مقالة منهجية

قوالب مطبوعة ثلاثية الأبعاد مخصصة لتصوير أسماك الزرد وتطور القلب

773 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/68768

⸱

أغسطس 15, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

في هذه المقالة

ملخص

نصف هنا طريقة باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد للطباعة الحجرية المجسمة غير مكلفة لإنشاء قوالب لتسهيل التركيب القابل للتكرار لأجنة أسماك الزرد لدراسات التصوير. باستخدام هذه الطريقة ، أنشأنا قوالب لتصوير تشكل القلب في أجنة الزرد.

الملخص

يعد تركيب الأجنة أحد التحديات التقنية التي يواجهها الباحثون عند القيام بمشروع تصوير. يجب توجيه الأجنة بطريقة قابلة للتكرار بحيث يمكن الوصول إلى الأنسجة ذات الأهمية بواسطة هدف المجهر طوال فترة التصوير. للتغلب على هذا التحدي ، يمكن للباحثين تضمين الأجنة في الوسائط اللزجة أو إنشاء أطباق وقوالب متخصصة لتثبيت الأجنة في الاتجاه المطلوب أثناء التصوير. هنا ، نصف طريقة لاستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد غير مكلفة للطباعة الحجرية المجسمة (SLA) لتصنيع قوالب قابلة لإعادة الاستخدام تخلق آبار الاغاروز التي يمكن تركيب الأجنة فيها للتصوير. توفر آبار الاغاروز هذه وسيلة موثوقة لتوجيه أجنة متعددة للتصوير. تتضمن هذه الطريقة إطار تصميم يمكن تخصيصه بسهولة لمجموعة متنوعة من الأنسجة والكائنات الحية وتحديات التصوير. باستخدام هذه الطريقة ، أنشأنا قوالب لتصوير تطور القلب في أسماك الزرد لكل من المجاهر المستقيمة والمقارير. من خلال استخدام المواد والمعدات التي يمكن الوصول إليها ، تتيح هذه الطريقة للباحثين إنشاء قوالب خاصة باحتياجاتهم المتصاعدة بسهولة.

المقدمة

يعد تصور الديناميكيات الخلوية داخل سليم أمرا ضروريا لفهم أمراض الأمراض الخلقية والعمليات الأساسية للتطور والتوازن. يشمل هذا التصور التصوير على نطاقات مكانية متعددة لتحديد الديناميكيات الفسيولوجية عبر الكائن الحي بأكمله وكذلك على مستويات الأنسجة والخلوية والخلوية والخلوية. تتراوح طرق التصوير المستخدمة لتصور الديناميكيات الخلوية من دراسات التألق المناعي للعينات الثابتة إلى التصوير بفاصل زمني للعينات الحية. تتطلب طرق التصوير هذه الاحتفاظ بالعينات سليمة في اتجاهات محددة ، بحيث يمكن الوصول إلى منطقة الاهتمام لهدف المجهر.

تعتبر أجنة أسماك الزرد كائنا نموذجيا مثاليا لدراسات التصوير نظرا لشفافيتها البصرية وقابليتها للتتبع الجيني والتخصيب الخارجي وأصل الفقاريات. ومع ذلك ، فإن تركيب أجنة الزرد في اتجاه محدد بطريقة متسقة وقابلة للتكرار يمثل تحديا مستمرا. يمثل التركيب تحديا خاصا لتصور نمو القلب في أجنة الزرد لأن تكوين القلب يحدث في مستويات مختلفة1.

