يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير انتشار الكروموسوم الانتصافي من بويضات الفئران لتقييم التشابك وإعادة التركيب

2.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68749

⸱

يوليو 18, 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

الأخطاء الانتصافية في نقاط الاشتباك العصبي وإعادة التركيب شائعة في بويضات الثدييات. يعد التحليل الدقيق للبروتينات المشاركة في هذه العمليات أمرا ضروريا لفهم كيف ولماذا يحدث تكوين البويضات بشكل خاطئ في كثير من الأحيان. تسمح التقنيات المعروضة هنا بمراقبة شاملة لإعادة التركيب والمشابك لتقييم جودة البويضات في الفئران.

الملخص

تحدد ثلاث عمليات حرجة ومترابطة الطور الأول: يجب أن تتزاوج الكروموسومات المتجانسة معا ، وهي بنية بروتينية تسمى الأشكال المعقدة المشبكية لربط المتماثلات معا (المشبك العصبي) ، وتخضع المتماثلات لإعادة التركيب ، وتبادل المواد الوراثية بشكل متبادل لتشكيل عمليات الانتقال (COs). يمكن أن تؤدي الأخطاء في هذه العمليات إلى قصور المبيض المبكر ، واختلال الصيغة الصبغية ، وفي النهاية فقدان الحمل والعقم. إعادة التركيب الانتصافي عرضة للخطأ بشكل خاص في البويضات ، حيث تحتوي أكثر من 7٪ من البويضات البشرية على زوج كروموسوم واحد على الأقل دون تقاطع ، وما بين 20٪ -80٪ من البويضات مقابل 2.5٪ -7٪ من المنوية اختلال الصيغة الصبغية. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح لماذا تظهر أخطاء الكروموسومات مثل هذه التفاوتات المذهلة بين الجنسين. يصف البروتوكول الحالي طرق تحضير وتحليل انتشار كروموسوم الطور الأول للبويضة من الفئران الجنينية واليافعة ، على التوالي. لتتبع ديناميكيات الكروموسوم الحرجة في جميع أنحاء الطور الأولي الانتصافي الأول ، يستخدم هذا البروتوكول تلطيخ التألق المناعي للعلامات الشائعة لإعادة التركيب الانتصافي (RAD51 لفواصل الخيوط المزدوجة ، MSH4 لوسيطات ثاني أكسيد الكربون ، و MLH1 / MLH3 لتحديد معظم ثاني أكسيد الكربون) والمشابك العصبي (SYCP3 لمحاور الكروموسوم ، و SYCP1 للمناطق المشبكية ، و HORMAD1 للمناطق غير المشبكي). علاوة على ذلك ، يستخدم هذا البروتوكول النضج في المختبر للبويضات التي تم جمعها لتقييم عدد الكروموسومات المزدوجة (ثنائية التكافؤ) والعدد الإجمالي للعمليات الانتقال (chiasmata) في الطور الأول. توفر هذه التقنيات معا إطارا شاملا وكميا لفحص الآليات التي تنظم ديناميكيات الكروموسومات المبكرة في الانقسام الاختزالي الأنثوي.

المقدمة

الانقسام الاختزالي هو انقسام خلوي متخصص ضروري لإنتاج الأمشاج أحادية الصيغة الصبغية. خلال الطور الأول ، يجب أن تنجز الكروموسومات المتجانسة (كل منها من كروماتيدات شقيقة متماسكة معا بواسطة التماسك) ثلاث مهام حاسمة: 1) التعرف على بعضها البعض والاقتران معها ، 2) الانسحاب معا عن طريق تشكيل المركب المشبكي (SC) بين محاورها الجانبية ، و 3) تبادل الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، مما يؤدي إلى عمليات الانتقال (COs) بين الكروماتيدات غير الشقيقة1،2. يضمن الاتصال المادي الناتج عن تكوين التقاطع ، الذي يحافظ عليه التماسك ، التوجيه الثنائي والفصل المناسبين للكروموسوم خلال الطور الأول3،4،5.

يتكون الطور الانتصافي الأول من خمس مراحل ، يتم تحديد كل منها من خلال حالة المشابك6. في leptonema (اليونانية للخيط الرفيع) ، تتكثف الكروموسومات حيث يتشكل العنصر المحوري (المميز ب SYCP3) على طول محاور الكروموسومات. أثناء zygonema (الخيوط المنضمة) ، تبدأ المتماثلات في التشابك حيث يتشكل العنصر المستعرض ل SC (SYCP1) بين المحاور7. في pachynema (الخيط السميك) ، يتم تشابك الكروموسومات على طولها بالكامل. ثم يتم تفكيك SC أثناء ازدواج البلوم (خيطان) ، تاركا المتماثلات متصلة فقط في مواقع التقاطع (chiasmata). Chiasmata هي نتاج إعادة التركيب المتماثل ، وهي عملية تبدأ بالحث المبرمج لفواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs). من بين مئات DSBs ، يصبح ~ 10٪ فقط COs. في الفئران ، يتشكل معظمها (90٪ -95٪) من خلال مسار ثاني أكسيد الكربون من الفئة الأولى الذي يسهله MutLγ (MLH1-MLH3) ، مع ثاني أكسيد الكربون المتبقي الذي يصنعه MUS81-EME1 من خلال مسار ثاني أكسيد الكربون من الفئةالثانية 8،9،10،11.

الاقتران والمشابك العصبي وإعادة التركيب هي عمليات شديدة التنظيم ومترابطة. عادة ما تؤدي الأخطاء إلى آليات نقطة التفتيش ، مما يؤدي إلى موت الخلايا. في الإناث ، يمكن أن يتسبب فقدان الخلايا الجرثومية من أخطاء الطور الأول المبكرة في قصور المبيض المبكر12،13 ، في حين أن الأخطاء المتأخرة (على سبيل المثال ، فشل المتماثلات في تكوين COs ، أو سوء وضع COs ، أو فقدان التماسك المبكر) يمكن أن تؤدي إلى خلل الكروموسومات واختلال الصيغة الصبغية في البشر ، تعد الأخطاء الانتصافية سببا رئيسيا لفقدان الحمل والعقم. الانقسام الاختزالي الأنثوي عرضة للخطأ بشكل خاص. حوالي 20٪ -80٪ من البويضات البشرية (مقابل 2.5٪ -7٪ من المنوية) تحمل أعدادا غير طبيعية من الكروموسومات ، معظمها ناتج عن أخطاء في الانقسام الانتصافي الأول14،15،16،17. على الرغم من أن العمر قد تم تحديده على أنه السبب الأكبر الوحيد لاختلال الصيغة الصبغية لدى الأم ، إلا أن سبب تعرض البويضات للأخطاء لا يزال غير واضح.

على الرغم من أهمية فهم العوامل الكامنة وراء معدلات الخطأ العالية في البويضات ، فإن معظم معرفتنا حول تنظيم أحداث الطور الأول تأتي من دراسات الانقسام الاختزالي للذكور. نظرا لأن جزءا صغيرا من مادة الخصية البالغة يوفر مادة كافية لتقييم جميع مراحل الخلايا الجرثومية الانتصافية وما بعد الانتصافي ، فقد كان الانقسام الاختزالي الذكري في متناول الباحثين منذ فترة طويلة. في المقابل ، يحدث الانقسام الاختزالي الأنثوي بطريقة متقطعة. في الفئران ، تتقدم الطور الأول بشكل شبه متزامن في مبيض الجنين ، بدءا من حوالي 14 يوما بعد الجماع (dpc; الشكل 1 أ) ، بعد فترة وجيزة من تحديد جنس الغددالتناسلية 18،19،20. في وقت قريب من الولادة ، تدخل البويضات في توقف الإملاء حتى أشهر الإباضة (في الفئران) أو عقود (في البشر) بعد21،22،23. وبالتالي ، لا يمكن الوصول إلى مراحل الطور الأول المحددة إلا خلال النوافذ التنموية المحدودة (الشكل 1 أ) ، مع حدوث أحداث ما بعد الطور الأول في عدد قليل من البويضات في وقت واحد في الأحداث والبالغين. على الرغم من أن التقدم التقني قد حسن دراسات الانقسام الاختزالي في بويضات الثدييات ، إلا أن هذه الأساليب لا تزال صعبة وتستغرق وقتا طويلا مقارنة بالتقنيات المماثلة المستخدمة في دراسات الذكور.

يزداد التحليل الانتصافي الأنثوي تعقيدا بسبب القيود في بويضات الباشيتين الفرعية - وهو أمر بالغ الأهمية لدراسة تعيين التقاطع والنضج. تستفيد دراسات الذكور من ديناميكيات إقران الكروموسوم الجنسي المميزة جيدا ووجود متغير هيستون ، H1t ، والتي تعمل كعلامات للباتشينيما المبكرة والمتوسطة والمتأخرة24،25،26. ومع ذلك ، لم يتم إضفاء الطابع الرسمي على أي طريقة موثوقة لبويضات الباشيتين الفرعية.

تسهل البروتوكولات المعروضة هنا تحليلا شاملا للتشابك العصبي وإعادة التركيب في بويضات الفئران من الطور الأول المبكر حتى الطور الأول. يعتمد هذا العمل على تقنيات نشر الكروموسوم الكلاسيكية التي طورها Peters et al.27 و Tarkowski28 والتحسينات السابقة لتلك الأساليب بواسطة Hunt29 و Sun and Cohen30. تم تطوير هذا البروتوكول للتأكيد: 1) إثراء وتحديد مراحل فرعية محددة من الطور الأول ، 2) تعظيم عدد التطبيقات التي يتم إجراؤها لكل زوج من مبيض الجنين ، و 3) مقاييس شاملة ويمكن الوصول إليها لتقييم عيوب المشبك وإعادة التركيب من البؤر إلى chiasmata.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع مناولة وإجراءاتها بعد موافقة لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كورنيل (IACUC) بموجب البروتوكول 2004-0063.

1. تحضير الطور الأولي للبويضة شريحة انتشار الكروموسوم

  1. في وقت متأخر من بعد الظهر ، قم بإعداد تزاوج موقوت لإناث الفئران C57BL / 6J (2-6 أشهر) مع الذكور (2-12 شهرا). ابتداء من اليوم التالي ، افحص الإناث كل صباح (قبل الساعة 9 صباحا) بحثا عن سدادة جماعية. يتم تعريف ظهر يوم القابس على أنه 0.5 نقطة في المواني.
  2. جهزي ما يلي قبل التضحية بالفئران الحامل.
    1. قم بإعداد غرفة رطبة بدرجة حرارة الغرفة H2O.
    2. تحضير 10 مل من مخزن الاستخراج المنخفض التوتر (HEB ؛ انظر الجدول 1) يتكون من 30 ملي مولار Tris-HCl ، و 50 ملي مولار من السكروز ، و 17 ملي سترات الصوديوم ، و 5 ملي مولار EDTA ، و 2.5 ملي مولار DTT ، و 0.5 ملي مولار PMSF في ماء Milli-Q. قبل إضافة DTT و PMSF ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.2 - 8.4 باستخدام 50 ملي مولار من حمض البوريك. اجعل HEB طازجا واستخدمه في غضون ساعتين من إضافة DTT.
    3. تحضير 100 ملي من السكروز بإضافة 342 مجم من السكروز إلى 10 مل من H2O. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستخدام.
    4. سخن H2O فائق النقاء في ميكروويف قياسي لمدة 1 دقيقة (حتى 90 - 95 درجة مئوية). تحت غطاء الدخان ، أضف H2O الساخن عالي النقاء إلى 0.5 جم من بارافورمالدهيد (PFA). أضف قطرتين من 1 N هيدروكسيد الصوديوم ، دوامة للخلط ، واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة. اضبط الرقم الهيدروجيني على 9.2 - 9.3 باستخدام 50 ملي مولار من حمض البوريك وأضف Triton X-100 إلى 0.15٪ (حجم / حجم). أضف H2O فائق النقاء إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل (محلول مثبت PFA 1٪) واسكب المثبت في وعاء تلطيخ زجاجي سعة 50 مل.
      ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام الماء القريب من الغليان لإعداد PFA. ومع ذلك ، فإن تسخين PFA في محلول أعلى من 65 درجة مئوية قد يتسبب في تدهور وإطلاق أبخرة سامة. بدلا من ذلك ، قم بتسخين H2O فائق النقاء إلى 60 درجة مئوية في حمام مائي.
    5. تنظيف المجهر الزجاجي ينزلق مع 70٪ الإيثانول. استخدم قلم PAP حاجز كاره للماء لرسم ما يصل إلى ثلاثة مربعات (حوالي 20 × 20 مم ؛ انظر الشكل 1 ه). سيوفر زوج واحد من المبايض مادة كافية لستة مربعات (أو شريحتين من 3 مربعات ، لكل منهما).
  3. التضحية بالفئران الحامل 14.5 - 18.5 نقطة في الثانية بواسطة ثاني أكسيد الكربون الاختناق وخلع عنق الرحم وفقا لإرشادات IACUC.
    1. تم توضيح النقاط الزمنية لتخصيب مراحل محددة من الطور الأول في الفئران C57BL / 6J في الشكل 1 أ. بالنسبة للنقاط الزمنية التنموية المحددة ، تم توفير النسبة المئوية التقريبية للبويضات في كل مرحلة من مراحل الطور الأول باستخدام بيانات من Evans et al. (1982) 31. بالنسبة لبويضات البيضات الملقحة ، اجمعها على 16.5 نقطة في الملقى ؛ باتشيتين المبكر على 17.5 نقطة في المواني. ومنتصف باتشيتين - ديبلوتين عند 18.5 نقطة في البوصة.
  4. استخدم مقص التشريح لفتح تجويف البطن وإزالة قرون الرحم.
  5. تشريح الفئران الجنينية من قرن الرحم والأنسجة المتساقطة وكيس الصفار. ضع فئران الجنين في طبق بتري 100 مم مع محلول ملحي عازل للفوسفات 1x (PBS).
  6. تشريح المبايض من أنثى جنين واحدة في كل مرة مع الحفاظ على الباقي في 1x PBS. التضحية بفئران الجنين بقطع الرأس وفقا لإرشادات IACUC. باستخدام دبابيس عينة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، قم بتأمين السطح البطني للجذع حتى وسادة السيليكون في طبق تشريح.
  7. استخدم مقص التشريح المجهري لعمل شق في البطن أسفل السرة مباشرة ، مع الحرص على تجنب شق الشرايين. استخدم ملقطا دقيقا لإزاحة الأمعاء حتى تظهر قرون الرحم الجنينية.
  8. لتحديد موقع المبايض، اتبع كل قرن رحمي للخارج من المثانة باتجاه الكلى. سيظهر المبيض وقناة البيض كهياكل كروية صغيرة في نهاية قرون الرحم ، الواقعة أسفل الكلى مباشرة وبالقرب من الجزء الخلفي من التجويف البريتوني (الشكل 1 ب).
  9. استخدم ملقطا دقيقا لقرص المبايض وجمعها في كوب ساعة صغير مملوء ب 750 ميكرولتر من 1x PBS.
  10. قم بتشريح المبيض من الأنسجة المحيطة وضع كلا المبيضين في زجاج ساعة يحتوي على 750 ميكرولتر من HEB ، مع الحرص على التأكد من غمر المبايض بالكامل (انظر الشكل 1C و 1D). احتضان المبايض لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. ماصة 35 ميكرولتر من 100 ملي مولار سكروز على شريحة تقعر. استخدم ملقطا دقيقا لنقل كلا المبيضين من HEB إلى السكروز.
  12. استخدم إبرة 25G لتأمين المبيض على الشريحة أثناء استخدام إبرة ثانية ، شطبة لأسفل ، للضغط على البويضات من المبيض.
    1. عندما يصبح المبيض شفافا وشبيه بالهلام ، قم بإزالة المبيض من HEB وكرر العملية مع المبيض الثاني. ماصة المحلول برفق لتفريق الخلايا.
  13. اغمس الشريحة في جرة تلطيخ Coplin الخاصة ب PFA وامسحها لفترة وجيزة على حافة الشريحة على منشفة ورقية. بمجرد جمع PFA في قطرات صغيرة على طول الحدود الكارهة للماء لكل مربع (الشكل 1E) ، قم بوضع 5 ميكرولتر من محلول البويضة والسكروز في كل قطرة من PFA.
  14. انشر البويضات على الأقسام المربعة عن طريق إمالة الشرائح برفق للخلف وللخلف. احرص على عدم السماح للمحلول من أي مربع واحد بالانسكاب إلى المربعات المجاورة.
  15. ضع الشريحة في غرفة رطبة واستمر في عمل الشرائح حتى ينفد محلول البويضات والسكروز.
  16. كرر الخطوات من 1.6 إلى 1.15 حتى يتم استخدام جميع الأجنة الإناث. احتضان الشرائح في غرفة رطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
  17. بعد الحضانة ، افتح الغرفة الرطبة. نظرا لأن معظم السائل / المثبت (إن لم يكن كله) يجب أن يظل موجودا على سطح الشريحة (حوالي 10 ميكرولتر في كل قسم مربع) ، انقل الشرائح برفق إلى منشفة ورقية ، واترك الشرائح تجف تماما في الهواء في درجة حرارة الغرفة على مقعد المختبر (تستغرق هذه العملية عادة من 30 إلى 60 دقيقة ، اعتمادا على الرطوبة المحلية).
    ملاحظة: يمكن أيضا تجفيف الشرائح بالهواء تحت غطاء الدخان للتخفيف من التعرض المحتمل لأبخرة PFA المتبقية. سيؤدي ذلك أيضا إلى تقصير التجفيف إلى ما يقرب من 20 - 30 دقيقة.
  18. اغسل الشرائح في عامل ترطيب 0.4٪ في H2O فائق النقاء لمدة دقيقتين. اترك الشرائح تجف تماما.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية ؛ ومع ذلك ، فإن بعض الحلقات غير مستقرة (على سبيل المثال ، في تجربتنا ، بقع MLH1 بشكل سيئ ، وتلوين SYCP3 له قطع أثرية كبيرة بعد التجميد). ينصح بشدة بأن تكون الشرائح ملطخة مناعية على الفور.

2. تلطيخ التألق المناعي لكروموسوم الطور الأول ينتشر

  1. قم بإعداد 10x مخزن مؤقت لتخفيف الأجسام المضادة (ADB ؛ انظر الجدول 2) يحتوي على 10٪ (v / v) مصل الماعز العادي ، و 3٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) ، و 0.05٪ Triton X-100 في 1x PBS. قم بتعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  2. اغسل الشرائح في وعاء تلطيخ Coplin من عامل ترطيب 0.4٪ في 1x PBS لمدة 10 دقائق. اغسل الشرائح في وعاء تلطيخ Coplin بنسبة 0.1٪ Triton X-100 في 1x PBS لمدة 10 دقائق. قم بحظر الشرائح في وعاء تلطيخ Coplin من 1x ADB لمدة 10 دقائق.
  3. تمييع الأجسام المضادة الأولية المختارة في 10x ADB (انظر جدول المواد للحصول على قائمة الأجسام المضادة والتخفيفات الخاصة بها).
    1. إعداد أربع مجموعات من الأجسام المضادة للتلوين المناعي المتعدد: (1) SYCP332،33 ، SYCP133 ، HORMAD133 ؛ (2) SYCP332،33 ، RAD5132،33 ، MLH332 ؛ (3) SYCP332،33 ، MSH432 ، MLH332 ؛ و (4) SYCP334 ، MLH132،33،34 ، CREST35.
  4. قم بإزالة الشرائح من ADB ، وتخلص من السوائل الزائدة ، وضع الشرائح في غرفة رطبة بماء بدرجة حرارة الغرفة. ضع 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة لكل قسم مربع من كل شريحة ، مع الحرص على عدم تسرب الأجسام المضادة من مربع واحد إلى المربعات المجاورة.
  5. أغلق الغرفة المرطبة واترك الشرائح تحتضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
  6. في صباح اليوم التالي ، افتح الغرفة الرطبة واضغط على الأجسام المضادة المخففة من الشرائح. كرر الخطوة 2.2.
  7. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المختارة في 10x ADB (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، تكون الشرائح والأجسام المضادة حساسة للضوء. أكمل جميع الحضانات اللاحقة في الظلام.
  8. قم بإزالة الشرائح من ADB ، وتخلص من السوائل الزائدة ، وضع الشرائح في غرفة رطبة من الماء بدرجة حرارة الغرفة. ضع 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخففة المختارة لكل قسم مربع من كل شريحة ، مع الحرص على عدم تسرب الأجسام المضادة من مربع واحد إلى المربعات المجاورة.
  9. أغلق الغرفة المرطبة واترك الشرائح تحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.
  10. اغسل الشرائح 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها في برطمانات تلطيخ Coplin من عامل ترطيب 0.4٪ في 1x PBS. اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في وعاء تلطيخ كوبلين من عامل ترطيب 0.4٪ في H2O فائق النقاء.
  11. ضع قطرة صغيرة (حوالي 10 ميكرولتر) من وسائط التثبيت المضادة للبهتان مع 4 بوصات أو 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) أو ما يعادلها من صبغة الحمض النووي. ضع غطاء زجاجيا مقاس 60 مم × 24 مم رقم 1.5 على كل شريحة وامسح السائل الزائد بعناية.
    ملاحظة: يمكن إغلاق الشرائح إما بطلاء أظافر شفاف أو أسمنت مطاطي. في حالة استخدام حامل المعالجة ، فإن إغلاق الشرائح غير ضروري. يجب تخزين الشرائح في صندوق شرائح أو مجلد عند 4 درجات مئوية. على الرغم من أنه من الأفضل تصوير الشرائح بعد فترة وجيزة من التلوين ، إلا أن الشرائح المخزنة في الظلام عند 4 درجات مئوية يمكن أن تحتفظ بكثافة الإشارة لعدة أشهر إلى عام. للتخزين على المدى الطويل ، يمكن الاحتفاظ بالشرائح عند -20 درجة مئوية لعدة سنوات دون فقدان كبير لجودة الإشارة.
  12. صور الخلايا عند 63x باستخدام الفحص المجهري epifluorescence (انظر جدول المواد). استخدم برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال ، Zen of ImageJ ، انظر جدول المواد) لقياس طول SC وشدة التألق لجميع القنوات على طول المحور. تتبع طول كل محور كروموسوم (SYCP3) ، بدءا من السنترومير (منطقة CREST أو DAPI الكثيفة).
    1. لتحليل HORMAD1 و SYCP1 ، سجل أطوال قمم إشارة التألق. احسب الأطوال الإجمالية لقمم HORMAD1 أو SYCP1 واقسمها على طول محور الكروموسوم.
    2. لتحليل MSH4 ، حدد عدد قمم إشارة التألق لكل قياس ل SYCP3. سجل كلا من العدد الإجمالي لقمم MSH4 لكل نواة وعدد قمم MSH4 المتداخلة مع قمم MLH3. تأكيد تعداد MSH4 من خلال مقارنة القمم بعدد البؤر المقابلة.

3. الاستعدادات الدياكينية / الطور الأولي لمراقبة chiasmata

  1. لتعظيم غلة البويضات المختصة انتصالا ، استخدم إناث الفئران الصغيرة (25-28 يوما).
    ملاحظة: يمكن إجراء التحفيز عن طريق حقن إناث الفئران داخل الصفاق ب 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المصلية للفرس الحامل (PMSG) قبل 48 ساعة من جمع البويضات لتعزيز المحصول. ومع ذلك ، لأغراض تحليلات chiasmata ، يمكن جمع بويضات الحويصلة الجرثومية (GV) كافية من الإناث غير المحفزة.
  2. قبل التضحية بالفئران ، قم بإعداد الكواشف والحلول التالية.
    1. اسمح ل M2 (3 مل لكل فأر) و KSOM (1 مل لكل فأر) بالتوازن في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2) لمدة ساعة واحدة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن وضع أنابيب الوسائط المجمدة في الحاضنة مع فك أغطيتها في المساء السابق لجمع البويضات ، مما يسمح بحوالي 14 ساعة من التوازن.
    2. تحضير وسائط M2 باستخدام 2.5 ميكرومتر ميلرينون (مثبط إيزونزيم فوسفوديستراز يمنع استئناف الانتصاف)36. ماصة خمس قطرات سعة 20 ميكرولتر من M2 + ميلرينون في طبق بتري مقاس 35 مم وتغطيتها بزيت معدني خفيف (الشكل 2 ج).
    3. تسقط الماصة الخامسة سعة 20 ميكرولتر KSOM في طبق بتري مقاس 35 مم وتغطى بزيت معدني خفيف (الشكل 2C).
      تنبيه: يعد التحكم في درجة الحرارة ودرجة الحموضة أمرا بالغ الأهمية لنضج البويضات في المختبر. يجب أن يتم جمع البويضات على سطح منضدة ساخن (37 درجة مئوية). يجب الاحتفاظ بجميع الوسائط في الحاضنة حتى يتم استخدامها ، ويجب إزالة أطباق الوسائط واحدة تلو الأخرى للحد من الاضطراب الناجم عن التعرض للهواء المحيط.
    4. نظف شرائح المجهر الزجاجي بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تجف في الهواء. على الجزء الخلفي من شرائح المجهر الزجاجي ، قم بتسجيل برفق (بقلم طرف ماسي) أو ارسم (بحبر مقاوم للماء) شبكة 5 × 5 من مربعات ~ 4 مم × 4 مم (يظهر مثال في الشكل 2 ب ويمكن استخدامه لتتبع الشبكة).
  3. اجمع البويضات من فأر واحد في كل مرة. التضحية بأنثى الفأر عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون2 وخلع عنق الرحم وفقا لإرشادات IACUC.
  4. استخدم مقص التشريح لفتح تجويف البطن. استخدم ملقطا دقيقا لإزاحة الأمعاء.
  5. اتبع كل قرن رحم من المثانة باتجاه الكلى. سوف يرتبط المبايض وقنوات البيض بقطعة دهون صغيرة بالقرب من الكلى.
  6. استخدم مقص التشريح المجهري لإزالة المبايض ووضعها في وسائط M2 الغازية مع الميلرينون.
  7. استخدم مقص التشريح المجهري لإزالة جميع الدهون والأنسجة الأخرى (بما في ذلك الجراب) من المبايض. استخدم إبر 25G لتمزيق البصيلات الجانبية.
  8. استخدم ماصة نقل لنشر البويضات في M2 + milrinone في طبقة رقيقة في طبق بتري مقاس 100 مم ، مع الحرص على عدم ترك الوسائط تلمس جوانب الطبق (الشكل 2 ج).
  9. استخدم مجهر تشريح (تكبير 25x - 50x) لتصور بويضات GV (الشكل 2F). قد ترتبط البويضات GV بالخلايا الركامية في مركب البويضات الركامية (COC). قم بإزالة الخلايا الركامية مع سحب العينة المتكرر.
  10. اجمع البويضات الإجمالية باستخدام ماصة زجاجية تعمل بالفم (قطر 100-150 ميكرومتر؛ الشكل 2 أ). انقل البويضات الإجمالية إلى قطرة 20 ميكرولتر من M2 + ميلرينون مغطاة بزيت معدني خفيف (الشكل 2 ج). لا تضع أكثر من 30 بويضة في قطرة واحدة.
  11. عندما يتم جمع جميع البويضات الإجمالية ، قم بتمريرها عبر قطرتين أو ثلاث قطرات سعة 20 ميكرولتر من M2 + milrinone مغطاة بزيت معدني خفيف لإزالة أي خلايا جسدية.
  12. انقل البويضات الإجمالية (بأقل قدر ممكن من الوسائط) إلى قطرة 30 ميكرولتر من KSOM. اغسل الميلرينون عن طريق تمرير البويضات عبر خمس قطرات KSOM (الشكل 2 ج).
  13. انقل جميع البويضات الإجمالية إلى 20 ميكرولتر قطرات من KSOM مغطاة بزيت معدني خفيف ، بحد أقصى 30 بويضة لكل قطرة KSOM (الشكل 2 ج). ضع البويضات في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2).
  14. احتضان البويضات لمدة 5 ساعات تقريبا.
    ملاحظة: انهيار GV (بمناسبة اختفاء الغلاف النووي والاستئناف الانتصافي؛ الشكل 2G) يحدث عادة بعد 2 ساعة في الثقافة ، ولكن قد يختلف معدل نضوج البويضات اعتمادا على سلالة الفأر أو تحفيز الهرمونات. في تجربتنا ، فإن ما مجموعه 5 ساعات في الثقافة يحسن بشكل أفضل من انتشار chiasmata في معظم سلالات الفئران. إذا تركت لتنضج لفترة طويلة جدا ، فقد يحدث الانقسام الانتصافي الأول وبثق الجسم القطبي (الشكل 2H).
  15. انقل 5-10 بويضات (مع أقل قدر ممكن من KSOM) إلى قطرة 30 ميكرولتر من محلول ناقص التوتر (0.9٪ سترات الصوديوم في H2O فائق النقاء). احتضان البويضات في محلول منخفض التوتر لمدة 5 - 10 دقائق.
  16. ماصة قطرة صغيرة (~ 1 ميكرولتر) من الماء المحمض (8 قطرات من حمض الخليك الجليدي في 50 مل من H2O فائق النقاء) على أحد المربعات الموجودة على الشرائح المحضرة (الشكل 2 ب).
  17. استخدم ماصة زجاجية تعمل بالفم بقطر 100 - 150 ميكرومتر لنقل بويضة واحدة بسرعة من قطرة الماء المحمضة. انقل أقل قدر ممكن من محلول نقص التوتر مع البويضة. استخدم نفس الماصة لإزالة بعض السائل حتى تلتصق البويضة بالشريحة.
    ملاحظة: حجم السائل حول البويضة أمر بالغ الأهمية. يجب أن يكون هناك سائل كاف حتى لا تجف البويضة قبل التثبيت ، ولكن ليس لدرجة أن البويضة لا تستطيع الالتصاق بالشريحة.
  18. قم بالتبديل بسرعة إلى طرف ماصة زجاجي بقطر 150 ميكرومتر. أضف قطرة واحدة من مثبت كارنوي الطازج (ثلاثة أجزاء من الميثانول المطلق إلى جزء واحد من حمض الخليك الجليدي) إلى البويضة. اسمح للمثبت بالتشتت فوق الشريحة. يجب أن تبدو البويضة وكأنها تصبح أقل تميزا وتذوب حيث يذوب الحمض من المثبت المنطقة الشفافة وتنفجر الخلايا.
  19. عندما يبدأ الجزء الأمامي من المثبت في الانقباض ، أضف بسرعة 2-3 قطرات أخرى من المثبت. انفخ برفق على الشريحة لتسريع التجفيف.
  20. كرر الخطوات 3.16 - 3.19 مع بويضات إضافية من محلول نقص التوتر.
  21. كرر الخطوات 3.15 - 3.20 حتى يتم إصلاح جميع البويضات. تحقق من انتشار الكروموسومات باستخدام مجهر تباين الطور.
  22. عندما تجف الشريحة تماما في الهواء ، ضع الشريحة في وعاء تلطيخ Coplin مع 50 مل من 4٪ Giemsa (v / v) في ddH2O. ينزلق البقع في Giemsa لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  23. اغسل الشرائح 3 مرات لمدة 3 دقائق لكل منها في ddH2O في درجة حرارة الغرفة. اترك الشرائح تجف تماما.
  24. ضع طبقة رقيقة (~ 60 ميكرولتر) من Permount عبر زلة غطاء زجاجي مقاس 60 مم × 24 مم رقم 1.5. قم بتركيب الشرائح عن طريق قلبها على الغطاء ومسح السوائل الزائدة بعناية. اترك الشرائح تجف طوال الليل قبل التصوير عند 63x على المجال الساطع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم عيوب المشبك في الخلايا الشبيهة بالباشيتين
تقوم هذه التجربة بتقييم عيوب المشبك في بويضات الباشيتين وتراقب تقدم الطور الأول (الشكل 3 أ). يتيح التلوين المناعي ل SYCP3 (عناصر SC المحورية / الجانبية) و SYCP1 (عنصر SC المركزي) و HORMAD1 (محاور الكروموسوم غير المتشابك / غير المشبكي) تقييم التدريج والمشبك. يتزامن HORMAD1 مع SYCP3 أثناء الزيغونما والازدواج (قبل المشابك وبعد إزالة المشبك)37

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بويضات الثدييات معرضة للخطأ بشكل خاص مقارنة بالخلايا المنوية. في حين أن نقطة تفتيش تجميع المغزل الأقل كفاءة للبويضة (SAC) تساهم في هذه الثغرةالأمنية 14،52،53 ، يقترح هاسول وهانت أن الضربات المتعددة تؤدي إلى اختلال الصيغة الصبغية ، مع كون إعادة التركيب المعيبة عاملا أساسيا54. تربط الدراسات البشرية اختلال الصيغة الصبغية بعدم كفاية ضمان التقاطع ووضع التقاطع دون المستوى الأمث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلف أي تعارضات للكشف عنها.

شكر وتقدير

تم توفير تمويل هذا المشروع من خلال جائزة K99 من معهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل ونموه (HD112986 إلى TH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.45 μ مرشح الحقنة mميليبور سيغماSLHAR33SBلصنع الماصة التي تعمل بالفم
0.5 مليون EDTA، الرقم الهيدروجيني 8.0كورنينغ46-034-CI ل HEB
حقنة معقمة بسعة 1 مل مع إبرة عيار 25 و16 ممفيشر ساينتيفك14-817-125 لمشكلة تمزق المبايض
طبق بتري بقياس 100 × 15 ممVWR25384-302 
ماصات باستور الزجاجية البوروسيليكاتية ذات الاستخدام الواحد بقطر 14.6 سمفيشر ساينتيفك13-678-20B لصنع الماصة التي تعمل بالفم
طبق بتري 35 × 10 ممكورنينغ351008
40 مم × 0.45 مم #3 دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ لعلم الحشراتأمازونB0CSSPW5S7لتثبيت الفئران الجنينية للتشريح
حمض الخليك، العصر الجليديفيشر ساينتيفكA38-212لتثبيت كارنوي
تجميعات أنابيب الشفط للماصات الدقيقة المعايرةميليبور سيغماA5177-5EAلصنع الماصة التي تعمل بالفم
ساعة B.P.I. نظارةNDS Technologies 1580-00بدلا من ذلك، استخدم طبق جنين بقطر 30 مم × عمق 12 مم (رمز Electron Microscopy Sciences: 70543-30)
حمض البوريكفيشر ساينتيفكBP168-1لضبط الرقم الهيدروجيني ل HEB وPFA
مصل البقر ألبومينميليبور سيغماA7906-100Gلصالح ADB
خزان ثاني أكسيد الكربونللحاضنة
شرائح المجهر الكورنينغميليبور سيغماCLS294875X25طول × عرض 75 مم × 25 مم، جانب واحد مغطى بالصماء
شرائح المجهر الكورنينغ، جانب واحد مغطى بالصقيعة، وطرف واحدVWR294875X25
غطاء زجاجي مستطيل. 60 × 24 مم، #1.5VWR48393-251
طبق التشريحعلوم المجهر الإلكتروني70540
مجهر التشريحأي نموذج قياسي
مقص التشريح، طرف حاد، 4.5"VWR82027-578
ملقط حاد ودقيق جداVWR76548-836
جيمسا ستينميليبور سيغماGS500-500لتلوين حوامل الكياسماتا
قلم ImmEdge للحاجز الكاره للماء PAPمختبرات فيكتورH-4000
الحاضنةأي نموذج قياسي مزود بتقنية تغليف CO2 والماء
محطة عمل أطفال صناعيكي-سيستمزأي موديل يحتوي على سطح طاولة مدفأة
حل كوداك فوتو-فلو 200BH Photo & الفيديو1464510لغسيل الشرائح
الميثانولفيشر ساينتيفكA412-4لتثبيت كارنوي
جرة تلوين كوبلين من MP Biomedicalsفيشر ساينتيفكICN17006201
مصل الماعز العاديجيبكو16210-072لصالح ADB
بارافورمالديهايد، درجة EM، بريل منقىعلوم المجهر الإلكتروني19200
بيرمونتفيشر ساينتيفكSP15-100for  تركيب شرائح لنشر الكياسماتا
تركيب مضاد التلاشي الزجاجي ProLong مع صبغة NucBlueثيرمو ساينتفيكP36985لتركيب شرائح مصبوغة بالمناعة
أنبوب السيليكون، القطر الداخلي: 0.125"، القطر الخارجي: 0.25"VWR89068-474لصنع الماصة التي تعمل بالفم
سترات الصوديوم ديهيدراتفيشر ساينتيفكS279-500بالنسبة ل HEB، المحلول الهيبوتوني
نظام صبغ الشرائح من StainTrayعلوم المجهر الإلكتروني71396-Bللاستخدام كغرفة رطبة. يجب استخدام الغطاء الأسود لتلوين الفلورة المناعية. قد تبطين أسفل صندوق منزلق معتم أو أواني تابر باستخدام مناديل ورقية مبللة لاستخدامها كغرفة رطبة.
نصائح للراقصات - 100كوبر سريجكالMXL3-100للماصة التي تعمل بالفم
نصائح للراقصات - 150كوبر سريجكالMXL3-150للماصة التي تعمل بالفم
سكروزميليبور سيغماS-8501بالنسبة ل HEB، محلول السكروز هيبوتوني
قاعدة تريسفيشر ساينتيفكBP152-5ل HEB
ترايتون X-100فيشر ساينتيفكBP151-100 بالنسبة ل PFA وADB وTriton-PBS
جرة تلوين كوبلين من يونايتد ساينتيفيكفيشر ساينتيفكS17495Aبلاستيك أبيض معتم للغسيل وسحب الشرائح بعد إضافة الأجسام المضادة الثانوية الحساسة للضوء
شرائح الزجاج السايفكي المتحدةفيشر ساينتيفكS139533سمك 1.3 مم، عدد بئرين
فاناس ميكروديسيكشر مقص 5 مم مستقيمVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2، Colibri 7كارل زايس000000-2624-307
برنامج Zen Blue 3.11كارل زايسبرامج اكتساب الصور وتحليلها
الأجسام المضادة
أليكسا فلور 488 أفيني بيور F(ab')؟ Fragment Goat Anti-Mouse IgG، خاصة بجزء Fcمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية.115-546-071تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
أليكسا فلور 488 أفيني بيور F(ab')؟ شظايا الماعز المضادة للأرانب IgG، Fc نوع من شظايا محددةمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية.111-546-046تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
أليكسا فلور 647 أفيني بيور F(ab')؟ ماعز شظايا مضاد للبشر، IgG، FC&جاما؛ نوع الأجزاء المحددةمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية.109-606-170تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Pig IgG، مقطع محددمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية.106-605-008تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
خنازير غينيا المضادة ل MLH3 pAbمصنوع خصيصا باستخدام ثيرمو-فيشر، ويستخدم تخفيف بنسبة 1:500
غينيا بيغ ضد SYCP1 pAbمن كريستر ه&أومل؛ ö g (كوزنتسوفا وآخرون 2005)، استخدم تخفيف 1:200
بروتينات مضادة للسنترومير البشري pABAntibodies Inc.15-234تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
ماوس مضاد ل-MLH1 mAbبكالوريوس العلوم الحيوية550838تم استخدام تخفيف بنسبة 1:100
ماوس ضد SYCP3 mAbأبكامab97672تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
رابيت ضد HORMAD1 pAbبروتين تك13917-1-APتم استخدام تخفيف 1:500
جهاز الأرنب المضاد ل MSH4 pAbأبكلونالA8556تم استخدام تخفيف بنسبة 1:100
جهاز الأرنب المضاد لRAD51 pAbميليبورPC130تم استخدام تخفيف 1:500
جهاز الأرنب المضاد ل SYCP3 pAbأبكامab15093تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
رودامين ريد-إكس (RRX) أفيني بيور F(ab')؟ Fragment Goat Anti-Mouse IgG، خاصة بجزء Fcمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية.115-296-071تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000
رودامين ريد-إكس (RRX) أفيني بيور F(ab')؟ شظايا الماعز المضادة للأرانب IgG، Fc نوع من شظايا محددةمختبرات جاكسون للأبحاث المناعية.111-296-046تم استخدام تخفيف بنسبة 1:1,000

المراجع

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحضير انتشار الكروموسوم الانتصافي من بويضات الفئران لتقييم التشابك وإعادة التركيب
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.