1،1،3،3،3-hexafluroropropanol (HFIP)445820500 Thermo Fisher Scientificتستخدم لتحضير المنشطات
حقنة 1725LTSN مع إبرة أسمنتية بطرف Luer   ؛هاميلتون81100يستخدم للغزل الرطب
2،2،2-ثلاثي فلورو الإيثانول (TFE)سيجما-ألدريتشT63002-500Gيستخدم لإعداد المنشطات
BP28184 الإيثانول المطلقفيشر العلمييستخدم لحمام التخثر   ؛
حمض الخليكفيشر العلميA38-212يستخدم لإعداد المنشطات
التوازن التحليليMettler Toledo   ؛جهاز اختبار الشدثنائي النطاق XS105
كلوريد الكالسيوم (CaCl2< / sub>)Sigma-AldrichC-3881يستخدم لتحضير المنشطات
حامض الستريك   ؛Millipore Sigma77-92-9يستخدم لإعداد المنشطات
الكمبيوترRaspberry Pi RaspberryPi 4 Model B   ؛ديفيس الغزل الرطب - يوفر القدرة على استخدام واجهة المستخدم الرسومية للتحكم في محركات السائر
فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Millipore Sigma7558-79-4يستخدم لتحضير المنشطات
حمض الفورميك   ؛فيشر العلميةA118-500تستخدم لإعداد المنشطات
الشرائح الزجاجية   ؛MilliporeSigma S8902-1PAKيستخدم لتركيب الألياف
حمض الهيدروكلوريك (HCl)EM ScienceHX0603-53يستخدم لإعداد المنشطات
MCT-A Cooled Detector  ؛Thermo Fisher Scientific840-199300تقييم FTIR للهيكل الثانوي للألياف
لوحة التركيبجهاز الغزل الرطبالمصنع في المنزل
NEMA 17 محرك السائر القطبي الحيويSTEPPERONLINE17HS15-1504S-X1جهاز الغزل الرطب - ملاحظة: محركات متعددة مطلوبة لأداء تمدد ما بعد الدوران
Nicolet iN10 FTIR المجهر الطيفيThermo Fisher Scientific912A0604تقييم FTIR للهيكل الثانوي للألياف
نيكوليت iN10 مرحلة رسم الخرائطثيرمو فيشر العلمي840-198800تقييم FTIR للهيكل الثانوي للألياف
Nicolet iN10 عصا التحكم الآلية   ؛Thermo Fisher Scientific840-199800تقييم FTIR للهيكل الثانوي للألياف
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350Thermo Fisher Scientific840-194800   ؛تقييم FTIR للهيكل الثانوي للألياف
OMNIC Picta الإصدار 1.7.224Thermo FisherScientific INQSOF018FTIR
OMNIC الإصدار 9.11.745معالجة وتحليل البيانات الخاص بجهازThermo FisherINQSOF018
الضوء البصري / المستقطب   مجهرزايس كنداأكسيو أوبزرفر A1مجهر ضوئي مقلوب
OriginPro 2025 10.2 SR1OriginLab CorporationOriginPro 10.200196برنامج معالجة وتحليل بيانات FTIR تابع لجهة خارجية
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم (KH2< / sub>PO4< / sub>)فيشر العلميP285-10يستخدم لتحضير المنشطات
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K2< / sub>HPO4< / sub>)فيشر العلميةBP363-500يستخدم لتحضير المنشطات
مزود الطاقةALITOVEALT-1205جهاز الغزل الرطب - محول محول مصدر طاقة 12 فولت 5 أمبير مدخل تيار متردد 100-240 فولت مع مقبس خرج تيار مستمر مقاس 5.5 × 2.5 مم - ملاحظة: للحصول على الأداء الأمثل ، قد يتطلب مصدر طاقة منفصل لكل محرك
أسيتات الصوديوم   ؛Sigma-AldrichS2889-1KGيستخدم لتحضير المنشطات
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)Millipore Sigma1310-73-2يستخدم لإعداد المنشطات
بكرات الغزل   ؛ملفقة داخلياتستخدم
لكابلات محرك السائرXMSJSIYB0BD5FV3R2جهاز الغزل الرطب - يوفر اتصالا من وحدات التحكم في محرك السائر إلى محركات السائر
وحدة التحكم في المحرك المتدرج (Pi HAT)AdafruitDC & محرك السائر قبعة ل Raspberry Piجهاز الغزل الرطب المحرك الباديل 1 - ملاحظة معدل دوران المحرك المحدود ~ 46 دورة في الدقيقة
وحدة التحكم في محرك السائر (USB)PoluluTic T249جهاز التحكم في المحرك الرطب التقليب 2 - استخدم عند الحاجة إلى دوران أسرع من 46 دورة في الدقيقة