تم تطوير مناهج متعددة لمواجهة تحديات تركيب الأجنة للتصوير. تتضمن إحدى أبسط الطرق تركيب أجنة الزرد بين غطاءين مع طبقات من الشريط بين الغطاء لمنع التكسير. تسمح هذه الطريقة بالتصوير على كل من المجاهر المقلوبة والمستقيمة2. يمكن أيضا تركيب أجنة أسماك الزرد في وسط أو هلام شديد اللزوجة ، مثل ميثيل السليلوز أو 0.1-0.8٪ من درجة حرارة نقطة الانصهار المنخفضة ، لتثبيت الأجنة في اتجاهات محددة2،3،4. تعمل هذه الأساليب منخفضة الإنتاجية بشكل جيد للعديد من مشاريع التصوير. ومع ذلك ، فإن ضمان سلامة الجنين والحصول على توجهات محددة بشكل متكرر قد يكون مزعجا. لزيادة إنتاجية التصوير وتسهيل التركيب ، يمكن إنشاء آبار متباعدة بانتظام من الاغاروز المتصلب في طبق تصوير5،6،7،8. لتسهيل إنشاء آبار الاغاروز هذه ، تم إنشاء قوالب بلاستيكية9،10،11. بينما يمكن تطبيق هذه القوالب على التصوير على طول المحاور الظهرية البطنية الجانبية القياسية10،12 ، إلا أنها غالبا ما يتم تصنيعها لتحديات تصوير محددة ، مثل استخدامها في ألواح 96 بئرا13 أو للكشف عن نبضات القلبالأولى 14. في الحالات المتخصصة ، تم إنشاء أطباق تصوير كاملة5،15،16. على سبيل المثال ، تسهل غرفة الموائع الدقيقة (المسماة ZEBRA) المصنوعة من PDMS كلا من التصوير والتعرض للأجنة للمواد الكيميائية17. غالبا ما تكون هذه القوالب مصنوعة من السيليكون أو تشكيلها من لوسيت10،18،19. ومع ذلك ، فإن ظهور طابعات ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) غير مكلفة نسبيا قد أدى إلى إضفاء الطابع الديمقراطي على إنشاء قوالب مخصصة تستخدم لإنشاء آبار تصوير الاغاروز.

تتضمن الطباعة ثلاثية الأبعاد ، التي تسمى أيضا التصنيع الإضافي أو الطبقات ، إنتاج كائن ثلاثي الأبعاد من تصميم رقمي عن طريق الإضافة المتسلسلة والاندماج للطبقات الفردية20،21. يستخدم الطباعة الحجرية المجسمة (SLA) الأشعة فوق البنفسجية (UV) لعلاج راتينج سائل حساس للضوء في طبقات متسلسلة22. طابعات SLA فعالة من حيث التكلفة وسريعة وعالية الدقة ويمكن استخدامها مع مجموعة متنوعة من الراتنجات ، بما في ذلك تلك التي توفر سطحا أملسا16. تبدأ العملية ببرنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) ، حيث يمكن تصميم النماذج الرقمية للكائن من جديد أو تعديلها من التصاميم الموجودة مسبقا. ثم يتم تقسيم النموذج الرقمي تقريبا إلى طبقات قابلة للطباعة. باستخدام هذه الطبقات الرقمية ، تقوم طابعة ثلاثية الأبعاد ببناء الكائن ، طبقة تلو الأخرى. هنا ، نقدم طريقة وإطارا للتصميم المخصص وإنشاء قوالب التصوير باستخدام طابعة SLA ثلاثية الأبعاد منخفضة التكلفة متوفرة تجاريا. بالإضافة إلى ذلك ، نستخدم هذا الإطار لإنشاء قوالب لتصوير مراحل مختلفة من تطور قلب الزرد على المجاهر المقلوبة أو المستقيمة ولتصوير أجنة الزرد على طول محاورها الجانبية أو الظهرية أو البطنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء البروتوكولات والتجارب والنتائج الموضحة هنا وفقا للوائح وإرشادات رعاية ، واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة ميسيسيبي (البروتوكول # 24-008).

لإنشاء آبار الاغاروز بأشكال مختلفة يمكن من خلالها توجيه الأجنة للتصوير ، قمنا بتطوير تصميم يستخدم قاعدة متصلة بالأوتاد (الشكل 1 أ). يمكن تخصيص شكل هذه الأوتاد (انظر السهم الذي يشير إلى الأوتاد باللون الأرجواني في الشكل 1 أ) لتوجيه الأجنة من مراحل النمو المختلفة والتركيز على الأنسجة المختلفة. أدناه ، نصف بروتوكولا لتخصيص هذه الأوتاد واستخدام هذا النظام لإنشاء آبار الاغاروز.

