هنا ، ندرس السمية الكبدية الناجمة عن اللاباتينيب والنيراتينيب من خلال استقطاب البلاعم الذي يحركها SASP ، والذي يوفر فهما ميكانيكيا أعمق يتجاوز اختبارات السمية التقليدية. يوضح هذا النهج كيف تؤثر خلايا الكبد الشائخة على الاستجابات المناعية. هذا ذو قيمة خاصة لتقييم آثار الأدوية على المدى الطويل واكتشاف أهداف علاجية جديدة لإدارة السمية الكبدية الناجمة عن الأدوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يعزز الشيخوخة الناجمة عن الأدوية في خلايا الكبد استقطاب البلاعم M2: الآثار المترتبة على السمية الكبدية المرتبطة بمثبطات التيروزين كيناز
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لاباتينيب ونيراتينيب من مثبطات التيروزين كيناز (TKIs) المعتمدة لعلاج سرطان الثدي النقيلي الإيجابي HER2 ، لكن استخدامها السريري محدود بالسمية الكبدية. داخل خلايا الكبد, أنزيمات السيتوكروم P450 تنتج نواتج الأيض التفاعلية من هذه الأدوية, تسبب تلف الحمض النووي, الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا, والإجهاد التأكسدي, مما يؤدي إلى إصابة خلايا الكبد. يؤدي هذا الإجهاد الخلوي إلى شيخوخة خلايا الكبد ، وهي حالة من توقف النمو مصحوبة بإفراز عوامل مؤيدة للالتهابات وإعادة تشكيل الأنسجة تسمى النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP). SASP يعدل بشكل كبير البيئة المكروية للكبد, يؤثر على سلوك الخلايا المناعية, ويزيد من سوء تلف الأنسجة. نظهر أن اللاباتينيب والنيراتينيب يحفزان الشيخوخة و SASP في خط خلايا الكبد HepG2. بالإضافة إلى ذلك ، يعزز SASP من هذه الخلايا الشائخة الاستقطاب الشبيه ب M2 للبلاعم RAW264.7. على الرغم من أن البلاعم M2 مرتبطة بالاستجابات المضادة للالتهابات وإصلاح الأنسجة ، إلا أن نشاطها المفرط أو المطول يمكن أن يؤدي إلى تلف الأنسجة والتليف. تسلط النتائج التي توصلنا إليها الضوء على آلية من خلالها يعدل شيخوخة خلايا الكبد الناجمة عن TKI و SASP الاستجابة المناعية وقد يساهم في سمية الكبد لدى مرضى سرطان الثدي. هذا يؤكد أهمية استهداف الخلايا الشائخة أو عوامل SASP لتقليل سمية الكبد وتحسين نتائج العلاج ، مما يجعل تحديد العلاج السينوعلاجي الفعال محورا حيويا للبحث. لم يكن هناك أي تقرير أدبيات يوضح تأثير إفرازات خلايا الكبد التي يسببها TKI على استقطاب البلاعم.
المقدمة
حصل Lapatinib و neratinib ، وكلاهما مثبطات التيروزين كيناز ذات الجزيئات الصغيرة (TKI) ، على موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) في عامي 2007 و 2017 ، لعلاج سرطان الثدي النقيلي1. ومن المعروف أن هذه الأدوية تمنع مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2, HER22, مستقبلات التيروزين كيناز التي يتم التعبير عنها في بعض سرطانات الثدي3. على الرغم من نجاحهما السريري ، يرتبط اللاباتينيب والنيراتينيب أيضا بآثار ضارة ، لا سيما السمية الكبدية4،5. تحدث إصابة الكبد الحادة ، التي تتجلى في ارتفاع مستويات الترانسفيراز الأمي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ثقافة الخلية
- استزراع خلايا HepG2 في وسط النسر المعدل (MEM) عالي الجلوكوز مع 10٪ مصل الأبقار الجنيني (FBS) وخلايا RAW264.7 في وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو عالي الجلوكوز مع 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 ويتم تحديثه كل 3 أيام.
ملاحظة: لا ينصح باستخدام المضادات الحيوية ما لم يكن هناك أي تلوث فطري أو بكتيري. خلايا RAW264.7 سريعة النمو ويجب تمريرها بعد يومين.
2. مقايسة MTT
- عد الخلايا وطلاء الخلايا
- قم بزراعة خلايا HepG2 في طبق مزرعة 60 مم في حاضنة مزرعة خلية في وسط نمو كامل (MEM + 10٪ FBS).
- عندما كانت الخلايا متقاربة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم إجراء سلسلة من المقايسات لتقييم تأثير TKI lapatinib و neratinib على خلايا سرطان الخلايا الكبدية (HepG2) وتأثيراتها النهائية على البلاعم. تمت معالجة خلايا HepG2 بتركيزات متفاوتة من اللاباتينيب أو النيراتينيب ، وتم قياس صلاحية الخلية في 48 ساعة باستخدام مقايسة MTT (الأشكال 1 أ ، ب). بناء على منحنيات البقاء على قيد الحياة ، تم اختيار جرعة شبه مميتة تبلغ 2.5 ميكرومتر لمزيد من التجارب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تستكشف الدراسة الحالية الآثار غير المباشرة لعلاج اللاباتينيب أو النيراتينيب على استقطاب البلاعم من خلال الوسائط المكيفة التي تم جمعها من خلايا الكبد HepG2 المعالجة بالمعارف التقليدية. باستخدام البلاعم RAW264.7 ، نلاحظ نمطا ظاهريا M2 عند التعرض للوسائط المكيفة ، كما يتضح من تنظيم ARG1. من الناحية الشكلية ، أظهرت البلاعم المعالجة شكلا مميزا متضخما وممدودا ، مما يدعم بشكل أكبر تحريض حالة شبيهة ب M2. أدناه ، نناقش الخطوات الحاسمة للبروتوكول ، والتعديلات المحتملة ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون معهد شيف نادار للنموع على دعم البنية التحتية. يتم تمويل هذه الدراسة من قبل منحة وزارة العلوم والتكنولوجيا CRG / 2022/003242.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خط خلية HepG2 | NCCS | خط الخلية الملتصق | |
| خط خلية RAW264.7 | NCCS | خط الخلية الملتصق | |
| DMEM (المتوسط المعدل من دولباكو) | هيميديا | AT066 | ارتفاع الجلوكوز، البودرة |
| MEM (النسر المتوسط المعدل) | جيبكو | 611100-053 | ذرور |
| PBS (محلول محلول الفوفات) | هيميديا | TS1101 | ذرور |
| حل تريبسين-إيدتا | هيميديا | TCL007 | حل |
| FBS (مصل البقر الجنين) | هيميديا | RM1112 | سائل |
| صبغة MTT | هيميديا | TC191 | ذرور |
| لاباتينيب | سيليكشم | S2111 | ذرور |
| نيراتينيب | شركة كايمان للكيماويات | 18404 | ذرور |
| DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) | هيميديا | TC185 | حل |
| فورمالديهايد | رانكيم | F0080 | حل |
| جلوتارالديهايد | سيغما-ألدرش | 340855 | حل |
| حمض الستريك أحادي الهيدرات، نقي | هيميديا | GRM229 | ذرور |
| فوسفات الصوديوم ثنائي الأساس اللامائي | هيميديا | MB024 | ذرور |
| فيروسيانايد البوتاسيوم، K4[Fe(CN)6] | فيشر ساينتفيك | P-236-500 | |
| فيريريسينيد البوتاسيوم، K3[Fe(CN)6] | فيشر ساينتفيك | P-232-500 | |
| NaCl | SRL | 41721 | ذرور |
| MgCl2 سداسي هيدرات | هيميديا | GRM-1068 | ذرور |
| إكس-جال | SRL | 45904 | ذرور |
| دهنيون بوليسكاريد | سيغما-ألدرش | L6529 | |
| الإنترفيرون والغاما المؤتلفان البشري؛ | هيميديا | CF040-20MCG | |
| كاشف خلية ROX الأحمر العميق | صيد حراري علمي | C10422 | |
| هوشتت | إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك | H3570 | ذرور |
| ميتو تراكر أخضر | إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك | 1842298 | ذرور |
| الأجسام المضادة ARG1 | تقارب | DF6657 | المحلول، MW محسوب - 35 كيلو دالتون، MW الملحوظ - 65 كيلو دالتون |
| الأجسام المضادة المضادة NOS2 | شركة كلاودو كلون كورب. | PAA837Hu01 | المحلول، حسب MW - 130 كيلو دالتون، MW الملحوظ - 65 كيلو دالتون |
| الأجسام المضادة المضادة ل-iNOS | تقارب | المحلول، MW محسوب - 130 كيلو دالتون، MW الملاحظة - 120 كيلو دالتون | |
| الأجسام المضادة المضادة لGAPDH | علوم الحياة البيوبهاراتي Pvt.Ltd | BB-AB0060 | حل |
| الأجسام المضادة للأرانب | شركة كايمان للكيماويات | 10004301 | حل |
| غشاء النيتروسيلولوز | شركة ميرك ميليبور المحدودة | HATF00010 (رقم المنتج) | |
| فيمتولوسنت<سوب>TMبلس HRP | جي بايوساينس | 786-003 | |
| أطباق 60 مم | نوك | 150462 | |
| لوحة 96 بئر، | نوك | 165306 | |
| حاضنة زراعة الخلايا | ثيرمو فيشر العلمي | 371 | |
| المجهر | 1. مجهر لايكا المقلوب 2. المجهر الكونفوكي نيكون | 1. دليل DMIL 2. Ti2E، A1R | كلاهما رقم موديل |
| نظام iBright للتصوير | إنفيتروجين، ثيرمو فيشر ساينتيفيك | CL1500 (رقم الطراز) | |
| قارئ الألواح | بيو-راد | قارئ الميكروبليت iMark | |
| الطرد المركزي | ثيرمو فيشر العلمي | سورفال ST 8R (رقم الطراز) |
المراجع
- Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
- Yang, X., Wu, D., Yuan, S.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
