مقالة منهجية

إعادة برمجة الخلايا السرطانية القابلة للتتبع في الجسم الحي إلى الخلايا الشبيهة بالخلايا المتغصنة التقليدية من النوع 1

DOI:

10.3791/68739

⸱

أغسطس 1, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول إعادة البرمجة في الجسم الحي لخلايا سرطان الفئران إلى خلايا شبيهة بالتغصنات من النوع 1 داخل البيئة المكروية للورم من خلال التعبير القسري عن عوامل النسخ PU.1 و IRF8 و BATF3.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتمد فعالية العلاج المناعي للسرطان على تجنيد وتنشيط استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا ضد الأورام الصلبة بواسطة الخلايا المتغصنة التقليدية من النوع 1 (cDC1s). ومع ذلك ، فإن توليد cDC1s للعلاج المناعي للسرطان يواجه قيودا كبيرة ، بما في ذلك ضعف إنتاجية الخلايا ، وعدم التجانس الوظيفي ، والقابلية لكبت المناعة في البيئة المكروية للورم (TME). لقد طورنا مؤخرا طريقة علاج مناعي تعتمد على إعادة برمجة الخلايا السرطانية في الجسم الحي إلى خلايا شبيهة ب cDC1 المناعية ، مما مكن الخلايا السرطانية من تقديم مستضدات الورم على أنها cDC1s وأثارت استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا متعددة النسيلة ومناعة جهازية دائمة مضادة للورم. هنا ، نصف بروتوكولا قابلا للتتبع لتوليد خلايا شبيهة ب cDC1 داخل TME عن طريق الإفراط في التعبير عن الحد الأدنى من الشبكة التنظيمية للجينات الخاصة ب cDC1 - PU.1 و IRF8 و BATF3 (يشار إليها مجتمعة باسم PIB) - في الخلايا السرطانية ، متبوعا بزرع تحت الجلد لمزيج من الخلايا المنقولة والأبوية. يقود الإفراط في التعبير PIB إلى الاستحواذ التدريجي على علامة المكونة للدم CD45 ومركب عرض المستضد الاحترافي معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية على الخلايا السرطانية ، حيث يعمل كقراءات لسطح الخلية لإعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي . عند مقارنتها بعملية إعادة البرمجة في المختبر ، أظهرت إعادة برمجة نموذج الورم الميلانيني للفأر YUMM1.7 في الجسم الحي حركية أسرع وكفاءة أعلى. تسببت الخلايا الشبيهة ب cDC1 في إعادة تشكيل سريعة ل TME عن طريق تجنيد الخلايا المناعية المضيفة خلال الأيام الثلاثة الأولى وتؤدي إلى تكوين بنية ليمفاوية ثلاثية بحلول اليوم 9. استمرت الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها في الأورام لمدة 9 أيام على الأقل ولكن لم يتم اكتشافها في اليوم 15. يوفر بروتوكول إعادة برمجة cDC1 الموصوف هنا في الجسم الحي طريقة قابلة للتتبع وقوية لتحويل الأورام "المناعية الباردة" بشكل فعال إلى "مناعة ساخنة". بشكل عام ، فإنه يوفر منصة قوية لدراسة الآليات الكامنة وراء المناعة المضادة للورم بوساطة cDC1 والكشف عن التركيبات التآزرية مع طرق العلاج المناعي الأخرى للسرطان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدت التطورات الحديثة في طرق العلاج المناعي للسرطان ، بما في ذلك حصار نقاط التفتيش المناعية (ICB) ، والعلاج بالخلايا بالتبني (ACT) ، واللقاحات ، إلى تغيير مشهد علاجالسرطان 1. في الورم الميلانيني ، يمكن أن تصل معدلات الاستجابة لبروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) وتثبيط البروتين المرتبط بالخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا 4 (CTLA-4) إلى 60٪ 2. ومع ذلك ، فإن أكثر من 40٪ من مرضى الورم الميلانيني يفشلون في الاستجابة للICB ، وتظل معدلات الاستجابة في السرطانات الأقل مناعة ، مثل سرطان الثدي وسرطان القولون والمستقيم المستقر بالأقمار الصناعية الدقيقة والورم الأرومي الدبقي ، أقل من 5٪ ، مما يسلط الضوء على الفجوات السريرية3،4،5. يتمثل أحد العوائق الرئيسية أمام النجاح السريري الواسع في ضعف تنشيط استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا ، والتي تعتمد على العرض الفعال للمستضد داخل البيئة المكروية للورم (TME) 6.

الخلايا المتغصنة التقليدية من النوع 1 (cDC1s) نادرة ، ولكنها لا غنى عنها لبدء المناعة الخاصة بالورم ، حيث تقدم ثلاث إشارات رئيسية لاستجابات الخلايا التائية الأولية: (1) المعالجة الاحترافية وعرض المستضدات على مجمعات التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) من الفئة الأولى والثانية ، (2) التحفيز المشترك عبر CD80 و CD86 ، و (3) إشارات السيتوكين المؤيدة للالتهابات بما في ذلك IL-127،8. من بين المجموعات الفرعية للخلايا المتغصنة (DC) ، تتفوق cDC1s في تقديم المستضدات المرتبطة بالخلايا السرطانية لتشغيل خلايا الذاكرة CD8 + T الساذجة أو إعادة تنشيطها أو دفع تمايز الخلايا التائية CD4 + إلى خلايا المساعدة من النوع 1 T (TH1)9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن cDC1s هي المنتجين الرئيسيين للكيموكينات ، روابط الكيموكين 9 و 10 (CXCL9 / 10) ، والتي تتوسط تجنيد الخلايا التائية في أنسجة الورم10،11،12،13. على مدى السنوات القليلة الماضية ، سلطت العديد من الدراسات الضوء على أن رفض الورم والاستجابات الفعالة ل ICB أو ACT ترتبط ارتباطا وثيقا بوجود cDC1s داخل الورم12،13. ومن ثم ، فقد تطورت cDC1s كهدف جذاب للعلاج المناعي للسرطان ويمكن أن يكون لتسخير ميزاتها الفريدة بنجاح إمكانات انتقالية كبيرة.

تعتمد الطرق الحالية لتوليد cDC1s على عزل الدم أو تمايزه من أسلاف CD34 + أو الخلايا الجذعية متعددةالقدرات 14،15،16. تعتمد الاستراتيجيات السريرية السائدة على عزل مزيج من مجموعات فرعية من DC الذاتية من الدم وتحفيزها خارج الجسم الحي باستخدام ناهضات مستقبلات شبيهة بالحصيلة أو السيتوكينات المؤيدة للالتهابات للحث على برنامج مناعي ناضج قبل إعادة التسريب16. ومع ذلك ، فإن هذه الاستراتيجيات محدودة بسبب ضعف نضج الخلايا ، والحواجز المثبطة للمناعة في TME ، وعدم تجانس المجموعة الفرعية في خليط DC المنقوع ، حيث توجد نسبة صغيرة فقط من cDC1s7. علاوة على ذلك ، فإن عزل cDC1s فقط للعلاج المناعي للسرطان أو التطعيم يمثل تحديا بسبب وفرة منخفضة للغاية في الدم المحيطي (<0.3٪)16. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إنتاج cDC1s من الخلايا السلفية CD34 + أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات باستخدام السيتوكينات وإشارات NOTCH. ومع ذلك ، تتطلب هذه الأساليب بروتوكولات معقدة وطويلة وتنتج أعدادا منخفضة ومجموعات غير متجانسة من المجموعات الفرعية DC17،18،19.

لمعالجة هذه القيود ، توفر إعادة البرمجة في الجسم الحي استراتيجية مناسبة للعلاج المناعي للسرطان لتوليد خلايا شبيهة ب cDC1 ، والتي تشبه الخصائص المظهرية والنسخية والوظيفية ل cDC1s20. من خلال الإفراط في التعبير عن الحد الأدنى من الشبكة التنظيمية للجينات الخاصة ب cDC1 - PU.1 و IRF8 و BATF3 (يشار إليها مجتمعة باسم PIB) - تمت إعادة برمجة الخلايا الليفية والخلايا اللحمية والخلايا السرطانية تدريجيا إلى خلايا شبيهة ب cDC1 مما يتيح معالجة مستضد الورم وعرضه على معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الأولى والثانية ، والإشارات التحفيزي المشترك عبر CD80 و CD86 ، وإفراز السيتوكين / الكيموكين ، بما في ذلك CXCL9 / 10 و IL-1220 ، 21،22،23. تقدمت إعادة برمجة cDC1 بشكل أسرع وأكثر كفاءة عبر الطعوم الغريبة البشرية في الجسم الحي وبشكل مستقل عن تثبيط المناعة ، مما أدى إلى توليد خلايا شبيهة ب cDC1 مع توقيع مناعي ناضج20. في أورام الورم الميلانيني الزاوي ، لاحظنا أن الخلايا الشبيهة ب cDC1 أعادت تشكيل TME ، وأثارت تكوين بنية ليمفاوية ثلاثية (TLS) ، وقامت بتجنيد وتوسيع الخلايا التائية متعددة النسيلة TH1 والذاكرة السامة للخلايا ، مما أدى إلى مناعة جهازية طويلةالأمد 20. أخيرا ، قمنا بتطوير طريقة جديدة للعلاج المناعي للسرطان تعتمد على إعادة برمجة الخلايا السرطانية في الموقع إلى خلايا شبيهة ب cDC1 عن طريق الحقن داخل الورم لنواقل الفيروساتالغدية 20. تمهد هذه النتائج الطريق للترجمة السريرية لإعادة برمجة cDC1 كطريقة جديدة للعلاج المناعي للسرطان يمكنها تسخير الخصائص الوظيفية ل cDC1s.

هنا ، نقدم بروتوكولا قابلا للتتبع لإنشاء خلايا شبيهة ب cDC1 داخل TME بناء على إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي. يسمح توصيل الفيروسات العدسية ل PIB إلى الخلايا السرطانية والزرع اللاحق كمزيج محدد من الخلايا السرطانية المنقولة مع الخلايا السرطانية الأبوية غير المنقولة بإعادة البرمجة في الجسم الحي لجزء خاضع للرقابة من الخلايا السرطانية داخل TME. بالإضافة إلى ذلك ، لا تقتصر هذه الطريقة على كفاءة التوصيل في الموقع للنواقل الفيروسية20. نحدد خطوات الإنتاج الفعال لنواقل الفيروسات القشرية ، والمعايرة الوظيفية ، وإعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي باستخدام نموذج الورم الميلانيني المتزاوي ، YUMM1.7 ، كمثال. نقوم بتفصيل الإعداد التجريبي واستراتيجية البوابات لتحليل الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها في الجسم الحي عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد تفكك الورم. نقدم أيضا خطوات تقييم التغييرات في TME من خلال إجراء الحفظ بالتبريد والتقسيم وتلوين التألق المناعي لأقسام الورم ، متبوعا بالفحص المجهري متحد البؤر. أخيرا ، نتناول كيفية مراقبة المناعة التي يسببها cDC1 عن طريق قياس نمو الورم والبقاء على قيد الحياة. يوفر هذا النهج القابل للتتبع والقابل للتطوير للباحثين أداة قيمة لتقييم استراتيجيات العلاج الاندماجية من خلال إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي ، لتوصيف التغييرات في تكوين التكوين الجديد TME و TLS عبر نماذج السرطان أو إجراء شاشات كبيرة لتعديل التعبير عن المسارات المناعية المختلفة ، على سبيل المثال ، عرض المستضد أو إفراز السيتوكين / الكيموكين ، وكشف تأثيرها على المناعة المضادة للأورام.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ إجراءات التجارب على وفقا للوائح السويدية بعد موافقة المجلس السويدي للزراعة.

1. إعداد الكاشف

  1. لتحضير وسط النسر المعدل (DMEM) الكامل من Dulbecco ، أضف 10٪ (v / v) مصل بقري الجنين (FBS) ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين (قلم) ، و 2 ملي مولار بديل الجلوتامين ، و 100 مجم / مل من الستربتومايسين (Strep).
  2. لتحضير وسائط RPMI 1640 الكاملة ، أضف 10٪ (حجم / حجم) FBS ، وبديل الجلوتامين 2 ملي مولار ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و 50 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول ، و 100 وحدة / مل قلم ، و 100 مجم / مل من البكتيريا العقدية.
  3. لتحضير وسائط DMEM/F12 الكاملة، أضف 10٪ (حجم/حجم) مصل بقري للجنين (FBS)، وبيروفات الصوديوم 1 مليمولار، و0.1 ملي مولار من الأحماض الأمينية غير الأساسية، و100 قلم واحد/مل و100 ملغم/مل من البكتيريا العقدية.
  4. لتحضير 1 ملغم/مل من بولي إيثيلينيمينين، قم بإذابة 100 ملغ من مسحوق جزيرة الأمير إدوارد في 100 مل من الماء منزوع الأيونات المعقم في دورق زجاجي أو أنبوب مخروطي الشكل. ضع الدورق على محرك مغناطيسي وحركه في درجة حرارة الغرفة (RT) لعمل دوامة حتى يذوب تماما. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.9-7.1 ، مع إضافة حمض الهيدروكلوريك (HCl) / هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بالتنقيط ، وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح غشاء PES 0.22 ميكرومتر.
  5. لتحضير 1 ملي مولار من زبدات الصوديوم ، قم بإذابة 1.10 مجم في 10 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات.
  6. لتحضير 8 ملغم/مل من البوليبرين، قم بإذابة 80 ملجم من مسحوق البوليبرين في 10 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات.
  7. لتحضير المخزن المؤقت FACS، أضف 2٪ FBS و1 ملي مولار EDTA إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).

2. إنتاج فيروس العدسي

  1. قم بإذابة خلايا HEK 293T عن طريق إضافة 1 مل من الخلايا إلى 9 مل من وسط DMEM الكامل المسخن مسبقا وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من وسط DMEM الكامل والخلايا المزروعة في صفيحة 150 مم عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. قم بتوسيع وتقسيم خلايا HEK 293T عندما تصل إلى 80-90٪ من التقاء. لتقسيم الخلايا ، اغسلها مرة واحدة باستخدام PBS ، وأضف 5 مل من التربسين لفصلها عن اللوحة ، واحتضن 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  3. اجمع الخلايا التي تحتوي على 5 مل من الوسط الكامل DMEM ، وقم بطردها عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بتقسيمها 1: 6 إلى ألواح جديدة مقاس 150 مم ، قبل 48 ساعة من التعداد.
    ملاحظة: تعد جودة خط الخلايا المنتجة لفيروس العدسات أمرا بالغ الأهمية لإنتاج عيارات عالية. لا تسمح للخلايا بتجاوز التقاء 95٪ وتجنب زرعها عند التقاء <30٪.
  4. بعد 48 ساعة ، أو عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ من التقاء ، قم بإعداد مزيج التعداء في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. استخدم بلازميد النقل التالي: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-a ناقل فيروسات عديم السترونيك يحتوي على عوامل النسخ PU.1 و IRF8 و BATF3 وموقع دخول الريبوسومي الداخلي (IRES) وبروتين الفلورسنت الأخضر المحسن (eGFP) كمبلغ نقل الفلورسنت ؛ أو 2) SFFV-eGFP، وهو ناقل فيروسي للتحكم مع موقع استنساخ متعدد وeGFP؛ أو 3) SFFV-mCherry ، ناقل فيروسي يعبر عن mCherry. أضف 10 ميكروغرام من بلازميد النقل ، و 7.5 ميكروغرام من بلازميد التغليف psPAX2 ، و 2.5 ميكروغرام من بلازميد المغلف pMD2.G. قم بتعبئة الأنبوب باستخدام Opti-MEM للوصول إلى حجم إجمالي يبلغ 2 مل. أخيرا ، أضف 60 ميكرولتر من كاشف التعدي PEI (من مخزون 1 مجم / مل) إلى مزيج التعدين.
    ملاحظة: يتم استخدام ناقل الفيروسات العسقرية SFFV-eGFP كعنصر تحكم في التنبيغ لإعادة برمجة التجارب لحساب المناعة بوساطة الفيروسات العدسية ، بينما يتم استخدام SFFV-mCherry لتوليد خطوط الخلايا السرطانية المصنفة بالفلورسنت.
  5. الدوامة يختلط التعداء جيدا لمدة 1 دقيقة ويحتضن لمدة 15 دقيقة في RT للسماح بتكوين مجمعات الحمض النووي والدهون.
    ملاحظة: يؤثر التقاء بشكل كبير على العيارات الفيروسية. سيؤدي نقل الخلايا عند أقل من 70٪ من التقاء إلى انخفاض العيار الفيروسي بسبب عدد أقل من الخلايا التي تتلقى البلازميدات.
  6. استنشق وسط خلايا HEK 293T وأضف 10 مل من DMEM بدون قلم / خطوة ومع 10٪ من FBS المصفى معقما.
  7. أضف مزيج الإرسال بالتنقيط إلى الألواح مقاس 150 مم واحتضانه لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  8. بعد التعدي ، استبدل الوسط ب 20 مل من وسط DMEM الكامل المكمل ب 1 ملي مولار من زبدات الصوديوم ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    ملاحظة: زبدات الصوديوم هو مثبط هيستون ديستيلاز من الفئة 1 (HDAC) ويمكن أن يعزز التعبير الجيني في خلايا HEK 293T عن طريق تحفيز فرط أسيتيل الهيستون ، مما يفتح بنية الكروماتين ويسهل نسخ العبوات الفيروسية ونقل البلازميدات. يمكن تقييم كفاءة التعدي عن طريق التحقق من تعبير eGFP باستخدام المجهر الفلوري.
  9. اجمع المادة الطافية المحتوية على الفيروسات العدسية بعد 48 ساعة و 60 ساعة من التعدي في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. بعد المجموعة الأولى ، أضف 12 مل من الوسط الكامل الدافئ مسبقا لكل لوحة 150 مم للمجموعة الثانية. قم بتخزين المجموعات في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، وقم بترشيحها من خلال مرشح PES منخفض البروتين 0.45 ميكرومتر واجمعها.
  10. لتركيز الفيروس، قم بوضع ماصة 37 جم من الوسط المحتوي على فيروس العدسات في أنابيب بولي بروبيلين رقيقة الجدران سعة 38.5 مل من الجدران الرقيقة. قم بقياس وزن الأنابيب باستخدام مقياس مقاعد البدلاء.
    ملاحظة: قم بقياس وزن الوسط المحتوي على فيروس العدسات بدلا من حجمه ، حيث يوفر الوزن دقة أكبر للتوازن. يجب أن يكون وزن الأنابيب متوازنا بشكل جيد لتجنب إتلاف جهاز الطرد المركزي الفائق.
  11. ضع الأنابيب في جرافات الطرد المركزي الفائق ، وأغلق الأغطية ، وضع الدلاء في دوار دلو متأرجح. جهاز طرد مركزي عند 25,000 × جم لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  12. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنابيب من الدلاء وشفط المادة الطافية.
    ملاحظة: يمكن ملء نفس الأنابيب بشكل متكرر واستخدامها لعدد إجمالي من ثلاث جولات طرد مركزي لإنتاج حبيبات أكبر من فيروس العدسات لكل أنبوب.
  13. ضع أنابيب البولي بروبلين ذات الجدران الرقيقة المفتوحة رأسا على عقب لمدة 5 دقائق على منديل مختبري أو مادة ماصة مماثلة للسماح للسائل الزائد بتصريف الحبيبات وتجفيفها.
  14. أضف 200 ميكرولتر من DMEM المثلج المكمل ب HEPES أو PBS إلى كل حبيبات. ضع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وأغلق الغطاء للحفاظ على العقم.
  15. احتضان الحبيبات طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح بإعادة التعليق.
  16. امزج الكريات المعلقة ، وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام.
    ملاحظة: لتجنب فقدان العيار عن طريق الجولات المتكررة من التجميد والذوبان ، استخدم أحجام أصغر (على سبيل المثال ، 50-200 ميكرولتر).

3. معايرة الفيروس الوظيفية

ملاحظة: يجب تكرار هذه الخطوة لكل دفعة من الفيروسات العدسية لتحديد الجرعة الفيروسية المثلى المطلوبة لتحقيق نسبة 1: 1 من الخلايا المنقولة (eGFP +) إلى الخلايا غير المنقولة (eGFP-).

  1. قم بإذابة الخلايا السرطانية وتوسيعها في وسط الاستزراع المناسب (على سبيل المثال ، خط خلايا الورم الميلانيني الفأري YUMM1.7 في وسط DMEM / F12 الكامل).
    ملاحظة: يجب أن تخضع الخلايا لجولة واحدة على الأقل من الانقسام قبل تجربة إعادة البرمجة. يجب أن تكون ممرات الخلايا متشابهة بين التجارب.
  2. قبل يوم واحد من إنشاء الورم ، قم برفع الخلايا السرطانية عن طريق شفط وسط استزراعها ، وغسلها مرة واحدة باستخدام PBS ، وإضافة 2 مل أو 5 مل من التربسين لكل صفيحة 100 مم أو لوحة 150 مم. احتضن لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 واجمع الخلايا عن طريق إضافة 8 مل أو 5 مل من الوسائط الكاملة لكل 100 مم أو 150 مم ، على التوالي ، في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  3. خلايا الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة التربسين وإعادة تعليقها في وسط كامل.
  4. خذ 10 ميكرولتر من الخلايا ، وأضف 10 ميكرولتر من Trypan Blue ، واحسب الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم.
  5. انقل 6 × 105 خلايا إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل يحتوي على 12 مل من الوسط الكامل وأضف 12 ميكرولتر من 8 مجم / مل من البوليبرين إلى تعليق الخلية للوصول إلى تركيز عمل يبلغ 8 ميكروغرام / مل.
  6. ماصة 2 مل من تعليق الخلية في كل بئر على صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر ، قم بزيادة عدد الخلايا إلى 1.2-1.8 × 106 لكل لوحة ذات 6 آبار.
  7. أضف كميات متزايدة من فيروس العدسات إلى كل بئر لتحديد الحجم الأمثل المطلوب لتحقيق نسبة 1: 1 من الخلايا المحولة (eGFP +) إلى الخلايا غير المحولة (eGFP-).
    ملاحظة: أضف الأحجام الموصى بها لفيروس العدسي من 1 و 2 و 4 و 8 و 16 و 32 ميكرولتر في ثلاث نسخ. إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي الوظيفية للناقل الفيروسي الفارغ SFFV-eGFP و SFFV-mCherry.
  8. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  9. في اليوم 0 ، قم بإزالة الوسائط المحتوية على فيروس العدسات ، واستبدلها بوسائط جديدة ، واحتضانها لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  10. في اليوم 3 ، افحص الخلايا بحثا عن تعبير eGFP تحت المجهر الفلوري.
    ملاحظة: توفر هذه الخطوة تحققا سريعا من نقل الخلايا ولكنها لا تحل محل التحليل الذي يتم إجراؤه بواسطة قياس التدفق الخلوي في الخطوة 3.14 لتحديد النسبة الدقيقة لخلايا eGFP + إلى خلايا eGFP.
    في بعض الخلايا السرطانية (على سبيل المثال ، خلايا الورم الميلانيني بالفأر B16) قد تكون إشارة eGFP منخفضة ويصعب اكتشافها باستخدام المجهر الفلوري. يوصى بالمتابعة مباشرة إلى قياس التدفق الخلوي.
  11. قم بشفط الوسط ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS ، وأضف 500 ميكرولتر من التربسين لكل بئر. احتضن لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  12. ارفع الخلايا في كل بئر باستخدام 1.5 مل من المخزن المؤقت FACS وقم بتحويل معلق الخلية إلى أنابيب البوليسترين سعة 5 مل. خذ حصة واحسب الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم وتلوين التريبان الأزرق.
  13. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، واستمر في تحليل قياس التدفق الخلوي.
  14. تحديد النسبة الدقيقة للخلايا المنقولة (eGFP +) إلى الخلايا غير المحولة (eGFP-) عن طريق قياس التدفق الخلوي. للاختبار في الجسم الحي ، استخدم حجم الفيروس العدسي الذي ينتج عنه أقرب إلى نسبة 1: 1.
    ملاحظة: لتحديد نسبة eGFP + إلى خلايا eGFP بدقة ، قم بتضمين الخلايا السرطانية غير المنقولة كعناصر تحكم سلبية للبوابات.

4. إنشاء الورم تحت الجلد لإعادة البرمجة في الجسم الحي

  1. قم بإذابة الخلايا السرطانية وتوسيعها في وسط الثقافة المناسب لتوليد الخلايا التي تعبر عن الكرز.
    ملاحظة: يسهل تعبير mCherry تمييز الخلايا السرطانية أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي من مجموعات سكانية أخرى في الورم ، على سبيل المثال ، الخلايا اللحمية والمناعية الذاتية.
  2. قم بتنفيذ الخطوات 3.2-3.4 وأعد تعليق الخلايا في وسائط كاملة بتركيز 105 خلايا لكل مل.
  3. أضف 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين والحجم المحدد من فيروس العدسات SFFV-mCherry إلى تعليق الخلية للوصول إلى كفاءة نقل بنسبة >90٪.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، إذا كان تحقيق التنبيغ بنسبة >90٪ يضر بصلاحية الخلية ، فقم بفرز خلايا mCherry + عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) بعد 72 ساعة من التنبيغ وقم بتوسيع الخلايا المصنفة في الثقافة.
  4. لوحة 5 مل من تعليق الخلية (تحتوي على 5 × 105 خلايا) لكل صفيحة 100 مم وتحتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة.
  5. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط ب 10 مل من الوسط الكامل وقم بتوسيع الخلايا عن طريق زراعتها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 7 أيام على الأقل قبل البدء في إعادة برمجة التجارب.
  6. بعد التوسع ، اتبع الخطوات 3.2-3.4 لإعداد معلقات الخلية للنقل اللاحق بالحجم المحدد مسبقا ل SFFV-PIB-IRES-eGFP ، مما ينتج عنه أقرب نسبة 1: 1 من الخلايا المحولة (eGFP +) إلى الخلايا غير المحولة (eGFP) في اليوم 3.
  7. أضف 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين إلى معلق الخلية ، جنبا إلى جنب مع الحجم المحدد مسبقا من فيروس العدسات إلى تعليق الخلية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. تخلط جيدا دون تكوين فقاعات.
  8. ماصة 2 مل من معلق الخلية (تحتوي على 105 خلايا) لكل بئر في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار وتحتضن لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، ضع الخلايا في 5 مل من وسائط التنبيغ في ألواح زراعة الأنسجة مقاس 100 مم. ومع ذلك، لاحظ أن كفاءة التنبيغ قد تنخفض في أحجام أكبر وينبغي تحديدها تجريبيا كما هو موضح في الخطوات 3-1-3-13.
    يوصى بنقل خلايا أكثر بنسبة 10٪ على الأقل للتعويض عن فقدان الخلايا المحتمل أثناء عملية التنبيغ ولضمان حجم كاف لسحب العينات أو الحقن أثناء إنشاء الورم.
  9. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الوسط المحتوي على فيروس العدسات ، واغسله مرتين باستخدام PBS ، وأضف 500 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر ، واحتضنه لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  10. تحقق تحت المجهر الضوئي مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت تماما عن الصفائح ثم اجمعها بوسائط كاملة في أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
  11. قم بتكبيل الخلايا عن طريق الطرد المركزي لها لمدة 5 دقائق عند 350 × جم ، واغسل الحبيبات باستخدام PBS ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 350 × جم. خذ حصة واحسب الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم وتلوين التريبان الأزرق.
  12. أعد تعليق الحبيبات في PBS المثلج للوصول إلى تركيز 2-4 × 107 خلايا لكل مل ، وهو ما يتوافق مع 1-2 × 106 خلايا في 50 ميكرولتر من حجم الحقن لكل ورم.
    ملاحظة: الأهم من ذلك ، تم التحقق من صحة هذه الأرقام لأورام الورم الميلانيني YUMM1.7 لعزل الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها في الجسم الحي لتحليل قياس التدفق الخلوي. بالنسبة لخطوط الخلايا الأخرى والقراءات التجريبية الأخرى ، مثل نمو الورم وتجارب البقاء على قيد الحياة ، يجب اختبار الأرقام تجريبيا. بالنسبة لتجارب نمو الورم والبقاء على قيد الحياة ، يوصى بتقليل أعداد الخلايا - التي تتراوح من 100,000 إلى 250,000 خلية لكل ورم.
  13. انتقل إلى منطقة العمل حيث يتم إجراء التجارب على واحتفظ بالخلايا على الجليد.
    ملاحظة: بعد تحضير الخلية ، قم بإجراء حقن الخلايا في أسرع وقت ممكن حيث تقل صلاحية الخلية بمرور الوقت.
  14. تحضير محلول التخدير الذي يحتوي على 3 ميكرولتر من الزيلازين (20 مجم / مل) ، و 27 ميكرولتر من الكيتامين (100 مجم / مل) ، و 30 ميكرولتر من PBS لكل فأر.
  15. تخدير الفئران CD45.1 عن طريق حقن 60 ميكرولتر من التخدير داخل الصفاق. قم بترتيب الفئران بشكل عشوائي واحتفظ بها على وسادة تسخين لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم. ضعي كريم العين على عيونهم لمنع جفاف العين أثناء التخدير.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان استخدام الفئران CD45.1 لتمكين التمييز بين الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها في الجسم الحي والتي تعبر عن أليل CD45.2 من النوع البري والخلايا المناعية الذاتية. إذا كان خط الخلية هو CD45.1 ، فيمكن استخدام C57BL / 6 فئران (CD45.2) كمستلمين. يجب أن تكون الفئران متطابقة بين الجنس والعمر بين المجموعات التجريبية وعشوائية قبل إنشاء الورم.
  16. انتظر من 5 إلى 10 دقائق حتى يتم تخدير جميع الفئران بالكامل.
  17. احلق الجانب الأيمن من الفئران باستخدام ماكينة حلاقة ؛ اختياريا ، قم بتمييزها باستخدام مقص الأذن. تطهير المنطقة واسحب الشعر المتبقي بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  18. أعد تعليق الخلايا السرطانية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000. قم بتحميل معلق الخلية في حقنة 0.5 مل 30 جرام.
  19. ارفع جلد الجناح المحلوق للفأر برفق باستخدام إصبعين وأدخل طرف الإبرة حيث يشكل الجلد تجعدا.
    ملاحظة: كن حذرا لتجنب ثقب أصابعك بالإبرة.
  20. حرر الجلد ، وأمسك المحقنة في مكانها بيد واحدة ، واستخدم إصبعين من اليد الأخرى لتمديد جلد الفأر.
  21. حقن 50 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية السرطانية لإنشاء انتفاخ بيضاوي (تورم تحت الجلد) في موقع الحقن.
    ملاحظة: إذا لم يتشكل انتفاخ ، فقد يكون المعلق قد تسرب إلى الأنسجة تحت الجلد المحيطة ، مما قد يؤدي إلى تكوين ورم غير متسق أو فاشل.
  22. بعد الإجراء ، راقب استيقاظ جميع الفئران لضمان البقاء على قيد الحياة بعد التخدير.
  23. حافظ على الفئران في بيئة درجة حرارة مضبوطة مع 23 ± 2 درجة مئوية ودورة إضاءة / ظلام ثابتة لمدة 12 ساعة وحرية الوصول إلى الطعام والماء.
    ملاحظة: إذا كنت ترغب في مراقبة نمو الورم ، فتابع الخطوات 4.24-4.26. وإلا، تخطي هذه الخطوات وانتقل مباشرة إلى الأقسام التالية.
  24. لمراقبة نمو الورم، كبح جماح الفأر برفق بيد واحدة، مما يسمح برؤية واضحة للورم.
  25. باستخدام الفرجار الإلكتروني ، قم بقياس طول الورم (l) وعرضه (w) وارتفاعه (h). احسب حجم الورم (V) باستخدام الصيغة: V = (l x w x h) / 2.
  26. قم بقياس أبعاد الورم كل يومين إلى ثلاثة أيام. عندما يصل الورم إلى حجم يفي بمعيار نقطة النهاية الإنسانية (على سبيل المثال ، 1,500 مم مكعب) ، قم بالقتل الرحيم للحيوان وفقا للإرشادات الأخلاقية والمؤسسية.

5. عزل الورم لتحليل قياس التدفق الخلوي

  1. قم بإعداد المقص ، والملقط ، والمخزن المؤقت ل FACS ، وألواح زراعة غير الأنسجة ذات 12 بئرا مع وسيط RPMI كامل مثلج بارد لجمع عينات الورم.
  2. تحضير محلول هضم الورم عن طريق خلط 30 ميكرولتر من 100 مجم / مل كولاجيناز D و 3 ميكرولتر من 10 مجم / مل DNAse I في 3 مل من وسط RPMI الكامل لكل ورم (للوصول إلى تركيز عمل يبلغ 1 مجم / مل كولاجيناز D و 10 ميكروغرام / مل DNAse I).
    ملاحظة: إذا كانت كفاءة الهضم دون المستوى الأمثل ، أضف 2-5 ملي CaCl2 لدعم نشاط الكولاجيناز.
  3. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم أو اختناق ثاني أكسيد الكربون2 في يوم العزل.
  4. استئصال الأورام تحت الجلد بالمقص والملقط ووضع كل ورم في بئر من صفيحة زراعة غير الأنسجة المكونة من 12 بئرا باستخدام RPMI المثلج. حاول تقليل استئصال الأنسجة غير الورمية.
  5. قم بتقطيع عينات الورم إلى 1-2 مم3 قطع باستخدام المقص ، واجمع القطع في أنابيب مخروطية سعة 50 مل تحتوي على 3 مل من محلول الهضم ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 200-250 دورة في الدقيقة لمدة 30-45 دقيقة.
    ملاحظة: دوامة أو ماصة كل 15 دقيقة لتسهيل عملية الهضم.
  6. بعد الهضم ، قم بماصة الخليط بقوة لمدة 1 دقيقة باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل. قم بتصفية معلق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  7. استخدم مكبس حقنة سعة 10 مل لتحطيم القطع غير المهضومة ضد مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وشطف المصفاة ب 10 مل من وسط RPMI الكامل.
  8. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وأعد تعليقه في 1 مل من المخزن المؤقت FACS ، وعد الخلايا القابلة للحياة.
  9. انقل معلق الخلية إلى 5 مل من أنابيب البوليسترين ، وخلايا الحبيبات عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليق 106 خلايا قابلة للحياة لكل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  10. افصل الخلايا لعناصر التحكم أحادية اللون (SC) و FMO في أنابيب البوليسترين المنفصلة.
  11. تحضير مزيج رئيسي لتلوين الأجسام المضادة يحتوي على مصل الفئران (1: 100) لمنع الارتباط غير المحدد ؛ صبغة قابلة للإصلاح (1: 100) لاستبعاد الخلايا الميتة في التحليل ؛ والأجسام المضادة المضادة المضادة للأشعة الفلورية المضادة ل CD45.1 ، ومضادة ل CD45.2 ، ومضادة ل معقد التوافق النسيجي الكبير - II بتركيزها الأمثل. أضف 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل عينة واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  12. اغسل العينات 2x باستخدام 2 مل من المخزن المؤقت FACS واستمر في تحليل قياس التدفق الخلوي.
  13. حدد النسب المئوية للخلايا الشبيهة ب cDC1 التي تعبر عن CD45.2 و / أو معقد التوافق النسيجي الكبير - II ، عن طريق البوابات في الخلايا السرطانية المنقولة (eGFP +) (CD45.1-mCherry +).
    ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء التنميط المناعي للأورام بعد إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي عن طريق استكمال لوحة التلوين بالأجسام المضادة ضد الخلايا المناعية اللمفاوية الداخلية و / أو الخلايا المناعية النخاعية.

6. تجميد الورم والتقطيع لتحليل الفحص المجهري متحد البؤر

  1. استعد لعزل الورم باتباع الخطوتين 5.1 و 5.3. استئصال الأورام تحت الجلد بالمقص والملقط.
  2. قم بإصلاح الأورام في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) المحضر حديثا في PBS عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف. اضبط وقت التثبيت وفقا لحجم الورم ، باستخدام 1 ساعة لكل ملم مكعب من الأنسجة كمبدأ توجيهي.
  3. انقل الأورام إلى سكروز بنسبة 15٪ في PBS واحتضانها عند 4 درجات مئوية مع هز الأنسجة برفق حتى تغرق في قاع الأنبوب. ثم انقلها إلى 20٪ سكروز في PBS في نفس الظروف.
  4. بمجرد أن تستقر الأورام في قاع الأنبوب ، قم باحتضانها في خليط 1: 1 من 20٪ سكروز في PBS ومركب OCT لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع الرج.
  5. قم بإزالة الخليط ، وقم بتضمين الأنسجة في كريومولد مع 100٪ OCT وقم بالتجميد باستخدام النيتروجين السائل.
    ملاحظة: ارتد دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات التبريد وواقي الوجه ومعطف المختبر) لمنع الحروق الباردة أو الإصابة الناتجة عن التمدد السريع للبخار. اعمل في منطقة جيدة التهوية لتجنب خطر الاختناق.
    1. قم بتخزين الكتل عند -80 درجة مئوية في حاويات مغلقة لمنع الجفاف.

7. تلطيخ التألق المناعي لأقسام الورم

  1. باستخدام ناظم البرد، قم بتقطيع الأورام إلى أقسام بسمك 8 ميكرومتر تقريبا وقم بتثبيتها على شرائح زجاجية مجهرية. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحفاظ على سلامة الأنسجة، احتفظ بالكتل والشرائح مع قطع الورم المثبتة على الجليد الجاف أثناء النقل من وإلى ناظم البرد. تأكد من الحفاظ على ناظم البرد عند -20 درجة مئوية أثناء التقسيم.
  2. قم بإذابة الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق وقم بإصلاحها في محلول PFA بنسبة 4٪ لمدة 10 دقائق في RT.
  3. بعد التثبيت ، اغسل الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: تأكد من بقاء الأنسجة رطبة ؛ احتفظ بها دائما في السائل خلال جميع خطوات التلوين اللاحقة. إذا كانت التجربة بحاجة إلى الإيقاف المؤقت ، فيمكن تخزين الشرائح في PBS في RT لمدة تصل إلى 3 ساعات. تجنب تخزين الشرائح في PBS طوال الليل.
  4. لاسترجاع المستضد ، املأ قدر بخاري بالماء وقم بتشغيله. ضع برطمانا يحتوي على ماء منزوع الأيونات وبرطمان يحتوي على 10 ملي سيترات الصوديوم (درجة الحموضة 6) في القدر البخاري وقم بتغطية الفتحة بورق الألمنيوم. بدون إزالة الغطاء ، أدخل مقياس حرارة من خلال فتحات غطاء القدر البخاري ، واثقب رقائق الألومنيوم ، وراقب درجة الحرارة ، مع التأكد من وصول المحاليل إلى ~ 99 درجة مئوية.
  5. عندما تصل المخازن المؤقتة إلى ~ 99 درجة مئوية ، اغمس الشرائح في الماء منزوع الأيونات لمدة 10 ثوان ثم انقلها بسرعة إلى محلول استرجاع المستضد.
  6. احتضان الشرائح عند ~ 99 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  7. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  8. استخدم قلم عنق الرحم الحاجز الكارهة للماء لتحديد كل قسم من أقسام الأنسجة ، وتشكيل محيط كاره للماء يمنع أي سائل يضاف إلى الأنسجة من التسرب.
    ملاحظة: قد تؤدي غسالات PBS اللاحقة إلى تعطيل المحيط الكارهة للماء المحيط بالأنسجة وتتطلب التجديد. ارسمها مرة أخرى حسب الحاجة.
  9. قم بسد الأنسجة وتنفذها باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (5٪ مصل و 0.5٪ Triton X-100 في 1x PBS) لمدة 60 دقيقة في RT. لجميع خطوات التلوين ، استخدم مصلا من نفس النوع مثل مضيف الجسم المضاد الثانوي.
  10. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  11. احتضان الأنسجة ب 20 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد الأساسي المضاد ل CD45 في المخزن المؤقت المانع (5٪ مصل و 0.5٪ Triton X-100 في 1X PBS) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: لاستخدام الأجسام المضادة الأخرى ، تحقق من تركيز الأجسام المضادة تجريبيا.
  12. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  13. احتضان أقسام الأنسجة بالجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفئران المقترن ب AlexaFluor-647 عند تخفيف 1: 250 في المخزن المؤقت المانع (مصل 5٪) لمدة ساعتين في الظلام في RT.
    ملاحظة: بعد إضافة الجسم المضاد الثانوي ، قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في الظلام لمنع التبييض الضوئي للفلوروفورات.
  14. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  15. احتضان الأنسجة ب 1 ميكروغرام / مل من DAPI و 20 ميكروغرام / مل من الأجسام المضادة المترافقة AlexaFluor-594 في المخزن المؤقت المانع (مصل 5٪) لمدة ساعة واحدة في الظلام في RT.
  16. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 3 × 5 دقائق.
  17. أضف قطرة من محلول التركيب على كل قسم من أقسام الورم ، ثم ضع بضع قطرات من وسط التثبيت على الغطاء. اقلب الغطاء بسرعة على الشريحة لتثبيته والتأكد من عدم وجود فقاعات بالقرب من الأورام.
  18. اترك الشرائح تجف طوال الليل وقم بتصويرها عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول إعادة البرمجة القابل للتتبع في الجسم الحي في الشكل 1. أولا ، أنتجنا ناقل الفيروسات العدسية متعدد السيسترونيك SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP) ، وترميز عوامل إعادة البرمجة الإرشادية ل cDC1 PU.1 و IRF8 و BATF3 ، متبوعا بموقع دخول الريبوسومي الداخلي (IRES) وبروتين الفلورسنت الأخضر المعزز (eGFP) في خط خلايا التعبئة والتغليف HEK 293T. للتحكم في المناعة بوساطة فيروس العدس، أنتجنا متجها فارغا من SFFV-MCS-eGFP (eGFP)، يحتوي على موقع استنساخ متعدد (MCS) و IRES-eGFP، ولكن باستثناء عوامل إعادة البرمجة. بعد الإنتاج الفيروسي ، حصدنا المادة الطافية المحتوية على فيروس العدسات وركزناها عن طريق الطرد المركزي الفائق. قمنا بمعايرة الفيروس وظيفيا لتحديد الكمية المطلوبة لتحقيق نسبة 1: 1 من الخلايا المحولة (eGFP +) إلى الخلايا غير المحولة (eGFP) ، والتي قمنا بتقييمها في اليوم 3 بعد التنبيغ. بعد ذلك ، استخدمنا كمية الفيروس الناتجة لتحويل خط الخلايا السرطانية المحدد في اليوم -1. بعد 24 ساعة ، قمنا بجمع الخلايا وزرعها تحت الجلد لإنشاء الأورام. ضمنت هذه الإستراتيجية إعادة برمجة الخلايا المنقولة إلى خلايا شبيهة ب cDC1 في الجسم الحي ، داخل TME. في النقاط الزمنية المحددة بعد النقش ، قمنا باستئصال الأورام ومعالجتها لتحليلات المصب ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي للخلايا السرطانية المنفصلة ، لتحديد كفاءة إعادة البرمجة في الجسم الحي ، أو تلطيخ التألق المناعي لأقسام الورم المحفوظة بالتبريد لتوصيف التغييرات في TME.

أولا ، لضمان إنتاج عيارات عالية من الفيروسات العدسية ، قمنا بمراقبة خلايا HEK 293T قبل التعدي ، بهدف الوصول إلى 70-80٪ التقاء وبعد 24 ساعة ، قمنا بتقييم كفاءة التعدي من خلال تعبير eGFP عن طريق المجهر الفلوري (الشكل 2 أ). بعد ذلك ، قمنا بجمع متوسط يحتوي على فيروسات بعد 48 ساعة و 60 ساعة من التعدي ، وقمنا بطرده المركزي الفائق ، وتخزينه في حصص عند -80 درجة مئوية (الشكل 2 ب). بعد ذلك ، حددنا الكمية الفيروسية المثلى المطلوبة لتحقيق نسبة 1: 1 من خلايا eGFP + إلى eGFP في خلايا الورم الميلانيني YUMM1.7. قمنا بزرع 105 خلايا YUMM1.7 لكل بئر في صفيحة مكونة من 6 آبار ، وقمنا بتحويل الخلايا بكميات متزايدة من فيروس العدسات ، واستبدلنا المادة الطافية المحتوية على الفيروس بوسائط كاملة جديدة من DMEM / F12 بعد 24 ساعة (الشكل 2 ج). في اليوم 3 ، قمنا بتقييم تعبير eGFP عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، قبل الشروع في تحديد النسب المئوية الدقيقة لخلايا eGFP + عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 2 ج). لتحديد نسبة eGFP + إلى خلايا eGFP ، قمنا ببوابات في خلايا مفردة حية لاستبعاد الخلايا الميتة والمزدوجات (الشكل 2 د). تم تحديد الحجم الأمثل لدفعة الفيروسات العدسية المنتجة لكل من PIB-eGFP وفيروس التحكم eGFP على أنه 2 ميكرولتر لكل 105 خلايا YUMM1.7 ، مما أدى إلى 50.0 ± 0.3٪ و 63.0 ± 0.9٪ eGFP + ، على التوالي (الشكل 2E).

بعد ذلك ، لتقييم كفاءة إعادة البرمجة في الجسم الحي ، قمنا بإنشاء خط خلايا سرطانية مصنف بالفلورسنت (mCherry +) (YUMM1.7-mCherry). هذا يضمن أنه يمكننا التمييز بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية أو المناعية عن طريق البوابات في خلايا mCherry + الحية في تحليل قياس التدفق الخلوي (الشكل 3 أ ، ب). ثم قمنا بتحويل خلايا YUMM1.7-mCherry مع 2 ميكرولتر من PIB-eGFP أو التحكم في فيروس eGFP لكل 105 خلايا لتحقيق نسبة 1: 1 eGFP + إلى eGFP. قمنا بزرع 1.6 × 106 خلايا تحت الجلد لكل ورم في الفئران CD45.1 واحتفظنا بكمية من الخلايا للزراعة في المختبر للمقارنة. قمنا بتقييم كفاءة إعادة البرمجة عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وبوابة خلايا mCherry + eGFP + و CD45.1- الحية لاستبعاد الخلايا المناعية المضيفة التي ابتلعت eGFP أو mCherry (الشكل 3 ب). من الأيام 1 إلى 9 ، لاحظنا الاستحواذ التدريجي على تعبير CD45.2 و / أو معقد التوافق النسيجي الكبير - II ، مما يشير إلى الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها جزئيا (CD45.2 + MHC-II- أو CD45.2- MHC-II +) والخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها بالكامل (CD45 + MHC-II +) (الشكل 3 ج). لقد تحققنا من أن إعادة برمجة خلايا سرطان الفئران في الجسم الحي أدت إلى نسب أعلى من الخلايا الشبيهة ب cDC1 في اليوم 9 مقارنة بالظروف المختبرية (9.54 ± 1.54٪ CD45 + MHC-II + في الجسم الحي مقابل 4.72 ± 1.1٪ CD45 + MHC-II + في المختبر ، P = 0.018). كما تم تسريع حركية إعادة البرمجة حيث لاحظنا نسبة أعلى من الخلايا الشبيهة ب cDC1 في وقت مبكر من اليوم الرابع (8.7 ± 3.3٪ CD45 + MHC-II + في الجسم الحي مقابل 0.3 ± 0.1٪ CD45 + MHC-II + في المختبر ، P = 0.05) ، مما يشير إلى أن وجود إشارات بيئية يعزز إعادة برمجة أسرع وأكثر كفاءة نحو الخلايا الشبيهة ب cDC119. بينما كانت الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها في المختبر موجودة حتى اليوم 15 ، استمرت الخلايا الشبيهة ب cDC1 في الجسم الحي لمدة 9 أيام ، ولكن لم يتم اكتشافها بحلول اليوم 15 ، مما يشير إلى استنفاد الجهاز المناعي المضيف من TME (الشكل 3C). 

أخيرا ، هدفنا إلى توصيف التغييرات المبكرة ل TME نتيجة لإعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي في أول 9 أيام. أجرينا تلطيخا مناعيا بالفلورة المناعية لأنسجة الورم المحفوظة بالتبريد والمقطعة من أورام eGFP و PIB-eGFP بعد 3 و 9 أيام من إعادة البرمجة في الجسم الحي ، مع التركيز على تسلل الخلايا المناعية التي تتميز بعلامة المكونة للدم CD45. والجدير بالذكر أن الخلايا الشبيهة ب cDC1 جندت المزيد من خلايا CD45 إلى TME بسهولة في اليوم 3 ، مقارنة بأورام eGFP (49.6 ± 17.0 مقابل 8.0 ± 5.8 eGFP متوسط شدة التألق لتلوين CD45 لكل منطقة ورم. الشكل 4 أ ، ب). ومن المثير للاهتمام ، أننا اكتشفنا TLS داخل TME للأورام بعد 9 أيام من إعادة البرمجة في الجسم الحي. يشير هذا إلى أن الخلايا الشبيهة ب cDC1 يمكنها إعادة تشكيل TME بسرعة من بيئة "مناعية باردة" إلى بيئة "مناعية ساخنة" في غضون 3 أيام ، مما يؤدي لاحقا إلى تكوين TLS في اليوم 9.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول لتوليد خلايا شبيهة ب cDC1 عن طريق إعادة برمجة الخلايا السرطانية في الجسم الحي . يتم إنتاج ناقلات الفيروسات النسية SFFV-PIB-IRES-eGFP-ترميز PU.1 و IRF8 و BATF3 في كاسيت متعدد السترونيك تحت سيطرة محفز الفيروسات المكونة للتركيز على الطحال (SFFV) و eGFP بعد موقع دخول الريبوسوم الداخلي (IRES) لتتبع الخلايا المنقولة عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري - في خط خلايا التعبئة HEK 293T. بعد ذلك ، يتم طرد النواقل الفيروسية العدسية بالطرد المركزي الفائق ومعايرة وظيفيا لتحديد كمية الفيروس المطلوبة لنقل الخلايا السرطانية بنسبة 1: 1 eGFP + المحولة إلى خلايا eGFP غير المحقولة. بالنسبة لتجارب إعادة البرمجة في الجسم الحي ، يتم طلاء الخلايا السرطانية بالكمية المثلى من فيروس العدسات في اليوم -1. في اليوم التالي ، يتم غسل هذا المزيج 1: 1 من GFP + المحولة وخلايا GFP غير المحولة وجمعها لإنشاء الورم تحت الجلد في الفئران. يتم الحفاظ على الثقافات المتوازية في المختبر للتحقق من صحة التنبيغ في اليوم 3 عن طريق قياس التدفق الخلوي. تتم مراقبة كل 2-3 أيام لنمو الورم والبقاء على قيد الحياة. يتم جمع الأورام في نقاط زمنية محددة ، ويتم فصلها وتلطيخها للتعبير عن علامة السطح لتحليل قياس التدفق الخلوي. بدلا من ذلك ، يتم إصلاح الأنسجة بأكملها وحفظها بالتبريد وتقسيمها من أجل تلطيخ التألق المناعي وتحليل المجهر متحد البؤر. يتم تقييم كفاءة إعادة البرمجة في الجسم الحي عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي ، بينما تتميز التغييرات في البيئة المكروية للورم بالتصوير متحد البؤر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: إنتاج فيروس العدسات ومعايرة حجمه الوظيفية لإعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي.(أ) عندما تصل خلايا HEK 293T إلى ~ 70-80٪ من التقاء ، يتم نقلها بخليط يحتوي على 10 ميكروغرام من بلازميد النقل إما SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) أو التحكم في ناقلات الفيروسات العسقرية SFFV-eGFP (eGFP) ، جنبا إلى جنب مع 7.5 ميكروغرام من psPAX2 ، و 2.5 ميكروغرام من mPD2.G و 60 ميكرولتر من 1 مجم / مل PEI. تظهر صور المجهر الساطع والفلوري لخلايا HEK 293T تعبير eGFP بعد 24 ساعة من التعداء ، مما يشير إلى تسليم البلازميد الناجح. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. (ب) التمثيل التخطيطي لسير عمل الطرد المركزي الفائق لتركيز فيروس العدس. يتم جمع المادة الطافية المحتوية على فيروس العدسي لخلايا HEK 293T بعد 48 ساعة و 60 ساعة من التعدي ، ويتم ترشيحها من خلال مرشح PES المرتبط بالبروتين منخفض البروتين 0.45 ميكرومتر ، ويتم وزن 37 جم في أنابيب البولي بروبيلين ذات الجدران الرقيقة المفتوحة باستخدام مقياس مقاعد البدلاء. يتم طرد الأنابيب بشكل فائق في دوار دلو متأرجح ، ويتم شفط المادة الطافية ، وتجفيف الحبيبات لمدة 5 دقائق. ثم يتم تعليق الكريات في DMEM المثلج البارد الذي يحتوي على HEPES وتحضينها طوال الليل قبل الاقتباس والتخزين عند -80 درجة مئوية. (ج) الإستراتيجية التجريبية للمعايرة بالتحليل الحجمي الوظيفية لتحديد الجرعة الفيروسية المثلى لتحقيق نسبة 1: 1 من خلايا GFP + إلى GFP. تظهر صور المجهر اللامع والفلوري اللامع تعبير eGFP في خلايا الورم الميلانيني YUMM1.7 ، بعد 72 ساعة من التنبيغ ، مما يشير إلى التسليم الناجح لعوامل إعادة البرمجة و eGFP. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (د) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي توضح استراتيجية البوابات لتحديد نسبة خلايا eGFP +. تم تسيير الخلايا الحية للبقاء للسكان السلبيين للصبغة (DAPI) متبوعا بالاستبعاد المزدوج. (ه) قياس التدفق الخلوي لكفاءة التنبيغ مع زيادة الجرعات الفيروسية لتحديد الحجم الأمثل لتحقيق خلايا 1: 1 GFP + / GFP. بالنسبة لكل من PIB-eGFP و eGFP lentivirus ، حقق حجم 2 ميكرولتر لكل 105 خلايا النسبة المطلوبة. الاختصارات: cDC1s = النوع 1 الخلايا المتغصنة التقليدية. DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; PIB = PU.1 و IRF8 و BATF3 ؛ جزيرة الأمير إدوارد = بولي إيثيلينيمين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تقييم كفاءة إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي. (أ) التمثيل التخطيطي لسير العمل التجريبي لتقييم كفاءة إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي. يتم نقل الخلايا السرطانية في البداية بفيروس عدسي يعبر عن mCherry لتوليد خط خلوي مصنف بالفلورسنت (YUMM1.7-mCherry) ، متبوعا بالنقل بالجرعة المثلى من فيروس العدسات PIB-eGFP في اليوم -1. ثم يتم حقن الخلايا تحت الجلد بنسبة 1: 1 من خلايا eGFP + / eGFP في اليوم 0 لإنشاء أورام في الفئران CD45.1 والسماح للخلايا المنقولة PIB بإعادة البرمجة إلى خلايا شبيهة ب cDC1 داخل TME. ثم يتم عزل الأورام في نقاط زمنية محددة ، وفصلها ، وتلطيخها ل CD45.1 و CD45.2 و MHC-II باستخدام قياس التدفق الخلوي. يسمح ذلك باستبعاد الخلايا المناعية المضيفة CD45.1 لتحديد كفاءة إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي عن طريق التعبير عن CD45.2 و MHC-II. يتم الاحتفاظ بالثقافات المتوازية في المختبر طوال النقاط الزمنية كمقارنة بإعادة البرمجة في الجسم الحي. (ب) مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية التي توضح استراتيجية البوابات في اليوم 9. تم بوابات الخلايا على mCherry + و GFP + لتحديد الخلايا السرطانية المنقولة بنجاح. تم استبعاد الخلايا المناعية المضيفة عن طريق إخراج خلايا CD45.1 +. (ج) القياس الكمي لكفاءة إعادة البرمجة في الجسم الحي (يسار) لخلايا YUMM1.7-mCherry عن طريق قياس التدفق الخلوي كنسبة مئوية لخلايا CD45 + MHC-II + (معاد برمجتها بالكامل) و CD45.2 + HLA-DR- أو CD45.2- HLA-DR + cDC1 (معاد برمجتها جزئيا) مسورة داخل eGFP + mCherry + خلايا. مخططات قياس التدفق الخلوي التمثيلية (على اليمين) تظهر الاستحواذ التدريجي على تعبير CD45.2 و MHC-II في خلايا YUMM1.7-mCherry المنقولة بواسطة PIB-eGFP خلال النقاط الزمنية المحددة. تم استخدام خلايا YUMM1.7-mCherry المنقولة بواسطة eGFP كعنصر تحكم وتم استخدام خلايا شبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها في المختبر للمقارنة. تشير البيانات الواردة في (C) إلى متوسط ± SD ل 3-5 تجارب تكرار بيولوجية. تم إجراء التحليل الإحصائي في (C) لخلايا CD45 + MHC-II + باستخدام اختبار مان ويتني. * ص < 0.05. الاختصارات: cDC1s = النوع 1 الخلايا المتغصنة التقليدية. PIB = PU.1 و IRF8 و BATF3 ؛ TME = بيئة مكروية للورم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل التسلل المناعي في البيئة المكروية للورم بعد إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي . (أ) صور متحدة البؤر تمثيلية تظهر خلايا CD45 + في أورام YUMM1.7 بعد الزرع تحت الجلد ل PIB-eGFP- أو التحكم في الخلايا المنقولة بواسطة eGFP (نسبة 1: 1 من الخلايا المنقولة إلى الخلايا الأبوية) في اليومين 3 و 9. أشرطة المقياس = 500 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي ل MFI لتلوين CD45 في أورام YUMM1.7 المعالجة ب PIB والسيطرة عليها في اليومين 3 و 9. تشير البيانات الواردة في (ب) إلى متوسط ± SD ل 3-6 تجارب بيولوجية مكررة. تم إجراء التحليل الإحصائي في (B) باستخدام اختبار مان ويتني. *P < 0.05 و ***P < 0.001. الاختصارات: cDC1s = النوع 1 الخلايا المتغصنة التقليدية. PIB = PU.1 و IRF8 و BATF3 ؛ MFI = متوسط شدة الفلورة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، نصف طريقة قابلة للتتبع لتوليد خلايا شبيهة ب cDC1 بناء على إعادة برمجة الخلايا السرطانية في الجسم الحي من الأورام الصلبة. توضح نتائجنا أن الإفراط في التعبير عن PU.1 و IRF8 و BATF3 يدفع إلى الاستحواذ التدريجي على النمط الظاهري cDC1 في TME حتى اليوم 9 ، وبعد ذلك يتم استنفاد الخلايا الشبيهة ب cDC1 من الأورام. في النهاية ، يؤدي هذا إلى زيادة تسلل خلايا CD45 إلى TME بحلول اليوم الثالث ، مما يتسبب في إعادة تشكيل TME "المناعي البارد" ليصبح "حارا للمناعة".

تشمل البروتوكولات الحالية لتوليد cDC1 إثراء التيار المستمر الذاتي من الدم المحيطي ، أو التمايز من الخلايا السلفية المكونة للدم CD34 + ، أو التمايز من الخلايا الجذعية متعددة القدرات14،15،16،17،18،19. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تقدم عوامل محدودة: النضج غير الكافي ، وانخفاض عرض المستضد والقدرة الإنتاجية للسيتوكين / الكيموكين في الجسم الحي ، والقابلية لتثبيط المناعة ، وعدم تجانس التيار المستمر العالي ، وانخفاض عدد الخلايا المتولدة7. هنا ، نقدم بروتوكولا يسمح بتوليد خلايا شبيهة ب cDC1 في الجسم الحي للدراسات الوظيفية والميكانيكية.

باستخدام هذه الطريقة ، اختبرنا ما إذا كان التعبير عن تركيبة عامل النسخ PU.1 و IRF8 و BATF3 كافيا لدفع إعادة البرمجة في الجسم الحي . يتيح هذا البروتوكول التحكم الدقيق في كفاءة التوصيل ، حيث يؤثر تغيير جرعة الخلايا المعدلة وراثيا المزروعة بشكل مباشر على فعالية العلاج. لقد أظهرنا سابقا أن 2٪ من الخلايا المنقولة ، والتي تتوافق مع 0.15٪ CD45 + و MHC-II + cDC1 ، كافية لاستنباط مناعة مضادةللورم 20. علاوة على ذلك ، يشير التسلل المناعي السريع الذي لوحظ في اليوم 3 إلى أن الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها جزئيا نشطة وظيفيا في الجسم الحي ، حيث لا توجد زيادة كبيرة في الخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها بالكامل في هذه المرحلة الزمنية. في المستقبل ، سيكون من المثير للاهتمام الكشف عن الدور الوظيفي للخلايا الشبيهة ب cDC1 المعاد برمجتها جزئيا مقابل المعاد برمجتها بالكامل في الفعالية المضادة للورم باستخدام نواقل معدلة تحتوي على جين انتحاري للحث على موت الخلايا في مجموعات خلايا مختارة في نقاط زمنيةمحددة 24. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا لاستكشاف الجمع مع المواد المساعدة اللاجينية ، والتي يمكن أن تزيد من كفاءة إعادةالبرمجة 25. أخيرا ، يمكن أيضا تكييف هذه الطريقة لتوليد أنواع فرعية أخرى من DC في الجسم الحي ، وإطلاق أنواع مختلفة من الاستجابات المناعية ، على سبيل المثال ، الاستجابات المضادة للفيروسات أو التحمل14. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا تسخير إعادة البرمجة في الجسم الحي كمنصة لأداء شاشات مشفرة لمجموعات عوامل النسخ لتوليد أنواع متنوعة من الخلايا المناعية. يمكن أن يزيد هذا الاحتمال من مرونة العلاجات من خلال الاستفادة من الخصائص الوظيفية المتنوعة لمجموعات فرعية مناعية محددة.

في دراستنا السابقة ، أظهرنا أن البيئة المثبطة للمناعة في الجسم الحي لا تعيق إعادة برمجة الخلايا السرطانية البشرية إلى cDC1s20 المناعي. في هذه المقالة ، نوضح أنه في الفئران ، تكون إعادة البرمجة أكثر سرعة وكفاءة في الجسم الحي منها في المختبر ، مما يشير إلى أن إعادة البرمجة المحسنة التي لوحظت في الجسم الحي هي ظاهرة محفوظة عبر كلا النوعين. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو عدم وجود بيئة في الجسم الحي أثناء التسليم الأولي للنواقل. وبالتالي ، لا يمكنها تمييز ما إذا كانت الإشارات البيئية تؤثر على كفاءة التسليم في الجسم الحي . يجب تحديد ذلك في الموقع من خلال مقارنة الشقوق المختلفة. يمكن مقارنة نواقل الفيروسات الغدية ، التي حددناها على أنها أكثر كفاءة من نواقل الفيروسات العسقرية للتوصيل في الموقع 20 بالشقوق غير الفيروسية مثل الحمض النووي الريبي الخطي والدائري وذاتي التضخيم أو كوكتيلات الجزيئاتالصغيرة 26،27.

لقد أظهرنا سابقا أن إعادة برمجة cDC1 تمنح الخلايا السرطانية إفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات وإفراز الكيموكينات المجندة للخلايا الليمفاوية ومعالجة المستضد الاحترافي والعرض التقديمي على معقد التوافق النسيجي الكبير الأول و MHC-II في نماذج الورم الميلانيني23،28. ينتج عن هذا إعادة تشكيل TME من حالة "البرد المناعي" إلى الحالة "المناعية الساخنة" عن طريق تحفيز تكوين TLS ، مما يزيد من تسلل الخلايا التائية المستجيبة للخلايا والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا البائية ، ويقلل من المجموعات المثبطة للمناعة مثل الخلايا التائية التنظيمية والمنهكة20. في المرضى ، تم ربط الاستجابات الإيجابية للعلاج المناعي بوجود TLS داخل الأورام ، حيث يولد تحضير الخلايا التائية والبائية المستمرة ضد مستضدات الورم استجابات للأجسام المضادة الخاصةبالورم 29،30. في المستقبل ، نتصور استخدام بروتوكول إعادة برمجة cDC1 القابل للتتبع في الجسم الحي لكشف آليات تكوين TLS المستحث ، وإعادة تشكيل TME والمناعة المضادة للأورام عبر أنواع السرطان المختلفة وتوصيف ما إذا كان إنتاج الأجسام المضادة الخاصة بالورم قد تم تحفيزه.

لقد لاحظنا سابقا التآزر بين إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي و ICB مع مضاد PD-1 أو مضاد CTLA-420. يشير هذا إلى أن TME "المناعي الساخن" الذي تم إنشاؤه بواسطة إعادة برمجة cDC1 يمكن أن يوفر بيئة مواتية للتوليفات المحتملة مع العلاجات المناعية الأخرى مثل ACT بما في ذلك مستقبلات الخلايا التائية (TCR) - الخلايا التائية ، أو الخلايا التائية المستقبلية للمستضد الخيمري (CAR) - الخلايا التائية ، أو الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs). ميزة أخرى لهذه الطريقة هي إمكانية إجراء شاشات اندماجية أو CRISPR كبيرة غير متحيزة ، حيث يمكن الإفراط في التعبير عن المستقبلات المناعية أو السيتوكينات أو الكيموكينات أو السموم اللمفاوية أو استنفادها في الخلايا الشبيهة ب cDC1 في أنواع الأورام المقاومة ، وبالتالي كشف دور المسارات المتميزة في تعزيز المناعة بوساطة cDC1. في الختام ، يوفر البروتوكول الحالي موردا قيما لمجتمع علمي واسع ، نظرا لأن إعادة برمجة cDC1 في الجسم الحي هي منصة مرنة وقوية للدراسات الميكانيكية والابتكار العلاجي في العلاج المناعي للسرطان.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع C.-F.P. بحصة في الأسهم وتعمل في مناصب إدارية في Asgard Therapeutics AB ، التي تطور العلاجات المناعية للسرطان بناء على تقنيات إعادة البرمجة في الجسم الحي DC. C.-F.P هو مخترع في براءات الاختراع الممنوحة US 11،345،891 و JP 7303743 و CN ZL201880005047.3 وطلبات براءات الاختراع WO 2018/185709 و WO 2022/243448 (جنبا إلى جنب مع EA) التي تحتفظ بها Asgard Therapeutics ، والتي تغطي نهج إعادة برمجة الخلايا الموضح هنا.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ماريانا لوبيز وكاميل شاتلين ، عضوين في مختبر إعادة برمجة الخلايا في تكون الدم والمناعة ، على تحرير المخطوطة وتدقيقها اللغوي.

تم إنجاز هذه الدراسة في سياق المدرسة الوطنية لأبحاث ATMP بتمويل من مجلس البحوث السويدي. تم تمويل المشاريع التي تمت مناقشتها هنا من قبل مجلس البحوث الأوروبي في إطار برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي (866448-TrojanDC and 101189370) ، Novo Nordisk Fonden (NNF22C0079466) ، مجلس الابتكار الأوروبي (101130218-RESYNC) ، Cancerfonden (23 2932 Pj) ، مجلس البحوث السويدي (2020-00615) ، الوكالة السويدية للابتكار (2024-02178) ، ALF (44410) ، FCT (2022.02338.PTDC) ، و Plano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEU (C644865576-00000005). يتم الاعتراف بمؤسسة Knut and Alice Wallenberg وكلية الطب في جامعة Lund و Region Skåne للدعم المالي السخي.

توافر المواد:

تتوفر التركيبات والنواقل المستخدمة لإعادة البرمجة من Asgard Therapeutics بموجب اتفاقية نقل المواد مع الشركة. جميع البيانات الأخرى اللازمة لتقييم الاستنتاجات الواردة في الورقة موجودة في النص الرئيسي أو المواد التكميلية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 μ مرشح ربط منخفض البروتين ، 150 مل مرشح فراغ علوي للزجاجةفيشر العلمي15983297
2-ميركابتوإيثانول 50 مليثيرموفيشر العلمية31350010
الجسم المضاد أحادي النسيلة CD45 المضاد للفأر (استنساخ: 30-F11) ، الفئران IgG2b ، &kappa ؛ثيرموفيشر العلمية14-0451-82
ب 6. SJL-PtprcaPepcb / BoyCrl (CD45.1)مختبر جاكسون002014
محاقن الأنسولين BD Micro-Fine U-100 (0.5 مل)فيشر العلمية11395751
الفئران C57BL / 6Jمختبر جاكسون000664
الكولاجيناز دسيجما ألدريتش11088882001
مصفاة خلية Corning Falcon للاستخدام مع أنابيب مخروطية 50 ملسيجما ألدريتشCLS352340
نظارات غطاء كورنينج 24 × 50 مم   ؛سيجما ألدريتشCLS2975245
DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole, ثنائي هيدروكلوريد)ثيرموفيشر العلميةد 1306
DNase Iسيجما ألدريتش10104159001
صبغة قابلية للحياة eBioscience قابلة للإصلاح eFluor 450إنفيتروجين65-0863-14
محلول استرجاع مستضد eBioscience IHC - درجة حموضة منخفضة (10x)ثيرموفيشر العلمية00-4955-58
مصل الأبقار الجنينية (FBS)ثيرموفيشر العلميةA5256701
Fluoromount-G تصاعد وسيطثيرموفيشر العلمية00-4958-02
الأجسام المضادة GFP [Alexa Fluor 594]نوفوس بيولوجيڪلNB600-308AF594
جيبكو DMEM / خليط المغذيات F-12 (DMEM / F-12)ثيرموفيشر العلمية31331028
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية Gibco MEM (100x)ثيرموفيشر العلمية11140035
جيبكو أوبتي MEM Iثيرموفيشر العلمية11058021
معهد جيبكو روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 متوسطثيرموفيشر العلمية52400025
جيبكو بيروفات الصوديوم (100 ملم)ثيرموفيشر العلمية11360070
محلول جيبكو تريبان بلو ، 0.4٪ثيرموفيشر العلمية15250061
الملحق GlutaMAX  ثيرموفيشر العلمية35050061
الماعز المضادة للفئران IgG (H + L) الأجسام المضادة الثانوية الممتزة ، متعددة النسيلة ، أليكسا فلور 488ثيرموفيشر العلميةأ 11006
خلايا HEK 293TATTCCRL-11268
هيكساديميثرين بروميد (بوليبرين)سيجما ألدريتش[إتش9268]
HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوزسيتيفاSH30243.01
محلول HyClone Penicillin Streptomycin 100x (قلم / Strep)سيتيفاSV30010
محلول ملحي مخزن HyClone Phosphate (PBS)سيتيفاSH30028.02
كيتامينول بيطري. محلول للحقن 100 مجم / ملMSD صحة السويدQN01AX03
شفرة ميكروتوم - C35PFM الطبية207500005
ماوس مضاد ل CD45.2 (104) ، سطح ، APC ، أحادي النسيلةبيوليجند109814
ماوس مضاد MHCII (M5 / 114.15.2) ، سطح ، PE-CY7 ، أحادي النسيلةبيوليجند107630
مصل الماعز العاديأبكامأب7481
مصل الفئران العادي (معقم)أبكامأب7488
أنابيب البولي بروبيلين ذات الجدران الرقيقة المفتوحةبيكمان كولتر علوم الحياة326823
بارافورمالديهايد، 16٪ وزن/حجم الخام. سولن، خال من الميثانولثيرموفيشر العلمية043368.9م
pFUW-tetO-Batf3 ، ماوس تشفير كاسيت أحادي Batf3أدجين139837
pFUW-tetO-Irf8 ، ماوس تشفير كاسيت أحادي Irf8أدجين139838
pFUW-tetO-Pu.1 ، ماوس تشفير كاسيت أحادي الكاسيت Pu.1أدجين139839
البلازميد pMD2.Gأدجين12259
البلازميد psPAX2أدجين12260
البلازميد SFFV-eGFP (eGFP)الاستنساخ في المنزل-
البلازميد SFFV-mCherry (mCherry)الاستنساخ في المنزل-
البلازميد SFFV-PIB-eGFP ،   ؛ ماوس تشفير كاسيت متعدد الكيسترونيك PU.1 و IRF8 و BATF3 (PIB)   ؛الاستنساخ في المنزل-تتوفر التركيبات والمتجهات المستخدمة في إعادة البرمجة من Asgard Therapeutics بموجب اتفاقية نقل المواد مع الشركة
البولي إيثيلينمين (PEI) ، خطي ، MW 25000 ، درجة تعداءعلوم متعددة23966
ReadyProbes قلم عنق الرحم الحاجز المقاوم للماءثيرموفيشر العلمية3777 راند
زبدات الصوديومسيجما ألدريتش303410
سكروزسيجما ألدريتشS7903
SuperFrost Plus التصاق مجهر الشرائحإبريدياJ1800AMNZ
مركب Tissue-Tek O.C.T.ساكورا فينتيك4583
إنزيم TrypLE Express (1x) لا فينول أحمرثيرموفيشر العلمية12604021
TT Cryomold متوسط، مربع (15 × 15 × 5 مم)ساكورا فينتيك4566
UltraPure 0.5 M EDTA ، درجة الحموضة 8.0إنفيتروجين15575020
الطبيب البيطري Xysol. محلول للحقن 20 مجم / ملفي إم فارماQN05CM92
خلايا YUMM1.7أنتينيو

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Oliveira, G., Wu, C. J. Dynamics and specificities of T cells in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 23 (5), 295-316 (2023).
  2. Larkin, J., et al. Five-year survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 381 (16), 1535-1546 (2019).
  3. Adams, S., et al. Pembrolizumab monotherapy for previously untreated, PD-L1-positive, metastatic triple-negative breast cancer: cohort B of the phase II KEYNOTE-086 study. Ann Oncol. 30 (3), 405-411 (2019).
  4. Patel, M. R., Falchook, G. S., Hamada, K., Makris, L., Bendell, J. C. A phase 2 trial of trifluridine/tipiracil plus nivolumab in patients with heavily pretreated microsatellite-stable metastatic colorectal cancer. Cancer Med. 10 (4), 1183-1190 (2021).
  5. Reardon, D. A., et al. Randomized phase 3 study evaluating the efficacy and safety of nivolumab vs bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: CheckMate 143. Neuro Oncol. 19 (suppl_3), iii21-iii21 (2017).
  6. Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy. Cell. 168 (4), 707-723 (2017).
  7. Heras-Murillo, I., Adán-Barrientos, I., Galán, M., Wculek, S. K., Sancho, D. Dendritic cells as orchestrators of anticancer immunity and immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 21 (4), 257-277 (2024).
  8. Heras-Murillo, I., et al. Immunotherapy with conventional type-1 dendritic cells induces immune memory and limits tumor relapse. Nat Commun. 16 (1), 3369(2025).
  9. Theisen, D. J., et al. WDFY4 is required for cross-presentation in response to viral and tumor antigens. Science. 362 (6415), 694-699 (2018).
  10. Meiser, P., et al. A distinct stimulatory cDC1 subpopulation amplifies CD8+ T cell responses in tumors for protective anti-cancer immunity. Cancer Cell. 41 (8), 1498-1515.e10 (2023).
  11. Spranger, S., Dai, D., Horton, B., Gajewski, T. F. Tumor-residing Batf3 dendritic cells are required for effector T cell trafficking and adoptive T cell therapy. Cancer Cell. 31 (5), 711-723.e4 (2017).
  12. Hubert, M., et al. IFN-III is selectively produced by cDC1 and predicts good clinical outcome in breast cancer. Sci Immunol. 5 (46), eaav3942(2020).
  13. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  14. Ascic, E., Pereira, C. -F. Transcription factor-mediated reprogramming to antigen-presenting cells. Curr Opin Genet Dev. 90, 102300(2025).
  15. Silk, K. M., et al. Cross-presentation of tumour antigens by human induced pluripotent stem cell-derived CD141+ XCR1+ dendritic cells. Gene Ther. 19 (10), 1035-1040 (2012).
  16. Nair, S., Archer, G. E., Tedder, T. F. Isolation and generation of human dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 7, 7.32.1-7.32.23 (2012).
  17. Makino, K., et al. Generation of cDC-like cells from human induced pluripotent stem cells via Notch signaling. J Immunother Cancer. 10 (1), e003827(2022).
  18. Balan, S., et al. Large-scale human dendritic cell differentiation revealing Notch-dependent lineage bifurcation and heterogeneity. Cell Rep. 24 (7), 1902-1915.e6 (2018).
  19. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Rep. 23 (12), 3658-3672.e6 (2018).
  20. Ascic, E., et al. In vivo dendritic cell reprogramming for cancer immunotherapy. Science. 386 (6719), eadn9083(2024).
  21. Rosa, F. F., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into antigen-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 3 (30), 1-16 (2018).
  22. Rosa, F. F., et al. Single-cell transcriptional profiling informs efficient reprogramming of human somatic cells to cross-presenting dendritic cells. Sci Immunol. 7 (69), eabg5539(2022).
  23. Zimmermannova, O., et al. Restoring tumor immunogenicity with dendritic cell reprogramming. Sci Immunol. 8 (85), eadd4817(2023).
  24. Bouquet, L., et al. RapaCaspase-9-based suicide gene applied to the safety of IL-1RAP CAR-T cells. Gene Ther. 30 (9), 706-713 (2023).
  25. Huangfu, D., et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2. Nat Biotechnol. 26 (11), 1269-1275 (2008).
  26. Rojas, L. A., et al. Personalized RNA neoantigen vaccines stimulate T cells in pancreatic cancer. Nature. 618 (7963), 144-150 (2023).
  27. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  28. Ferreira, A. G., Zimmermannova, O., Kurochkin, I., Ascic, E., Åkerström, F., Pereira, C. F. Reprogramming cancer cells to antigen-presenting cells. Bio Protoc. 13 (22), 1-25 (2023).
  29. Cabrita, R., et al. Tertiary lymphoid structures improve immunotherapy and survival in melanoma. Nature. 577 (7791), 561-565 (2020).
  30. Ng, K. W., et al. Antibodies against endogenous retroviruses promote lung cancer immunotherapy. Nature. 616 (7957), 563-573 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

cDC1 CD45

مقالات ذات صلة