1. إنشاء قالب تصوير مصمم خصيصا

  1. قم بإنشاء رسم أولي للعينة أو الجنين الموضوع في الاتجاه المطلوب. ضع في اعتبارك اتجاه الجنين المطلوب وما إذا كان المجهر المراد استخدامه يحتوي على أهداف منتصبة أو مقلوبة. ضع في اعتبارك أيضا حجم الطبق وعدد الأجنة المراد تركيبها والتباعد بينها.
  2. قم بقياس أبعاد الجنين (على سبيل المثال ، الطول والعرض والارتفاع) باستخدام مجهر مدمج مع أداة برمجية مثل FIJI23. استخدم هذه الأبعاد للتأكد من أن الأجنة تتناسب مع الآبار التي تم إنشاؤها بواسطة الأوتاد.
  3. تحديد الشكل الذي يتوافق مع هندسة الجنين. باستخدام القياسات من الخطوة 1.2 بالاشتراك مع برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) ، قم بإنشاء ربط يقترب من شكل العينة وحجمها.
    ملاحظة: يمكن إنشاء هذا الشكل في برنامج CAD أساسي عن طريق الجمع بين الأشكال المختلفة المصممة مسبقا وتداخلها ، أو يمكن إنشاء الشكل من جديد باستخدام برنامج CAD متقدم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمرء تعديل أحد الأوتاد المصممة مسبقا (انظر الملف التكميلي 1). يمكن أن يساعد تناقص الوتد ، كما في الشكل 1 أ ، في توجيه الأجنة للتأكد من أن الأنسجة ذات الأهمية هي الأقرب إلى الهدف.
  4. الجمع بين تصميم الوتد والتصميم الأساسي:
    1. في برنامج CAD ، أضف ربطا مصمما خصيصا لإحدى القواعد المصممة مسبقا (الملف التكميلي 1). بعد ذلك ، قم بتكرار الأوتاد ووضعها بالتساوي في جميع أنحاء القاعدة للتصوير عالي الإنتاجية باستخدام الأدوات الموجودة في برنامج CAD المتقدم. تحقق مرة أخرى للتأكد من وصول جميع الأوتاد إلى نفس الارتفاع بعيدا عن القاعدة.
  5. إعداد التصميم للطباعة ثلاثية الأبعاد:
    1. انقل تصميم القالب المخصص أو أحد القوالب المصممة مسبقا (الملف التكميلي 2) إلى برنامج تقطيع ، والذي يحول التصميم إلى أوامر للطابعة ثلاثية الأبعاد.
    2. داخل برنامج مقسم العرض، تأكد من تدوير التصميم بحيث يتم وضع المكونات الهامة مثل الأوتاد بعيدا عن مرحلة الطابعة. بالنسبة لحامل الغطاء المطبوع على طابعة نمذجة الترسيب المنصهر (FDM)، ضع الطباعة أفقيا.
      ملاحظة: سيمنع دوران التصميم الالتواء ، والذي يمكن أن يحدث عند وضع الأجزاء الدقيقة بالقرب من مرحلة الطباعة.
    3. أضف دعامات داخل برنامج تقطيع الملابس لضمان عدم كسر الجوانب الدقيقة للقالب أثناء الطباعة. تضمن ميزة وضع الدعم التلقائي المتوسط في البرنامج جنبا إلى جنب مع التنظيم اليدوي انتشارا جيدا للدعامات دون فجوات كبيرة. يتم استخدام استراتيجية حشو بنسبة 100٪ لإنشاء قالب صلب.
    4. اطبع أجزاء متعددة في وقت واحد إما باستخدام ملف STL واحد يحتوي على جميع القوالب أو ترتيب ملفات STL الفردية معا باستخدام برنامج تقطيع الطائرة.
  6. طبع
    ملاحظة: طابعات SLA هي نوع الطابعة ثلاثية الأبعاد المفضل لدينا لقوالب التصوير نظرا لجدواها ودقتها وإنشائها للأسطح الملساء. تستخدم طابعة FDM لصنع حامل الغطاء لأنها تخلق مطبوعات خفيفة الوزن وأكثر صلابة من طابعات SLA.
    1. ابدأ بإعدادات الطباعة التالية وقم بالتحسين من هناك: ارتفاع الطبقة 0.05 مم ؛ 5 عدد الطبقة السفلية ؛ 2.5 ثانية وقت التعرض ؛ 35 ثانية وقت التعرض السفلي ؛ 5 مم مسافة الرفع والرفع السفلية ؛ 60 مم / دقيقة سرعة الرفع السفلي ؛ سرعة رفع 80 مم / دقيقة ؛ و 210 مم / دقيقة سرعة التراجع
      ملاحظة: من المحتمل أن تحتاج إعدادات الطباعة إلى تحسينها من قبل المستخدم لأنها تعتمد على نوع الراتنج ودرجة حرارة الغرفة وطراز الطابعة.
  7. بعد الطباعة ، اغسل القوالب بالماء ، وقم بإزالة الدعامات ، ووضع القوالب تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء مزرعة الأنسجة لضمان تصلب الراتنج.
    ملاحظة: يعد غسل القوالب ومعالجتها جيدا أمرا مهما لمنع الراتنج من التقشر ولمنع العفن من التشوه.
    يجب ارتداء القفازات ومعطف المختبر عند التعامل مع الراتنج غير المعالج وتنظيف القوالب ، لأن الراتنج غير المعالج يمكن أن يكون مهيجا للجلد. تستخدم طابعات SLA ضوء الأشعة فوق البنفسجية لعلاج الراتنج ، والذي يمكن أن يكون ضارا بالعينين والجلد. تأكد من أن غرفة الطباعة مغلقة بإحكام وتجنب النظر مباشرة إلى مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

2. إجراء لاستخدام القوالب المطبوعة ثلاثية الأبعاد لإنشاء آبار الاغاروز

  1. صنع آبار الاغاروز
    1. اصنع آبار الاغاروز عن طريق إذابة 2٪ (جم / مل) من الاغاروز في وسائط E3 (1.578 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.169 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.249 ملي كلوريدالكالسيوم 2 * 2 ساعة2درجة ، 0.161 ملي مللي ملغم4 * 7 ساعات2درجة مئوية). ضع قالبا في وسط الطبق السفلي مع توجيه السهم لأسفل نحو البئر (انظر الشكل 2 أ ، ب). الماصة 750 ميكرولتر من 2٪ الاغاروز المنصهر / E3 على طول نصف محيط قالب التصوير (انظر الشكل 2 ج).
      ملاحظة: يجب أن يكون الاغاروز المنصهر غير لزج ولكنه بارد بدرجة كافية للماصة دون تكوين فقاعات. نستخدم أطباق 60 مم مع قاع غطاء 30 مم ، بينما بالنسبة للقوالب المصممة للمجاهر المستقيمة ، يمكن استخدام طبق قياسي مقاس 60 مم. يتم استخدام بروتوكول مختلف قليلا لقالب الغربلة (انظر أدناه).
    2. ماصة 750 ميكرولتر أخرى من 2٪ الاغاروز المنصهر / E3 على طول النصف الآخر من محيط قالب التصوير (انظر الشكل 2 د).
    3. انتظر 5-7 دقائق حتى يتجمد الاغاروز ، مع ملاحظة الانتقال من سائل شفاف إلى هلام أزرق معتم (انظر الشكل 2 ه).
    4. أضف طبقة رقيقة من الاغاروز المنصهر حول محيط الاغاروز المركزي المتصلب.
      ملاحظة: على الرغم من أنها ليست مطلوبة بشكل صارم ، إلا أن هذه الخطوة تساعد في تثبيت الاغاروز المتصلب في الطبق ومنع الانفصال الناجم عن الوسائط.
    5. ضع الحلقة الخارجية (الشكل التكميلي S1B) فوق مجموعة قالب الاغاروز مع توجيه السهم نحو الاغاروز (انظر الشكل 2F).
    6. أثناء الضغط برفق على الحلقة الخارجية ، اسحب بعناية لأعلى على القالب الداخلي لفصله عن الاغاروز (انظر الشكل 2G).
      ملاحظة: لتجنب كسر أو إتلاف آبار الاغاروز ، لا تضغط لأسفل بشدة على الحلقة الخارجية ولا تقم بلف القالب الداخلي أو تحريكه عند السحب لأعلى.
    7. قم بإزالة الحلقة الخارجية ، واكشف عن آبار الاغاروز في الطبق السفلي للغطاء (الشكل 2 ح).
    8. افحص آبار الاغاروز تحت المجهر للتأكد من التحجيم والإنتاج الصحيحين.
      ملاحظة: للتصوير على المجهر المقلوب ، غالبا ما يحتاج غشاء رقيق من الاغاروز إلى إزالته من قاع البئر. يمكن القيام بذلك باستخدام الملقط.
  2. بروتوكول معدل لاستخدام قالب الفرز
    1. صب 2٪ agarose / E3 المنصهر في طبق بتري حتى يمتلئ في نصفها تقريبا.
    2. امسك القالب بحيث تكون الأوتاد متجهة لأعلى وقم بتصهور 2٪ agarose / E3 على الأوتاد ، حتى يتم تغطيتها (~ 3 مل).
      ملاحظة: تأكد من عدم إدخال الفقاعات عن طريق إطلاق 90٪ فقط من الاغاروز المنصهر الذي تم سحبه إلى الماصة.
    3. باستخدام حركة إمالة ، ضع أحد طرفيه ثم القالب بأكمله مع توجيه الأوتاد لأسفل في طبق بتري الذي يحتوي على الاغاروز المنصهر (الشكل التكميلي S2).
    4. دع الاغاروز يتصلب لمدة 5-7 دقائق.
    5. قم بإزالة القالب بعناية باستخدام المقبض لنزع أحد طرفيه ثم الطرف الآخر.

3. تركيب الأجنة في آبار الاغاروز مع وبدون درجة حرارة انصهار منخفضة

  1. إزالة الأجنة من التخريم وتخديرها في محلول 200 ميكروغرام / مل من التريكيين قبل التركيب.
    ملاحظة: مطلوب محلول ثلاثي الكنائين ~ 400 ميكروغرام / مل لمنع القلب من النبض.
    1. بدون استخدام الاغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة: املأ طبق التصوير ب 1x E3 و tricaine (200 ميكروغرام / مل) ، وأضف أجنة مخدرة منزوعة التأخير إلى طبق التصوير ، واستخدم الملقط لوضع الأجنة وتوجيهها في آبار الاغاروز ، ثم الصورة (انظر الشكل 2I ، J).
      ملاحظة: نظرا لأن الملقط يمكن أن يتلف الجنين بسهولة ، يمكن استخدام لعبة البوكر الجنينية التي يتم فيها إدخال خط الصيد بقطر 0.41 مم في أنبوب شعري أو طرف ماصة وتثبيتها بالغراء الفائق بدلا منذلك 24.
    2. باستخدام درجة حرارة انصهار منخفضة الاغاروز:
      ملاحظة: في حين أن القوالب مصممة لوضع الأجنة في اتجاهات محددة ، فإن استخدام درجة حرارة انصهار منخفضة لتثبيت الأجنة في مكانها يمكن أن يضمن عدم انجراف الأجنة أثناء التصوير أو أثناء نقل طبق التصوير مع الأجنة المثبتة إلى المجهر. الخطوات أدناه مشتقة من بروتوكولناالسابق 6.
      1. قم بإنشاء أنابيب من الاغاروز ذات درجة حرارة الانصهار المنخفضة عن طريق إذابة 0.1-0.8٪ من الاغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة في 5 مل من وسائط E3 والتسخين إلى 65-70 درجة مئوية في حمام مائي. من حين لآخر ، اقلب الأنبوب حتى يذوب الاغاروز ذو درجة الحرارة المنخفضة. قم بتجميع محلول الاغاروز ذو درجة الحرارة المنخفضة في أنابيب الطرد الدقيق وضعها على كتلة حرارية مضبوطة على 42 درجة مئوية. اسمح للمحلول بالتوازن مع 42 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل.
        ملاحظة: ينصح عموما باستخدام محلول الاغاروز الطازج ذو درجة حرارة منخفضة الذوبان.
      2. باستخدام ماصة باستور زجاجية عريضة التجويف، انقل جنينا واحدا إلى أنبوب يحتوي على محلول الاغاروز منخفض درجة الذوبان. لتجنب إضافة السائل الزائد إلى محلول الاغاروز ذو درجة الحرارة المنخفضة ، انقل الجنين والسائل المحيط به مباشرة فقط. انقل الجنين على الفور ، الموجود الآن في الاغاروز منخفض الذوبان ، إلى أحد آبار الاغاروز. أعد محلول الاغاروز ذو درجة الحرارة المنخفضة إلى الكتلة الحرارية لإعادة استخدامها.
      3. باستخدام ملقط أو بوكر الجنين (انظر الخطوة 3.1.1) ، ضع الجنين في البئر للتصوير.
      4. كرر الخطوات 3.1.2.2-3.1.2.3 للآبار الأخرى. إذا بدأت الآبار السابقة في الجفاف ، فاستخدم ماصة p200 لإضافة كمية صغيرة من E3 (~ 50-100 ميكرولتر) فوق البئر.
  2. بمجرد تركيب الأجنة في جميع الآبار وتصلب درجة حرارة الانصهار المنخفضة ، أضف محلول التريكين / E3 ببطء إلى طبق التصوير.
  3. بعد التصوير ، استخرج الأجنة بعناية من الآبار باستخدام الملقط واسمح لها بالتطور أكثر للتأكد من أن التصوير لا يسبب عيوبا في النمو.
    ملاحظة: يمكن إزالة آبار الاغاروز من طبق التصوير ، والتي يمكن شطفها وإعادة استخدامها. يساعد الشطف بمنظف الزجاج المتاح تجاريا ثم عدة مرات باستخدام ddH2O على إزالة رواسب الملح على الغطاء. على الرغم من أننا لم نشهد سمية بسبب الآثار المتبقية لمنظف الزجاج ، ينصح الباحث بتأكيد هذه النتائج باستخدام ظروفه المعملية الخاصة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام البروتوكول أعلاه لتصميم قوالب لتصوير مراحل مختلفة من تطور القلب في أسماك الزرد ، بما في ذلك اندماج القلب ، وتكوين أنبوب القلب ، والحلقات القلبية ، وتكوين الغرفة. نظرا لأن نمو القلب لا يحدث على طول المحاور التشريحية الرئيسية للجنين ، فقد تم تخصيص شكل الأوتاد لمراحل النمو المختلفة من أجل وضع الأجنة بشكل صحيح. على سبيل المثال ، يتطلب الوضع الداخلي الأمامي لقلب سمك الزرد بعد 48 ساعة من الإخصاب (HPF) بالنسبة إلى صفار البيض الكروي اتجاها مائلا للجنين تم تسهيله عن طريق إنشاء أوتاد ذات حواف مدببة في القالب V2 (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذا البروتوكول ، نحدد طريقة لتصميم قوالب مطبوعة ثلاثية الأبعاد تخلق آبار الاغاروز التي يمكن أن تسهل تركيب الأجنة أو الأنسجة لدراسات التصوير. يمكن صنع هذه القوالب للتصوير إما بالمجاهر المستقيمة أو المقلوبة ويمكن استخدام آبار الاغاروز المصنوعة باستخدام هذه القوالب المخصصة لتطبيقات التصوير التي تتراوح من دراسات التألق المناعي للأجنة الثابتة إلى التصوير بفاصل زمني للأجنة الحية.

تستخدم هذه الطريقة أساسا يحتوي على قطعتين: قالب قاعدة داخلي على شكل مكبس مع أوتاد مت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

نود أن نشكر أعضاء مختبر Bloomekatz ، وخاصة Sasmitha Singh و Allison Holmes ، بالإضافة إلى قلب التصوير GlyCORE (المدعوم من P20GM130460) ، ومختبر IDEA بجامعة ميسيسيبي ، والدكتور Yiwei Han ومختبر Han ، وأعضاء مجتمعات علم السكر وعلم الأحياء التنموي بجامعة ميسيسيبي. يتم دعم هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (R15HD108782 ، P20GM130460).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طابعة SLA ثلاثية الأبعادElegooMARS 2 PRO
Agarose قمة البحوث الحيوية. جينيسي العلمية 20-102QDيمكن استبدال أي علامة تجارية
ب Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ .برنامج تصميم مساعدات الكمبيوتر (CAD) - أكثر تقدما
مجهر مستقيم Axio-ZoomZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/برنامج التقطيع
طبق سفلي للغطاء (طبق 60 مم مع بئر قاع 30 مم)سلسلة ثقيلة من CellvisD60-30-1.5N
F59 Myosin (جميع الأشكال الإسوية السريعة)DHSBF591:50
خيوط FDMBambuPLA خيوط
FDM طابعةBambu BambuX1 Carbon FDM0.4mm فوهة الطارد
ملقطفيشر16-100-121من المحتمل أن تكون العلامات التجارية الأخرى مناسبة
للماعز المضادة للفأر Alexa 488ThermoFisher#A281751:300 التخفيف
ImarisAndor10.2Software
مقلوب مجهر متحد البؤرLeicaLeica SP8 X
التكنولوجيا الحيوية للتكنولوجيا الحيويةالذهبية ذات درجة الذوبان المنخفضةلا: A-204-25من المحتمل أن تكون العلامات التجارية الأخرى مناسبة
لمضخة الماصةBel-ArtF37898
الراتنج لطابعةSLA ElegooElegoo P05BB028راتنج بوليمر ضوئي قابل للغسل بالماء V2.0
Ricinus communis agglutinin (RCA-120)مختبرات النواقل#RLK-2200 (مجموعة الليكتين)1: 300 تخفيف
TinkerCADAutodesk Inc. https://www.tinkercad.com/برنامج تصميم مساعدات الكمبيوتر (CAD) - أساسي
Tricaine S & nbsp ؛شركة ويسترن كيميكال  ANADA # 200-226
جنين القمح agglutinin (WGA)مختبرات النواقل#RLK-2200 (مجموعة الليكتين)1:300 تخفيف
زجاج واسع التجويف ماصة باستور  دوران ويتون كيمبل (DWK)63A53WT
تخفيف كتالوج

المراجع

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة