مقالة منهجية

SCAnED - ماكرو تجزئة الجلد مفتوح المصدر للكشف شبه الآلي عن الخلايا والنوى في مقصورات البشرة والجلد

DOI:

10.3791/68746

⸱

أغسطس 8, 2025

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا شبه آلي لتحديد وقياس الخلايا المناعية وغير المناعية في أقسام الجلد باستخدام SCAnED ، وهو ماكرو مجاني قائم على ImageJ لتجزئة الجلد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر التوزيع المكاني للخلايا المناعية وغير المناعية داخل الأنسجة والتعبير عن العلامات الخاصة بالخلية معلومات أساسية عن وظيفة الخلية في الموقع. جلد الإنسان هو عضو معقد للغاية مع مقصورات محددة تتكون من خلايا مختلفة ذات أنماط ظاهرية متنوعة. باستخدام الملصقات متعددة التألق ، يمكن تحديد مجموعات خلايا الجلد المميزة وتمييزها بشكل أكبر. ومع ذلك ، في الوقت الحالي ، فإن توافر الأدوات غير التجارية لتحليل الصور لعينات الجلد التي تسمح في تجزئة الخلايا السيليكية على وجه التحديد داخل البشرة أو الأدمة بدقة خلية واحدة محدود. نحن نقدم هنا بروتوكولا خطوة بخطوة لتلوين التألق المناعي لأقسام الجلد ، والفحص المجهري متحد البؤر ، وتحليل الصور باستخدام أداتنا المتاحة مجانا SCAnED (Skin Compartment Aalysis of Epidermis و Dermis). يسمح ماكرو SCAnED بتحديد وتصنيف الخلايا والنوى بدقة في كل من مقصورات البشرة والجلد في جلد الإنسان. نحن نقدم إرشادات حول كيفية تحديد متوسط مستويات شدة تعبير الصانع في الخلايا المختلفة والأجزاء الخلوية ، مثل السيتوبلازم والنواة ، وكيفية تحديد الخلايا التي تعبر عن كميات متفاوتة من هذه العلامات باستخدام خط أنابيب Python المصاحب الذي يتم توفيره كدفتر ملاحظات Jupyter جاهز للاستخدام تم تنفيذه في Google Colab. سيسمح هذا البروتوكول للمستخدمين عديمي الخبرة بتحديد ملامح التعبير الخاصة بالخلايا داخل أنسجة الجلد وتقديم رؤى حول التوزيع المكاني للخلايا داخل مقصورات البشرة والجلد، مما يسمح بفهم أعمق لبنية الأنسجة المعقدة وتكوين الخلايا في جلد الإنسان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد فهم أنسجة الجلد على المستوى الخلوي وتمييز الأنماط الظاهرية للخلايا ، والتشكل ، وتوطينها داخل كل من مقصورات البشرة والجلد أمرا محوريا في أبحاث الأمراض الجلدية وعلم الأنسجة1،2. يصبح التركيب الخلوي داخل البشرة ، الذي يشمل الخلايا الكيراتينية والخلايا الصباغية وخلايا لانجرهانز في ظل ظروف صحية ، غير متوازن إلى حد كبير في أمراض الجلد الالتهابية والسرطان. علاوة على ذلك ، يمكن أن يتغير النمط الظاهري وتوطين الخلايا داخل الأدمة ، الواقعة تحت البشرة وتؤوي الخلايا الليفية وغالبية الخلايا المناعية ، بشكل كبير في المرض. ومن ثم ، فإن تجزئة الخلايا والنوى أمر ضروري لتقييم السمات الخلوية مثل عدد الخلايا ، وتعبير البروتين ، والتشكل والتنظيم المكاني ، وخصائص النواة مثل الحجم والشكل وتعبير عامل النسخ ، وبالتالي المساعدة في فهم توازن الجلد والأمراض3،4،5.

