Method Article

إجراء استئصال/خياطة العصب الوركي للفأر لدراسة إصلاح الأعصاب والتعافي الوظيفي

DOI:

10.3791/68724

⸱

January 16th, 2026

 , 
1Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cell Systems and Anatomy, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 3Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نموذج قطع وإعادة العصب الوركي في الفئران لدراسة تجديد الأعصاب الطرفية باستخدام خلايا عصبية العقد الظهرية الظهرية البالغة. يتيح التحليل الحي لنمو المحاور العصبية، وإعادة تعصيب العضلات، والتعافي الوظيفي بعد إصابة الأعصاب.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصلاح الأعصاب ضروري لاستعادة الوظيفة بعد إصابة المحاور المحورية. ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية الناضجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لديها قدرة محدودة على تجديد محاورها بعد الإصابة بسبب انخفاض القدرة على النمو الداخلي والبيئة المعادية. على النقيض من ذلك، تظهر الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) إمكانات تجديدية قوية. من بينها، تشتهر خلايا العقد الظهرية الظهرية (DRG) البالغة بقدرتها على التجدد بفعالية بعد إصابات الأعصاب الطرفية، مما يجعلها نموذجا مثاليا لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء إصلاح الأعصاب. هنا، يتم وصف تقنية خياطة دقيقة معدلة تسمى "الحلقة قبل القطع" لتوليد نموذج قطع وإعادة القطع في العصب الوركي في الفئران، تليها تحليل تجديد المحاور العصبية. كما ثبت أن التقييمات السلوكية وإعادة تعصيب العضلات تقيم التعافي الوظيفي. بعد قطع وإعادة العصب الوركي، تظهر في البداية عيوب سلوكية، لكن عادة ما يلاحظ التعافي الكامل بحلول 30 يوما من الإصابة. تطبيق أدوية تعزز اندماج المحوريات في موقع الإصابة يسرع بشكل كبير من التعافي الوظيفي. يقدم هذا النظام النموذجي أداة قوية للتحقيق في الآليات التي تحكم إصلاح الأعصاب في الجسم الحي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصابة المحاور هي نتيجة شائعة وشديدة لتلف الدماغ والحبل الشوكي، وغالبا ما تحدث بسبب إصابات رضحية أو سموم عصبية أو اضطرابات عصبية تعطل الاتصال العصبي وتعيق تجدد المحاورالمحورية 1,2. ليست الخلايا العصبية الشاملة تمتلك قدرة جوهرية على التجدد، وهو أمر ضروري لإصلاح المحاور العصبية المقطوعة. يتأثر معدل تجدد المحوريات العصبية بعدة عوامل، منها إمكانات النمو الجوهرية للعصبون، وكفاءة تخليق البروتين، وديناميكيات الهيكل الخلوي، وإزالة بقايا الميلين، وتوفر عوامل النمو3،4.

في الجهاز العصبي المركزي للثدييات البالغة (CNS)، تؤدي إصابة المحور العصبي إلى تقليل القدرة التجديدية، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص العوامل الدافعة للنمو الداخلي ووجود إشارات خارجية مثبطة 1,5. على النقيض من ذلك، تمتلك المحاور العصبية في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) قدرة قوية على التجدد بعد الإصابة، وذلك بفضل آليات الإصلاح الذاتي الذاتية الجوهرية للخلايا العصبية الطرفية وإعادة التنشيط السريعة لبرامج النمو الإيجابي للتجدد. عند الإصابة، ينفصل الجزء البعيد من المحور عن السوما العصبية ويخضع لتنكس واليري، يتميز بتفكك وتجزئة المحاورالعصبية 6,7. إزالة الخلايا الدبقية بكفاءة لبقايا المحور العصبي والميالين ضرورية لنجاح التجدد، لأنها تمنع تكون الندوب التي قد تعيق نمو المحور3،8. تدعم هذه العملية، إلى جانب إعادة تشكيل الهيكل الخلوي للمحاور العصبية المصابة، نمو الجذع القريب وتسهل إعادة تعصيب الهدف. تحدث هذه الأحداث في مراحل متداخلة جزئيا، حيث يؤدي تنشيط عوامل النسخ الناتجة عن الإصابة مثل ATF3 وc-Jun إلى تعزيز برامج التعبير الجيني المؤيدة للتجدد 4,9,10.

يمثل الاندماج المحوري التجديدي آلية فعالة لاستعادة الترابط العصبي بعد إصابة المحاور العصبية11. تم وصف هذه العملية لأول مرة في سرطان البحر Procambarus clarkii عام 196712، ومنذ ذلك الحين تم توثيقها عبر عدة أنواع13، 14، 15، 16، بما في ذلك Caenorhabditis elegans17. على الرغم من أن الأدلة المباشرة على اندماج المحاور العصبية في الثدييات لا تزال محدودة، إلا أن استراتيجيات تحفيز الاندماج تم استخدامها بنجاح لتعزيز إصلاح الأعصاب11. ومن الجدير بالذكر أن المادة الكيميائية الفوزوجين البولي إيثيلين غليكول (PEG) تعزز إعادة إغلاق الأغشية، وقد ثبت أنها تسهل التعافي الوظيفي بعد إصابات الأعصاب الطرفية والحبل الشوكي في نماذج الثدييات18، 19، 20، 21، 22، 23، 24. تشير النتائج الحديثة إلى أن استنزاف الجلوتاثيون بيروكسيداز (GPX) كاف لتعزيز الاندماج المحوري في C. elegans25. وبالمثل، أظهرت فئران الضربة القاضية الشرطية ل Gpx4 أو تلك التي عولجت بمثبط GPX ML162 تعافيا وظيفيا متسارعا بعد قطع العصب الوركي، ربما من خلال تعزيز دمج المحاور المحورية25.

العصب الوركي هو عصب مختلط يتكون من محاور حسية، حركية جسدية، وعصبية حركية ذاتية26. ينشأ من الأجزاء الفقرية L4 وL5 في الفئران27، ومن الأجزاء L3 وL4 في الفئران28. وبفضل سهولة الوصول إليها واتساقها التشريحي، أصبحت إصابة العصب الوركي واحدة من أكثر النماذج استخداما لدراسة تجديد الأعصاب الطرفية29,30. تمكن هذه النماذج من دراسة كل من الآليات العصبية الداخلية والعوامل البيئية الخارجية التي تؤثر على نمو المحور واستعادة الوظائف 3,4,9. يعود استخدام سحق العصب الوركي كنموذج تجريبي في علم الأعصاب إلى أواخر القرن التاسععشر 29. بالإضافة إلى نماذج سحق الأعصاب، يستخدم قطع الأعصاب على نطاق واسع لدراسة تجديد المحاور واستعادة الوظائف الوظيفية. ومع ذلك، فإن الاستئصال الكلاسيكي للعصب الوركي يليه الغرز في الفئران غالبا ما يكون أقل قابلية للتكرار وموثوقية مقارنة بالفئران، بسبب صغر حجم العصب وملمسه الهش31.

باستخدام نموذج معدل لقطع وإعادة العزف الوركي يسمى "الحلقة قبل القطع"، تم إنتاج نماذج إعادة إنتاج وإعادة إنتاج العصب الوركيالقابلة للتكرار بنجاح 25. يلغي هذا النهج الحاجة إلى التعامل مع الأعصاب بعد القطع عن طريق إدخال الغرز مسبقا قبل القطع، مما يقلل من الإجهاد الميكانيكي ويقلل من التغيرات الناتجة عن التقنية الجراحية. وجد أن مستويات معتدلة من تعديل GPX تساهم في التعافي الوظيفي بعد الاستئصال الكامل للعصب الوركي في الفأر25. وقد عزز العلاج المشترك للتركيزات المنخفضة ML162 (0.25 ميكرومولار)32، ومثبط GPX، والبولي إيثيلين جليكول (PEG، 500 مللي مول) 18، 19، 20، 21، 22، 23، 24 على قطع العصب الوركي (SNT) / آفة الاستعادة بنجاح من درجة السلوك التي تم تقييمها بواسطة اختبار الوخز، وعدم تماثل صدع القدم، واختبار انتشار الأصابع25,33.34. تدهور شظايا المحاور العصبية البذرية الببتور من خلايا العقد الظهرية للثدييات (DRG) خلال 3 أيام، مما يؤدي إلى اضطراب الوصلات العصبية العضلية (NMJ)6,35، وتقوم خلايا DRG المتجددة بإعادة تعصيب العضلات لاستعادة وظائفها. أظهرت مجموعة العلاج المشترك SNT/Resutur-ML162/PEG تعصيبا في NMJ وتحسينات سلوكية في النقطة الزمنية المبكرة (بعد 3 أيام من العملية)، مما يشير إلى تعافي مبكر للوظيفة العضليةالعصبية 25.

هنا، يتم وصف طريقة الخياطة المجهرية "الحلقة قبل القطع" وإعطاء الدواء الذي مكن من الملاحظات السابقة في الفئران. تمتعديل بروتوكول PEG-fusion الذي تم تأسيسه سابقا، والذي يمكن من إصلاح أعصاب الفئران المقطوعة بسرعة. تم الإبلاغ في البداية عن أن البولي إيثيلين غليكول (PEG) يعزز إعادة الاتصال الخارجية لمحاور السرطان العملاقة الوسطى (MGA) في المختبر. حسنت بروتوكولات دمج PEG النتائج السلوكية في 25٪-30٪ من التجارب التي شملت إصابات الانفصال الساحق في العصب الوركي للجرذ، رغم أن التعافي الوظيفي لم يلاحظ في وقت مبكر من النقاط34. أما التحسينات اللاحقة فقد دمجت مفهوم ختم الغشاء الداخلي37. بعد إصابة الأعصاب، يكون الإصلاح السريع للبلازماليم وقائيا عصبيا ويمنع التنكس العصبي. يسهل تراكم الحويصلات المرتبطة بالغشاء بواسطة Ca2+ عملية الإغلاق هذه38. يؤدي القطع الكامل للعصب إلى تعطيل المحور المحوري وكذلك الأغلفة الداخلية العصبية والمحيط بالعصب وفوق العصب في موقع الآفة. الخياطة الدقيقة للغمد فوق العصب تصطف جذوع الأعصاب القريبة والبعيدة. خلال خطوة الخياطة، يقلل استخدام محلول ملحي منخفض التوتر الخالي من Ca2+ من تكوين الحويصلات المحيطة بالغشاء، مما يحافظ على فتح الأغلفة الداخلية والداخلية وحول العصب ويسمح بتقارب الدوائر فوق العصب عن كثب. بعد ذلك، يؤدي تطبيق محلول ملحي يحتوي على Ca2+ إلى تراكم الحويصلات لإغلاق الاضطراب البلازميالمتبقي 18.

في هذا البروتوكول، تم استخدام فئران FVB البالغة (8-10 أسابيع) وفئران C57BL/6، ولم يلاحظ فرق خاص بالسلالة. يقع العصب الوركي في الفئران على بعد حوالي 1-2 مم تحت عضلة الأرداف عند منتصف الفخذ، وهو أرق وأكثر هشاشة بشكل ملحوظ من الفئران، مما يتطلب دقة جراحية أكبر أثناء التشريح والخياطة. يجب توخي الحذر لتجنب تمدد الأعصاب الزائد أو التلاعب المفرط الذي قد يضر بالتعافي الوظيفي. تتضمن هذه الطريقة قطع العصب بالكامل، مما يؤدي إلى وجود فجوة فيزيائية بين الجذع القريب والبعيد. نظرا لأن هذه الفجوة تعيق التجدد المباشر، فإن التعافي الناجح عادة ما يتطلب التدخل الجراحي المجهري أو ترقيع الأعصاب.

نظرا لأن عصب الورك الفأر أرق وأكثر حساسية من العصب الوركي الفأر، فإن دقة جراحية أكبر مطلوبة. على الرغم من أن الخياطة الدقيقة شائعة، إلا أنها قد تسبب عن غير قصد إصابات إضافية بسبب التلاعب المفرط أو تكرار مرور الإبر39. يمكن أن تؤدي هذه القيود إلى وجود تفاوين وقد تربك تقييم استراتيجيات العلاج الجديدة. لذلك، فإن تحقيق نتائج جراحية متسقة مع تقليل تلف الأعصاب الناتج عن الغرز أمر ضروري لتقييم التعافي الوظيفي بشكل موثوق في نماذج قطع الأعصاب. باستخدام هذه الطريقة "الحلقة قبل القطع"، تم توليد نماذج قابلة للتكرار لقطع العصب الوركي وإعادة التشغيل، وتم تقييم تأثيرات العلاج المزدوج ب PEG وML162 على التعافي الوظيفي. بشكل عام، وعلى الرغم من استخدامه الواسع، يشكل نموذج قطع العصب الوركي للفأر تحديات تقنية بسبب صغر حجم العصب وهشاشته. تعالج هذه الطريقة المعدلة للعلاج الموضحة هنا حاجة ملحة لبروتوكول جراحي دقيق موحد وقابل للتكرار يقلل من الضرر الميكانيكي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع إجراءات وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام المؤسسية (IACUC) في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو (رقم البروتوكول: 20200082AR). تم استخدام فئران FVB البالغة الذكور والإناث (8-10 أسابيع، وزنها 20-25 جرام) في إجراءات JoVE التجريبية الموضحة هنا. تم استخدام فئران C57BL/6 (عمرها 8-10 أسابيع، وزنها 20-25 جرام) فقط في العمليات الجراحية التمهيدية التي أجريت قبل التجارب الرسمية لتحسين التعامل ودقة الخياطة. أكدت هذه الجلسات التدريبية أن إجراء "الحلقة قبل القطع" أنتج نتائج مماثلة في كلا السلالتين؛ لذلك، تم الحصول على جميع البيانات الرسمية المقدمة في هذا المخطوطة من فئران FVB. تم تضمين ما مجموعه عشرة فئران FVB (خمسة ذكور وخمس إناث) في البداية لقطع العصب الوركي تلاها علاج ML162 + PEG. أظهر واحد تغيرا تشريحيا خلقيا حيث انقسم العصب الوركي إلى فرعين رئيسيين قبل موقع القطع، مما أدى إلى جراحة غير مكتملة واستبعاد من التحليل. لذلك، أجريت تحليلات سلوكية ونسيجية على تسعة (n = 9). أظهر كلا الجنسين تعافيا تجديديا وسلوكيا متقاربا، ولم تلاحظ أي فروق جنسية محددة. خضع فأر إضافي لاختراق غرزتين دون قطع عصبي (تحكم وهمي) لتقييم التأثير المحتمل لإجراء الغرز نفسه على النتائج السلوكية. لم تلاحظ فروق ملحوظة في الاستجابة التجددية بين الجنسين. تم إيواء في ظروف قياسية مع دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة، عند 75 درجة فهرنهايت ورطوبة نسبية بين 40٪-60٪، مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل مرضي. تم استخدام كل من الفئران الذكور والإناث، ولم يلاحظ فرق ملحوظ بين الذكور والإناث. أجريت العمليات الجراحية تحت تخدير إيزوفلوران من نظام التخدير منخفض التدفق سومنوسويت. تم إجراء اختبارات سلوكية بدءا من اليوم الثاني بعد العملية، وتكررها في الأيام 4، 7، 10، 14، 18، 22، و27، كما هو موضح في الأرقام المقابلة. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. استئصال/إعادة العصب الوركي والعلاج بالأدوية

  1. ضع على وسادة ساخنة حيث يمكن ملاحظة العصب الوركي تحت مجهر تقطيع صوتي (الشكل 1A).
  2. تخدير الفأرة باستخدام نظام التخدير منخفض التدفق SomnoSuite.
    ملاحظة: تأكد من عمق التخدير من خلال غياب استجابات ردود فعل، مثل رد الفعل على قرص إصبع القدم، قبل بدء الجراحة. ضع مرهم العيون البيطري على العينين لمنع جفاف القرنية.
  3. احلق شعر الفخذ وحوله.
    ملاحظة: أزل الشعر الحليق والمتساقط بأكبر قدر ممكن من النظافة. وإلا، سيلتصق الشعر بخياطة النايلون 10-0 ويلوث العصب الوركي. يمكن إزالة الشعر المتبقي بلطف باستخدام شريط المختبر أو شريط اللاصق بعد الحلاقة لضمان نظافة الحقل الجراحي. قم بتعقيم موقع الجراحة بمسح المنطقة المحلقة بشكل متسلسل بنسبة 70٪ إيثانول وبيتادين، ومسح نهائي بنسبة 70٪ إيثانول باستخدام كرات قطنية معقم الجهاز.
  4. حدد موقع عظم الفخذ وقم بعمل شق جلدي صغير بحجم حوالي 1.0 سم (النطاق 0.8-1.2 سم) عند منتصف الفخذ، وحوالي ~1 مم خلفيا وبالتوازي مع عظم الفخذ باستخدام مقص جراحي دقيق.
    1. اسحب عضلة الألوية الكبرى بلطف لكشف عضلات البايسبس الفخذية الأساسية. ثم استخدم أطراف المقص لفصل رؤوس عضلة الفخذ الأمامية والخلفية برفق، دون قطع، لكشف العصب الوركي تحت الشق الوركي. تتم هذه الخطوات تحت المراقبة البصرية المباشرة، وليس تحت المجهر.
  5. اسحب العصب الوركي خارج الجسم باستخدام ملقط دقيق لتسهيل الجراحة على العصب الوركي (الشكل 1A).
    ملاحظة: ثبت الملقط بشريط لاصق لمنع انتشاره إلى ما بعد مستوى معين لتقليل الضرر في العصب الوركي. ضع طرف الملقط تحت العصب الوركي وارفع العصب الوركي للأعلى باستخدام فخذ الفأر كنقطة ارتكاز. احرص على رفع العصب فقط بالقدر المطلوب لتسهيل الخياطة، وتجنب تطبيق الشد أو سحبه للخارج، لأن التمدد الزائد قد يضر المحاور أو الهياكل المحيطة.
  6. ركز المجهر على العصب الوركي المكشوف. من هذه الخطوة، تقدم عبر الخطوة 15 باستخدام المجهر (الشكل 1A).
  7. اخترق العصب الوركي مرتين بخيط نايلون 10-0 (الشكل 1B,C). اذهب إلى الخطوة 1-8 للتحكم غير المقطوع. اذهب إلى الخطوة 1-11 لعملية قطع الأعصاب.
    ملاحظة: تم إجراء اختراق على بعد حوالي عرض عصب واحد (~0.7 مم)، موضوعين بشكل متماثل على جانبي موقع القطع المقصود. هذا التباعد ضمن محاذاة صحيحة للجذوع القريبة والبعيدة مع تقليل الإجهاد الميكانيكي عند الآمة. قم بالاختراق عبر مركز العصب الوركي مع الخياطة، مع التأكد من أن الاختراقين اللذين يحدثان بواسطة الغرز متوازيان تماما. غرز 10-0 صغيرة ويجب التحكم بها باستخدام ملقط فائق النقة. تم استخدام نايلون 10-0 غير المتصاص لأنه يوفر استقرارا ممتازا في الشد وتفاعل الأنسجة النسيجية خلال فترة المراقبة التي تستمر 30 يوما. تستخدم هذه المادة على نطاق واسع في نماذج إصلاح الأعصاب الجراحية المجهرية في الفئران والجرذان18,31. لم تستخدم الغرز القابلة للامتصاص لأن التدهور التدريجي قد يؤثر على محاذاة جذوع الأعصاب المقطعة قبل اكتمال التعافي الوظيفي. لتقليل التفاوت المعتمد على المشغل، أجريت جميع العمليات الجراحية بواسطة جراح واحد مدرب بعد ممارسة مكثفة للجراحة المجهرية تحت المجهر المجسم. طريقة "الحلقة قبل القطع" نفسها تقلل من التباين أكثر من خلال إلغاء الحاجة إلى التلاعب بالأعصاب بعد القطع، مما يضمن محاذاة وتوتر متسقين بين. وهذا يتطلب تدريبا كبيرا ومستوى عال من مهارات السيطرة. قبل إجراء جراحات، قد يجد المبتدئون أنه من المفيد ممارسة حركة الخياطة باستخدام خيوط صناعية دقيقة مثل خيوط الأسنان لتطوير المهارة والتحكم تحت المجهر المجسم.
  8. اربط عقدة بحذر بخياطة النايلون.
  9. ضع العصب الوركي المكشوف تحت طبقة العضلات وأغلق الجلد باستخدام غرز نايلون 4-0.
  10. حدد أن الاختراق المزدوج للعصب الوركي باستخدام خياطة نايلون 10-0 لا يؤثر على سلوك الفأر.
    ملاحظة: لتأكيد ذلك، خضعت الفئران التي خضعت لاختراق الغرز المزدوج دون قطع لنفس الاختبارات السلوكية المستخدمة في المجموعات التجريبية، بما في ذلك وخز الدبابيس، وعدم تماثل صدع القدم، وانتشار الأصابع. حققت هذه الفئران باستمرار درجات كاملة تعادل النقاط غير العملية للتحكم البري الطبيعي، مما يشير إلى أن إجراء الخياطة وحده لم يؤثر على وظيفة العصب الوركي.
  11. اقطع العصب الوركي في منتصف الطريق بين غرزتي النايلون 10-0 باستخدام مشرط (الشكل 1D).
    ملاحظة: لتقليل التباين، أجريت جميع العمليات الجراحية من قبل نفس المجرب المدرب باستخدام إجراء موحد. بالإضافة إلى ذلك، يقلل تصميم "الحلقة قبل القطع" من التنوع بطبيعته من خلال تجنب التعامل مع الأعصاب بعد القطع، مما يضمن وضع الغرز المتسق والتوتر عبر جميع. تم التحقق من موقع الغرز تحت مجهر تشريح لضمان التجانس بين.
  12. ضع الملقط جانبا.
  13. غسل العصب المقطوع بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات خالي من الكالسيوم2+ (PBS؛ 137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار Na2HPO4/NaH2PO4، pH 7.4)، معدا بدون كلوريد الكالسيوم.
    ملاحظة: اشطف جذع العصب المقطوع بمادة PBS خالية من الكالسيوم لمدة تقارب 10-20 ثانية لتنظيف الدم ومنع الإغلاق المبكر. يجب إكمال إعادة الخياطة بسرعة خلال دقيقة إلى دقيقتين للحفاظ على المحاذاة وصلاحية الأنسجة.
  14. قم بإزالة PBS الخالي من Ca2+ عن طريق امتصاصه باستخدام منديل.
  15. اربط عقدة بعناية باستخدام خياطة النايلون (الشكل 1E). تابع إلى الخطوة 20 إذا لم يكن العلاج مخططا له أو مطلوبا.
    ملاحظة: كان يستخدم عقدة مربعة قياسية للخياطة المجهرية، تتكون من رميين متقابلين يتم شدهما بلطف باستخدام ملقط دقيق تحت المجهر المجسم. يعود المحوران المنفصلان المتصلان بالخياطة إلى شكل قريب من شكلهما الأصلي. يمكن أن يكون إعادة اتصال وعاء دموي مقطوع مؤشرا بصريا على أن جذوع الأعصاب القريبة والبعيدة مصطفة بشكل صحيح. خلال الإجراء، يجب أن تبدو الأنسجة منتعشة ورطبة، دون شحوب أو ضغط. تجنب ربط الخيط بإحكام زائد، لأن ذلك قد ينهار الأوعية الدموية أو يشوه العصب. قبل ربط العقدة النهائية، تأكد من أن نهايات العصب متقارب دون شد. إذا لزم الأمر، أعد وضع الطرف بلطف لتسهيل المحاذاة الطبيعية بدلا من سحب العصب، لأن التوتر الزائد قد يزيد من خطر الإصابة بالورم العصبي أو التليف.
  16. ضع 0.25 ميكرومولار من ML162 في DMSO مخفف في PBS على العصب الوركي المخيط باستخدام حقنة. دع العصب الوركي المخروط يغمر في الدواء لمدة دقيقة واحدة.
  17. قم بإزالة ML162 عن طريق امتصاصه بمكشوف قطني معقم.
  18. ضع 500 مللي مول من PEG في ماء مقطر، مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية على العصب الوركي المخيط باستخدام حقنة. دع العصب الوركي المخروط يغمر في الدواء لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: 500 مللي مول من PEG هو محلول كثيف قد يصبح صلبا عند درجة حرارة غرفة العمليات. ضع الحقنة على وسادة ساخنة أثناء التشغيل لضمان بقاء PEG سائلا. يعتقد أن PEG يعزز اندماج الغشاء عن طريق إزالة جزيئات الماء من بين طبقات الدهون الثنائية المتجاورة، مما يتيح تلامسا وثيقا بين الغشاء والاندماج التلقائي. على الرغم من أن الآلية الجزيئية الدقيقة لا تزال قيد البحث، فقد ثبت أن هذا النهج يسهل استمرارية المحور العصبي ويعزز التعافي الوظيفي في نماذج إصابات الأعصاب الطرفية.
  19. قم بإزالة PEG عن طريق امتصاصه بواسطة منديل.
  20. غسل العصب المخيط ب PBS يحتوي على Ca2+ (PBS مدعوم ب 1 ملم CaCl2؛ 137 ملليمولار NaCl، 2.7 ملليمولار KCl، 10 ملليمولار فوسفات مخزن، pH7.4).
  21. قم بإزالة PBS الذي يحتوي على Ca2+ عن طريق امتصاصه بواسطة منديل.
  22. ضع العصب الوركي المكشوف تحت طبقة العضلات وأغلق الجلد باستخدام غرز نايلون 4-0.
  23. بمجرد أن يتعافى من التخدير، أعده إلى قفصه.
    ملاحظة: بعد إغلاق الجلد، تم علاج موقع الجراحة بمرهم مضاد حيوي موضعي يحتوي على مسكن للألم. كان كل يراقب على وسادة تدفئة حتى يستعيد وعيه بما يكفي للحفاظ على الاستلقاء في عظم القص. ثم تم إيواء بشكل فردي وإعادتها إلى مجموعتها فقط بعد استعادة وظيفتها الحركية بالكامل. على الرغم من أن البيئة الجراحية لم تحافظ عليها تحت غطاء تدفق طبقي، إلا أن جميع الأدوات الجراحية كانت معقمة، وأجريت الإجراءات باستخدام تقنية معقمة باستخدام الأيدي المغطاة بالقفازات وأدوات المعقمة.

2. اختبار السلوك - وخز دبوس

ملاحظة: لتقييم استجابة الحساسية الميكانيكية عالية العتبة بعد الإصابة33.

  1. ضع الفأرة في شبكة سلكية ودعها تتجول بحرية لمدة 30 دقيقة لتعتاد على البيئة الجديدة.
  2. الجزء الجانبي الأعلى من السطح الأخمصي للكف الخلفي كان مقسما إلى 5 مناطق (من A إلى E). ضع بلطف عصا Austerlitz (مقاس 000) على سطح الأخمص في الكف من نفس الجانب. تم تطبيق وخز الإصبع مرتين من أعلى إصبع قدم جانبي (المنطقة A) إلى الكعب (المنطقة E).
    ملاحظة: لا تخترق الجلد.
    ملاحظة: تم اعتبار الاستجابة إيجابية عندما أزال مخلبه بسرعة من المحفزتين الصغيرتين. تم تقييم الفأرة 1 لهذه المنطقة ثم تم اختبارها للمنطقة التالية (الحد الأقصى 5). إذا لم تحظ أي من الطلبات باستجابة إيجابية، كانت الدرجة الإجمالية 0. استخدم المنطقة الصافنة لنفس الجانب المقابل كتحكم إيجابي. سيثير ذلك دائما رد فعل إيجابي.

3. اختبار السلوك - عدم تماثل صدع القدم (FF)

ملاحظة: لقياس مدى قدرة المحاور الوركي على تعصيب العضلات القريبة34.

  1. اسمح للحيوانات بالتجول بحرية على شبكة سلكية مرتفعة على القفص لتعتاد على البيئة. تتكون إحدى التجارب من 50 خطوة إجمالية لكل طرف خلفي.
  2. سجل عندما تخطئ. معايير التسجيل هي كما يلي.
    النتيجة 1: خطأ جزئي. سحبت الساق قبل أن تسقط الساق بالكامل إلى الفخذ.
    النتيجة 2: الخطأ الكامل. سقط تماما إلى منطقة الفخذ.
  3. احسب درجة الخطأ المركبة في القدم من جميع الأطراف الخلفية المصابة وغير المصابة في كل وقت بعد العملية.
    درجة عطل القدم المركبة = (# أعطال جزئية × 1) + (# أعطال كاملة × 2)
  4. اقسم درجة صدع القدم المركب على 50 (إجمالي الخطوات/الطرف) للحصول على نسبة الصدع لكل طرف خلفي.
    ٪ خطأ القدم = درجة عطل القدم المركبة/50 (إجمالي الخطوات) × 100٪
  5. اطرح صدوع القدم في الطرف الخلفي المصاب من نسبة صدوع القدم في الطرف الخلفي السليم للحصول على درجة عدم تماثل لكل في وقت ما بعد الجراحة.
    درجة عدم التماثل في القدم (FF) = ٪FF (الطرف السليم) - ٪FF (الطرف المصاب)

4. اختبار السلوك - انتشار أصابع القدم

ملاحظة: لتقييم التعافي الحركي بعد إصابة الأعصاب. وفقا لدراسة سابقة، اختبار انتشار حركة إصبع القدم أكثر حساسية من تحليل المشي للكشف عن تعافي الوظائف الحركية بعد إصابة العصب الوركي30.

  1. غط بلطف بقطعة قماش وارفع الذيل لرؤية الأقدام الخلفية بوضوح.
    ملاحظة: بديل: أمسك مؤخرة مؤخرة الفأر بلطف، ثبت الذيل، قلبه، واجعل الفأر يتلوى لمراقبة حركة إصبع القدم.
  2. امنح النتيجة في توزيع الأصابع كما يلي:
    النتيجة 2: الانتشار الكامل. عرف ذلك بأنه انتشار كامل وواسع ومستدام لجميع الأصابع لمدة لا تقل عن ثانيتين.
    النتيجة 1: الانتشار المتوسط. أي حركة لا تصل إلى درجة انتشار كاملة. ارتجاف طفيف، أو حركة جزئية.
    النتيجة 0: لا يوجد تفرق. لا حركة على الإطلاق.
    ملاحظة: تم التحقق من جميع التقييمات السلوكية (وخز القدم، وصدع القدم، وانتشار الأصابع) من قبل متجر أعمى عن مجموعات العلاج. تم توزيع عشوائيا على مجموعات العلاج وقت الجراحة وفقا للتصميم المستخدم في دراستنا السابقة (كو وآخرون، 25)، والذي شمل أربع حالات تجريبية (الخياطة فقط، PEG، ML162، ML162 + PEG). تقدم المقالة الحالية بيانات من مجموعة ML162 + PEG، تم تحليلها بشكل مستقل مع الحفاظ على الصرامة التجريبية الأصلية.

5. تروية الأنسجة والمعالجة لعلم الأنسجة

  1. تخدير بعمق وإجراء تروية عبر القلب باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عبر البطين الأيسر.
  2. شق الأذين الأيمن للسماح بتصريف الدم بالكامل.
  3. اغمر الأنسجة المجمعة في 4٪ بارافورمالديهيد (PFA) عند 4 درجات مئوية طوال الليل للتثبيت.
  4. اغسل الأنسجة المثبتة ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم حضنها في PBS عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
  5. قم بحماية الأنسجة بالتبريد عن طريق غمرها في السكروز بنسبة 30٪ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل.
  6. قم بإدخال الأنسجة في مركب OCT، وتجميدها، وقطعها بسماكة 12 ميكرومتر باستخدام جهاز تجميد (كريوستات).
  7. تخزين كتل الأنسجة عند -80 درجة مئوية وعمليات التبريد عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  8. بالنسبة لجمع الأعصاب الوركي فقط، استبعد التروية، لأن محتوى الدم لا يؤثر بشكل كبير على جودة التلوين المناعي في هذه الأنسجة الطرفية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تعديل بروتوكول PEG-fusionالسابق رقم 18 للحفاظ على نتائج جراحية متسقة وتقليل تلف الأعصاب الناتج عن خياطة25. بوضع الخيط لاختراق العصب قبل القطع، تم تقليل الضرر الناتج عن الضغط بالملاقط أو وخز الإبرة بعد القطع. لاختبار تأثير ربط الغرز الذي يخترق العصب على وظيفته، تم تمرير الغرز مرتين عبر عصب سليم وعقدها (الشكل 2A، الغرز بدون SNT). لوحظ أن الغرز التي اخترقت العصب لم تخلق ندبة على العصب عند فحصها بعد 30 يوما من ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجرى دراسات تجديد الأعصاب باستخدام نماذج قطع الأعصاب على نطاق واسع على العصب الوركي في الفأر31,39. ومع ذلك، وبسبب صغر حجمه وملمسه الناعم، يصعب التعامل مع العصب الوركي للفأر بلطف باستخدام الأدوات الجراحية، كما أن الأنسجة عرضة للتمزق أثناء الخياطة. عملية الخياطة الدقيقة، التي غالبا ما تتضمن تلاعبا مفرطا، يمكن أن تؤدي إلى تشوه عصبي وإصابات. حتى عندما يتم تقليل التحفيز غير الضروري للجهاز، يمكن أن يؤدي الحركة المفرطة للعصب المخروط إلى...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يوجد للمؤلفين تضارب مصالح ليكشفوا عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل من قبل NIA R01AG070214 إلى L.C.، وNIA R01AG071591 إلى L.C.، وNIA 1R01AG085545 إلى L.C. المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدها ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ملقط #55دوموستار-بيولوجيا11295-51واحدة في كل يد. ستحتاج إلى اثنين لالتقاط خياطة نايلون 10-0.
غرزة نايلون 10-0ديميتكNL761000,4F0P
غرزة نايلون 4-0ماتريكس ويزارد0197
مضاد بيتا-توبولينR& دي سيستمزMAB1195
ضد NF-200ميليبور سيغماN4142
مقاس أوسترليتز 000لاختبار بينبريك
CF488 التوكسين المرافق-ألفا-بونغاروتوكسينالبيوتيوم00005
تشريح المقصكنت ساينتفيك  
مقص خياطة دقيقكنت ساينتفيك  
ملقط القزحيةكنت ساينتفيك  
ك & وسادة تدفئة الحيوانات الصغيرةك & منتجات H pet
ML162ميليبور سيغماSML2561
عدة جراحة الفئرانكنت ساينتفيك  
حامل الإبركنت ساينتفيك  
البولي إيثيلين جليكول (PEG)ميليبور سيغماP5413
SCG10نوفوس بيولوجيالزNBP1-49461
SomnoSuiteكنت ساينتفيك  للتخدير الإيزوفلوراني
ملقط المقسميستخدم لكشف العصب الوركي.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akram, R., et al. Axonal Regeneration: Underlying molecular mechanisms and potential therapeutic targets. Biomedicines. 10 (12), 10123186(2022).
  2. Sutherland, T. C., Geoffroy, C. G. The influence of neuron-extrinsic factors and aging on injury progression and axonal repair in the central nervous system. Front Cell Dev Biol. 8, 190(2020).
  3. Farah, M. H., et al. Reduced BACE1 activity enhances clearance of myelin debris and regeneration of axons in the injured peripheral nervous system. J Neurosci. 31 (15), 5744-5754 (2011).
  4. Mahar, M., Cavalli, V. Intrinsic mechanisms of neuronal axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 19 (6), 323-337 (2018).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Tsao, J. W., George, E. B., Griffin, J. W. Temperature modulation reveals three distinct stages of Wallerian degeneration. J Neurosci. 19 (12), 4718-4726 (1999).
  7. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu Rev Neurosci. 30, 153-179 (2007).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
  9. Hussain, G., et al. Current status of therapeutic approaches against peripheral nerve injuries: A detailed story from injury to recovery. Int J Biol Sci. 16 (1), 116-134 (2020).
  10. Raivich, G., Makwana, M. The making of successful axonal regeneration: genes, molecules and signal transduction pathways. Brain Res Rev. 53 (2), 287-311 (2007).
  11. Neumann, B., Linton, C., Giordano-Santini, R., Hilliard, M. A. Axonal fusion: An alternative and efficient mechanism of nerve repair. Prog Neurobiol. 173, 88-101 (2019).
  12. Hoy, R. R., Bittner, G. D., Kennedy, D. Regeneration in Crustacean Motoneurons: Evidence for axonal fusion. Science. 156, 251-252 (1967).
  13. Birse, S. C., Bittner, G. D. Regeneration of giant axons in earthworms. Brain Res. 113, 575-581 (1976).
  14. Murphy, A. D., Kater, S. B. Specific reinnervation of a target organ by a pair of identified molluscan neurons. Brain Res. 156, 322-328 (1978).
  15. Deriemer, S. A., Elliott, E. J., Macagno, E. R., Muller, K. J. Morphological evidence that regenerating axons can fuse with severed axon segments. Brain Res. 272, 157-161 (1983).
  16. Bedi, S. S., Glanzman, D. L. Axonal rejoining inhibits injury-induced long-term changes in aplysia sensory neurons in vitro. J Neurosci. 21 (24), 9667-9677 (2001).
  17. Neumann, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H., Ben-Yakar, A., Hilliard, M. A. Axonal regeneration proceeds through specific axonal fusion in transected C. elegans neurons. Dev Dyn. 240 (6), 1365-1372 (2011).
  18. Bittner, G. D., et al. effective, and long-lasting behavioral recovery produced by microsutures, methylene blue, and polyethylene glycol after completely cutting rat sciatic nerves. J Neurosci Res. 90 (5), 967-980 (2012).
  19. Bamba, R., et al. A novel therapy to promote axonal fusion in human digital nerves. J Trauma Acute Care Surg. 81, S177-S183 (2016).
  20. Borgens, R. B., Shi, R., Bohnert, D. Behavioral recovery from spinal cord injury following delayed application of polyethylene glycol. J Exp Biol. 205, 1-12 (2002).
  21. Kim, C. Y., et al. Accelerated recovery of sensorimotor function in a dog submitted to quasi-total transection of the cervical spinal cord and treated with PEG. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S637-S640 (2016).
  22. Kim, C. Y., Oh, H., Hwang, I. K., Hong, K. S. GEMINI: Initial behavioral results after full severance of the cervical spinal cord in mice. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S629-S631 (2016).
  23. Liu, Z., et al. Restoration of motor function after operative reconstruction of the acutely transected spinal cord in the canine model. Surgery. 163 (5), 976-983 (2018).
  24. Shi, R., Borgens, R. B. Acute repair of crushed cuinea pig spinal cord by polyethylene glycol. Am Physiol Soc. 81 (5), 2406-2414 (1999).
  25. Ko, S. H., et al. GPX modulation promotes regenerative axonal fusion and functional recovery after injury through PSR-1 condensation. Nat Commun. 16 (1), 1079(2025).
  26. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  27. Swett, J. E., Torigoe, Y., Elie, V. R., Bourassa, C. M., Miller, P. G. Sensory neurons of the rat sciatic nerve. Exp Neurol. 114 (1), 82-103 (1991).
  28. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: Implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  29. Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: A simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J Neurosci Methods. 227, 166-180 (2014).
  30. Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behav Brain Res. 219 (1), 55-62 (2011).
  31. Lee, J. I., et al. A novel nerve transection and repair method in mice: histomorphometric analysis of nerves, blood vessels, and muscles with functional recovery. Sci Rep. 10 (1), 21637(2020).
  32. Moosmayer, D., et al. Crystal structures of the selenoprotein glutathione peroxidase 4 in its apo form and in complex with the covalently bound inhibitor ML162. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (Pt 2), 237-248 (2021).
  33. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  34. Britt, J. M., et al. Polyethylene glycol rapidly restores axonal integrity and improves the rate of motor behavior recovery after sciatic nerve crush injury. J Neurophysiol. 104 (2), 695-703 (2010).
  35. Bittner, G. D., Schallert, T., Peduzzi, J. D. Degeneration, trophic interactions, and repair of severed axons: A reconsideration of some common assumptions. Neuroscientist. 6 (2), 88-109 (2000).
  36. Bittner, G. D., Ballinger, M. L., Raymond, M. A. Reconnection of severed nerve axons with polyethylene glycol. Brain Res. 367 (1-2), 351-355 (1986).
  37. Spaeth, C. S., Robison, T., Fan, J. D., Bittner, G. D. Cellular mechanisms of plasmalemmal sealing and axonal repair by polyethylene glycol and methylene blue. J Neurosci Res. 90 (5), 955-966 (2012).
  38. Spaeth, C. S., Boydston, E. A., Figard, L. R., Zuzek, A., Bittner, G. D. A model for sealing plasmalemmal damage in neurons and other eukaryotic cells. J Neurosci. 30 (47), 15790-15800 (2010).
  39. Félix, S. P., Pereira Lopes, F. R., Marques, S. A., Martinez, A. M. Comparison between suture and fibrin glue on repair by direct coaptation or tubulization of injured mouse sciatic nerve. Microsurgery. 33 (6), 468-477 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sciatic Nerve TransectionNerve RepairFunctional RecoveryAxon RegenerationPeripheral Nerve InjuryDorsal Root GanglionMicrosuture TechniqueMuscle ReinnervationAxonal FusionBehavioral Assessment
Video Coming Soon

Related Articles