مضخة حقنةKDScientific Model 100جهاز اختبار الشد وجهاز الغزل الرطب
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA)Millipore SigmaTX1276-7تستخدم لإعداد المنشطات
Tris-hydrochloride   ؛EMD Millipore9310-500GMتستخدم لإعداد المنشطات
USB HubAcasisB07Q3TYF15  ؛جهاز الغزل الرطب - محور USB يعمل بالطاقة 48 واط - ACASIS 10 منافذ USB 3.0 Data Hub - مع مفاتيح تشغيل / إيقاف فردية ومحول طاقة 12 فولت / 4 أمبير USB Splitter - واجهة بين وحدات التحكم في محرك السائر Raspberry Pi و Tic T249
برنامج التحكم في أداة برنامج FTIR الرطب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gosline, J. M., Demont, M. E., Denny, M. W. The structure and properties of spider silk. Endeavour. 10 (1), 37-43 (1986).
  2. Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J Exp Biol. 202 (23), 3295-3303 (1999).
  3. Lewis, R. V. Spider silk: Ancient ideas for new biomaterials. Chem Rev. 106 (9), 3762-3774 (2006).
  4. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New opportunities for an ancient material. Science. 329 (5991), 528-531 (2010).
  5. Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int J Biol Macromol. 24 (2-3), 271-275 (1999).
  6. Römer, L., Scheibel, T. The elaborate structure of spider silk: structure and function of a natural high performance fiber. Prion. 2 (4), 154-161 (2008).
  7. Altman, G. H., et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24 (3), 401-416 (2003).
  8. Fahnestock, S. R., Irwin, S. L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 23-32 (1997).
  9. Xia, X. -X., et al. Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (32), 14059-14063 (2010).
  10. Fahnestock, S. R., Bedzyk, L. A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 33-39 (1997).
  11. Bogush, V. G., et al. Recombinant analogue of spidroin 2 for biomedical materials. Dokl Biochem Biophys. 441, 276-279 (2011).
  12. Huemmerich, D., et al. Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr Biol. 14 (22), 2070-2074 (2004).
  13. Menassa, R., et al. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: Accumulation and field production. Plant Biotechnol J. 2 (5), 431-438 (2004).
  14. Hauptmann, V., et al. Native-sized spider silk proteins synthesized in planta via intein-based multimerization. Transgenic Res. 22, 369-377 (2013).
  15. Lazaris, A., et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295 (5554), 472-476 (2002).
  16. Xu, H. T., et al. Construct synthetic gene encoding artificial spider dragline silk protein and its expression in milk of transgenic mice. Anim Biotechnol. 18, 1-12 (2007).
  17. Ghimire, A., Xu, L., Liu, X. Q., Rainey, J. K. A recombinant chimeric spider pyriform-aciniform silk with highly tunable mechanical performance. Mater Today Bio. 26, 101073(2024).
  18. Wohlrab, S., et al. Cell adhesion and proliferation on RGD-modified recombinant spider silk proteins. Biomaterials. 33 (28), 6650-6659 (2012).
  19. Baker, L. A., et al. Nerve growth factor-binding engineered silk films promote neuronal attachment and neurite outgrowth. Adv Funct Mater. 32 (45), 2205178(2022).
  20. Kluge, J. A., Rabotyagova, O., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Spider silks and their applications. Trends Biotechnol. 26 (5), 244-251 (2008).
  21. Bakhshandeh, B., Nateghi, S. S., Gazani, M. M., Dehghani, Z., Mohammadzadeh, F. A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues. Int J Biol Macromol. 192, 258-271 (2021).
  22. Hijirida, D. H., et al. 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland. Biophys J. 71 (6), 3442-3447 (1996).
  23. Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid Crystalline Spinning of Spider Silk. Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).
  24. Doblhofer, E., Heidebrecht, A., Scheibel, T. To spin or not to spin: spider silk fibers and more. Appl Microbiol Biotechnol. 99, 9361-9380 (2015).
  25. Koeppel, A., Holland, C. Progress and trends in artificial silk spinning: A systematic review. ACS Biomater Sci Eng. 3 (3), 226-237 (2017).
  26. Xu, L., Weatherbee-Martin, N., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Recombinant silk fiber properties correlate to prefibrillar self-assembly. Small. 15 (12), 1805294(2019).
  27. Teulé, F., et al. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat Protoc. 4 (3), 341-355 (2009).
  28. Yang, M., Kawamura, J., Zhu, Z., Yamauchi, K., Asakura, T. Development of silk-like materials based on Bombyx mori and Nephila clavipes dragline silk fibroins. Polymer. 50 (1), 117-124 (2009).
  29. Lewis, R. V., Hinman, M., Kothakota, S., Fournier, M. J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Express Purif. 7 (4), 400-406 (1996).
  30. Arcidiacono, S., et al. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
  31. Weatherbee-Martin, N., et al. Identification of wet-spinning and post-spin stretching methods amenable to recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 17 (8), 2737-2746 (2016).
  32. Schmuck, B., et al. Strategies for making high-performance artificial spider silk fibers. Adv Funct Mater. 34 (35), 2305040(2024).
  33. Xu, L., et al. Structural and mechanical roles for the C-terminal nonrepetitive domain become apparent in recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 18, 3678-3686 (2017).
  34. Xu, L., Rainey, J. K., Meng, Q., Liu, X. Q. Recombinant minimalist spider wrapping silk proteins capable of native-like fiber formation. PLoS One. 7 (11), e50227(2012).
  35. Exler, J. H., Hümmerich, D., Scheibel, T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. Angew. Chem, Int Ed. 46 (19), 3559-3562 (2007).
  36. Teulé, F., Furin, W. A., Cooper, A. R., Duncan, J. R., Lewis, R. V. Modifications of spider silk sequences in an attempt to control the mechanical properties of the synthetic fibers. J Mater Sci. 42, 8974-8985 (2007).
  37. Khan, A. Q., et al. Innovations in spider silk-inspired artificial gel fibers: methods, properties, strengthening, functionality, and challenges. SusMat. 4 (3), e205(2024).
  38. Simmons, J. R., Xu, L., Rainey, J. K. Recombinant pyriform silk fiber mechanics are modulated by wet-spinning conditions. ACS Biomater Sci Eng. 5 (10), 4985-4993 (2019).
  39. Seidel, A., Liivak, O., Jelinski, L. W. Artificial spinning of spider silk. Macromolecules. 31 (19), 6733-6736 (1998).
  40. Venkatesan, H., et al. Artificial spider silk is smart like natural one: Having humidity-sensitive shape memory with superior recovery stress. Mater Chem Front. 3 (11), 2472-2482 (2019).
  41. Sommer, C., Scheibel, T. Suitable electrospinning approaches for recombinant spider silk proteins. Open Ceramics. 15, 100420(2023).
  42. Wang, M. Y., et al. Dry-spinning of artificial spider silk ribbons from regenerated natural spidroin in an organic medium. Macromol Rapid Commun. 44 (12), 2300024(2023).
  43. Chang, M., Zhang, X., Yang, Z. Artificial metal-ion doped spider silk fibers with excellent mechanical property and humidity-driven actuator property. Macromol Chem Phys. 226 (10), 2400502(2025).
  44. Kang, E., et al. Digitally tunable physicochemical coding of material composition and topography in continuous microfibres. Nat Mater. 10 (11), 877-883 (2011).
  45. Lin, B., et al. Overexpressed artificial spidroin based microneedle spinneret for 3D air spinning of hybrid spider silk. ACS Nano. 18 (37), 25778-25794 (2024).
  46. Gonska, N., et al. Structure-function relationship of artificial spider silk fibers produced by straining flow spinning. Biomacromolecules. 21 (6), 2116-2124 (2020).
  47. Blackledge, T. A., Cardullo, R. A., Hayashi, C. Y. Polarized light microscopy, variability in spider silk diameters, and the mechanical characterization of spider silk. Invert Biol. 124 (2), 165-173 (2005).
  48. Greco, G., et al. Properties of biomimetic artificial spider silk fibers tuned by postspin bath incubation. Molecules. 25 (14), 3244(2020).
  49. Andersson, M., et al. Biomimetic spinning of artificial spider silk from a chimeric minispidroin. Nat Chem Biol. 13 (3), 262-264 (2017).
  50. Tremblay, M. L., et al. Spider wrapping silk fibre architecture arising from its modular soluble protein precursor. Sci Rep. 5 (1), 11502(2015).
  51. Schmuck, B., et al. Impact of physio-chemical spinning conditions on the mechanical properties of biomimetic spider silk fibers. Commun Mater. 3 (1), 83(2022).
  52. Yue, X., et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution. Mater Lett. 128, 175-178 (2014).
  53. Sulekha, A., et al. An engineered recombinant spider silk protein providing disulfide-locked control over self-assembly and fiber formation. Adv Funct Mater. 35 (15), 2420254(2025).
  54. Harvey, M., Ghimire, A., Cisek, R., Kreplak, L., Rainey, J. K., Tokarz, D. Polarization-resolved second harmonic generation microscopy of silk fibers is sensitive to β-sheet orientation and molecular structure. ACS Appl Bio Mater. 8 (6), 5229-5238 (2025).
  55. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  56. Huan, Y., et al. Experimental study of the mechanical properties of a novel supramolecular polymer filament using a microtensile tester based on electronic balance. Exp Tech. 40, 737-742 (2014).
  57. Hu, X., Kaplan, D., Cebe, P. Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy. Macromolecules. 39 (18), 6161-6170 (2006).
  58. Breslauer, D. N. Current progress on scale-up and commercialization of microbially-produced silk. Adv Funct Mater. 35 (15), 2408386(2025).
  59. Branković, M., et al. Review of spider silk applications in biomedical and tissue engineering. Biomimetics. 9 (3), 169(2024).
  60. Pan, L., et al. A supertough electro-tendon based on spider silk composites. Nat Commun. 11 (1), 1332(2020).
  61. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
  62. Malay, A. D., et al. Spider silk self-assembly via modular liquid-liquid phase separation and nanofibrillation. Sci Adv. 6 (45), eabb6030(2020).
  63. Asakura, T., Naito, A. Structure of spider silk studied with solid-state NMR. Adv Funct Mater. 35 (15), 2407544(2024).
  64. Yarger, J. L., Cherry, B. R., Van Der Vaart, A. Uncovering the structure-function relationship in spider silk. Nat Rev Mater. 3 (3), 1-11 (2018).
  65. Lefèvre, T., Paquet-Mercier, F., Rioux-Dubé, J. F., Pézolet, M. Structure of silk by Raman spectromicroscopy: from the spinning glands to the fibers. Biopolymers. 97 (6), 322-336 (2012).
  66. Schiller, T., Scheibel, T. Bioinspired and biomimetic protein-based fibers and their applications. Commun Mater. 5 (1), 56(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
Posted by JoVE Editors on 9/08/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68714

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة