سير عمل توصيف الببتيد العصبي من أخذ العينات إلى قياس الطيف الكتلي للاكتساب المستقل عن البيانات

Samuel Okyem; Yanqi Tan; Elena Romanova; Jonathan V. Sweedler

doi:10.3791/68741

Method Article

سير عمل توصيف الببتيد العصبي من أخذ العينات إلى قياس الطيف الكتلي للاكتساب المستقل عن البيانات

DOI:

10.3791/68741

⸱

August 8th, 2025

Samuel Okyem¹^,² , Yanqi Tan¹^,² , Elena Romanova¹^,² , Jonathan V. Sweedler¹^,²

¹Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, ²Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول سير عمل شامل لأمراض الجذع العصبية في أنسجة دماغ الفئران الذي يجمع بين الاستحواذ المعتمد على البيانات والتراكم الموازي والتجزئة التسلسلية (DDA-PASEF) وقياس الطيف الكتلي المستقل عن البيانات (DIA).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الببتيدات العصبية الذاتية هي معدلات رئيسية لوظائف المخ ، وتلعب أدوارا حاسمة في السلوك والتوتر والألم والتنظيم الاستتبابي ، ومع ذلك لا يزال تحليلها صعبا. من الناحية البيولوجية ، فهي منخفضة الوفرة ، وتتحلل بسرعة ، وتتم معالجتها بشكل مختلف من بروتينات السلائف ، مع اقتصار التعبير على مجموعات الخلايا الصغيرة الموضعية. من الناحية الفنية ، فإن اكتشافها معقد بسبب نطاق ديناميكي واسع ، وتعديلات متنوعة بعد الترجمة ، وإشارات متفرقة في مجموعات بيانات قياس الطيف الكتلي. يحدد هذا البروتوكول سير عمل شامل لتحليل الببتيد العصبي في أنسجة الدماغ Rattus norvegicus باستخدام كل من الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) وقياس الطيف الكتلي (MS) المعتمد على البيانات (DIA) على منصة timsTOF. بعد التحضير الأمثل لعينة الدماغ ، بما في ذلك التشريح واستخراج الببتيد وتنظيفه ، يتم إجراء كروماتوغرافيا النانو السائلة (LC) -MS مع تجزئة طور الغاز المتحركة الأيونية لتحسين حساسية الكشف ودقته. تدعم المكتبة الطيفية التي تم إنشاؤها بواسطة DDA القياس الكمي المستند إلى DIA في Skyline ، مما يتيح قياسات عالية الثقة على مستوى MS2. يزيد سير العمل المتكامل هذا من تغطية الببتيد العصبي ويعزز قابلية التكاثر الكمي ، مما يوفر منصة قوية لدراسة الببتيدات العصبية في أنسجة المخ المعقدة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الببتيدات العصبية هي فئة متنوعة وظيفيا من جزيئات الإشارات الذاتية التي تعمل كمعدلات حاسمة للاتصالات العصبية ووظائف الجهاز العصبي والغدد الصم العصبية. تعمل كمعدلات عصبية أو هرمونات أو ناقلات مشتركة ، وتؤثر على مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك تعديل الألم ، والاستجابة للإجهاد ، والتنظيم اليومي ، والتحكم في الشهية. على عكس الناقلات العصبية الكلاسيكية ، التي يتم تصنيعها على شكل جزيئات صغيرة ، يتم ترميز الببتيدات العصبية داخل بروتينات السليفة الكبيرة التي يتم تصنيعها من خلال ترجمة الرنا المرسال. ثم تخضع بروتينات السلائف ، أو الهرمونات الأولية ، لمعالجة محللة للبروتين لإطلاق الببتيدات النشطة ، والتي يتم تعبئتها في حويصلات كثيفة النواة (DCVs). عند التحفيز ، يتم إطلاق الببتيدات العصبية لممارسة تأثيرات تعديلية ، وعادة ما تكون أبطأ وأطول من خلال التفاعلات مع المستقبلات المقترنة ببروتين G. جعلت أهميتها في الحفاظ على وظيفة الجهاز العصبي المركزي والمحيطي مجالا ذا أهمية بيولوجية وسريرية^{مكثفة 1}^،²^،³^،⁴^،⁵.

على الرغم من أهميتها ، لا تزال الببتيدات العصبية صعبة التحليل في توصيفها. هياكلها غير المتجانسة للغاية - التي تتراوح من التسلسلات القصيرة إلى الممتدة ، وغالبا ما تحمل تعديلات متنوعة بعد الترجمة (PTMs) مثل المنتصف ، أو الأستلة ، أو الفسفرة ، أو أزمرة الأحماض الأمينية ، أو الاقتطاع - تؤدي إلى تباين في سلوكيات التأين والتجزئة في قياس الطيف الكتلي (MS) ¹^،⁶^،⁷^،⁸. علاوة على ذلك ، فهي موجودة عادة بتركيزات منخفضة بالنسبة لمكونات المصفوفة البيولوجية ، وتتحلل بسهولة ، ويتم توطينها بطريقة مقيدة مكانيا داخل الأنسجة المعقدة للجهاز العصبي. تعقد هذه الميزات كلا من التحديد والقياس الكمي ، لا سيما عند استخدام مناهج البروتينات التقليدية التي تعتمد على الهضم الأنزيمي الذي يمكن التنبؤ به وخصائص الببتيد الموحدة⁹^،¹⁰^،¹¹.

هنا ، نقدم استراتيجية شاملة لتحديد وقياس الببتيدات الذاتية في دماغ Rattus norvegicus ، مع التركيز بشكل خاص على الببتيدات العصبية. يبدأ سير العمل هنا بإجراءات أخذ عينات الدماغ المحسنة ، متبوعة بفواصل الكروماتوغرافيا السائلة (LC) الشاملة ، وينتهي بتحليل MS عالي الدقة باستخدام التجزئة التسلسلية المتوازية للتراكم (PASEF) على منصة قياس طيف الحركة الأيونية المحبوسة (TIMS)¹²^،¹³^،¹⁴^،¹⁵^،¹⁶. من خلال دمج تجزئة طور الغاز المتحركة الأيونية (IM-GPF) قبل اختيار السلائف ، يتيح نهج الاستحواذ المعتمد على البيانات PASEF (DDA-PASEF) تحسين فصل السلائف والكشف المعزز عن الببتيدات العصبية منخفضة الوفرة ، والتي قد يتم تفويت الكثير منها في تدفقات عمل DDA أحادية^{البعد 17}.

في حين أن DDA لا يزال الإستراتيجية الأكثر استخداما في تحديد الببتيد نظرا لأطياف MS / MS عالية الجودة ، إلا أنه محدود بطبيعته باعتماده على اختيار أيونات السلائف حسب الشدة ، والذي يتحيز ضد الأنواع منخفضة الوفرة¹⁸^،¹⁹^،²⁰. علاوة على ذلك ، يؤدي أخذ العينات شبه العشوائية إلى فقدان القيم عبر التكرارات ، مما يعيق القياس الكمي القابل للتكرار. للتغلب على هذه القيود ، قمنا ببناء مكتبة طيفية قوية باستخدام بيانات DDA-PASEF الخاصة بنا ، والتي يمكن استخدامها لاحقا لتحليل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA). على عكس DDA ، تقوم DIA بأخذ عينات من جميع أيونات السلائف داخل نوافذ m / z محددة ، مما يضمن أخذ عينات متسقة لكل من الببتيدات الوفيرة والنادرة ، وعند دمجها مع المكتبة الطيفية والتحليل المستهدف في Skyline ، يسمح بالقياس الكمي على مستوى MS2 الحساس والقابل^{للتكرار 21}^،²²^،²³^،²⁴.

تم تطوير هذا النهج التكاملي - الذي يمتد عبر استخراج الببتيد في الدماغ ، والفصل الكروماتوغرافي ، واكتساب MS المعزز بحركة الأيونات ، والقياس الكمي الهجين القائم على DDA / DIA - مع وضع تعقيد الببتيدات العصبية في الاعتبار. إنه يزيد من تغطية الببتيد مع تقليل فقدان البيانات ، ومعالجة القيود الرئيسية لبيبتيدوميك أبسط مدفوع ب DDA. على هذا النحو ، نقدم منصة مرنة وقوية لاستكشاف مشهد الببتيد العصبي في دماغ الثدييات ، والتي يمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة واسعة من الأسئلة التجريبية وعينات الأنسجة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت جميع التجارب على في هذه الدراسة وفقا لبروتوكول استخدام المعتمد من قبل لجنة إلينوي المؤسسية لرعاية واستخدام (23228) مع الالتزام الصارم بالمعايير الوطنية ومعايير ARRIVE للمعاملة الأخلاقية للحيوانات ورعايتها.

1. تشريح وعزل الدماغ

قم بإجراء نضح المحلول الملحي البارد متبوعا مباشرة بتجميد الأنسجة للحفاظ على سلامة الببتيد العصبي ، وتقليل القطع الأثرية المتدهورة ، وتحسين جودة البيانات لتحليل الببتيدوم النهائي.
قتل الفئران رحيما باستخدام طريقة ثاني أكسيد الكربون₂ باتباع إرشادات رعاية المؤسسية. تأكيد الموت بسبب غياب ضربات القلب وعدم وجود ردود أفعال.
ضع الفئران ضعيفة. قم بعمل شق لفضح التجويف الصدري.
قم بعمل شق صغير في البطين الأيسر للقلب.
قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن للسماح بتدفق الدم ومحلول التروية.
أدخل طرف ماصة بلاستيكية مقطوعة حسب الحجم متصلة بحقنة سعة 60 مل مملوءة ب 50 مل من المحلول الفسيولوجي المثلج (على سبيل المثال، 0.9٪ محلول ملحي أو ملي جي جي إس إس) في البطين الأيسر.
قم بتفريف جسم بالمحلول. اقطع رأس الجرذ باستخدام مقص حاد أو مقصلة.
قم بإزالة الجلد والجمجمة التي تغطي الدماغ باستخدام المقص أو المقص الناعم.
ارفع الدماغ بعناية من تجويف الجمجمة ، وقطع الأعصاب القحفية حسب الحاجة.
قم بتجميد الدماغ على الفور على الثلج الجاف أو تجميده في الأيزوبنتان المبرد على الثلج الجاف.
انقله إلى ورق القصدير أو ورق القصدير الملصق ، ثم احفظه في درجة حرارة -80 درجة مئوية.

2. استخراج الببتيد من أنسجة دماغ الفئران

بالنسبة لعينات الدماغ بأكملها، قم بوزن كل نسيج مجمد بسرعة باستخدام ميزان تحليلي. قم بتجانس الأنسجة باستخدام محلول LC-MS من الدرجة التي تحتوي على 10٪ حمض الخليك الجليدي و 1٪ ماء في الميثانول ، باستخدام نسبة المذيبات إلى الأنسجة 10: 1 (حجم / وزن).
احتضان العينات المتجانسة على الجليد لمدة 20 دقيقة.
الطرد المركزي للعينات عند 16,000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات.
أعد تعليق الحبيبات في ماء بدرجة LC-MS, باستخدام 10:1 (حجم / وزن) نسبة المذيب إلى الأنسجة, وكرر الحضانة على الجليد لمدة 20 دقيقة.
الطرد المركزي ثانية تحت ال نفسه شروط (16,000 × [غ], 20 دقيقة و4 [ك]), ويجمع الثاني طاف.
اجمع بين كل من المواد الطافية وانقل 1/10 من الحجم الكلي إلى أنبوب جديد للمعالجة النهائية. جفف هذا الكوكوت باستخدام مكثف فراغ حتى يجف تماما. قم بتخزين المستخلص المتبقي عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. استخراج الطور الصلب (SPE) باستخدام أعمدة الدوران C18

ملاحظة: يجب أن تكون جميع المذيبات من الدرجة LC-MS. ما لم يذكر خلاف ذلك ، يتم تنفيذ خطوات الطرد المركزي عند 1,500 × غرام في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز طرد مركزي على الطاولة.

تحضير الكاشف
1. تحضير محلول التنشيط (أ): 50٪ أسيتونيتريل / 50٪ 0.1٪ حمض الفورميك في الماء.
2. تحضير محلول التوازن والغسيل (ب): 0.1٪ حمض الفورميك في الماء.
3. تحضير محلول الشطف (C): 50٪ أسيتونيتريل / 50٪ 0.1٪ حمض الفورميك في الماء.
تحضير العينة
1. أعد تكوين مستخلص الببتيد المجفف في 200 ميكرولتر من المحلول (ب).
2. الطرد المركزي العينة عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
3. اجمع بعناية المادة الطافية ل SPE.
تكييف العمود والتوازن
1. أضف 150 ميكرولتر من المحلول (A) إلى عمود الدوران C18.
2. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة عند 1,500 × جم.
3. كرر الخطوتين 3.3.1 و 3.3.2 مرتين لضمان التنشيط الكامل.
4. أضف 150 ميكرولتر من المحلول (ب).
5. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة.
6. كرر الخطوتين 3.3.4 و 3.3.5 مرتين.
تحميل وغسيل العينة
1. قم بتحميل 200 ميكرولتر من محلول العينة المحضر على العمود.
2. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة.
3. أعد تحميل التدفق مرة أخرى على العمود ثلاث مرات لزيادة احتباس الببتيد.
4. أضف 150 ميكرولتر من المحلول (ب).
5. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة.
6. كرر الخطوتين 3.4.4 و 3.4.5 ثلاث مرات لإزالة الملوثات غير المحتجزة.
شطف الببتيد
1. أضف 150 ميكرولتر من محلول الشطف (C) إلى العمود.
2. جهاز طرد مركزي لمدة 1 دقيقة.
3. كرر خطوات الشطف 3.5.1-3.5.2 مرة أخرى.
4. يمزج كل من المواد ويخزن على الثلج أو يستمر في التجفيف تحت الفراغ.

4. تحليل LC-MS / MS

تحضير المحلول (أ): 0.1٪ حمض الفورميك في الماء ، المحلول ؛ (ب): 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل ، محلول ؛ (ج): 25 fmol / μL معيار وقت الاحتفاظ (iRT) 0.1٪ حمض الفورميك في الماء.
أعد تعليق العينات في محلول 20 ميكرولتر (C) قبل حقن LC-MS.
ملاحظة: تم تحليل عينتين بيولوجيتين ، وتم حقن كل منهما خمس مرات لكل من عمليات تشغيل DDA و DIA ، مما أدى إلى خمس تكرارات تقنية لكل طريقة لكل عينة.
قم بإجراء فصل الببتيد باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) ، مع المرحلة المتنقلة A التي تتكون من المحلول (A) والمرحلة المتنقلة B التي تتكون من محلول (B).
قم بتحميل 1 ميكرولتر من العينات على خمسة وعشرين عمودا تحليليا C18 (150 ميكرومتر × 250 مم ، جسيمات 1.9 ميكرومتر ، حجم مسام 120 درجة) وحافظ على درجة حرارة 40 درجة مئوية طوال فترة التشغيل.
قم بإجراء فصل LC بمعدل تدفق 600 nL / دقيقة باستخدام ملف تعريف التدرج التالي: 0-5 دقائق: 2-10٪ B ؛ 5-85 دقيقة: 10-45٪ ب ؛ 85-87 دقيقة: 45-50٪ ب ؛ يليه غسل عضوي عالي وإعادة التوازن.
ملاحظة: تم اقتران LC مباشرة ب timsTOF MS عبر مصدر أيوني.
لتحليل DDA، أستخدم طريقة التطبيق الافتراضية DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime على timsTOF MS.
1. باختصار، قم بتشغيل مطياف الكتلة في وضع PASEF مع تمكين الاستبعاد الديناميكي . اضبط كل دورة لتتكون من 10 عمليات مسح PASEF MS/MS خلال دورة عمل تبلغ 1.1 ثانية.
2. اضبط نطاق الكتلة على m/z 100-1700، ونطاق التنقل الأيوني من 0.60 إلى 1.60 فولت ثانية/سم²، باستخدام وقت منحدر يبلغ 100.0 مللي ثانية. قم بتكثيف طاقة الاصطدام من 20.0 إلى 59.0 فولت كهرباء كدالة للتنقل الأيوني.
تجزئة طور غاز الحركة الأيونية (IM-GPF)
1. قم بتقسيم نطاق الحركة الأيونية من 0.6-1.6 فولت ثانية / سم² إلى ثلاث نوافذ متداخلة: 0.6-1.0 ، 0.9-1.3 ، و 1.2-1.6 فولت / ثانية^{/ سم 2}.
2. للقيام بذلك، قم بتغيير قيم بدء ونهاية التنقل في إعداد TIMS، انقر فوق محرر timsControl أو timsControl إلى قيم النافذة المقابلة.
3. الحصول على البيانات لكل نافذة. بالنسبة لجميع نوافذ اكتساب الحركة الأيونية ، استخدم تراكما ثابتا ووقت منحدر يبلغ 100 مللي ثانية.
4. الحصول على البيانات في وضع DDA-PASEF باستخدام نفس المعلمات المفصلة في الخطوة 4.6.
لتحليل DIA ، استخدم عرض نافذة عزل يبلغ 25 م / z عبر نطاق الكتلة 400-1200 م / تز. استخدم نفس الإعدادات التجريبية للتنقل الأيوني (IMEX) المستخدمة في طريقة DDA.
1. تتضمن إعدادات DIA الإضافية منحدرا MS1 واحدا متبوعا ب 16 منحدرا من MS / MS لكل دورة ، مما ينتج عنه وقت دورة إجمالي يبلغ 1.8 ثانية.
2. استخدم طريقة البروتينات الافتراضية DIA-PASEF كقالب لتطوير أسلوب DIA. بعد إنشاء طريقة DIA ، قم بتحميلها في علامة تبويب الطريقة في Hystar. لا يلزم تنشيط وضع DIA.
  ملاحظة: سيتم تسجيل طريقة DIA تلقائيا بمجرد تحميلها بنجاح.

5. معالجة البيانات

ملاحظة: بعد الحصول على البيانات ، يجب إجراء تحديد الببتيد باستخدام أدوات المعلوماتية الحيوية مثل PEAKS Online أو PEAKS Studio أو MSFragger أو Maxquant أو الأنظمة الأساسية المماثلة. استخدمت هذه الدراسة Peaks Online ، القادرة على العمل مع البيانات الأولية بتنسيق .d.

البحث في قاعدة البيانات
1. استخدم قاعدة بيانات مرجعية مناسبة لعمليات البحث عن الببتيد ، مثل قاعدة بيانات الببتيد المنسقة لإشارات الفئران ، أو بروتين الفئران ، أو البروتين البشري ، أو قاعدة بيانات ببتيد إشارات منسقة بناء على مصدر العينة.
  ملاحظة: يمكن الحصول على قواعد البيانات هذه من مصادر موثوقة مثل NCBI أو UniProt (https://www.uniprot.org/). ملاحظة: سيتم تحديد البروتين أو الببتيدات فقط في قاعدة البيانات. تم تنسيق بيانات إشارة الفئران عن طريق تصفية بروتين الفئران بواسطة التعليق التوضيحي "ببتيد الإشارة" في UniProt. في مصطلحات Uniprot ، تعني التصفية بواسطة "ببتيد الإشارة" تضييق نطاق البروتين إلى البروتينات المشاركة في الإفراز أو توطين الغشاء أو الاتجار المجزأ. تحتوي قاعدة البيانات المخصصة هذه على 5630 بروتين. يوفر الحد من حجم قاعدة بيانات البروتين من 50,000 إلى 5,000 العديد من المزايا. أولا ، يعزز الثقة في تحديد الهوية عن طريق تقليل احتمالية حدوث تطابقات عشوائية في طيف الببتيد ، وبالتالي زيادة دقة تعيينات الببتيد. ثانيا ، تعمل قاعدة البيانات الأصغر على تحسين الكفاءة الحسابية ، مما يسمح بأوقات معالجة أسرع وتقليل الطلب على الموارد الحسابية. ثالثا ، يمكن أن تؤدي قاعدة البيانات الأكثر إيجازا إلى تحكم أفضل في معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) ، مما يؤدي إلى تحديد أكثر موثوقية وقوة إحصائيا للبروتين. ومع ذلك ، يجب أن تكون قاعدة البيانات كبيرة نسبيا لتجنب التضخم المصطنع لدرجات الثقة وتقدير FDR غير الدقيق.
2. قم بتكوين البحث في قاعدة البيانات في واجهة المستخدم الرسومية للبرنامج باستخدام المعلمات الموصى بها التالية: التسامح مع خطأ كتلة السلائف: 10-25 جزء في المليون ؛ التسامح مع خطأ كتلة الشظية: 0.01-0.05 د. خصوصية الإنزيم: لا شيء (هضم غير محدد) ؛ نطاق طول الببتيد: 4-45 من الأحماض الأمينية.
3. حدد مجموعة PTMs المراد تضمينها في البحث.
4. بعد الانتهاء من البحث في قاعدة البيانات ، قم بتصدير ملفات pepxml و mzXML (أو MGF) المقابلة لكل نافذة حركة أيونية ، بما في ذلك نطاق التنقل الكامل القياسي (0.6-1.6 فولت ثانية / سم²).
بناء مكتبة سكاي لاين
1. افتح Skyline وأنشئ مستندا جديدا، وتأكد من تحديد واجهة Proteomics ، واستخدم الإعدادات الافتراضية ما لم ينص على خلاف ذلك.
2. انتقل إلى استيراد > الملف > البحث عن الببتيد.
3. في معالج البحث عن استيراد الببتيد ، حدد إنشاء وإضافة ملفات pepxml ذات الصلة (تأكد من وجود ملفات mzXML أو MGF المقابلة في نفس الدليل).
4. قم بتعيين الببتيدات القياسية iRT على تلقائي، واختر DIA كسير عمل، ثم انقر فوق التالي.
5. بعد إنشاء المكتبة، اختر ما يقرب من 10-15 ببتيدا كمعايير iRT للمحاذاة عبر النسخ المتماثلة. إذا طلب منك إعادة معايرة iRT، فانقر فوق موافق للمتابعة.
6. في صفحة استخراج الكروماتوجرام ، انقر على استعراض لتحديد جميع ملفات DIA الأولية واستيرادها، ثم انقر على متابعة.
7. في نافذة إعدادات الانتقال ، قم بتعيين نطاق شحنات السلائف إلى 1-5، وتتراوح شحنات المنتج إلى 1-3، وأنواع الأيونات إلى ، p، y، b وحدد تحديد أيون المنتج من الأيون 2 إلى الأيون الأخير. الإعدادات الأخرى الموصى بها: تحمل مطابقة الأيونات: 0.05 د، القمم للاختيار: 5.
8. في نافذة إعدادات الببتيد ، قم بتعيين التعديلات التي تطابق إعداد بحث القمم الموضح في 4.1.3.
9. في صفحة نظام العزل ، أدخل اسما للعزل والمخطط وحدد نوافذ العزل المحددة مسبقا. انقر فوق استيراد وتحميل أحد ملفات DIA لاستيراد تكوين نافذة عزل التجربة تلقائيا.
10. قم بتعيين إعدادات الحصول على الفحص الكامل باستخدام المعلمات التالية. طريقة الاستحواذ: DIA ؛ محلل كتلة المنتج: Centroided. مخطط العزل: استخدم المخطط المحدد أعلاه ؛ دقة الكتلة: 10-20 جزء في المليون ؛ قوة حل التنقل: 30-50 ؛ تمكين استخدام عمليات الفحص فقط في غضون 5 دقائق من RT المتوقع؛ اختياريا، قم بتعديل تصفية MS1 إذا كانت هناك حاجة إلى استيراد كروماتوغرام MS1. حدد محلل الكتلة المناسب والدقة لاستخراج الكروماتوجرام MS1 الأمثل.
11. استيراد FASTA وإنشاء الأفخاخ. تعيين طريقة إنشاء الشرك: تسلسل المراوغة.
12. حدد الإنزيم: الهضم غير محدد في تحليل الببتيد الداخلي. قم بتحرير الإنزيم عن طريق تحديد إضافة من قائمة الإنزيم المنسدلة. قم بتعيين اسم الإنزيم ، اكتب على كليهما ، وقم بشق الطرف c إلى KR وشق الطرف N إلى KR ، واسمح بشبه الانقسام ، وانقر فوق موافق. اضبط الانقسامات الفائتة على 3.
13. قم باستيراد ملف FASTA الهدف، ثم انقر فوق إنهاء. قم بتأكيد صفحة البروتينات المرتبطة إذا طلب منك ذلك.
14. تأكد من إنشاء المكتبة الطيفية بنجاح واستيراد بيانات DIA. افحص يدويا قائمة الببتيدات المحددة وتابع التحليل الكمي والنوعي النهائي.
القياسات النوعية والكمية
ملاحظة: يتم إجراء التحليلات النوعية والكمية في Skyline. للحصول على تفاصيل حول تحليل بيانات DIA في Skyline ، قم بزيارة https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
1. إذا تم تحميل بيانات DDA ، فحدد الإعدادات > إعداد الانتقال من القائمة ، واختر DDA في طريقة الاكتساب ؛ في الإعدادات > إعداد الببتيد، أختر مستوى MS 1 للقياس الكمي.
2. إذا تم تحميل بيانات DIA ، > الإعدادات إعداد الانتقال ، اختر DIA في طريقة الاكتساب ؛ في الإعدادات > إعداد الببتيد، اختر مستوى MS 2 للقياس الكمي.
3. في عرض > Document Grid، حدد Peptide Quantification، ثم تصدير جدول البيانات. اجمع بين جداول البيانات من نتائج DDA ونتائج DIA.
  ملاحظة: يلخص جدول البيانات مناطق الذروة لجميع الببتيدات الموجودة في المكتبة عبر جميع العينات. في هذه التجربة ، تم تطبيع مناطق ذروة الببتيد إلى الببتيد القياسي لوقت الاستبقاء GISNEGQNASIK ، وهو جزء من خليط وقت الاحتفاظ بيرس. تم إجراء التطبيع عن طريق حساب نسبة منطقة ذروة كل ببتيد إلى تلك الخاصة بالمعيار.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر مخطط تجريبي تمثيلي في الشكل 1. كشف تحليل بيانات DDA-PASEF (الشكل 2) التي تم الحصول عليها باستخدام كل من نطاق الحركة الأيونية القياسي و IM-GPF عن تغطية ببتيد أعلى بكثير لنهج IM-GPF (الشكل 2 ب). والجدير بالذكر أن معظم الببتيدات التي تم تحديدها باستخدام طريقة DDA-PASEF القياسية تتداخل مع تلك الموجودة في مجموعة بيانات IM-GPF. لتعظيم تغطية تحديد الببتيد ، تم إنشاء مكتبة طيفية شاملة من خلال دمج التعريفات من كلا النهجين.

كشف تحليل قاعدة البيانات الإضافي لمجموعات البيانات المكررة التي تم الحصول عليها عبر DDA- و DIA-PASEF (الشكل 3) ، باستخدام قاعدة بيانات ببتيد إشارات الفئران المنسقة ، عن 217 بروتينا مشتركا في كلتا الطريقتين. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد 115 بروتينا بشكل فريد بواسطة DIA-PASEF ، بينما كان 69 بروتينا حصريا ل DDA-PASEF. أظهرت التحليلات الاستكشافية التي استخدمت المكتبات الطيفية المشتقة من بيانات DDA و IM-GPF أن DIA-PASEF مكن من الكشف الواثق عن الببتيدات العصبية مثل NPAFLFQPQRF (الببتيد العصبي SF) و YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (المشتق من proenkephalin). لم يتم اكتشاف هذه الببتيدات العصبية بشكل موثوق في مجموعات بيانات DDA-PASEF المقابلة بسبب ضعف تخصيص الذروة (الشكل 3 ب ، ج).

من منظور كمي ، يكشف مخطط التشتت في الشكل 4 أ عن علاقة إيجابية معتدلة بين شدة سلائف DDA وكثافة أيون شظية DIA ، كما هو متوقع بالنظر إلى أن كلا النهجين يحددان نفس الببتيدات ولكنهما يلتقطان أنواعا مختلفة من الأيونات. توضح المخططات الصندوقية للببتيدات المختارة الموضحة في الشكل 4ب إمكانية تكرار القياسات الكمية التي تم الحصول عليها بواسطة كلا النهجين. تظهر المخططات الصندوقية مناطق الذروة النسبية لكل ببتيد تم قياسها بواسطة DIA و DDA ، مع أشرطة الخطأ التي تمثل تباين القياس عبر التكرارات التقنية. يتم اشتقاق الببتيدات المختارة من الهرمونات الأفيونية الأولية ، بما في ذلك البروينكيفالين (PENK) والبرودينورفين (PDYN) ، وكلاهما يلعب أدوارا مركزية في تعديل الألم والمسكن.

figure-results-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل الببتيدوميكس لتحديد وقياس الببتيدات الذاتية من أنسجة دماغ الفئران. يتضمن سير العمل تشريح الأنسجة ، واستخراج الببتيد وتنقيتها ، والحصول على بيانات LC-ion mobility-MS (LC-IM-MS) باستخدام تجزئة طور الغاز (IM-GPF) ، ومعالجة البيانات لإنشاء مكتبات طيفية وإجراء تحليل كمي. تم إنشاء أجزاء من الشكل في BioRender. تان ، واي (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: قاعدة بيانات الببتيد وتحديد البروتين. (أ) مخطط شريطي يقارن العدد الإجمالي للسلائف ، وتطابقات طيف الببتيد (PSMs) ، والببتيدات الفريدة المحددة عبر نوافذ التنقل الأيوني المختلفة. (ب) مخطط دائري يوضح نسبة الببتيدات التي يتم تحديدها بشكل شائع عبر جميع نوافذ التنقل وتلك التي يتم اكتشافها بشكل فريد داخل النوافذ الفردية. (ج، د) خرائط الحرارة التي تصور توزيع الإشارات الأيونية عبر m / z وأبعاد التنقل الأيوني لنطاق التنقل الكامل (0.6-1.6 V·s / cm²) (C) ونافذة التنقل المقيد (0.6-1.0 V·s / cm²) (D). (ه) مخطط مضطرب يوضح عدد البروتينات المحددة في مجموعات البيانات المكتسبة باستخدام طرق DDA و DIA ، مع تسليط الضوء على تعريفات البروتين المشتركة والفريدة. (و) خريطة التمثيل اللوني التي تمثل الببتيدات المشتقة من سلائف البروينكيفالين المحددة في التكرارات المكتسبة من DIA (اللوحة العلوية) والنسخ المتماثلة المكتسبة من DDA (اللوحة السفلية). لم يتم اكتشاف Leu-enkephalin في اثنين من مكررات DDA الأربعة ، مما يشير إلى القيم المفقودة المحتملة في الاستحواذ القائم على DDA. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحليل المقارن والاستكشافي لبيانات DDA-PASEF و DIA-PASEF باستخدام المكتبات الطيفية. (أ) محاذاة وقت الاستبقاء للببتيد العصبي SF عبر مكررات DIA و DDA-PASEF. (ب) EIC لأيونات شظايا PENK (212-229) من مجموعات بيانات DIA (أعلى) و DDA (أسفل). (ج) تكرر كروماتوغرامات الأيونات الشظية للببتيد العصبي SF من DIA مما يدل على الشطف المشترك العالي والجودة الطيفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: مقارنة القياسات الكمية بين DIA-PASEF (مستوى MS2) و DDA-PASEF (مستوى MS1). (أ) يقارن مخطط الانتثار هذا شدة إشارة الببتيد التي تم الحصول عليها باستخدام وضعي DIA و DDA. على وجه التحديد ، يمثل المحور x منطقة ذروة السلائف المحولة في السجل₁₀ من DDA ، بينما يظهر المحور y منطقة ذروة الجزء المحول₁₀ من DIA لكل ببتيد. (ب) تمثل قطع الأراضي الصندوقية مناطق الذروة النسبية لأربعة ببتيدات تمثيلية ، PENK 107-133 و PENK 188-195 و PDYN 221-233 و PDYN 235-248. تمثل أشرطة الخطأ التباين عبر التكرارات الفنية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الببتيدوميكس ، خاصة عند تحليل الببتيدات الذاتية ، يعد الحفاظ على ملف تعريف الببتيد الأصلي أمرا ضروريا لسلامة البيانات والتفسير البيولوجي. لا يزيل النضح الملحي البارد الدم فحسب ، بل يبرد الدماغ أيضا ، مما يقلل بشكل كبير من تدهور الحالة للبروتين بعد الوفاة الذي يحدث بسرعة بسبب نشاط البروتياز الداخلي. عن طريق خفض درجة حرارة الدماغ ، يتم إبطاء النشاط الأنزيمي ويتم طرد البروتياز المنتشرة من الأوعية الدموية ، مع تقليل التغيرات الأيضية بعد الوفاة²⁵^،²⁶. يؤدي الامتزاج بمحلول ملحي مثلج أيضا إلى طرد الدم من الأوعية الدموية في الدماغ. هذه الخطوة مهمة بشكل خاص ، حيث يحتوي الدم على بروتينات عالية الوفرة (مثل الألبومين والجلوبيولينات) والبروتياز المنتشرة التي يمكن أن تتداخل مع اكتشاف الببتيد العصبي. يمكن أن يؤدي تدهور بروتينات الدم الوفيرة بعد الوفاة إلى زيادة تعقيد مستخلصات الببتيد العصبي وإخفاء الإشارات منخفضة الوفرة ، مما يؤدي في النهاية إلى تعريض كل من التحديد والقياس الكمي^{للخطر 25}^،²⁶^،²⁷. يؤدي التجميد الفوري لأنسجة المخ ، إما على الجليد الجاف أو عن طريق التجميد المفاجئ في الأيزوبنتان المبرد ، إلى إيقاف العمليات الأنزيمية على الفور تقريبا. هذا الحفظ مهم بشكل خاص للكشف عن الببتيدات العصبية الناضجة منخفضة الوفرة وكاملة الطول وضمان القياس الكمي الموثوق. بدون هذه الخطوات ، يمكن أن يؤدي تدهور الببتيد إلى زيادة التباين والقطع الأثرية التي تضر بكل من التحديد والقياس الكمي. وبالتالي ، فإن إزالة الدم ، والتروية الباردة ، والتبريد السريع للدماغ هي تقنيات أساسية تؤثر بشكل مباشر على جودة وحساسية وقابلية تكرار بيانات الببتيدومس قبل القياسات.

كشف تحليل الببتيدات المستخرجة من دماغ الفئران عن وجود عمودين متميزان للحركة الأيونية (الشكل 2 ج ، د). يمكن أن تعزى هذه الظاهرة إما إلى فئات جزيئية مختلفة أو إلى حالات شحنة مختلفة للببتيدات. إذا كانت الأعمدة تتوافق مع فئات جزيئية مميزة ، فقد تتنافس الأنواع غير الببتيدية المتوافقة مع الببتيدات على الاختيار والتجزئة. أيضا ، إذا نشأ الفصل عن الاختلافات في حالات الشحنة ، فمن المتوقع أن ينتج عن العمود الذي يحتوي على ببتيدات عالية الشحنة أطياف MS / MS عالية الجودة ، مما يسهل تحديد الببتيد بشكل أكثر ثقة.

للتحقيق في ذلك ، قمنا بتنفيذ استراتيجية تجزئة الحركة الأيونية ، والحصول على البيانات عبر ثلاث نوافذ تنقل منفصلة: 0.6-1.0 و 0.9-1.3 و 1.2-1.6 فولت / سم². تمتد هذه النوافذ بشكل جماعي إلى نطاق حركة الأيونات الكامل الذي يتم تحليله عادة في تجارب DDA-PASEF القياسية للببتيدات. كما هو موضح في الشكل 2 ، على الرغم من أن العدد الإجمالي للسلائف المكتشفة كان أعلى في نطاق المسح الكامل (0.6-1.6 فولت / ثانية^{/ سم 2}) ، فقد لوحظ عدد أكبر بكثير من تطابقات طيف الببتيد (PSMs) داخل نافذة 0.6-1.0 فولت / ثانية / سم² . تشير هذه النتيجة إلى أن وجود عمودين قد يكون بالفعل بسبب تداخل الجزيئات الأخرى.

أدى تجزئة السلائف القائمة على الحركة الأيونية إلى زيادة بنسبة 30٪ في تغطية الببتيد مقارنة بطريقة المسح الكامل التقليدية. تداخلت ما يقرب من 82٪ من الببتيدات المحددة في مجموعة بيانات المسح الكامل مع الببتيدات التي تم تحديدها باستخدام التجزئة (الشكل 2 ب) ، مما يسلط الضوء على اتساق ومتانة استراتيجية التجزئة. بناء على هذه الملاحظات ، استخدمنا تجزئة الحركة الأيونية وبيانات المسح الكامل لبناء مكتبات طيفية للتحليل الكمي لببتيدات الغدد الصم العصبية باستخدام DIA-PASEF.

كشف تحليل قاعدة البيانات لمجموعات البيانات المكررة التي تم الحصول عليها عبر DDA و DIA عن عدد أكبر من تعريفات الببتيد والبروتين في بيانات DIA ، بما في ذلك 115 بروتينا تم تحديدها بشكل فريد بواسطة DIA (الشكل 2 ه). وشملت هذه الببتيدات العصبية مثل الببتيدات المرتبطة ب Pro-FMRFamide FF و VF. في المقابل ، تم تحديد 69 بروتينا حصريا بواسطة DDA ، ويرتبط العديد منها بالتصاق الخلايا وتطور الخلايا العصبية. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن تطبيق منهجيات DDA و DIA بطريقة تكميلية لتحقيق تغطية ببتيد أوسع.

أظهر التحليل الإضافي أن الحصول على DIA يعالج بشكل فعال بعض مشكلة القيمة المفقودة التي تواجهها بشكل متكرر في تحليل الببتيد الداخلي باستخدام DDA. على سبيل المثال ، تم اكتشاف Leu-enkephalin في اثنين فقط من أصل أربعة مكررات DDA (الشكل 2F ، اللوحة السفلية) ، بينما تم تحديده باستمرار عبر جميع مكررات DIA الأربعة (الشكل 3F ، اللوحة العلوية).

تم استخدام Skyline ، وهي منصة تستخدم على نطاق واسع للبروتينات الكمية ، لتحليل مجموعات بيانات DDA و DIA-PASEF²⁸. يسهل البرنامج تحديد الببتيد من خلال مطابقة المكتبة الطيفية ، والشطف المشترك لأيون الشظايا ، ومحاذاة وقت الاحتفاظ. لتقييم قدرة DIA-PASEF على تقليل التحديد المفقود ، أجرينا تقييما نوعيا للببتيدات المكتشفة حصريا في مجموعة بيانات DIA.

كما هو موضح في الشكل 3D ، تم اكتشاف الببتيد العصبي SF باستمرار عبر جميع مكررات DIA خلال نفس النافذة الزمنية للاحتفاظ. أظهر الكشف في تكرارات DDA تباينا كبيرا ، حيث تراوحت أوقات الاحتفاظ من 25 دقيقة إلى 45 دقيقة (الشكل 3 أ). من المحتمل أن تكون التناقضات الملحوظة ، بما في ذلك الأخطاء في الذروة ذات درجات الثقة المنخفضة ، ناتجة عن تغطية أيون الشظايا المحدودة أو منخفضة الجودة ، كما هو موضح في الشكل 3 ب. في المقابل ، يوضح الشكل 3C أن أيونات الشظايا المقابلة للببتيد العصبي SF كانت محاذاة بشكل جيد عبر جميع مكررات DIA ، مما يدعم تحديد آليا واثقا.

أظهرت مقارنة الجودة الطيفية ل MS / MS لببتيد PENK (212-229) ، المشتق من proenkephalin ، مزايا DIA-PASEF. أظهرت الأطياف التي تم الحصول عليها من DIA كثافة أعلى وجودة أيون شظية محسنة مقارنة ب DDA (الشكل 3) ، وهو أمر مفيد بشكل خاص للكشف عن الببتيدات الداخلية منخفضة الوفرة.

أكد التحليل الكمي أن DIA-PASEF أسفر عن قياسات متسقة وقابلة للتكرار عبر التكرارات البيولوجية ، مع أداء مشابه ل DDA (الشكل 4). علاوة على ذلك ، مكنت DIA من القياس الكمي على مستوى MS2 ، مما يوفر خصوصية على مستوى أيون الشظية وزيادة الثقة في تحديد الببتيد بالنسبة إلى DDA المستند إلى MS1. تدعم هذه النتائج استخدام DIA-PASEF كنهج موثوق وفعال للقياس الكمي المستهدف للببتيد العصبي في المصفوفات البيولوجية المعقدة ، خاصة عندما يكون اكتمال البيانات وقابليتها للتكرار أمرا بالغ الأهمية.

يحدد هذا البروتوكول استراتيجية شاملة لتحليل الببتيد العصبي وتقديره الكمي. يسهل نهج IM-GPF بناء مكتبات طيفية عالية الجودة. بينما يوفر DIA-PASEF قابلية استنساخ محسنة وتغطية ببتيد متزايدة مقارنة ب DDA-PASEF ، فإنه يعزز أيضا القياس الكمي المستند إلى MS2. يؤدي الجمع بين كلتا استراتيجيتي الاستحواذ إلى زيادة التغطية الإجمالية للببتيد ، حيث تساهم كل طريقة بشكل فريد في تحديد الببتيدات المتميزة (الشكل 2 ه). يتمثل الحد من هذا البروتوكول في الحاجة إلى مواد عينة وافرة لدعم كل من إنشاء المكتبة الطيفية والحصول على البيانات عبر طرائق DDA و DIA-PASEF.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين مصالح متنافسة للإفصاح عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم P30DA018310 (JVS).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1٪ حمض الفورميك المياه	فيشر العلمية	LS118-500	LC / MS درجة
حمض الخليك ؛	فيشر العلمية	A11350	LC / MS الصف
أسيتونيتريل	فيشر العلمي ؛	AA47138K7	LC / MS الصف
حمض الفورميك	فيشر العلمي ؛	PI28905	LC / MS الصف
الميثانول	فيشر العلمي ؛	AA47192K7	LC / MS الصف
nanoELute2	Bruker	N / A
بيرس C18 تدور الأعمدة	فيشر العلمية	AA47192K8
معايرة وقت الاحتفاظ بالببتيد	بيرس ثيرمو فيشر	A11351	LC / MS درجة
SpeedVac مكثف الفراغ	جنيف	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	لم يعد النموذج المحدد المستخدم في هذه الدراسة متاحا من الشركة المصنعة. يتم توفير رابط للنموذج المكافئ الحالي للإشارة
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	درجة LC / MS

خليط

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annu Rev Anal Chem. 1, 451-483 (2008).
Buchberger, A., Yu, Q., Li, L. Advances in mass spectrometric tools for probing neuropeptides. Annu Rev Anal Chem. 8 (1), 485-509 (2015).
Burbach, J. P. H. What are neuropeptides. Methods Mol Biol. 789, 1-36 (2011).
Li, C., Kim, K. Neuropeptides. WormBook. , (2008).
Herlenius, E., Lagercrantz, H. Development of neurotransmitter systems during critical periods. Exp Neurol. 190 (Suppl 1), S8-S21 (2004).
Fricker, L. D. Analysis of mouse brain peptides using mass spectrometry-based peptidomics: implications for novel functions ranging from non-classical neuropeptides to microproteins. Mol Biosyst. 6 (8), 1355-1365 (2010).
Schrader, M., Schulz-Knappe, P., Fricker, L. D. Historical perspective of peptidomics. EuPA Open Proteomics. 3, 171-182 (2014).
Fricker, L. D., Margolis, E. B., Gomes, I., Devi, L. A. Five decades of research on opioid peptides: current knowledge and unanswered questions. Mol Pharmacol. 98 (2), 96-108 (2020).
von Bohlenund Halbach, O. The renin-angiotensin system in the mammalian central nervous system. Curr Protein Pept Sci. 6 (4), 355-371 (2005).
Anapindi, K. D. B., Romanova, E. V., Checco, J. W., Sweedler, J. V. Mass spectrometry approaches empowering neuropeptide discovery and therapeutics. Pharmacol Rev. 74 (3), 662-679 (2022).
Hellinger, R., et al. Peptidomics. Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 1-21 (2023).
Kwok, K. Y., et al. Detection of bioactive peptides including gonadotrophin-releasing factors (GnRHs) in horse urine using ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UHPLC/HRMS). Drug Test Anal. 12 (9), 1274-1286 (2020).
Peeters, M. K. R., Baggerman, G., Gabriels, R., Pepermans, E., Menschaert, G., Boonen, K. Ion mobility coupled to a time-of-flight mass analyzer combined with fragment intensity predictions improves identification of classical bioactive peptides and small open reading frame-encoded peptides . Front Cell Dev Biol. 9, 720570(2021).
Fabre, B., Combier, J. -P., Plaza, S. Recent advances in mass spectrometry-based peptidomics workflows to identify short-open-reading-frame-encoded peptides and explore their functions. Curr Opin Chem Biol. 60, 122-130 (2021).
Skowronek, P., Wallmann, G., Wahle, M., Willems, S., Mann, M. An accessible workflow for high-sensitivity proteomics using parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF). Nat Protoc. 20 (6), 1700-1729 (2025).
Toba, E. A. D. L., Bell, S. E., Romanova, E. V., Sweedler, J. V. Mass spectrometry measurements of neuropeptides: from identification to quantitation. Annu Rev Anal Chem. 15, 83-106 (2022).
Okyem, S., Mast, D. H., Romanova, E. V., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Isoaspartate-containing galanin in rat hypothalamus. Commun Chem. 8 (1), 1-10 (2025).
Chapman, J. D., Goodlett, D. R., Masselon, C. D. Multiplexed and data-independent tandem mass spectrometry for global proteome profiling. Mass Spectrom Rev. 33 (6), 452-470 (2014).
Fan, K. -T., Hsu, C. -W., Chen, Y. -R. Mass spectrometry in the discovery of peptides involved in intercellular communication: from targeted to untargeted peptidomics approaches. Mass Spectrom Rev. 42 (6), 2404-2425 (2023).
Foreman, R. E., George, A. L., Reimann, F., Gribble, F. M., Kay, R. G. Peptidomics: a review of clinical applications and methodologies. J Proteome Res. 20 (8), 3782-3797 (2021).
DeLaney, K., Li, L. Data independent acquisition mass spectrometry method for improved neuropeptidomic coverage in crustacean neural tissue extracts. Anal Chem. 91 (8), 5150-5158 (2019).
Zhang, F., Ge, W., Ruan, G., Cai, X., Guo, T. Data-independent acquisition mass spectrometry-based proteomics and software tools: a glimpse in 2020. Proteomics. 20 (17-18), e1900276(2020).
Bersching, K., Michna, T., Tenzer, S., Jacob, S. Data-independent acquisition (DIA) is superior for high precision phospho-peptide quantification in Magnaporthe oryzae. J Fungi. 9 (1), 63(2023).
Bichmann, L., Gupta, S., Röst, H. Data-independent acquisition peptidomics. Methods Mol Biol. 2758, 77-88 (2024).
Lone, A. M., Kim, Y. -G., Saghatelian, A. Peptidomics methods for the identification of peptidase-substrate interactions. Curr Opin Chem Biol. 17 (1), 83-89 (2013).
Parkin, M. C., Wei, H., O'Callaghan, J. P., Kennedy, R. T. Sample-dependent effects on the neuropeptidome detected in rat brain tissue preparations by capillary liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Anal Chem. 77 (19), 6331-6338 (2005).
Che, F. -Y., Zhang, X., Berezniuk, I., Callaway, M., Lim, J., Fricker, L. D. Optimization of neuropeptide extraction from the mouse hypothalamus. J Proteome Res. 6 (12), 4667-4676 (2007).
MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

سير عمل توصيف الببتيد العصبي من أخذ العينات إلى قياس الطيف الكتلي للاكتساب المستقل عن البيانات

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles