$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: قبل الشروع في هذا البروتوكول، من المهم الرجوع إلى المبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية والوطنية ذات الصلة لسلامة النظائر المشعة. باختصار ، تعامل مع جميع المواد المشعة ، أو أي شيء قد يكون قد لامس النظائر المشعة ، أثناء ارتداء قفازات مزدوجة ومعطف مختبر ونظارات واقية للسلامة. تم تنفيذ الإجراء في مساحة مخصصة في المختبر بشريط لاصق لتمييز الأقسام التي تحتوي على نظائر مشعة. أيضا ، بعد كل الإجراءات ، قم بتنظيف الأواني الزجاجية والأدوات على الفور ، ثم قم بمسحها واختبرها بحثا عن وجود نظائر مشعة ملوثة عن طريق عدد الوميض. كما تم التخلص من جميع المواد والسوائل المستخدمة في هذه المقايسات في حاويات نفايات مشعة مخصصة والتخلص منها بشكل صحيح وفقا لمبادئ توجيهية جامعة كالجاري ولجنة السلامة النووية الكندية.
1. تحضير محلول Hoagland
- قم بإعداد محلول Hoagland 0.5x (نصف القوة) من خليط تجاري أو اصنع الوسائط من الصفر ، تتكون من 0.5 ملي مولار NH4H2PO4 ، 3 ملي مولار KNO3 ، 2 ملي مولار Ca (NO3) 2 ، 1 ملي مولار MgSO4 ، 23 ميكرومتر H3BO3 ، 5 ميكرومتر MnCl2 • 4H2O ، 400 نانومتر ZnSO4 • 7H2O ، 200 نانومتر CuSO4 • 5H2O ، 70 نانومتر H2MnO4 • 1H2O ، 45 ميكرومتر FeSO4 • 7H2O.
- أضف MES أو أي مخزن مؤقت مناسب آخر لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ملليمتر.
- اضبط الرقم الهيدروجيني على القيمة المطلوبة (هنا ، كان الرقم الهيدروجيني 5.0).
2. تحضير محلول الملصقات الراديوية
- انقل الحجم المطلوب من محلول Hoagland 0.5x (50 مل لكل تكرار) إلى قارورة نظيفة.
- أضف 0.1-0.26 كيلو بيكيو/مل من المركب ذي العلامات الإشعاعية إلى محلول هوغلاند.
ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام 14C-AdCA (حمض أدامانتان -1-كربوكسيل) مذاب في الميثانول.
- امزج جيدا عن طريق تحريك القارورة لمدة 2-3 دقائق.
- أليكوت 50 مل من محلول الملصقات الراديوية في 125 مل قوارير إرلينماير لكل تكرار.
3. نبات الأرابيدوبسيس ( نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا (L.) هينه.) تحضير النبات
ملاحظة: بروتوكول نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا للزراعة المائية مفصل في Conn et al. (2013) 9.
- لكل نبات ، قم بإزالة غطاء من أنبوب ميكروفوج قياسي سعة 1.7 مل بمقص واخترق ثقبا قطره 3 مم في وسط الغطاء باستخدام ثقب جلدي.
- أغلق قمم الأغطية مؤقتا بشريط لاصق واملأ الأغطية بوسائط Hoagland منصهرة 0.5x تحتوي على 0.8٪ أجار ، ثم ضعها في غطاء صندوق طرف معدل (خزان الإنبات) (الشكل 1 أ).
- قم بتعقيم بذور نبات الأرابيدوبسيس عن طريق الغسيل المتتالي بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق ، ثم 5 دقائق ، وجففها في غطاء التدفق على ورق ترشيح معقم.
- زرع البذور في وسط أجار من خلال الفتحة المثقوبة في الجزء العلوي من غطاء جهاز الطرد المركزي الدقيق.
- قم بتقسيم البذور إلى طبقات في رف الطرف عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 أيام.
- انقل خزان الإنبات إلى غرفة النمو في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء ، 8 ساعات داكنة عند ~ 150 ميكرولتر / م2ثانية من الضوء و 22 درجة مئوية).
- املأ رفوف الأطراف بمحلول 0.5x Hoagland.
ملاحظة: تأكد من أن المحلول يلامس الأجار لمنع الجفاف.
- ازرع النباتات لمدة 2-3 أسابيع ، مع تعبئة المحلول حسب الحاجة (كل 3-4 أيام) حتى يظل الأجار على اتصال بمحلول الزراعة المائية.
- ازرع الأغطية والشتلات في فتحة قطرها 10 مم مقطوعة من خلال وسط غطاء أنبوب فالكون سعة 50 مل باستخدام مثقاب ومنشار حفر (الشكل 1 ب).
- قم بحفر 12 حفرة في غطاء حمل بلاستيكي سعة 10 لتر مع مثقاب منشار بقطر 30 مم (خزان النضج).
- ضع أغطية أنبوب Falcon فوق الفتحات الموجودة في الجزء العلوي من الحمل بحيث تمر الجذور إلى الحمل أدناه.
- قم بتوصيل أحجار الهواء بقاع خزان النضج واملأها بمحلول Hoagland حتى تغمر الجذور في الغالب.
- أعد النباتات إلى غرفة النمو وتنمو لمدة 6-8 أسابيع أخرى (16 ساعة ضوء ، 8 ساعات داكنة عند ~ 150 ميكرولتر / م2ثانية من الضوء و 22 درجة مئوية) ، حتى يبلغ قطر الوريدات حوالي 10 سم.

الشكل 1: خزانات الزراعة المائية الإنبات والنضج نبات الأرابيدوبسيس ووعاء المعالجة 14C-AdCA. (أ) خزان الإنبات المستخدم لإنبات بذور نبات الأرابيدوبسيس للنمو المائي. (ب) نباتات نبات الأرابيدوبسيس في خزان النضج جاهزة للتجريب. (ج) نبات نبات الأرابيدوبسيس مع جذور مغمورة في محلول 14C-AdCA أثناء التجريب. عادة ما يتم تغطية القوارير سعة 50 مل (وعاء المعالجة 14درجة مئوية) بورق الألمنيوم (غير معروض) أثناء التعرض لمنع نمو الطحالب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. اندفاع البلطيق (Juncus balticus Willd. ) تحضير النبات
- قم بتقطيع البذور إلى طبقات بين قطعتين مبللتين من ورق الترشيح في طبق بتري عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أسابيع.
- قم بإزالة ورق الترشيح العلوي وضع الطبق في غرفة النمو في ظل ظروف اليوم الطويل (16 ساعة ضوء ، 8 ساعات داكنة عند ~ 150 ميكرولتر / م2ثانية من الضوء و 22 درجة مئوية) لمدة أسبوع واحد.
- زرع الشتلات في رفوف الأطراف المعدلة كما هو موضح ل نبات الأرابيدوبسيس (الخطوة 3.1-3.4).
- ازرع النباتات لمدة 2-3 أسابيع (16 ساعة ضوء ، 8 ساعات داكنة عند ~ 150 ميكرولتر / م2ثانية من الضوء و 22 درجة مئوية) ، أو حتى يصل طول الجذور إلى 3-4 سم.
- زرع النباتات في حمل 10 لتر معدلة بأحجار الهواء ، واملأها بمحلول Hoagland حتى تغمر الجذور في الغالب ، وتنمو لمدة 6-8 أسابيع إضافية (16 ساعة ضوء ، 8 ساعات داكنة عند ~ 150 ميكرولتر / م2ثانية من الضوء و 22 درجة مئوية).
5. تحضير نبات الصفصاف الرملي (Salix Rowlee الداخلي)
ملاحظة: تم وصف بروتوكول زراعة نباتات الصفصاف الرملية في Alberts et al. (2021) 10.
- قم بقص قصاصات جذعية مقاس 10 سم (قطرها 5 مم) واغمرها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة بدرجةحرارة 2درجة مئوية لترطيب وتحفيز التجذير.
- انقل القصاصات المائية إلى خزانات الزراعة المائية الخلوية مع 10 لتر من محلول Hoagland 0.5x وتنمو لمدة شهر واحد (16 ساعة ضوء ، 8 ساعات داكنة عند ~ 150 ميكرولتر / م2ثانية من الضوء و 22 درجة مئوية) لتأسيس نمو الجذور والنبتة.
ملاحظة: قم بتحديث محلول Hoagland كل أسبوعين لمنع نقص المغذيات أثناء نمو النبتة.
6. وضع العلامات على النظائر المشعة
- بعد عمل محلول الملصقات الراديوية ، اجمع كمية 100 ميكرولتر من محلول عد تلألؤ السائل لتحديد تركيز النظائر الأولي.
- امسح جذور النبات برفق وانقل مجموعة غطاء أنبوب Falcon إلى قوارير Erlenmeyer سعة 125 مل (وعاء المعالجة 14درجة مئوية) التي تحتوي على محلول 0.5x Hoagland مع 14مركبا عضويا تحمل علامة C من الخطوة 2.4.
- ضع علامة على مستوى المحلول على القارورة للتأكد من إمكانية تعبئتها إلى حجم البداية أثناء التجربة ، مع مراعاة التبخر والتبخر.
- لف القوارير بورق الألمنيوم ورجها عند 40-60 دورة في الدقيقة تحت أضواء النمو طوال مدة الفحص أو حتى يتم نقل النباتات الملصقة إلى محلول Hoagland 0.5x بدون ملصق راديو لفترة مطاردة.
- قم بتعبئة مستوى الصوت في القارورة كل 1-2 ساعة إلى الخط المصنوع في الخطوة 6.3 باستخدام محلول Hoagland بدون الملصق الراديوي قبل جمع 100 ميكرولتر من الاقتباسات. تأكد من قياس حجم Hoagland المضافة إلى كل قارورة لمقارنة معدل التبخر من كل محلول. بعد أول 6-8 ساعات ، يمكن أن تزيد أوقات أخذ العينات إلى كل 12-24 ساعة.
ملاحظة: يمكن أن تستمر هذه الخطوة لعدة أيام إذا لزم الأمر ، ولكن تأكد من مراقبة النشاط الإشعاعي في الحصص يوميا مع تقدم التجربة.
- اختياري: لمراقبة النضح خلال فترة المطاردة ، انقل النبات ومجموعة غطاء أنبوب فالكون إلى قارورة بها 50 مل من محلول هوغلاند الطازج (لا يحتوي على مركب 14يحمل علامة C) وقم بإزالة كمية 100 ميكرولتر كل ساعتين لأول 6-8 ساعات ، ثم على فترات 24 ساعة من بداية التجربة.
ملاحظة: للتمييز بين النضح السلبي والنضح النشط للمركب من جذور النبات ، يمكن إضافة مثبط نقل نشط مثل السيكلوسبورين أ بتركيز 20 ميكرومتر.
- قم بقياس التعداد المشع لكل حصة تم جمعها بين الخطوات 6.1-6.6 باستخدام عداد تلألؤ السائل.
7. تصوير الفوسفور للنباتات
- اشطف الجذور لمدة 15 دقيقة في محلول هوغلاند 0.5x بدون الملصق الراديوي لإزالة النظائر المشعة غير المرتبطة.
- اجمع 100 ميكرولتر من محلول الشطف لعدد التلألؤ السائل.
- قم بوزن النباتات أو المواد النباتية غير الخشبية لتحديد الكتلة الطازجة.
- جفف المادة النباتية بمجفف جل على قطعة من ورق الترشيح الملصق عند 50 درجة مئوية تحت الفراغ لمدة ساعتين ، ثم اتركها لتجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بمجرد تجفيفها ، يمكن تخزين النباتات لفترات طويلة (4-6 أشهر) ويمكن أن يتم التصوير في وقت لاحق مع الحد الأدنى من الانخفاض في الإشارة المشعة.
- امسح شاشة الفوسفور عن طريق تعريضها للضوء العالي على ممحاة الفوسفور لمدة 15 دقيقة.
- قم بتوزيع 2-10 ميكرولتر من محلول الملصقات الراديوية مع النشاط الإشعاعي المعروف على قطعة من ورق الترشيح واتركه يجف في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
ملاحظة: هنا ، يتم استخدام معايير الأنشطة الإشعاعية: 67 و 33 و 17 و 8 و 4 و 2 Bq ، ولكن يمكن تغيير ذلك لاستيعاب شدة الإشارة من عينات المصنع.
- ضع شاشة الفوسفور فوق عينات النباتات المجففة والمعايير المشعة في الظلام أو في وعاء مغلق غير شفاف وقم بتعريضها لمدة 24 ساعة على الأقل.
ملاحظة: إذا كانت الصورة منخفضة التعريض الضوئي أو الزائدة، فاضبط وقت التعريض الضوئي وفقا لذلك.
- قم بتصوير الشاشات باستخدام نظام تصوير الفوسفور بالليزر بدقة 50 ميكرومتر.
- تحليل شدة إشارة الصورة الفوسفورية وتوزيعاتها باستخدام برنامج ImageJ11.
- خطوات ImageJ: افتح الصورة عن طريق تحديد ملف > تحليل > تعيين القياسات ... حدد المنطقة ومتوسط القيمة الرمادية > موافق. اختر أداة تحديد الشكل التي تناسب الأنسجة. انقر واسحب الصورة لتمييز منطقة الاهتمام. اضغط على Ctrl + M. انسخ المنطقة ومتوسط القيمة الرمادية في جدول بيانات.
- قم بتحويل متوسط القيم الرمادية إلى Bq باستخدام المعايير المشعة في منحنى قياسي.
- احسب النشاط الكلي في الأنسجة النباتية (الكثافة المتكاملة) بالمعادلة التالية:
الكثافة المتكاملة (Bq) = (متوسط Bq للأنسجة (Bq / cm2) - الخلفية (Bq / cm2)) * المساحة (سم2)
- اختياري: قم بتحويل الصورة ذات التدرج الرمادي إلى مقياس كثافة اللون باستخدام برنامج ImageJ11.