مقالة منهجية

تطوير الخطوط العضوية المشتقة من الفئران من الخلايا الظهارية لقناة فالوب لنمذجة سرطان المبيض المصلي عالي الجودة

DOI:

10.3791/68753

⸱

أغسطس 6, 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل تطوير نماذج الفئران المصلية عالية الجودة لسرطان المبيض المصلي (HGSOC) في المختبر وفي الجسم الحي. من اشتقاق عضيات قناة فالوب الفئران ، وتعديلها الجيني لتلخيص علم الوراثة البشرية HGSOC ، وإدخالها في الجراب المبيضي للفئران المتجانسة لتطور الأورام في الجسم الحي .

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد النمذجة الفعالة للأمراض في بيئات واقعية أمرا بالغ الأهمية لتحسين فهمنا للأمراض المتنوعة. في هذا الجانب ، توفر العضيات بيئة أكثر إخلاصا من نظيراتها الكلاسيكية ثنائية الأبعاد في المختبر. وبالمثل ، تسمح نماذج الفئران المتزاهرة أيضا للباحثين بالتحقيق في تفاعلات أكثر اكتمالا بين الورم والمضيف ، كما هو الحال مع الجهاز المناعي ، في الجسم الحي. نقدم هنا بروتوكولا كاملا حول استخراج الخلايا الظهارية لقناة فالوب ، وهي خلية المنشأ لسرطان المبيض المصلي عالي الجودة (HGSOC) ، من الفأر واشتقاقها كثقافات عضوية أولية ، بالإضافة إلى زراعتها في المختبر وصيانتها. بعد ذلك ، نصف كيفية استخدام تقنيات الهندسة الوراثية ، مثل الإفراط في التعبير عن الجينات الفيروسية أو الفيروسية القهقرية ، بالإضافة إلى حذف جين CRISPR-Cas9 ، لتعديل هذه الخطوط وتحويلها إلى أورام ما قبل سرطانية. نبلغ أيضا عن كيفية استخدامها للتحقق من الصحة في المختبر ، عن طريق استخراج المواد الوراثية وتلوين التألق المناعي. أخيرا ، نشير إلى كيفية حقن هذه الأورام بشكل فعال في الجراب المبيضي ، وهو الموقع الأصلي ل HGSOC ، لبدء الورم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يزال سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) مرضا غير مفهوم جيدا ومميت للغاية. تاريخيا ، كان الافتقار إلى نماذج المؤمنين في المختبر وفي الجسم الحي التي تمثل بيولوجيا HGSOC والاستجابة العلاجية عائقا رئيسيا أمام التقدم. على سبيل المثال ، استخدمت دراسات متعددة (إن لم يكن معظمها) خطوط الخلايا التي تفشل في مشاركة السمات الجينومية / الجينية الرئيسية ل HGSOC ، مما يجعل أهمية النتائج التي توصلوا إليهامشكوك فيها 1،2،3،4. على سبيل المثال ، نموذج الفأر المتزابقي ID8 الشائع مشتق من ظهارة سطح المبيض (OSE) وهو Trp53-wild type5. على النقيض من ذلك ، ينشأ معظم HGSOC إن لم يكن كله في ظهارة قناة فالوب (FTE) 6 ، و HGSOC هو TP53 متحولة عالميا تقريبا أو صامتة7. حاول الباحثون منذ ذلك الحين تصحيح هذا الخط من خلال دمج طفرات Trp53 فيه5 ، ولكن نظرا لأن طفرة Trp53 هي حدث مبكر في التسبب في التسبب في HGSOC ، فمن المحتمل أن يأتي هذا التعديل بعد فوات الأوان في تحويل هذا الخط الخلوي ومن المحتمل ألا يمثل تطور HGSOC الطبيعي.

على مدى العقد الماضي ، بذلت محاولات لتصحيح هذا الوضع من خلال إنشاء نماذج أكثر واقعية ل HGSOC. على سبيل المثال ، تسمح نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEMMs) التي تؤوي طفرات ذات صلة على خلايا سلالة Müllerian-tract ، غالبا تحت نظام Cre-recombinase للسيطرة على التسبب في المرض ، للباحثين بتقليد المرض بشكل أفضل في الجسم الحي8،9،10. لسوء الحظ ، غالبا ما تكون هذه النماذج معقدة في الإنشاء ، وقد يكون لها مشكلات أخرى مثل تسرب Cre أو Cre-effect أو "تأثيرات المجال" 11،12،13. في هذا الصدد ، يبدو أن النماذج العضوية المتزامنة تمثل حلا وسطا قويا للباحثين الذين يرغبون في تقليد المرض بشكل أفضل في المختبر وفي الجسمالحي 14،15،16،17،18،19. في الواقع ، في حين أن معظم نماذج HGSOC المتاحة والمستخدمة في الوقت الحالي هي نماذج ثنائية الأبعاد ، إلا أنها للأسف لا يمكنها محاكاة تعقيد المصفوفة خارج الخلية (ECM) بشكل صحيح ، وهو عنصر حاسم يؤثر على بيولوجيا الخلية. العضيات هي أنسجة ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم ، غالبا ما يتم إنشاؤها من الخلايا الجذعية ، والتي يمكن أن تعيد إنشاء التعقيد الهيكلي والوظيفي المبكر لعضو في طبق بتري20. يعمل توليدها عادة عن طريق تعليق الخلايا المفردة ، وهي متعددة القدرات ، في مصفوفة غشاء القاعدية (BMM) ، مثل Matrigel21. في المختبر ، تكون هذه النماذج أكثر دقة نسبيا في تلخيص الظروف في الجسم الحي من النماذج ثنائية الأبعاد. وبالمثل ، نظرا لطبيعتها المتجانسة ، فإن هذه النماذج قادرة على زرعها في فأر بجهاز مناعي يعمل بكامل طاقته ، مما يسمح بإعادة بناء أكثر إخلاصا للتسبب في المرض والتنمية14،15. هذه ميزة واضحة على الطعوم الغريبة المشتقة من المريض ، والتي ، على الرغم من امتلاكها لعلم الوراثة الأكثر واقعية للورم ، تتطلب النقش في نماذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة.

في هذا البروتوكول ، نصف كيفية تطوير نماذج عضوية HGSOC مترابطة. من توليد الثقافة العضوية الأصلية من النوع البري FTE المستخرجة من الفأر ، وهندستها الوراثية لتوليد أنماط وراثية مستنيرة بالأمراض ، إلى زرعها أخيرا مرة أخرى في الجراب المبيضي لتوليد أورام كاملة التطور. قمنا أيضا بتضمين بعض البروتوكولات الإضافية للمساعدة في التجارب الشائعة ، مثل تلطيخ التألق المناعي (IF) للعضيات في المختبر ، والتحويل ثنائي الأبعاد لخطوط الخلايا لإنتاج الخلايا على نطاق واسع ، مثل الحقن. يستهدف هذا البروتوكول الباحثين الذين يرغبون في تطوير نماذج متجانسة عضوية ل HGSOC مع التحكم في تركيبتهم الجينية ، مع نية خاصة لدراسة بيولوجيا HGSOC في ظروف أكثر واقعية في المختبر بالإضافة إلى التفاعلات الموجودة في البيئة المكروية للورم في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع عمليات جمع الأنسجة الحيوانية وإجراءاتها بشكل أخلاقي تحت موافقة اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في مركز الإسكندرية لعلوم الحياة ومركز بيرلموتر للسرطان في جامعة نيويورك لانجون هيلث ، نيويورك ، نيويورك.

1. تحضير المواد

  1. تحضير الوسائط العضوية الفئران (MOM)
    1. قم بإعداد الوسط القاعدي من خلال الجمع بين العناصر الموجودة في الجدول 1.
      ملاحظة: الوسائط مستقرة لمدة تصل إلى شهر عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الوسائط ثنائية الأبعاد
    1. يمزج بين الفئران المؤتلف EGF 50 نانوغرام / مل ، الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (التركيزات النهائية 10 مجم / لتر الأنسولين ، 5.5 مجم / لتر ترانسفيرين ، 6.7 ميكروغرام / لتر) ، 3٪ مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة (FBS) ، والبنسلين - الستربتومايسين (100 وحدة / مل) ، في DMEM (مع البيروفات والجلوكوز العالي).
  3. تحضير مزيج الهضم
    1. اجمع بين الكولاجيناز / الهيالورونيداز (3000 وحدة / مل كولاجيناز ، 1000 وحدة / مل هيالورونيداز) مع DMEM (مع البيروفات والجلوكوز العالي) بنسبة 1:10. قم بإعداد 1 مل من الحصص في أنابيب دقيقة سعة 1.5 مل. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج.
    2. قم بإعداد حصص أحادية الاستخدام من DNAse I (10,000 وحدة / مل) و Dispase (5 U / mL).
    3. بمجرد إذابة كمية من الكولاجيناز / الهيالورونيداز في DMEM ، أضف DNAseI (10 ميكرولتر ، 100 وحدة) و Dispase (25 ميكرولتر ، 0.1 وحدة).
      ملاحظة: محلول الهضم هذا مفيد أيضا لهضم ما يصل إلى 0.5 غرام من الورم.
  4. التعامل مع BMM
    1. قم بتخزين BMM عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل. لتجنب ذوبان الجسم بالتجميد ، قم بإعداد 1 مل من الحصص في أنابيب سعة 1.5 مل. قم بإذابة الكمية عن طريق وضعها على الجليد لمدة ساعتين ، أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: سوف تصلب BMM في درجة حرارة الغرفة (RT). لذلك ، يوصى دائما بإبقاء أنبوب BMM على الجليد أو على رف أنبوب بارد. استخدم أطراف الماصة التي تم تبريدها مسبقا في فريزر -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.

2. عزل الخلايا من FTE للفأر

  1. قم بإذابة كمية من BMM ، وإنزيم TrypLE Express الدافئ مسبقا ، ولوحة 24 بئرا عند 37 درجة مئوية (قم بتخزين اللوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة للحصول على أفضل النتائج). بعد ذلك ، قم بإعداد منطقة التشغيل: أدوات لتشريح وتنظيف الأنسجة على مجهر التشريح ، ولوحة مع PBS + P / S بارد ، ومزيج الهضم الدافئ.
  2. القتل الرحيم لإناث الفئران C57BL / 6J عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون. إجراء طريقة القتل الرحيم الثانوي (خلع عنق الرحم) كما هو مطلوب من قبل IACUC.
  3. قم بتشريح وإزالة المبيض وقناة فالوب ونقلهما إلى طبق بتري معقم يحتوي على DMEM + PS عند 4 درجات مئوية. باستخدام مجهر تشريح ، تقوم مجموعة دقيقة من الملقط والمقص بإزالة الكمية المتبقية من الدهون من المبيض وعزل قناة فالوب (إنفونديبولوم وجزء من الأمبولا البعيدة) من المبيض والرحم.
    ملاحظة: احرص على تجنب لمس أي من جلد الفأر أو شعره بالأدوات لمنع التلوث الميكروبي.
  4. انقل الأنسجة إلى الأنبوب الذي يحتوي على مزيج الهضم الكامل واستخدم مقصا ناعما لفرم قناة فالوب إلى قطع صغيرة (<0.5 مم). احتضن لمدة 40-50 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. بعد التفكك ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية. أضف 500 ميكرولتر من TrypLE Express الدافئ مسبقا. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. قم بإخماد التربسين باستخدام 500 ميكرولتر من 3٪ FBS في DMEM (وسائط ثنائية الأبعاد). صفي الخليط من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب دقيق جديد. تدور لمدة 5 دقائق عند 350 جم وتخلص من المادة الطافية.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية (بالكاد مرئية اعتمادا على عدد FTs المستخدمة) في 12.5 ميكرولتر من وسائط الفئران العضوية واحتضانها لفترة وجيزة على الجليد. تخلط مع 37.5 ميكرولتر من BMM المثلجة وتزرع الحجم الكامل (50 ميكرولتر) في قاع بئر من صفيحة 24 بئرا مسخنة مسبقا.
  8. ضع اللوحة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل ، ولكن ليس أكثر من 48 ساعة ، لضبط BMM. احرص على عدم إزعاج القباب عند نقل اللوحة إلى الحاضنة.
  9. أضف 500 ميكرولتر من MOM الدافئ مسبقا إلى كل بئر عن طريق سحب الوسط برفق أسفل جانب البئر. لا تقم أبدا بإضافة الوسائط مباشرة إلى القبة ، لأنها يمكن أن تسبب تلفا أو انفصالا. ضع الغطاء على لوحة الاستزراع واحتضنه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.

3. صيانة العضيات المشتقة من الفئران FTE

  1. تغيير الوسائط
    1. باستخدام طرف معقم غير مفلتر سعة 10 ميكرولتر ، قم بشفط الوسائط من قاع البئر بينما يتم تثبيت اللوحة عند منحدر 45 درجة. إذا انفصلت القبة عن اللوحة ، فقم بشفط الوسائط بعناية من أعلى البئر بينما تكون القبة المنفصلة في الأسفل.
    2. أضف ببطء 750 ميكرولتر من MUM ، مسخنة مسبقا عند 37 درجة مئوية ، مع ضغط الطرف على الجدار الجانبي للبئر.
    3. قم بتغيير الوسائط كل 2 إلى 3 أيام أو حتى يتغير لون الوسائط من الوردي إلى الأصفر. إذا تحولت الوسائط إلى اللون الأصفر بعد أقل من 24 ساعة من تغييرها ، فإن العضيات جاهزة للمرور.
  2. عابرة العضيات
    1. قم بإزالة الوسائط وغسل كل بئر ب 500 ميكرولتر من PBS البارد (4 درجات مئوية). قم بشفط PBS وأضف 500 ميكرولتر من محلول استعادة الخلايا البارد (4 درجات مئوية) مباشرة إلى قبة BMM لإذابتها. استمر في سحب العينات حتى يذوب BMM تماما وانقله إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
    2. ضع الأنبوب على الثلج لمدة 30 دقيقة وأعد اللوحة إلى الحاضنة حتى تظل دافئة. إذا كنت تستخدم طبقا جديدا ، فتأكد من تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
      ملاحظة: إذا كان يمر أكثر من 2 × 50 ميكرولتر من القباب ، كما هو الحال أثناء التوسعات الموضحة أدناه ، فقد يتعين تمديد الحضانة على الجليد لمدة تزيد عن 30 دقيقة للحصول على أفضل النتائج.
    3. جهاز طرد مركزي عند 350 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون شفط الحبيبات واغسلها ب 500 ميكرولتر من PBS البارد. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
      ملاحظة: إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي البارد متوفرا ، اترك الأنبوب يبرد بين عمليات الغسيل عن طريق وضعه على الثلج أو رف بارد.
    4. بعد الغسيل الأخير ، جهاز الطرد المركزي على حرارة 350 جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 500 ميكرولتر من إنزيم TrypLE Express الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية). لتجنب فقدان الخلايا من سحب العينات، اسحب الأنبوب مقابل شبكة فتحة التهوية في شفاط زراعة الأنسجة لتجانس الخلايا.
    5. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تكييف الوقت اعتمادا على النمط الجيني العضوي ووقت المرور ، حيث قد يتطلب البعض التربسين لفترة أطول لإنتاج معلقات أحادية الخلية.
    6. أوقف عملية تفكك الخلايا عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من DMEM + 3٪ HI FBS واخلطها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل حتى يتجانس المحلول.
    7. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وشفط المادة الطافية حتى يتبقى ~ 20 ميكرولتر من الحجم. قم بإزالة المادة الطافية المتبقية يدويا باستخدام ماصة P20 بدلا من شفاط الفراغ ، حيث من الشائع شفط الحبيبات في هذه الخطوة.
    8. أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من البرد (4 درجات مئوية) MOM وقياس تركيز الخلية. قم بإعداد تخفيفات الخلايا حسب الرغبة واحتفظ بها على الجليد. بعد ذلك، امزجه مع BMM المثلج باستخدام أطراف الماصة التي تم تخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية مسبقا.
      ملاحظة: يوصى بإعداد قبتين سعة 50 ميكرولتر عند 2 × 105 خلايا / مل ، حيث تكون نسبة MOM إلى BMM 1: 4. لذلك ، يجب أن يكون لديك ؛ 25 ميكرولتر من الخلايا في MOM عند 8 × 105 خلايا / مل ، و 75 ميكرولتر من BMM ليصبح المجموع 100 ميكرولتر ، مقسمة إلى 2 قبة. مثل هذا ، سوف يزرع المرء بشكل فعال 1 × 104 خلايا لكل قبة.
    9. قم بزرع كل قبة سعة 50 ميكرولتر في منتصف بئر صفيحة 24 بئرا مسخنة مسبقا. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح ل BMM بالتصلب. أضف 500 ميكرولتر من MOM عند 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.1.2 وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
  3. توسع
    1. لتوسيع زراعة الخلايا العضوية إلى صفيحة (دافئة مسبقا) من 6 آبار ، قم بإعداد خمس قباب سعة 50 ميكرولتر عند 8 × 105 خلايا / مل. أعد تعليق الخلايا في إجمالي 62.5 ميكرولتر من MOM واخلطها مع 187.5 ميكرولتر من BMM المثلج وزرع القباب ال 5 في نفس البئر.
    2. انقل اللوحة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة للسماح ل BMM بالتصلب. أضف 2 مل من MOM عند 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.1.2 وأعد اللوحة إلى الحاضنة. قم بتغيير الوسائط حسب الضرورة حتى تتلاقى الخلايا.
      ملاحظة: لجمع الخلايا للمرور ، استخدم 1 مل من محلول استعادة الخلايا بدلا من 500 ميكرولتر ، واحتضانه على الجليد لمدة 45 دقيقة بدلا من 30 دقيقة.
  4. الحفظ بالتبريد
    1. لتخزين العضيات على المدى الطويل ، المرور كما هو موضح في الخطوات 3.2.1-3.2.7. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق 250 ميكرولتر من وسائط التجميد العضوية (80٪ MOM و 10٪ FBS و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) ونقلها إلى أنبوب تبريد. تجميد 1 × 105 خلايا لكل تبريد.
    2. قم بتخزين الأنبوب في وعاء تجميد قارورة مبرد (على سبيل المثال ، السيد فروستي) واتركه يبرد في فريزر -80 درجة مئوية. للتخزين طويل الأجل ، احتفظ بالخلايا في تخزين النيتروجين السائل أو في فريزر -150 درجة مئوية.

4. التعديل الجيني للعضيات المشتقة من الفئران FTE لتطوير خطوط خلوية جديدة

  1. التنبيغ عن طريق التنبيط (العدسي الفيروسي أو الفيروسي القهقري)
    1. قم بإعداد خليط من 25 ميكرولتر من MOM و 75 ميكرولتر من BMM وأضفه إلى بئر واحد من البرد (4 درجات مئوية ، يسمح ل BMM ب "تبليل" البئر بالكامل) 48 بئر. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 إلى 60 دقيقة للسماح ل BMM بالتصلب قبل بذر الخلايا.
    2. احصل على خلايا مفردة مشتقة من العضيات (الخطوة 3.2.5) وبذرة حوالي 2 × 104 فوق BMM. أضف 200 ميكرولتر من MOM الدافئ (37 درجة مئوية) واحتضنه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 48 ساعة.
    3. أضف الفيروس بالتركيز المطلوب. تحديد وزارة الداخلية تجريبيا. يقترح أن يكون معدل التنفيذ التقريبي أقل من 30٪.
      ملاحظة: يصعب إصابة العضيات بشكل خاص مقارنة بخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد ، وتتوقع انخفاض عمليات التنفيذ حتى عند ارتفاع عيارات الفيروس. خلايا الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 60 دقيقة عند 32 درجة مئوية. أعد اللوحة إلى الحاضنة بعد انتهاء التطعيم.
    4. بعد 8 ساعات ، قم بإزالة الوسائط وأضف مزيجا من 25 ميكرولتر من MOM و 75 ميكرولتر من BMM فوق الخلايا "لشطيرة" في BMM ، مما يسمح للعضويات بالنمو بشكل طبيعي في 3 أبعاد. اسمح ل BMM بالتصلب عن طريق وضع اللوحة في الحاضنة لمدة 30-60 دقيقة. ثم أضف 250 ميكرولتر من الدفء (37 درجة مئوية) على الأم.
    5. بمجرد أن تتلاقى الخلايا ، انتقل إلى تمريرها كما هو مفصل في الخطوة 3.2 ، وتوسيع الحجم الكامل للخلايا إلى قبتين في صفيحة 24 بئرا.
      ملاحظة: في حالة استخدام اختيار المضادات الحيوية ، يوصى بإجراء الاختيار مباشرة في 48 بئر ، بدءا من 48 ساعة بعد التطعيم الأولي. في حالة إجراء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، يوصى بالتوسع بشكل أكبر على صفيحة مكونة من 6 آبار كما هو موضح أعلاه للحصول على خلايا كافية. يوصى أيضا بأوقات التربسين الأطول (1 ساعة) لضمان الخلايا المفردة قبل تصفية العينات للتدفق.
  2. التحويل بواسطة CRISPR-Cas9 القائم على التثقيب الكهربائي
    ملاحظة: للحصول على تركيزات معقدة للبروتين النووي الريبي (RNP) وتحضيرها ، راجع دليل الإصلاح الموجه ب IDT Homology (ص 9-11) 22. ومع ذلك ، احذف HDR Enhancer V2 للضربة القاضية ، حيث يوصى به فقط لتحرير الجينوم الذي يتطلب إعادة تركيب متماثل.
    1. قم بإعداد معلق أحادي الخلية مشتق من العضيات (الخطوة 3.2.7). يغسل ب PBS وقياس تركيز الخلية. نقل معلق خلية يحتوي على كمية ضمن ترتيب الحجم 104 (1 × 104 إلى 9 × 104 خلايا) إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
    2. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحرير الجينوم. إذا كانت هناك حاجة إلى >1 × 104 خلايا للتثقيب الكهربائي ، فقم بإعداد حجم كاف للتثقيب الكهربائي التسلسلي ، مع التأكد من أن كل 10 ميكرولتر تحتوي على 1 × 104 إلى 9 × 104 خلايا.
    3. باستخدام نظام ماصة التثقيب الكهربائي، اجمع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية، مما يضمن عدم إدخال أي فقاعات. التثقيب الكهربائي في ظل الظروف التالية: جهد 1200 فولت ، مدة نبضة 20 مللي ثانية ، إجمالي 4 نبضات. ضع الخلايا في أنبوب مع الأم الباردة.
    4. بعد أن يتم تكليف الخلايا بالكهرباء ، قم بالطرد المركزي للتعليق بالكامل عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في MOM و BMM المثلج (نسبة 1: 4) ، وقم بإعداد ما يكفي لزرع قبة واحدة في كل جولة من التثقيب الكهربائي (قبة واحدة لكل 1 104 خلايا).
    5. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح ل BMM بالتصلب. أضف 500 ميكرولتر من MOM عند 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.1.2 وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
  3. اختيار نسخ مفردة
    1. للحصول على استنساخ قادم من خلية واحدة ، قم بتمرير الخلايا كما هو موضح أعلاه ، ولكن قم بزرع 50 إلى 100 خلية لكل قبة (4 × 103 إلى 8 × 103 خلايا / مل في تعليق الخلية قبل الخلط مع BMM).
    2. قم بتغيير MOM كل 3 أيام. تأكد من أن العضيات تنمو بشكل مناسب ولاحظ أي منها منفصل جيدا عن الآخرين.
    3. عندما تنمو العضيات إلى حجم ملحوظ (حوالي 500 ميكرومتر) ، استخدم مجهرا ضوئيا لتحديد 4-5 عضيات كبيرة مفصولة بدرجة كافية.
      ملاحظة: يجب أن تكون مرئية للعين المجردة ، ولكن من المفيد وضع علامة على الجزء السفلي من اللوحة بعلامة ذات طرف رفيع عن طريق رسم دائرة حول منطقة اللوحة حيث توجد العضوية.
    4. باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر في الغطاء المعقم ، أدخل الطرف برفق في BMM واستنشق العضو العضوي الفردي (استنشق حجم حوالي 12.5 ميكرولتر). ضع العضوية في أنبوب تجميع سعة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من الأم.
    5. جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 500 ميكرولتر من إنزيم TrypLE Express. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. قم بإخماد تفاعل تفكك الخلية ب 500 ميكرولتر من 3٪ FBS في DMEM (وسائط ثنائية الأبعاد) وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية بعناية فائقة ، وأعد تعليقها في 12.5 ميكرولتر من MUM البارد ، واخلطها مع 37.5 ميكرولتر من BMM المثلجة ، وقم بزرع التعليق بالكامل كقبة واحدة سعة 50 ميكرولتر في صفيحة مكونة من 24 بئرا ، كما هو موضح أعلاه.
    7. ضع اللوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح ل BMM بالتصلب. أضف 500 ميكرولتر من MOM عند 37 درجة مئوية كما هو موضح سابقا في الخطوة 3.1.2 وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
    8. قم بتغيير الوسائط كل 3-4 أيام والمرور عندما تكون القبة ملتقية.

5. اشتقاق خط الخلية 2D من العضيات

  1. زراعة الخلايا الانتقالية
    1. ابدأ من معلق خلية واحدة ، كما هو الحال بعد مرور العضيات.
    2. استمر كما تفعل في زرع صفيحة من 6 آبار (الخطوة 3.3) ، ولكن باستخدام مبردة مسبقا (4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة) بدلا من ذلك. قم بزرع القباب على طبق من 6 آبار مخزن عند 4 درجات مئوية طوال الليل واترك اللوحة ترتاح في الغطاء المعقم لمدة 5-10 دقائق قبل إدخالها إلى الحاضنة.
      ملاحظة: ستسمح هذه الخطوة للخلايا بالاستقرار برفق في الجزء السفلي من اللوحة لاستيعاب حالة نمو ثنائية الأبعاد مع الاستمرار في الوصول إلى مكونات ECM في BMM.
    3. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة ، ثم أضف 2 مل من MOM عند 37 درجة مئوية. قم بتغيير الوسائط حسب الضرورة.
    4. عندما تصل العضيات إلى التقاء ، يمر كما هو موضح في الخطوات 3.2.1-3.2.7. بعد الغسيل النهائي PBS للبئر لإزالة بقايا BMM ، أضف 2 مل من الوسائط ثنائية الأبعاد الدافئة مسبقا في البئر.
      ملاحظة: لن تؤدي إزالة BMM إلى إزالة الخلايا المتصلة بالبئر ، ويمكن الآن غزو بقية البئر بحرية أثناء التكيف مع الظروف / الوسائط ثنائية الأبعاد.
    5. بمجرد الوصول إلى تعليق خلية واحدة مع الخلايا التي بقيت في BMM ، قم بزرع نصف حجم الخلايا ، وكرر الخطوة 5.1.2. أضف النصف الآخر من البئر الأصلي ، مما يسمح لمزيد من الخلايا بالزرع ، مما سيسرع من التقاء.
    6. قم بتغيير الوسائط ثنائية الأبعاد بعد 24 ساعة لإزالة الخلايا غير المرفقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك العديد من الخلايا غير المتصلة ، حيث أن الخلايا المزروعة في BMM ليست معتادة على الركائز البلاستيكية ولن ترتبط بسهولة.
    7. كرر الخطوة 5.1.4. بعد ذلك ، أعد تعليق الحجم الكامل للخلايا في 4 مل من الوسائط ثنائية الأبعاد وبذرة 2 مل في كل من الآبار المستخدمة سابقا. قم بتغيير الوسائط ثنائية الأبعاد كل 3-4 أيام.
  2. ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد للتوسع
    1. بمجرد أن تصل الخلايا إلى حوالي 80٪ من التقاء ، انتقل إلى المرور الأول.
    2. للمرور ، قم بشفط الوسائط ، واغسلها مرة واحدة باستخدام 1 مل من PBS ، وأضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق.
      ملاحظة: قد يكون لخطوط الخلايا المختلفة خصائص التصاق مختلفة ، مما يجعل مدة التربسين تختلف. تحقق تحت المجهر مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. يمكن أن يساعد النقر اللطيف على لوحة زراعة الخلايا باليد في فصل الخلايا.
    3. بمجرد انفصال جميع الخلايا ، قم بإخماد التفكك باستخدام DMEM + 10٪ FBS وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. للتوسع الأول (عندما يكون 80-100٪ ملتقا) ، أعد البذر بنسبة تقسيم 1: 1. كرر الخطوة 5.1.6 وقم بتغيير الوسائط ثنائية الأبعاد كل 2-3 أيام.
    5. عند التمدد الثاني (التقاء 80-100٪) ، قم بزرع جميع الخلايا في طبق 100 مم عن طريق تعليق الخلايا في 10 مل من الوسائط ثنائية الأبعاد عند 37 درجة مئوية. كرر الخطوة 5.1.6 وقم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام.
      ملاحظة: تستغرق هذه العملية وقتا طويلا ويمكن أن تستغرق ما يصل إلى شهر كامل. إذا كنت تعمل مع خطوط الخلايا التي تحتوي على جينات متكاملة فيروسات للإفراط في التعبير عن البروتين ، فمن المستحسن الحفاظ على المضادات الحيوية المختارة موجودة في وسط النمو طوال الوقت. إذا كانت العلامة عبارة عن بروتين فلوري ، فقم بإجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة في أسرع وقت ممكن (أي نهاية تمدد الطبق 100 مم).
  3. الحفظ بالتبريد
    1. لتخزين هذه الخلايا ، المرور كما هو موضح في الخطوات 5.2.1-5.2.3. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق ~ 1 × 106 خلايا في 1 مل من وسائط التجميد ثنائية الأبعاد ، والتي تتكون من 80٪ وسائط ثنائية الأبعاد ، و 10٪ FBS ، و 10٪ DMSO ، ونقلها إلى أنبوب تبريد. قم بتخزين الخلايا باتباع الخطوة 3.5.2.

6. التحقق من صحة الخطوط العضوية

  1. عزل المادة الوراثية عن العضيات
    1. بدءا من تعليق خلية واحدة ، قم بزرع قبتين بمضاعفة كثافة الخلية المعتادة (1 × 106 خلايا / مل). قم بتغيير MOM في اليوم 3.
    2. في اليوم 5 ، قم بإزالة الوسائط ، واغسلها مرة واحدة باستخدام PBS ، وأضف 350 ميكرولتر من مخزن التحلل المفضل مباشرة على القباب. بعد 5 دقائق من الحضانة في RT - أو حتى يتم إذابة BMM - انقل المحللة إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
    3. للاستخدام طويل الأمد ، قم بتخزين المحللة عند -80 درجة مئوية. خلاف ذلك ، تابع بروتوكول استخراج الحمض النووي و / أو الحمض النووي الريبي باستخدام تقنية الاستخراج المفضلة أو مجموعة تجارية.
  2. تلطيخ التألق المناعي (IF)
    1. لتحضير الخلايا ، قم بالمرور كما هو موضح في الخطوات 3.2.1-3.2.5. قم بالتعليق في مزيج من 37.5 ميكرولتر من MOM و 112.5 ميكرولتر من BMM المثلج (يكفي لثلاث قباب سعة 50 ميكرولتر تعمل كتكرارات بيولوجية). اتبع الخطوة 3.2.6 وقم بتغيير الوسائط في اليوم 3 واليوم 5.
    2. في اليوم 7 ، قم بشفط MOM وغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS. قم بإصلاح كل قبة على حدة عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من محلول بارافورمالدهيد (PFA) الدافئ مسبقا (37 درجة مئوية) بنسبة 4٪ في PBS مباشرة على القبة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة حتى يذوب BMM.
    3. باستخدام طرف ماصة P1000 عريض التجويف (إذا لم يكن متاحا، فما عليك سوى قص طرف P1000 عادي على بعد حوالي 0.5 سم من الطرف الناعم)، وجمع العضيات في 4٪ PFA ونقل الحجم إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
      ملاحظة: سيؤدي استخدام طرف الماصة القياسي إلى كسر العضيات.
    4. انتظر من 2 إلى 3 دقائق حتى تغرق العضيات في قاع الأنبوب. استنشق 4٪ PFA (مع ترك كمية آمنة من الحجم حتى لا تستنشق العضيات) وأضف 500 ميكرولتر من PBS لغسل العضيات. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين ، ليصبح المجموع 3 غسلات.
      ملاحظة: يفضل انتظار غرق العضيات في القاع من الطرد المركزي للحفاظ على الشكل العضوي.
    5. للتخزين طويل الأجل (4-6 أسابيع) ، احتفظ بالعضيات في PBS عند 4 درجات مئوية. لمتابعة التلوين ، تخلل باستخدام PBS + 1٪ Triton-X لمدة 30 دقيقة في RT. اغسل مرة واحدة باستخدام PBS.
    6. كتلة مع PBS + 0.2٪ Triton-X + 4٪ FBS + 1٪ مصل ماوس لمدة 60 دقيقة في RT. اغسلها مرة واحدة باستخدام PBS واترك 100 ميكرولتر من الحجم في الأنبوب.
    7. قم بإعداد المخزن المؤقت للعمل لتلوين الأجسام المضادة: PBS + 0.2٪ Triton-X ، 0.4٪ FBS ، 0.1٪ مصل الفئران. سيعمل هذا المخزن المؤقت مع كل من الأجسام المضادة الأولية والثانوية.
    8. لتحضير صبغة الجسم المضاد الأولي ، احسب التخفيف ليكون ضعف تركيزه من التخفيف الفعلي المطلوب. قم بإعداد محلول كاف لإضافة 100 ميكرولتر من الجسم المضاد إلى 100 ميكرولتر من PBS المتبقية في كل أنبوب. على سبيل المثال ، للتخفيف الأصلي 1: 1000 ، قم بإعداد 100 ميكرولتر من محلول 1: 500.
    9. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ذلك ، اغسل ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS.
    10. قم بإعداد بقعة الجسم المضاد الثانوية كما هو موضح في الخطوة 6.2.8. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
      ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا ، تأكد من تغطية منطقة العمل بورق الألمنيوم / الصندوق المظلم المفضل لتجنب التبييض الضوئي للأجسام المضادة الفلورية.
    11. بعد انتهاء التلوين الثانوي ، اغسل ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من الأنبوب بعد الغسيل الأخير لتحضير العينة للتركيب. استخدم ماصة سعة 20 ميكرولتر للمساعدة في تجنب شفط العضيات.
    12. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف أو مقطوع، أضف 20 ميكرولتر من وسائط التركيب المفضلة وقم بتجانس المحلول جيدا، مع تجنب الفقاعات.
    13. ضع قطرة من العضيات في محلول التركيب على زلة غطاء مستطيلة. باستخدام الملقط ، ضع غطاء دائريا فوق القطرة ، مع تجنب الفقاعات ، واتركه طوال الليل حتى يجف في الظلام عند RT. كرر هذه الخطوة على نفس الشريحة إذا كان سيتم وضع أكثر من عينة واحدة لكل شريحة.
    14. أضف 20 ميكرولتر أخرى من وسائط التركيب مباشرة أعلى زلة الغطاء الدائرية. الآن ، قم بإنشاء "شطيرة" متصاعدة عن طريق قلب الغطاء المستطيل 180 درجة ووضعه فوق شريحة المجهر. اتركيه ليجف في الظلام عند RT لمدة 8 ساعات على الأقل.
      ملاحظة: يجب أن تكون الشريحة بالترتيب التالي من الأسفل إلى الأعلى: شريحة المجهر ، زلة الغطاء الدائري ، العضيات ، شريحة الغطاء المستطيل. هذا يخلق ظروف التصوير المثلى.

7. تطوير نماذج الورم في الفئران

  1. تحضير الخلايا
    1. قم بإذابة قارورة واحدة من الخلايا ثنائية الأبعاد المفضلة في وسائط ثنائية الأبعاد. اسمح لهذه الخلايا بالنمو والتوسع إلى صفيحة 150 مم. إذا كانت الخلايا تحتوي على علامات اختيار المضادات الحيوية ، فحدد الخلايا قبل الحقن لضمان مجموعة نقية من الخلايا المرغوبة.
    2. للحصول على 5 حقن فأر ، قم بتوسيع الخلايا إلى لوحين مقاس 150 مم. عندما تكون الصفائح ملتصقة بنسبة 80٪ ، قم بحصاد الخلايا باتباع الخطوات 5.2.2-5.2.3. قم بتعليق الخلايا في 1 مل من وسط المصل المختزل Opti-MEM I وقياس تركيز الخلية.
      ملاحظة: تحتوي كل حقنة على 4 × 106 خلايا. ومع ذلك ، يوصى بالتحضير لحقنة إضافية لحساب الحجم الميت للمحاقن. في هذه الحالة ، قم بإعداد 24 × 106 خلايا بدلا من 20 × 106 خلايا.
    3. ضع حجم الخلية بالكامل لجميع الحقن في أنبوب سعة 1.5 مل. تحضير ما مجموعه 44 ميكرولتر لكل حقنة ، تتكون من جزء واحد من الخلايا في Opti-MEM I غير المكملة و 1 جزء من BMM المثلج. على سبيل المثال ، بالنسبة ل 24 × 106 خلايا (6 حقن) ، أعد تعليقها في 132 ميكرولتر من Opti-MEM I و 132 ميكرولتر من BMM.
    4. امزج الخلايا جيدا واتركها على الثلج حتى إجراء الحقن.
  2. التحضير للإجراء
    1. طرد فقاعات الهواء من الحجم الميت للحقنة (أنسولين U-100 28 G) باستخدام PBS البارد.
    2. باستخدام الخلايا الموجودة في الأنبوب سعة 1.5 مل ، قم بإعداد خمس حقن سعة 40 ميكرولتر عن طريق تحميل المحقنة ببطء لتجنب تحلل الخلايا بسبب قوى القص داخل الإبرة. استمر في وضع الثلج حتى يتم تخدير الفئران.
    3. بمجرد تحضير كل شيء للحقن ، ضع المحاقن بجوار مصباح التسخين حتى يسخن BMM ويصبح لزجا ، مما يسهل الحقن والنقش. لا تضعها مباشرة تحت مصباح التسخين ، لأن BMM المفرط التصلب لن يمر عبر المحقنة بشكل مناسب. بشكل عام ، اعمل بسرعة لتجنب حدوث ذلك.
  3. الحقن داخل البورس (IBI) في المبيض
    1. تخدير فأر C57BL / 6J باستخدام الكيتامين (100 مجم / مل). يتناول 0.1 مل لكل 10 جم من وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق.
      ملاحظة: غالبا ما تتطلب إناث الفئران الصغيرة حقن 0.2 مل فقط ، ولكنها قد تحتاج إلى المزيد إذا كانت أكبر سنا. سيوفر هذا تخديرا لمدة 20-40 دقيقة ولكنه لن يوفر أي تسكين.
    2. ضع الماوس في قفص تم تسخينه بواسطة مصباح التدفئة.
      ملاحظة: لا تضع الفئران مباشرة تحت مصباح التسخين ، لأن هذا يمكن أن يسبب نخر الذيل وارتفاع الحرارة ، والذي يمكن أن يكون مميتا.
    3. بمجرد تخدير الفأر الأول بالكامل ، باستخدام تقنية التعقيم ، قم بقطع شق بطول <1 سم على طول جناح فأر C57BL / 6J في منطقة البطن وفوق الفخذ. تأكد من المرور عبر البشرة وتحت الجلد قبل الوصول إلى منطقة الجراب.
    4. اسحب المبيض بعناية (يمكن العثور عليه بسهولة بواسطة وسادة الدهون المرفقة به). خذ إحدى المحاقن المحضرة وحقن الخلايا ببطء من خلال وسادة الدهون خلف المبيض مباشرة ، من خلال المبيض نفسه ، في كيس قناة البيض.
      ملاحظة: الحقن الناجح سيشهد بالون كيس قناة البيض مع BMM. من المحتمل أن يتسرب الخليط أيضا في جميع أنحاء وسادة الدهون ، وهو أمر طبيعي.
    5. ضع المبيض بحذر مرة أخرى في الجراب وأغلق الشق باستخدام الدبابيس الجراحية أو عن طريق الخياطة.
    6. ضع الماوس مرة أخرى في القفص. استخدم مصباح تسخين للحفاظ على دفء الفئران أثناء تعافيها بعد العملية حتى تصبح شبه واعية (>15 دقيقة). في اليوم التالي ، تحقق من الماوس للتحقق من عدم حدوث تعفن الدم بين عشية وضحاها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر في الشكل 1 تخطيطي يلخص سير العمل لتوليد سرطان المبيض HGSOC والتحقق من صحته. تبدأ هذه العملية باستخراج أنسجة قناة فالوب من أنثى فأر من النوع البري C57BL / 6J (الشكل 2 أ). يوصى بالبدء بقطعة سخية من المناديل لضمان الجمع المناسب. يسمح استخدام مجهر تشريح بالعزل الدقيق لقناة فالوب البعيدة مع إزالة الأنسجة المحيطة مثل الدهون والمبيض. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، يتم تغطية المبيض في البداية بالدهون ، ولك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من التقدم الكبير في أبحاث الأورام ، لا يزال HGSOC أكثر أنواع الأورام الخبيثة النسائية عدوانية والسبب الرئيسي للوفيات بين جميع سرطانات المبيض23،24. مع تطور أبحاث الأورام النسائية ، يجب أن تتطور النماذج المستخدمة فيها. في الواقع ، تم اكتشاف أن العديد من خطوط الخلايا التاريخية لسرطان المبيض دون المستوى الأمثل لدراسة هذا المرض لعدة أسباب ، بما في ذلك الأهمية الجينومية أو التناقضات في خلية المنشأ أو القيود المتعلقة بتقليد

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة بموجب رقم الجائزة R01 (CA257507). تم إنشاء مخططات الأشكال باستخدام BioRender. نود أن نشكر الدكتور بنيامين نيل على دعمه طوال هذا المشروع ، والدكتور شوانغ تشانغ على تطوير البروتوكول الأصلي والدكتورة كيومي أراكي على مساعدتها في تحسينه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تريبسين، 0.1٪ EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديومكورنينغ25053CI
A83-01توكريس للعلوم الحيوية2939
DMEM/F12 المتقدمجيبكو12-634-028
العمر C57BL/6J (أنثى)مختبر جاكسون000664
مجموعة AllPrep للحمض النووي الريبي المصغركياغين80204لاستخراج الحمض النووي النووي/الحمض النووي الريبي
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3تقنيات الحمض النووي المتكاملة10008100
الأجسام المضادة المضادة ل-Ki67أبكامab15580
نظام أوتوكليبأدوات العلوم الدقيقة12020-00لإغلاق الجرح بعد IBI
مكمل B-27 (50x)، خالي من المصلجيبكو17-504-001
بلاستيسيدين HCl (10 ملغ/مل) 50 ملغإنفيفوجينأنت-بلو-05
مصل البقر ألبومينسيغما ألدريتشA9647
مخزن RLT Plusكياغين1053393تحليل الخلايا قبل استخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي
حل استعادة الخلاياكورنينغ354253
كولاجناز/هيالورونيدازتقنيات الخلايا الستيمية07912
كورالايت 594-فالويدين (أحمر)بروتين تكPF00003
غطاء زجاجي 15CIR-1فيشربراند12-545-83
زجاج التغطية 24 مم وحاد؛ 40 مم-1فيشربراند12-544-12
مكمل N-2 لأنظمة العلاج الخلوي (CTS)جيبكوA1370701
DAPIروش10236276001
ديوكسي ريبونوكلياز I (DNAse I) من بنكرياس البقرسيغما ألدريتشD5025
ديفكو سكايم ميلكبيكتون ديكنسون232100
Dispaseتقنيات الخلايا الستيمية07913
DMEM مع إل-جلوتامين، 4.5 ج/لتر جلوكوز وبيروفات الصوديومكورنينغ10013CV
DNase I مؤتلف، خال من RNaseروش04716728001
محلول دولبيكو المخزن بالفوسفاتسيغما ألدريتشD8537
دومونت #5 - ملقط مطلية بالسيراميكأدوات العلوم الدقيقة11252-50لتشريح قناة فالوب
مصل الأبقار الجنينيكورنينغ35-010-CVإيقاف الحرارة عند 56 ودرجة مئوية؛ C لمدة 60 دقيقة.
المقص الدقيق - ToughCutأدوات العلوم الدقيقة14058-09لجمع قناتي فالوب وشق IBI
مضاد حيوي انتقائي جينيسين (G418 سلفات) (50 ملغ/مل)جيبكو10131027
مكمل جلوتاماكس (100x)جيبكو35-050-061
الجسم المضاد الثانوي المتقاطع IgG (H+L) المضاد للأرانب الماعز، السياني3إنفيتروجينA10520
ملقط جريفأدوات العلوم الدقيقة11053-10لمعالجة الأنسجة
مخزن HEPESكورنينغ25060CI
بروتين R-Spondin 1 البشري المؤتلفبيبروتك120-38
حقنة الأنسولين، U-100 0.5 مل 0.36 مم (28 ج) × 12.7 مم (1/2")BDBD329461
الأنسولين-ترانسفيرين-سيلينيوم (ITS -G) (100x)جيبكو41-400-045
إل-جلوتامين 200 ملليمولار (100x)جيبكو25-030-081
مصفوفة الغشاء القاعدي Matrigel GFRكورنينغ356231بي إم إم
بروتين EGF المؤتلف في الفأربيبروتك315-09
البروتين المؤتلف الأساسي في FGF الفأربيبروتك450-33
بروتين النوجين المؤتلفبيبروتك250-38
بروتين الفأر Wnt-3a المؤتلفبيبروتك315-20
ملحق N2جيبكو17502048
أميد N-أستيل سيستينسيغما ألدريتشA0737
نظام الحفر الكهربائية النيون NxTإنفيتروجيننيون1إسلعملية التقميم الكهربائي بتقنية CRISPR-Cas9
نظام التقشير الكهربائي Neon NxT 10-μ مجموعة L بأنابيب قناة واحدةإنفيتروجينN1025المواد الاستهلاكية للتقميم الكهربائي، بما في ذلك مخزن تحرير الجينوم
نيكوتيناميدسيغما ألدريتشN3376
مصل الفأر العاديإنفيتروجين10410
مصل الجرذ العاديتقنيات الخلايا الستيمية13551
أوبتي-مم I متوسط مصل مخفضجيبكو31985070
PAX8 الأجسام المضادة متعددة النسيلاتبروتين تك10336-1-AP
البنسلين-ستريبتوميسين (10,000 U/mL)جيبكو15-140-122
بوروميسينسيغما ألدريتشP8833
سيلكتفروست 25 مم وحادة؛ 75 مم وحادة؛ 1.0 ممفيشربراند12-550-003
ترايتون X-100كواشف فيشر الحيويةBP151
إنزيم TrypLE Express (1x)، بدون فينول ريدجيبكو12-604-013
مقص زنبريك فاناس - حافة قطع 4 ممأدوات العلوم الدقيقة15019-10لتشريح قناة فالوب
Y27632تقنيات الخلايا الستيمية72304مثبط روكيناز (ROCK)  

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 4, 2126(2013).
  3. Anglesio, M. S., et al. Type-specific cell line models for type-specific ovarian cancer research. PLoS One. 8 (9), e72162(2013).
  4. Beaufort, C. M., et al. Ovarian cancer cell line panel (OCCP): Clinical importance of in vitro morphological subtypes. PLoS One. 9 (9), e103988(2014).
  5. Walton, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma. Cancer Res. 76 (20), 6118-6129 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nat. Commun. 8 (1), 1093(2017).
  7. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
  8. Kim, J., Coffey, D. M., Creighton, C. J., Yu, Z., Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  9. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. J Pathol. 233 (3), 228-237 (2014).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Vooijs, M., Berns, J. A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2 (4), 293-297 (2001).
  12. Semprini, S., et al. Cryptic loxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35 (5), 1402-1410 (2007).
  13. Loonstra, A., et al. Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9209-9214 (2001).
  14. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  15. Yver, S., et al. Genetically defined syngeneic mouse models of ovarian cancer as tools for the discovery of combination immunotherapy. Cancer Discov. 11 (2), 384-407 (2021).
  16. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. Commun. 11 (1), 2660(2020).
  17. Maniati, E., et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment. Cell Reports. 30 (2), 525-540.e7 (2020).
  18. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protoc. 3 (1), 101164(2022).
  19. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32, 51-60 (2018).
  20. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).
  21. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med. 145 (1), 204-220 (1977).
  22. Homology-directed repair using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and HDR Donor Oligos. , Integrated DNA Technologies (IDT). https://idtsfprod.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/protocol/homology-directed-repair-using-the-alt-r-crispr-cas9-system-and-hdr-donor-oligos.pdf?sfvrsn=47121607_6 (2022).
  23. Santoro, A., et al. The multiple facets of ovarian high grade serous carcinoma: A review on morphological, immunohistochemical and molecular features. Crit Rev Oncol Hematol. 208, 104603(2025).
  24. Lisio, M. -A., Fu, L., Goyeneche, A., Gao, Z., Telleria, C. High-grade serous ovarian cancer: Basic sciences, clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci. 20 (4), 952(2019).
  25. Silva-Pedrosa, R., Salgado, A. J., Ferreira, P. E. Revolutionizing disease modeling: The emergence of organoids in cellular systems. Cells. 12 (6), 930(2023).
  26. Claassen, D. A., Desler, M. M., Rizzino, A. ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 76 (8), 722-732 (2009).
  27. Leibowitz, M., et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet. 53 (6), 895-905 (2021).
  28. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  29. Kossaï, M., Leary, A., Scoazec, J. -Y., Genestie, C. Ovarian cancer: A heterogeneous disease. Pathobiology. 85 (1-2), 41-49 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9

مقالات ذات صلة