على الرغم من توفر منصات تحليل الصور للأغراض العامة مثل QuPath6 و CellProfiler7 و ilastik8 ، إلا أن هذه الأدوات غالبا ما تتطلب تخصيصا وبرمجة نصية مكثفة للتكيف مع التعقيد الهيكلي ومورفولوجيا الخلايا غير المتجانسة لأنسجة الجلد. تم تصميم عدد قليل من الأدوات خصيصا للتجزئة الآلية لمقصورات البشرة والجلد، والعديد من الحلول المتاحة تجارية ولا يمكن الوصول إليها مجانا. هذه القيود تجعل من الصعب على غير الخبراء تنفيذ خطوط أنابيب فعالة للتحليل الخاص بالجلد.

نقدم هنا بروتوكولا شاملا لتحليل الخلايا والنوى داخل أنسجة الجلد ومقصوراتها ، يغطي جميع الخطوات الحيوية من تلطيخ الأنسجة إلى تحليل الصور باستخدام خط أنابيب تحليل الصور شبه الآلي. نبدأ بمعلومات مفصلة عن تلطيخ التألق المناعي لأنسجة الجلد ، بما في ذلك التلوين باستخدام E-cadherin لتجزئة البشرة / الأدمة و 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) للكشف عن الخلايا / النوى. تم تضمين علامتين مهمتين ، Vimentin (VIM) و CD90 ، لأغراض التحقق من الصحة. نوصي باستخدام الأجسام المضادة بتركيزات محسنة (انظر الجدول 1) والتقاط الصور باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر مع إعدادات متسقة لكثافة الليزر ووقت التعرض والدقة لضمان قابلية التكاثر.

علاوة على ذلك ، نقدم ImageJ9 macro SCAnED المصمم خصيصا ، والذي يرمز إلى Skin Compartment Aalysis of Epidermis و Dermis ، ونقدم جميع الخطوات اللازمة لتجزئة السيليكو والكشف عن النوى والخلايا داخل كل من البشرة والأدمة. يمكن للمستخدمين الاختيار بين طريقتين مختلفتين للكشف عن النوى ، إما باستخدام عتبة بسيطة وسريعة أو أداة التعلم العميق StarDist10 ونموذج الجلد المدرب الخاص بنا ، قبل متابعة بروتوكول SCAnED. على عكس الأدوات العامة ، تم تطوير SCAnED خصيصا لأنسجة الجلد ويتفوق عليها من خلال تمكين التقسيم التلقائي لمناطق البشرة والجلد والقياس الكمي المتكامل لعلامات متعددة في كلتا المنطقتين. هذا مفيد بشكل خاص للباحثين الذين يفتقرون إلى الخبرة في البرمجة أو التعلم العميق ، حيث يقدمون أداة جاهزة للاستخدام مصممة لتحليل صور الجلد.

نوضح أيضا كيف يتم استخراج مستويات الشدة المتوسطة لكل خلية من صور التألق المناعي لما يصل إلى خمس علامات مميزة ذات أهمية. أخيرا ، نقدم كود Python للتحليل الإحصائي للبيانات أحادية الخلية التي تم الحصول عليها والتي تمت كتابتها وتنفيذها في Google Colab11 ومشاركتها كدفتر ملاحظات Jupyter. يهدف بروتوكولنا وماكرو SCAnED إلى تزويد الباحثين في الجلد الذين ليس لديهم خبرة متقدمة في التألق المناعي والحوسبة بأداة عملية لتسمية الخلايا والتعبير عن العلامات في جلد الإنسان وتحديدها بشكل شبه تلقائي ، مع التركيز على مقصورات البشرة والجلد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. وضع العلامات المناعية على E-cadherin و VIM و CD90 والتلوين النووي باستخدام DAPI في أقسام الجلد المضمنة في البارافين

ملاحظة: يعرض البروتوكول خطوات للأقسام المضمنة في البارافين. بالنسبة لعينات الأنسجة الطازجة والمجمدة ، قم بإصلاح أقسام الأنسجة وتابع الخطوة 1.3 من البروتوكول.

  1. تذوب البارافين باستخدام مروحة أو فرن.
  2. أعد ترطيب الأقسام عن طريق المرور عبر الكحوليات المتدرجة مع زيادة محتوى الماء (على سبيل المثال ، الزيلين → 100٪ إيثانول → 85٪ إيثانول → 70٪ إيثانول → الماء).
  3. قم بتنفيذ خطوات استرجاع المستضد حسب الاقتضاء للمستضدات.
  4. تخلل أقسام الأنسجة بنسبة 0.3٪ Triton X في PBS (3 × 20 دقيقة) (انظر الجدول 2).
  5. اغسل الشرائح باستخدام PBS (1 × 5 دقائق).
  6. قم بتطويق كل عينة بقلم تحديد منزلق كاره للماء لمنع انسكاب السائل وتقليل حجم الكواشف واتركها تجف.
  7. تطبيق الأجسام المضادة الأولية (المخزن المؤقت ل Abs: PBS + 2٪ BSA) (انظر الجدول 1 والجدول 2). ضع الشرائح في صندوق غرفة رطب (صندوق مبلل) واحتضنه طوال الليل.
  8. اغسل الشرائح باستخدام 0.3٪ Triton X في PBS (3 × 5 دقائق).
  9. قم بإزالة المنظفات الزائدة عن طريق غسل الشرائح باستخدام PBS (1 × 5 دقائق).
  10. ضع الأجسام المضادة الثانوية ومصل الماعز (انظر الجدول 1). احتضان الشرائح في مكان مظلم لمدة 1 ساعة.
  11. اغسل الشرائح باستخدام 0.3٪ Triton X في PBS (3 × 5 دقائق).
  12. قم بإزالة المنظفات الزائدة عن طريق غسل الشرائح باستخدام PBS (1 × 5 دقائق).
  13. أضف DAPI لتلوين النوى (انظر الجدول 1). احتضن الشرائح في مكان مظلم لمدة 30 دقيقة.
  14. اغسل الشرائح باستخدام 0.3٪ Triton X في PBS (3 × 5 دقائق).
  15. اغسل الشرائح باستخدام PBS (1 × 5 دقائق).
  16. ضع قطرة واحدة (~ 5-15 ميكرولتر) من وسط تركيب التألق على كل عينة وضع أغطية بعناية (قم بإزالة الفقاعات إذا لزم الأمر). اترك الشرائح تجف في الظلام.
الأجسام المضادة والصبغةتركيز العملالتخفيف
الجسم المضاد للفيمنتين0.8 ميكروغرام / مل1:50
الأجسام المضادة للإي كاديرين1 ميكروغرام / مل1:333
الجسم المضاد ل CD901:1000
AF488 مضاد للماوس1:500
AF568 مضاد للأرانب1:500
AF647 مضاد للماوس1:500
دابي1 ميكروغرام / مل

الجدول 1: الأجسام المضادة والصبغة.

1. تلطيخ العازلة
الكاشفالتركيز النهائيمبلغ
جيش صرب البوسنه2%1 جرام
برنامج تلفزيوني1x50 مل
مجموعغير متاح50 مل
2. المخزن المؤقت للنفاذية
الكاشفالتركيز النهائيمبلغ
تريتون إكس0.30%300 ميكرولتر
برنامج تلفزيوني1x100 مل
مجموعغير متاح100 مل

الجدول 2: وصفات للحلول.

2. التصوير متحد البؤر

ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر ، المجهز بهدف 10x (NA 0.4) ، و 4 خطوط ليزر (405 نانومتر ، 488 نانومتر ، 561 نانومتر ، 640 نانومتر).

  1. احصل على الصور باستخدام المجهر الفلوري (انظر مثال الصورة في الشكل 1).
  2. استخدم معلمة حجم المسح الضوئي التالية لإنشاء الماكرو ، وتدريب نموذج StarDist ، ومن الناحية المثالية للحصول على الصور: حجم الصورة = 4,096 × 4,096 بكسل (أو 1,273 × 1,273 ميكرون) ، عمق البت = 16 بت ، الحد الأدنى لحجم البكسل = 0.3 ميكرون ، نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) = الحد الأدنى من 3.

figure-protocol-1
الشكل 1: تلطيخ التألق المناعي لقسم الجلد. DAPI: نوى الملصقات ، CD90: علامة الخلايا الليفية ، E-cadherin: تستخدم لتسمية البشرة ، VIM: الخلايا الشفبرة عن VIM ، الدمج: دمج DAPI (أرجواني) ، CD90 (أزرق) ، E-cadherin (أصفر) ، و VIM (أخضر). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحليل الصور باستخدام ماكرو SCAnED (الملف التكميلي 1 والفيديو التكميلي S1 والفيديو التكميلي S2)

  1. ابدأ تشغيل الماكرو (SCAnED.mp4 الفيلم).
    1. افتح صور التألق المناعي في Fiji/ImageJ باستخدام التنسيقات الحيوية مع الإعدادات الافتراضية.
      ملاحظة: لا تقم بتقسيم القنوات في هذه الخطوة.
    2. قم بتنزيل وتشغيل ماكرو SCAnED بالانتقال إلى المكونات الإضافية | وحدات الماكرو | قم بتشغيل وتحديد البرنامج النصي للماكرو SCAnED (الملف التكميلي 1).
    3. اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة خطوة بخطوة التي يوفرها الماكرو.
  2. في تجزئة السيليكو للبشرة والأدمة باستخدام SCAnED macro.
    1. حدد قناة E-cadherin عندما يطلب منك ذلك.
    2. اضبط الحد يدويا بالانتقال إلى صورة | ضبط | العتبة والنقر فوق موافق لقناة E-cadherin لالتقاط منطقة البشرة بالكامل.
    3. إذا لزم الأمر ، قم بتأكيد خطوة Flood Fill لسد الفجوات في قناع E-cadherin عن طريق تحديد أيقونة أداة تعبئة الفيضانات في ImageJ ، والنقر فوق الجزء العلوي من البشرة ، والنقر فوق موافق (الشكل التكميلي S1A-E ونصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها في قسم المناقشة).
    4. إذا كان القناع مقلوسا، فحدد نعم وموافق عند مطالبتك بعكس التحديد. وإلا، حدد لا وموافق (راجع الشكل التكميلي S1F، G وتلميحات استكشاف الأخطاء وإصلاحها في قسم المناقشة).
    5. حدد قناة DAPI عندما يطلب منك ذلك. تظهر صور النوى قبل وبعد تجزئة البشرة الجلدية في الشكل 2.
  3. تجزئة النوى باستخدام دالة العتبة
    1. التحديد التلقائي لمستويات الشدة.
  4. تجزئة النوى باستخدام StarDist
    1. افتح StarDist في ImageJ (الشكل 3).
    2. قم بتحميل نموذج الكشف عن النوى (الملف التكميلي 2) في واجهة المستخدم الرسومية StarDist (الشكل 4). يظهر زوج التدريب المقابل لإنشاء نموذج StarDist في الشكل التكميلي S2.
      ملاحظة: يجب استخدام الإصدار 1.15 من Tensor Flow لهذا النموذج في حالة حدوث خطأ StarDist (انظر الشكل التكميلي S3).
    3. انقر فوق قناة النوى أولا.
    4. اضبط إعدادات البلاط وفقا لذلك (تأكد من أن عدد المربعات يطابق حجم التصحيح المتوقع (256 × 256 بكسل) (انظر الشكل 3 والشكل 4).
      ملاحظة: قد يستغرق تجزئة StarDist وقتا اعتمادا على عدد النوى.
  5. قياس كثافة البروتينات النووية وتقديرها
    ملاحظة: قبل تشغيل SCAnED ، انتقل إلى تحليل | قم بتعيين القياسات وتكوين المعلمات لضمان إخراج بيانات دقيق وملائم (الشكل 5).
    1. عند المطالبة، حدد نعم لقياس شدة العلامة في النوى.
    2. اختر قناة العلامة المناسبة (حتى خمسة ممكنة).
    3. احفظ النتائج كملفات CSV وفقا لتعليمات الماكرو.
    4. كرر لكل قناة.
    5. بعد معالجة جميع القنوات، احفظ النتائج كملفات CSV وفقا لتعليمات الماكرو.
      ملاحظة: للحصول على تصور أفضل ، قمنا بتضمين عرض مكبر لمنطقة جلدية معينة لبقية التحليل (الشكل 6).
  6. تجزئة الخلايا (المنطقة السيتوبلازمية)
    ملاحظة: يعتمد تجزئة الخلية على توسيع عائد الاستثمار النووي وبالتالي يجب أن يبدأ بعد تجزئة النوى.
    1. عندما يتم استخدام وظيفة العتبة لتجزئة النوى ، قم بتطبيق التمدد الثنائي.
    2. عند استخدام StarDist لتجزئة النوى ، استخدم توسيع التوسيع ، الذي له وقت معالجة أطول (انظر الشكل التكميلي S4).
  7. قياس كثافة البروتينات السيتوبلازمية وتقديرها الكمي
    1. حدد نعم لقياس شدة العلامة في الخلايا الكاملة.
    2. احفظ ملفات CSV الناتجة وفقا لتعليمات الماكرو.
    3. كرر لكل قناة علامة بالترتيب.
    4. احتفظ بنفس ترتيب القنوات لكل من قياسات النواة والخلية للحفاظ على الاتساق في بيانات الإخراج.
    5. اختر تجاهل كلما طلب الماكرو ذلك، لتجنب خلط بيانات النوى بين البشرة والأدمة. يوضح الشكل 7 جميع خطوات التجزئة المستندة إلى العتبة.

figure-protocol-2
الشكل 2: تحليل النوى الخاصة بالقناة وفصلها في نوى البشرة والجلد. يوضح تلوين التألق المناعي ل DAPI التشكل والتوزيع المكاني للنوى في الجلد كله (الصورة اليسرى). تمثيل قناة النوى لنوى البشرة الملطخة ب DAPI ، مما يوفر نظرة ثاقبة لتوزيع النوى داخل حجرة البشرة (الصورة الوسطى). تمثيل قناة النوى للنوى الجلدية الملطخة ب DAPI ، مما يوفر تصورا لتوزيع النوى داخل الحيز الجلدي (الصورة اليمنى). أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 3: استخدام خيار "StarDist". لقطة شاشة تسلط الضوء على موقع خيار "StarDist 2D" داخل القائمة / الإضافات / StarDist / StarDist 2D. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-4
الشكل 4: تعليمات لاستخدام نموذج الكشف عن النوى. قم بتنزيل الملف "nuclei_detection_model.zip" وقم بتوفير مسار الملف الخاص به في قسم استعراض . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-5
الشكل 5: تكوين إعدادات القياس. (أ) لقطة شاشة تبرز موقع خيار تعيين القياسات داخل القائمة ، مما يتيح تخصيص معلمات القياس للتحليل اللاحق. (ب) اضبط مربع القياسات الذي يعرض الواجهة لضبط إعدادات القياس ، مما يسمح للمستخدمين بتحديد معلمات لجمع البيانات وتحليلها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-6
الشكل 6: عرض مكبر لمنطقة معينة. (أ) دمج تلوين DAPI (أرجواني) و VIM (أخضر). (ب) عرض مكبر لمنطقة معينة من A ، مما يوفر تصورا مفصلا لتعبير VIM داخل أنسجة الجلد. يرجى ملاحظة التشكل المختلف للنوى داخل البشرة والأدمة. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر (أ) ، 20 ميكرومتر (ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-7
الشكل 7: تجزئة SCAnED في البشرة والأدمة للنوى والخلايا باستخدام العتبة. (أ) الصورة الكاملة: دمج تلطيخ DAPI (أرجواني) و VIM (أخضر). الجزء العلوي: (ب) دمج نوى البشرة الملطخة ب DAPI و VIM بعد الانفصال. (ج) قناع نوى البشرة باستخدام العتبة. (د) تجزئة نوى نوى البشرة متراكبة على دمج DAPI و VIM ، مما يساعد في تصور توزيع النوى داخل حجرة البشرة. (ه) تجزئة الخلايا لنوى البشرة المتراكبة على دمج DAPI و VIM ، مما يساعد في تصور توزيع النوى داخل حجرة البشرة باستخدام العتبة والتمدد ، حيث يظهر أن منطقة الانتقاء أكبر من النوى. الجزء السفلي: (F) دمج النوى الجلدية الملطخة ب DAPI و VIM بعد الانفصال. (ز) قناع النوى الجلدية باستخدام العتبة. (ح) تجزئة نوى النوى الجلدية متراكبة على دمج DAPI و VIM ، مما يساعد في تصور توزيع النوى داخل الحجرة الجلدية. (I) تجزئة الخلايا للنوى الجلدية المتراكبة على دمج DAPI و VIM ، مما يساعد في تصور توزيع النوى داخل الحجرة الجلدية. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. تصنيف وتصور بيانات الخلية المفردة المستخرجة (الفيديو التكميلي S3)

ملاحظة: تولد كل علامة تألق مناعي ملفين CSV: أحدهما لحجرة البشرة والآخر للحجرة الجلدية.

  1. إنشاء عتبات شدة خاصة بالعلامة باستخدام عينات التحكم في النمط المتماثل.
    1. قم باستيراد ملفات إخراج CSV التي تم إنشاؤها بواسطة ماكرو SCAnED إلى Google Colab باستخدام Jupyter Notebook المقدم. في البداية ، قم بتنزيل Jupyter Notebook المناسب (على سبيل المثال ، الملف التكميلي 3 أو الملف التكميلي 4) ، وانتقل إلى Google Colab (https://colab.research.google.com/) ، وانقر فوق ملف ، وافتح دفتر الملاحظات ، وحدد الملف ، وقم بتشغيل خلايا التعليمات البرمجية واحدة تلو الأخرى. عندما يطلب منك اختيار الملفات، انقر فوق الزر وقم بتحميل ملف .csv.
    2. لكل جسم مضاد ، احسب متوسط شدة التألق من عناصر التحكم في النمط المتماثل. لتحديد القطع لكل جسم مضاد ، افتح دفتر ملاحظات DotPlot (الملف التكميلي 4) ، وقم بتحميل ملف التحكم في النمط المتماثل المقابل ، وقم بتشغيل التعليمات البرمجية.
    3. بناء على توزيع النقاط في التحكم في النمط المتماثل ومخططات الأجسام المضادة المحددة ، اختر عتبة شدة مناسبة لفصل الخلفية (التحكم في النمط المتماثل) عن الإشارة (تلطيخ محدد). استخدم هذه القيم كقطع لتصنيف الخلايا الفردية على أنها موجبة أو سلبية للتعبير عن العلامة.
  2. قارن شدة العلامات في العينات التجريبية بالعتبات المحسوبة.
    1. تصنيف الخلايا ذات الشدة ≥ عتبة على أنها إيجابية.
    2. تصنيف الخلايا ذات الشدة < عتبة على أنها سلبية.
    3. تصنيف المجموعات السكانية الفرعية بناء على مجموعات من تعبير العلامة ، على سبيل المثال ، تحديد مجموعات الخلايا الموجبة المفردة أو الإيجابية المزدوجة أو الثلاثية الإيجابية.
  3. تصور توزيع وعلاقات تعبير العلامة باستخدام نوعين من المخططات:
    1. قم بإنشاء الرسوم البيانية وتراكب الرسوم البيانية لمقارنة توزيع الشدة بين الحالات (على سبيل المثال ، التحكم مقابل الجلد المريض) عن طريق تشغيل رمز الرسم البياني (قم بتنزيل الملف التكميلي 3 ، وانتقل إلى Google Colab (https://colab.research.google.com/) ، وانقر فوق ملف ، وافتح دفتر الملاحظات ، وحدد الملف ، وقم بتشغيل الرمز) (الشكل 8).
    2. قم بإنشاء مخططات نقطية لمحاكاة مخططات مبعثرة على غرار قياس التدفق الخلوي لتقييم أنماط التعبير المشترك عن طريق تشغيل كود DotPlot (قم بتنزيل الملف التكميلي 4 ، وانتقل إلى Google Colab (https://colab.research.google.com/) ، وانقر فوق ملف ، وافتح دفتر الملاحظات ، وحدد الملف ، وقم بتشغيل الكود) (الشكل 9).
    3. تصدير البيانات المعالجة لإجراء تحليلات إضافية وتقييم الفروق الهامة باستخدام الاختبارات الإحصائية.

figure-protocol-8
الشكل 8: الرسم البياني المتراكب الذي يقارن متوسط شدة الخلايا الموجبة ل VIM. تراكب الرسم البياني الذي يقارن متوسط شدة خلايا VIM في العينات السليمة (H) في عينات الزرقاء والصدفية (P) باللون البرتقالي داخل الأدمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-9
الشكل 9: إشارات موجبة مزدوجة على مخطط نقطي. عرض توضيحي لمخطط النقاط المزدوج التلوين الذي يمكن أن يساعد في تصور أفضل للسكان الإيجابيين الفرديين والإيجابيين المزدوجين والسلبيين المزدوجين. يوضح هذا المثال التلوين المزدوج ل CD90 و VIM في أدمة الجلد (A) السليم و (B) الصدفية ، وفي بشرة (C) السليمة و (D) عينات الجلد الصدفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراسة سابقة ، استخدمنا SCAnED بنجاح لاكتشاف وتحديد الخلايا ومستويات التعبير عن ليزيل أوكسيديز (LOX) ، وهو بروتين سيتوبلازم ، وعامل النسخ المحفز لنقص الأكسجة العامل 1 (HIF-1) في الخلايا داخل أدمة جلد الإنسان12 مما يسلط الضوء على قابلية تطبيق هذه الأداة لأبحاث الجلد.

لمزيد من التقييم لدقة تجزئة الجلد في تحديد الخلايا والنوى في مقصورات البشرة والجلد ، قمنا بتلطيخ عينات أنسجة الجلد السليمة والملتهبة من الصدفية المضمنة في البارافين باستخدام DAPI و E-cadherin لتجزئة النوى ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول SCAnED هو طريقة شبه آلية للتحليل الخاص بالمقصورة لكل من الخلايا المناعية وغير المناعية في أنسجة الجلد البشري. يدمج سير العمل بروتوكول تلطيخ قائم على E-cadherin لتمكين تجزئة البشرة والأدمة ، واكتشاف النوى والخلايا المستندة إلى DAPI ، متبوعا بالقياس الكمي لتعبير العلامات في النوى والخلايا باستخدام الماكرو المستند إلى ImageJ. علاوة على ذلك ، نقوم بتوجيه المستخدمين من خلال تحليل سير عمل Python الخاص بنا لتصور البيانات أحادية الخلية المستخرجة. البروتوكول مرن ويدعم تحليل ما يصل إلى خم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل تطوير خط أنابيب تحليل الصور هذا من قبل Land Niederösterreich كجزء من مجموعة أبحاث حساسية الدانوب ومن قبل Fellinger Krebsforschung.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.3٪ ترايتون X سيغما-ألدرتشT9284
BSA (ألبومين مصل البقر)سيغما ألدريتش
CD90الإشارات الخلويةD3V8A
DAPI روش10236276001
الماء منزوع الأيونات
E-cadherin أبكامab1416
وسط تثبيت فلوري  داكوS3023
الجسم المضاد الثانوي المتقاطع IgG1 المضاد للفأر في الماعز، Alexa Fluor 488  (AF 488 مضاد للفأرة)ثيرمو فيشر العلميA-21121
الجسم المضاد الثانوي المتقاطع لمضاد الفأر IgG2A، أليكسا فلور 647 (AF 647 مضاد للفئران)ثيرمو فيشر العلميA-21241
الجسم المضاد الثانوي الممتص متقاطع IgG (H+L) مضاد للأرانب الماعز، أليكسا فلور 568 (AF 568 مضاد للأرانب)ثيرمو فيشر العلميA-11011
مصل الماعز  أجيلينت تكنولوجيز وأومل؛ شركة ستيرايش GmbH، داكوX0907
PBS جيبكو14190-094
فيمنتين داكوM7020
<قوي>مواد
صندوق الحجرة (الصندوق الرطب)
كوفرسلبز  ثيرمو فيشر
قلم علامة منزلقة طاردة للسوائل للتلوين (كاره للماء) دايدو سانغيوZ37782124x50مم
<القوة>الحلول
مخزن نفاذية (0.3٪ ترايتون X في PBS) راجع الجدول 2
مخزن التلوين (2٪ BSA في PBS) راجع الجدول 2
<قوي>برمجيات ومجموعات بيانات
مجهر الليزر الكونفوكلي الماسح  أوليمبوسFV3000 مبني على IX83 المقلوبمجهزة بهدف 10 أضعاف (NA 0.4)، و4 خطوط ليزر (405 ميل بحري، 488 ميل بحري، 561 ميل بحري، 640 ميل بحري، متماسك)
فيجي (ImageJ) V1.54h
جوجل كولابجوجل
GraphPad Prism شركة جراف باد سوفتوير إنك.بريزم 10لمزيد من التحليل الإحصائي
هالومختبرات إنديكا
برنامج بايثونبايثون 3.11.12
كيوباثالبرمجيات المفتوحة (بانكهيد، ب. وآخرون، https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
ستارديستتثبيت نسخة وحدة المعالجة المركزية TF1.15.0

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichtenberger, B. M., Kasper, M. Cellular heterogeneity and microenvironmental control of skin cancer. J Intern Med. 289 (5), 614-628 (2021).
  2. Watt, F. M. Mammalian skin cell biology: at the interface between laboratory and clinic. Science. 346 (6212), 937-940 (2014).
  3. Bergstresser, P. R., Pariser, R. J., Taylor, J. R. Counting and sizing of epidermal cells in normal human skin. J Invest Dermatol. 70 (5), 280-284 (1978).
  4. Régnier, M., Patwardhan, A., Scheynius, A., Schmidt, R. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 821-824 (1998).
  5. Régnier, M., Staquet, M. J., Schmitt, D., Schmidt, R. Integration of Langerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis. J Invest Dermatol. 109 (4), 510-512 (1997).
  6. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  7. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biol. 16 (7), e2005970(2018).
  8. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
  11. Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
  12. Balsini, P., et al. Stiffness-dependent lysyl oxidase regulation through hypoxia-inducing factor 1 drives extracellular matrix modifications in psoriasis. J Invest Dermatol. 1145 (7), 1653-1669.e10 (2024).
  13. Mahrle, G., Bolling, R., Osborn, M., Weber, K. Intermediate filaments of the vimentin and prekeratin type in human epidermis. J Invest Dermatol. 81 (1), 46-48 (1983).
  14. de Waal, R. M., Semeijn, J. T., Cornelissen, M. H., Ramaekers, F. C. Epidermal Langerhans cells contain intermediate-sized filaments of the vimentin type: an immunocytologic study. J Invest Dermatol. 82 (6), 602-604 (1984).
  15. Bata-Csorgo, Z., Hammerberg, C., Voorhees, J. J., Cooper, K. D. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med. 178 (4), 1271-1281 (1993).
  16. Nakamura, Y., et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. British Journal of Dermatology. 154, 1062-1070 (2006).
  17. Wetzel, A., et al. Increased neutrophil adherence in psoriasis: role of the human endothelial cell receptor Thy-1 (CD90). J Invest Dermatol. 126 (2), 441-452 (2006).
  18. RRID:SCR_018350. , Indica Labs. https://www.indicalab.com/halo/ (2025).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

StarDist

مقالات ذات صلة