هنا ، ندرس السمية الكبدية الناجمة عن اللاباتينيب والنيراتينيب من خلال استقطاب البلاعم الذي يحركها SASP ، والذي يوفر فهما ميكانيكيا أعمق يتجاوز اختبارات السمية التقليدية. يوضح هذا النهج كيف تؤثر خلايا الكبد الشائخة على الاستجابات المناعية. هذا ذو قيمة خاصة لتقييم آثار الأدوية على المدى الطويل واكتشاف أهداف علاجية جديدة لإدارة السمية الكبدية الناجمة عن الأدوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يعزز الشيخوخة الناجمة عن الأدوية في خلايا الكبد استقطاب البلاعم M2: الآثار المترتبة على السمية الكبدية المرتبطة بمثبطات التيروزين كيناز
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لاباتينيب ونيراتينيب من مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) المعتمدة لعلاج سرطان الثدي النقيلي الإيجابي HER2 ، لكن استخدامها السريري محدود بالسمية الكبدية. داخل خلايا الكبد, أنزيمات السيتوكروم P450 تنتج نواتج الأيض التفاعلية من هذه الأدوية, تسبب تلف الحمض النووي, الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا, والإجهاد التأكسدي, مما يؤدي إلى إصابة خلايا الكبد. يؤدي هذا الإجهاد الخلوي إلى شيخوخة خلايا الكبد ، وهي حالة من توقف النمو مصحوبة بإفراز عوامل مؤيدة للالتهابات وإعادة تشكيل الأنسجة تسمى النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP). SASP يعدل بشكل كبير البيئة المكروية للكبد, يؤثر على سلوك الخلايا المناعية, ويزيد من سوء تلف الأنسجة. نظهر أن اللاباتينيب والنيراتينيب يحفزان الشيخوخة و SASP في خط خلايا الكبد HepG2. بالإضافة إلى ذلك ، يعزز SASP من هذه الخلايا الشائخة الاستقطاب الشبيه ب M2 للبلاعم RAW264.7. على الرغم من أن البلاعم M2 مرتبطة بالاستجابات المضادة للالتهابات وإصلاح الأنسجة ، إلا أن نشاطها المفرط أو المطول يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة والتليف. تسلط النتائج التي توصلنا إليها الضوء على آلية من خلالها يعدل شيخوخة خلايا الكبد الناجمة عن TKI و SASP الاستجابة المناعية وقد يساهم في سمية الكبد لدى مرضى سرطان الثدي. هذا يؤكد أهمية استهداف الخلايا الشائخة أو عوامل SASP لتقليل سمية الكبد وتحسين نتائج العلاج ، مما يجعل تحديد العلاج السينوعلاجي الفعال محورا حيويا للبحث. لم يكن هناك أي تقرير أدبيات يوضح تأثير إفرازات خلايا الكبد التي يسببها TKI على استقطاب البلاعم.
المقدمة
حصل Lapatinib و neratinib ، وكلاهما مثبطات التيروزين كيناز ذات الجزيئات الصغيرة (TKI) ، على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) في عامي 2007 و 2017 ، لعلاج سرطان الثدي النقيلي1. ومن المعروف أن هذه الأدوية تمنع مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2, HER22, مستقبلات التيروزين كيناز التي يتم التعبير عنها في بعض سرطانات الثدي3. على الرغم من نجاحهما السريري ، يرتبط اللاباتينيب والنيراتينيب أيضا بآثار ضارة ، لا سيما السمية الكبدية4،5. تحدث إصابة الكبد الحادة ، التي تتجلى في ارتفاع مستويات الترانسفيراز الأمينية ، في حوالي 14٪ من المرضى الذين يخضعون للعلاج إما ب lapatinib أو neratinib6. تعزى السمية الكبدية إلى حد كبير إلى التمثيل الغذائي الكبدي لهذه الأدوية ، والتي تتضمن إنزيمات السيتوكروم P450 (CYP) ، ومعظمها CYP3A4 / 57،8. تحفز هذه الإنزيمات تكوين وسيطات كينون-إيمين ، وهي محبة للكهرباء وشديدة التفاعل9،10. يمكن أن تشكل هذه المستقلبات التفاعلية ، بما في ذلك لاباتينيب O-dealkylated ، و N-dealkylated lapatinib ، و N-hydroxy lapatinib ، و O-dealkylated neratinib ، و N-demethylated neratinib ، مقربات تساهمية مع الجزيئات الخلوية الكبيرة ، وبالتالي تعطيل الوظائف الخلوية الطبيعية وتؤدي في النهاية إلى إصابة الكبد11.
يمكن أن تؤدي المستقلبات التفاعلية من اللاباتينيب والنيراتينيب أيضا إلى إجهاد التأكسدي ، وهو محفز رئيسي للشيخوخة الخلوية12. الشيخوخة الخلوية هي حالة توقف النمو ولكنها نشطة من الناحية الأيضية ، وتتميز بإفراز العديد من السيتوكينات المؤيدة للالتهابات وعوامل النمو والبروتياز. يعرف هذا النمط الظاهري الإفرازي باسم النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) 13،14،15. يمكن أن يؤثر SASP بشكل عميق على البيئة المكروية المحيطة ، وغالبا ما يعزز الالتهاب وإعادة تشكيل الأنسجة. في سياق علاج السرطان ، يمكن ل SASP إثراء مجموعة الخلايا الجذعية السرطانية وتعديل الاستجابة المناعية لصالح بقاء الورم16. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي السيتوكينات الالتهابية إلى تفاقم تلف الأنسجة. توقعنا أنه في المرضى الذين عولجوا ب lapatinib و neratinib ، تساهم إصابة الكبد جزئيا في الشيخوخة الناجمة عن TKI وإنتاج SASP المؤيد للالتهابات.
أظهرت تجاربنا أن اللاباتينيب والنيراتينيب يحفزان إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا الكبدية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي وخلل وظيفي في الميتوكوندريا ، مما يؤدي بدوره إلى الشيخوخة الخلوية. قد يساهم هذا الشيخوخة في السمية الكبدية التي يسببها لاباتينيب / نيراتينيب عن طريق إطلاق عوامل SASP ، والتي يمكن أن تؤثر على استقطاب البلاعم.
تلعب البلاعم دورا مهما في الاستجابة المناعية ، ويمكن أن يتغير نمطها الظاهري الوظيفي استجابة لمحفزات مختلفة17،18. عادة ما يرتبط النمط الظاهري الكلاسيكي للبلاعم M1 بالاستجابات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك إنتاج السيتوكينات مثل TNF-α و IL-1β ، ويعتبر عموما علامة على الالتهاب الحاد19،20. في المقابل ، يرتبط النمط الظاهري للبلاعم M2 بالتليف ، وإصلاح الأنسجة21 ، وتثبيط المناعة ، والاستجابة للالتهاب المزمن22،23. يمكن أن تؤثر السيتوكينات الالتهابية في SASP على استقطاب البلاعم ، مما يعزز تحويل البلاعم M1 إلى نمط ظاهري يشبه M223. يمكن أن يكون لهذا التحول في الاستقطاب آثار كبيرة على البيئة المكروية المناعية ، مما قد يؤدي إلى تثبيط المناعة وتطور الورم وإعادة تشكيل بنية الأنسجة.
للتحقيق في استقطاب البلاعم الناجم عن lapatinib و neratinib ، استخدمنا خط خلية RAW264.7 ، وهو خط خلوي يشبه البلاعم الفئران شائع الاستخدام في الأبحاث المناعية24،25. خلايا RAW264.7 مشتقة من فئران BALB / c وتستخدم على نطاق واسع لدراسة الالتهاب والبلعمة والاستجابات المناعية25. إنها تستجيب للمنبهات المختلفة ، بما في ذلك عديدات السكاريد الدهنية (LPS) ، وهي ذات قيمة خاصة لدراسة وظيفة البلاعم وإنتاج السيتوكين وبيولوجيا السرطان26. في هذه الدراسة ، تم علاج HepG2 ، وهو خط خلية ورم كبدي بشري ، باللاباتينيب والنيراتينيب لتقليد التأثيرات السامة للكبد التي لوحظت في المرضى. غالبا ما يستخدم خط خلايا HepG2 كنموذج لدراسة التمثيل الغذائي للأدوية والسمية الكبدية نظرا لأصله البشري وسلالة سرطان الخلايا الكبدية27. بعد معالجة خلايا HepG2 باستخدام TKIs ، تم جمع الوسائط المكيفة وإضافتها إلى خلايا RAW264.7. تمت مراقبة التغيرات المظهرية اللاحقة للبلاعم ، مع التركيز على ما إذا كان العلاج يحفز التحول من النمط الظاهري M1 المؤيد للالتهابات إلى النمط الظاهري M2 المثبط للمناعة.
تتم دراسة السمية الكبدية التي يسببها الدواء بشكل عام من خلال فحوصات السمية الخلوية ، وتقييم العلامات الالتهابية ، واستخدام النماذج الحيوانية. بالمقارنة مع هذه ، فإن طريقتنا في فحص السمية الكبدية التي يسببها TKI lapatinib و neratinib من خلال عوامل النمط الظاهري الإفرازي المرتبطة بالشيخوخة (SASP) وتأثيرها على استقطاب البلاعم لها العديد من المزايا. أولا ، تؤسس طريقتنا علاقة بين عوامل SASP التي تنتجها خلايا الكبد الشائخة التي يسببها الدواء والمناعة الفطرية ، والتي يمكن ربطها بشكل أكبر بإعادة تشكيل الأنسجة والالتهاب المزمن والتسرطن28،29،30،31. لا يمكن أن تساعدنا شاشات السمية التقليدية في التقاط التفاعلات قصيرة المدى بين الكبد والخلايا المناعية ، ولا يمكنها الكشف عن التأثير طويل المدى للمعارف التقليدية على التهاب الكبد والتليف ، لا سيما في سياق التعرض المزمن للأدوية. عند دمجها مع نهج البروتينات المناسب لتحديد مكونات SASP ، يمكن أن تساعد هذه التقنية في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية للسمية الكبدية التي يسببها TKI وإبلاغ تصميم التدخلات العلاجية للتخفيف من حدتها29،30،31.
للتنفيذ ، يجب على الباحثين استخدام الثقافة المشتركة أو أنظمة الوسائط المشروطة مع خطوط الخلايا الكبدية والمناعية ، كما هو موضح ، وتقييم المؤشرات الحيوية للشيخوخة بالإضافة إلى البلاعم M1 و M2. هذه الطريقة هي الأكثر فعالية لتقييم إصابات الكبد الحادة أو المزمنة الناجمة عن الأدوية ، أو لاستكشاف استراتيجيات لتقليل الآثار غير المستهدفة لعلاجات السرطان29،30،31.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ثقافة الخلية
- استزراع خلايا HepG2 في وسط النسر المعدل (MEM) عالي الجلوكوز مع 10٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS) وخلايا RAW264.7 في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 ويتم تحديثه كل 3 أيام.
ملاحظة: لا ينصح باستخدام المضادات الحيوية ما لم يكن هناك أي تلوث فطري أو بكتيري. خلايا RAW264.7 سريعة النمو ويجب تمريرها بعد يومين.
2. مقايسة MTT
- عد الخلايا وطلاء الخلايا
- قم بزراعة خلايا HepG2 في طبق مزرعة 60 مم في حاضنة مزرعة خلية في وسط نمو كامل (MEM + 10٪ FBS).
- عندما كانت الخلايا متقاربة بنسبة 80٪ تقريبا ، قم بإزالة وسائط النمو ، وغسل سريع ب 1 مل من 1x PBS ، وأضف 600 ميكرولتر من 0.5x التربسين. احتضان لمدة 5-6 دقائق.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في خزانة زراعة الخلايا BSL 2. - قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة 1.2 مل من وسائط النمو الكاملة داخل BSL 2.
ملاحظة: لمنع الإفراط في المحاولة ، يجب إضافة وسائط كاملة ، ضعف حجم التربسين المضاف. - خذ معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 5 مل (MCT) وقم بتهويره عن طريق الطرد المركزي عند 180 جم (1000 دورة في الدقيقة) لمدة 3-4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
- تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من الوسائط ، والماصة لخلطها كتعليق خلية واحدة ، وعد باستخدام مقياس الخلايا الدموية تحت المجهر.
- بعد ذلك ، قم بصفيحة خلايا HepG2 في صفيحة 96 بئرا عند 5000-7000 خلية لكل بئر ، في وسط نمو كامل ، في ثلاث نسخ لكل جرعة دواء ، واحتفظ بها في الحاضنة لمدة 12-16 ساعة.
ملاحظة: يجب أن يكون التقاء الخلايا 50-60٪ للعلاج من تعاطي المخدرات ، ويجب تنفيذ هذه الخطوة داخل غطاء المحرك.
- العلاج من تعاطي المخدرات
- قم بإعداد تركيزات عمل متزايدة تدريجيا من اللاباتينيب والنيراتينيب في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) من تركيز المخزون (30 ملي مولار و 3.5 ملي مولار ، على التوالي) داخل الغطاء. التركيزات النهائية هي 1 ، 2.5 ، 5 ، 10 ، 15 ، 25 ، 50 ميكرومتر لللاباتينيب و 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 10 ميكرومتر للنيراتينيب في وسط النمو (MEM + 5٪ FBS). احتفظ بعنصر تحكم واحد لكلا الدواءين.
- تخلص من الوسائط السابقة من لوحة 96 بئرا تحتوي على خلايا ، وأضف 100 ميكرولتر من الوسائط مع الدواء واحتضن لمدة 48 ساعة داخل الحاضنة.
- تلطيخ وقياس كمية
- بعد 48 ساعة ، أضف 10 ميكرولتر من صبغة بروميد 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تترازوليوم بروميد (MTT ؛ 5 مجم / مل) ، تذوب في محلول ملحي عازلة للفوسفات 1x (PBS) في كل بئر ، واحتضن لمدة ساعتين على الأقل داخل الحاضنة حتى تظهر بلورات أرجوانية اللون.
ملاحظة: أضف الصبغة مباشرة إلى الوسائط المحتوية على الأدوية ولا تحتضن الخلايا بالصبغة لأكثر من 4 ساعات. - بعد الحضانة ، قم بإزالة الصبغة ، وقم بإذابة البلورات في 100 ميكرولتر من DMSO في كل بئر ، واحتضان لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بأخذ الكثافة الضوئية (OD) عند 595 نانومتر.
ملاحظة: يمكن إجراء هذه الخطوة خارج غطاء المحرك.
- بعد 48 ساعة ، أضف 10 ميكرولتر من صبغة بروميد 3- (4،5-ثنائي ميثيل ثيازول-2-يل) -2،5-ثنائي فينيل تترازوليوم بروميد (MTT ؛ 5 مجم / مل) ، تذوب في محلول ملحي عازلة للفوسفات 1x (PBS) في كل بئر ، واحتضن لمدة ساعتين على الأقل داخل الحاضنة حتى تظهر بلورات أرجوانية اللون.
3. مقايسة SA-β galactosidase
- العلاج من تعاطي المخدرات
- صفيحة خلايا HepG2 في أطباق 35 مم بكثافة 40 × 104 خلايا لكل لوحة في ثلاث مجموعات ، واحدة لللاباتينيب ، وواحدة للنيراتينيب ، وواحدة تحكم غير معالجة.
ملاحظة: خطوات عد الخلايا وطلاءها كما هو موضح في الخطوة 2.1. - أضف 1 ميكرولتر من اللاباتينيب من مخزون العمل 5 ملي مولار و 1.43 ميكرولتر من النيراتينيب من المخزون الرئيسي 3.5 ملي مولار في 2 مل من الوسائط لعمل تركيز نهائي قدره 2.5 ميكرومتر (جرعة شبه مميتة) من اللاباتينيب والنيراتينيب.
ملاحظة: يتم تحديد جرعة الدواء دون المميتة باتباع الرسم البياني لبقاء الخلية في مقايسة MTT. - قم بإزالة الوسائط السابقة من الأطباق واغسلها ب 500 ميكرولتر من 1x PBS مرة واحدة ، وأضف الوسائط المحتوية على الأدوية (داخل الغطاء) واحتفظ بها لمدة 48 ساعة داخل الحاضنة.
- صفيحة خلايا HepG2 في أطباق 35 مم بكثافة 40 × 104 خلايا لكل لوحة في ثلاث مجموعات ، واحدة لللاباتينيب ، وواحدة للنيراتينيب ، وواحدة تحكم غير معالجة.
- التثبيت والتلوين
- بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الدواء ، وغسل سريع ب 500 ميكرولتر من 1x PBS مرة واحدة ، ثم قم بتثبيته ب 1.5 مل من 2٪ فورمالديهايد و 0.2٪ جلوتارالديهايد في 1x PBS لمدة 10 دقائق في RT.
- بعد التثبيت ، اغسل الألواح ب 1 مل من 1x PBS مرتين وتأكد من إزالة المحلول المثبت بشكل صحيح. أضف 1.5 مل من محلول التلوين (40 ملي مولار من حامض الستريك / محلول فوسفات الصوديوم ، 5 ملي مولار K4 [Fe (CN) 6] ، 5 ملي مولار K3 [Fe (CN) 6] ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي MgCl 2 ، 1 مجم / مل X-gal في الماء المعقم) واحتضان لمدة 8 ساعات عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظة: قد تختلف فترة الحضانة وفقا لنوع الخلية. بالنسبة إلى HepG2 ، يجب ألا تتجاوز فترة الحضانة 8 ساعات. - بعد التلوين ، اغسل الألواح بسرعة في 1 مل من 1x PBS مرتين والتقط صور Brightfield بتكبير 20x و 40x باستخدام مجهر مضان. التقط ما لا يقل عن أربعة إلى خمسة حقول لكل مجموعة علاجية.
ملاحظة: يختلف حجم محلول التثبيت والتلوين باختلاف حجم اللوحة ، ويمكن تنفيذ جميع الخطوات خارج غطاء المحرك.
- القياس الكمي للصورة
- التقط صورة من حقل واحد ، واحسب العدد الإجمالي للخلايا بالإضافة إلى الخلايا التي تظهر إشارة زرقاء. احسب النسبة المئوية للخلايا ذات الإشارة الزرقاء يدويا. احسب أربع صور على الأقل ، وخذ المتوسط ، وارسم في رسم بياني لجدول البيانات ، وقم بإجراء اختبار t.
4. كشف ROS
- طلاء الخلايا والعلاج الدوائي
- صفيحة خلايا HepG2 في أطباق ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم بكثافة 40 × 104 خلايا لكل لوحة في ثلاث مجموعات: واحدة لللاباتينيب ، وواحدة للنيراتينيب ، وواحدة غير معالجة.
ملاحظة: خطوات عد الخلايا وطلاءها كما هو موضح في الخطوة 2.1. - اتبع نفس استراتيجية العلاج كما هو موضح في الخطوة 3.1.
- صفيحة خلايا HepG2 في أطباق ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم بكثافة 40 × 104 خلايا لكل لوحة في ثلاث مجموعات: واحدة لللاباتينيب ، وواحدة للنيراتينيب ، وواحدة غير معالجة.
- تلطيخ وتصوير
- بعد 48 ساعة من العلاج ، أضف 2 ميكرومتر من كاشف ROX الأحمر الغامق للخلية (مخزون 5 ملي مولار) ، و 1 ميكرومتر ميتو تعقب الأخضر (مخزون 1 ملي مولار) لمدة 30 دقيقة ، وقم بالبقع بصبغة تلطيخ نووية 500 نانومتر Hoechst (مخزون 500 ميكرومتر).
ملاحظة: يجب إضافة صبغة داخل غطاء المحرك ، وتجنب التعرض المباشر للضوء. يتم التلطيخ عن طريق إضافة صبغة تلطيخ نووية Hoechst أثناء إعطاء الأصباغ الأخرى. - بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الصبغة ، واغسلها ب 1x PBS لإزالة الصبغة الزائدة والصورة بمجهر متحد البؤر بتكبير 100x (ظهور الزيت ، 640 نانومتر ، 488 نانومتر ، و 405 نانومتر طول موجة إثارة ، على التوالي).
- بعد 48 ساعة من العلاج ، أضف 2 ميكرومتر من كاشف ROX الأحمر الغامق للخلية (مخزون 5 ملي مولار) ، و 1 ميكرومتر ميتو تعقب الأخضر (مخزون 1 ملي مولار) لمدة 30 دقيقة ، وقم بالبقع بصبغة تلطيخ نووية 500 نانومتر Hoechst (مخزون 500 ميكرومتر).
- القياس الكمي للصورة
- حدد إشارة الخلية ROX الحمراء باستخدام برنامج Fiji ImageJ ومقارنتها بإشارة عنصر التحكم غير المعالج. استخدم MitoTracker باللون الأخضر للإشارة إلى أن الإشارة تنشأ من الميتوكوندريا. بعد رسم الرسوم البيانية الشريطية بقيم متوسطة ، قم بإجراء اختبار t.
5. مجموعة الوسائط المكيفة (CM)
- عالج خلايا HepG2 ب 2.5 ميكرومتر من اللاباتينيب أو النيراتينيب لمدة 48 ساعة (استراتيجية علاج مشابهة للخطوة 3.1 ، باستثناء هذه التجربة ، صفيحة 70 × 104 خلايا في طبق 60 مم).
- بعد 48 ساعة ، قم بإزالة الدواء واغسله ب 500 ميكرولتر من 1x PBS مرة واحدة.
- في الحد الأقصى ليوم الشيخوخة (بعد 48 ساعة من العلاج الدوائي)، يجب إضافة 4 مل من وسائط MEM الخالية من المصل (بدون FBS أو أي مكملات أخرى) إلى الخلايا المعالجة بالعقاقير بالإضافة إلى عنصر التحكم غير المعالج لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: يعتمد حجم الوسائط الخالية من المصل على حجم اللوحة. - بعد ذلك ، اجمع الوسائط الخالية من المصل التي تحتوي على جميع الإفرازات ، والتي تسمى الوسائط المكيفة ، وقم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: بعد جمع CM ، يجب طرده بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 2800 جم (4000 دورة في الدقيقة) لإزالة الخلايا الميتة والحطام الخلوي الآخر. عادة ما يتم زراعة خلايا RAW264.7 في DMEM ، ولكن يتم جمع CM في MEM وفقا لظروف ثقافة HepG2. للحفاظ على التوافق ، يجب خلط الوسائط المكيفة مع DMEM الخالي من المصل بنسبة 1: 1 قبل حضانة RAW264.7.
6. استقطاب M1 / M2 في RAW264.7
- طلاء الخلية
- اتبع عد الخلايا وطلاء الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.1 ، باستثناء خطوة التهربسين. أثناء محاولة خلايا RAW264.7 ، أضف 600-700 ميكرولتر من 0.5x التربسين ، واحتضان لمدة 15-20 دقيقة في الحاضنة ، ولتحييد التربسين ، أضف 2 مل من وسائط النمو (DMEM + 10٪ FBS) ولوحة 70 × 104 خلايا في طبق 60 مم في ثلاث مجموعات: لاباتينيب ، نيراتينيب وعنصر تحكم واحد غير معالج.
- تحريض RAW264.7
- قم بإزالة وسائط النمو العادية ، واغسلها ب 1 مل من 1x PBS مرة واحدة ، وأضف CM المقابل لمدة 48 ساعة.
ملاحظة: قبل إضافة CM ، تأكد من تكييفه باستخدام DMEM الخالي من المصل بنسبة 1: 1 ، حيث تنمو خلايا RAW264.7 في DMEM ، لذا فإن الاحتفاظ بالخلايا في MEM سيسبب الإجهاد ، مما قد يعيق النتيجة. قد يتسبب زراعة RAW264.7 في سم (وسائط خالية من المصل) لمدة 48 ساعة أيضا في الإجهاد. في هذه الحالة ، يمكن إجراء حضانة لمدة 24-30 ساعة قبل جمع البيانات. - بعد الحضانة ، تخلص من CM ، واغسلها ب 1 مل من 1x PBS ، وأضف 600 ميكرولتر من التربسين في كل طبق ، واحتضان لمدة 10 دقائق ، ثم قم بحبيبها عند 180 جم (1000 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق عند RT. استخدم الحبيبات لتنقية البروتين أو قم بتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: يختلف وقت التربسين باختلاف نوع الخلية ، ولا ينصح بالطرد المركزي فوق 180 جم.
- قم بإزالة وسائط النمو العادية ، واغسلها ب 1 مل من 1x PBS مرة واحدة ، وأضف CM المقابل لمدة 48 ساعة.
- عزل البروتين والنشاف الغربي
- قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق خلط مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) وكوكتيل مثبط البروتياز بنسبة 100: 1. أضف المخزن المؤقت للتحلل إلى حبيبات الخلية ، وأعد تعليقه ، واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: سيختلف حجم المخزن المؤقت للتحلل باختلاف حجم لوحة الخلية ، ويمكن إجراء التحلل خارج الغطاء. إذا تم تخزين الحبيبات عند -80 درجة مئوية, ثم قم أولا بإذابة الحبيبات على الثلج, إعطاء دوران قصير, وإزالة أي وسائط متبقية. - بعد الحضانة ، قم بتدوير محللة الخلية عند 20,000 جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية واستمر في اللطخة الغربية ، أو قم بتخزينها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- تحضير عينة البروتين عن طريق أخذ 35-40 ميكروغرام من البروتين ، وإضافة صبغة تحميل 1x ، وتسخين لمدة 5-6 دقائق عند 95 درجة مئوية ، وتشغيل SDS-PAGE (10٪ و 12٪ جل الأكريلاميد) عند 90 فولت ، ونقلها إلى غشاء النيتروسليلوز.
- ملاحظة: لمزيد من المعلومات التفصيلية حول اللطخة الغربية ، راجع Joubert et al.32.
- تحقق من التعبير عن علامات الاستقطاب M1 و M2 ، من خلال تطوير اللطخة باستخدام مطور بيروكسيداز الفجل (HRP) ، iNOS (M1) و arginase1 (M2) ، على التوالي ، باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل NOS2 ومضادة ل ARG1.
ملاحظة: تركيز كل من الأجسام المضادة الأولية ، مضاد NOS2 ومضاد ARG1 هو 1: 1000 ، والأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب هو 1: 10،000.
- قم بإعداد المخزن المؤقت للتحلل عن طريق خلط مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA) وكوكتيل مثبط البروتياز بنسبة 100: 1. أضف المخزن المؤقت للتحلل إلى حبيبات الخلية ، وأعد تعليقه ، واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة.
- استقطاب البلاعم باستخدام LPS و IFN-γ
- صفيحة 70 × 104 خلايا RAW264.7 في طبقين مقاس 60 مم.
ملاحظة: يشبه إجراء الطلاء الخطوة 6.1. - بعد 12-16 ساعة ، امزج 4 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل عديدات السكاريد الدهنية (LPS ، تركيز المخزون 1 مجم / مل) و 1.33 ميكرولتر من 33 نانوغرام / مل من γ الإنترفيرون (IFN-γ ، تركيز المخزون 100 ميكروغرام / مل) في 4 مل من وسائط النمو (DMEM + 10٪ FBS) وأضفه إلى RAW264.7 المطلي مسبقا ، مع الحفاظ على تحكم واحد غير مستحث.
- بعد 48 ساعة ، اجمع حبيبات الخلية عن طريق التربسين ، وعزل البروتين ، وقم بتشغيل لطخة غربية ، وتحقق من التعبير عن iNOS (M1) و ARG1 (M2) ، على التوالي ، باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل iNOS و anti-ARG1.
ملاحظة: يجب التخلص من جميع نفايات زراعة الخلايا والنفايات الكيميائية الحيوية في صندوق المخاطر البيولوجية ، وتعقيمها بشكل صحيح ، ثم التخلص منها.
- صفيحة 70 × 104 خلايا RAW264.7 في طبقين مقاس 60 مم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء سلسلة من المقايسات لتقييم تأثير TKI lapatinib و neratinib على خلايا سرطان الخلايا الكبدية (HepG2) وتأثيراتها النهائية على البلاعم. تمت معالجة خلايا HepG2 بتركيزات متفاوتة من اللاباتينيب أو النيراتينيب ، وتم قياس صلاحية الخلية في 48 ساعة باستخدام مقايسة MTT (الأشكال 1 أ ، ب). بناء على منحنيات البقاء على قيد الحياة ، تم اختيار جرعة شبه مميتة تبلغ 2.5 ميكرومتر لمزيد من التجارب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تستكشف الدراسة الحالية الآثار غير المباشرة لعلاج اللاباتينيب أو النيراتينيب على استقطاب البلاعم من خلال الوسائط المكيفة التي تم جمعها من خلايا الكبد HepG2 المعالجة بالمعارف التقليدية. باستخدام البلاعم RAW264.7 ، نلاحظ نمطا ظاهريا M2 عند التعرض للوسائط المكيفة ، كما يتضح من تنظيم ARG1. من الناحية الشكلية ، أظهرت البلاعم المعالجة شكلا مميزا متضخما وممدودا ، مما يدعم بشكل أكبر تحريض حالة شبيهة ب M2. أدناه ، نناقش الخطوات الحاسمة للبروتوكول ، والتعديلات المحتملة ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ،...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون معهد شيف نادار للنموع على دعم البنية التحتية. يتم تمويل هذه الدراسة من قبل منحة وزارة العلوم والتكنولوجيا CRG / 2022/003242.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خط خلية HepG2 | NCCS | خط الخلية الملتصق | |
| خط خلية RAW264.7 | NCCS | خط الخلية الملتصق | |
| DMEM (المتوسط المعدل من دولباكو) | هيميديا | AT066 | ارتفاع الجلوكوز، البودرة |
| MEM (النسر المتوسط المعدل) | جيبكو | 611100-053 | ذرور |
| PBS (محلول محلول الفوفات) | هيميديا | TS1101 | ذرور |
| حل تريبسين-إيدتا | هيميديا | TCL007 | حل |
| FBS (مصل البقر الجنين) | هيميديا | RM1112 | سائل |
| صبغة MTT | هيميديا | TC191 | ذرور |
| لاباتينيب | سيليكشم | S2111 | ذرور |
| نيراتينيب | شركة كايمان للكيماويات | 18404 | ذرور |
| DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) | هيميديا | TC185 | حل |
| فورمالديهايد | رانكيم | F0080 | حل |
| جلوتارالديهايد | سيغما-ألدرش | 340855 | حل |
| حمض الستريك أحادي الهيدرات، نقي | هيميديا | GRM229 | ذرور |
| فوسفات الصوديوم ثنائي الأساس اللامائي | هيميديا | MB024 | ذرور |
| فيروسيانايد البوتاسيوم، K4[Fe(CN)6] | فيشر ساينتفيك | P-236-500 | |
| فيريريسينيد البوتاسيوم، K3[Fe(CN)6] | فيشر ساينتفيك | P-232-500 | |
| NaCl | SRL | 41721 | ذرور |
| MgCl2 سداسي هيدرات | هيميديا | GRM-1068 | ذرور |
| إكس-جال | SRL | 45904 | ذرور |
| دهنيون بوليسكاريد | سيغما-ألدرش | L6529 | |
| الإنترفيرون والغاما المؤتلفان البشري؛ | هيميديا | CF040-20MCG | |
| كاشف خلية ROX الأحمر العميق | صيد حراري علمي | C10422 | |
| هوشتت | إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك | H3570 | ذرور |
| ميتو تراكر أخضر | إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك | 1842298 | ذرور |
| الأجسام المضادة ARG1 | تقارب | DF6657 | المحلول، MW محسوب - 35 كيلو دالتون، MW الملحوظ - 65 كيلو دالتون |
| الأجسام المضادة المضادة NOS2 | شركة كلاودو كلون كورب. | PAA837Hu01 | المحلول، حسب MW - 130 كيلو دالتون، MW الملحوظ - 65 كيلو دالتون |
| الأجسام المضادة المضادة ل-iNOS | تقارب | المحلول، MW محسوب - 130 كيلو دالتون، MW الملاحظة - 120 كيلو دالتون | |
| الأجسام المضادة المضادة لGAPDH | علوم الحياة البيوبهاراتي Pvt.Ltd | BB-AB0060 | حل |
| الأجسام المضادة للأرانب | شركة كايمان للكيماويات | 10004301 | حل |
| غشاء النيتروسيلولوز | شركة ميرك ميليبور المحدودة | HATF00010 (رقم المنتج) | |
| فيمتولوسنت<سوب>TMبلس HRP | جي بايوساينس | 786-003 | |
| أطباق 60 مم | نوك | 150462 | |
| لوحة 96 بئر، | نوك | 165306 | |
| حاضنة زراعة الخلايا | ثيرمو فيشر العلمي | 371 | |
| المجهر | 1. مجهر لايكا المقلوب 2. المجهر الكونفوكي نيكون | 1. دليل DMIL 2. Ti2E، A1R | كلاهما رقم موديل |
| نظام iBright للتصوير | إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك | CL1500 (رقم الطراز) | |
| قارئ الألواح | بيو-راد | قارئ الميكروبليت iMark | |
| الطرد المركزي | ثيرمو فيشر العلمي | سورفال ST 8R (رقم الطراز) |
المراجع
- Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
- Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
- Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
- Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
- Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
- Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
- Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
- Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
- Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
- Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
- Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
- Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
- Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
- Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
- Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
- Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
- Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
- Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
- Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
- Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
- Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
- Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
- Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
- Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
- Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
- Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
- Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
- Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
- Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
- Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
- Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
