يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بزل وريد الوجه لجمع دم الفئران

2.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/68776

⸱

سبتمبر 26, 2025

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Dartmouth Geisel School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتقنية جمع الدم المحسنة في الأشخاص الذين يخضعون للفئران من خلال بزل وريد الوجه باستخدام إبرة الوخز. نستخدم هذه التقنية جنبا إلى جنب مع تقييم قياس التدفق الخلوي لتوصيف الأنماط الظاهرية الخلوية للسلالات المعدلة وراثيا والوراثية والمراسلة. كما أنها مناسبة لتحليل السيتوكين في الدم ودراسات مرض السكري.

الملخص

تقدم هذه الورقة بروتوكولا محسنا لجمع دم الفئران عن طريق بزل وريد الوجه باستخدام إبرة الوخز ، مما يوفر بديلا سريعا وطفيف التوغل وفعالا من حيث التكلفة للتقنيات الشائعة الأخرى مثل وريد الذيل وأخذ العينات الحجاجية الرجعية. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للدراسات التي تتطلب أخذ عينات متكررة ، مثل التنميط الظاهري للفئران وتحليل السيتوكين في الدم وأبحاث مرض السكري. البروتوكول فعال ، ويتطلب الحد الأدنى من المعدات المتخصصة ، وهو مناسب تماما للتحليل الخلوي عالي الإنتاجية في الفئران. تطبيقنا الأساسي هو التنميط الظاهري للفئران المعدلة وراثيا والوراثية والمراسلة باستخدام قياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح هنا مع تلطيخ الأجسام المضادة وفئران مراسل tdTomato . توضح الورقة الإجراء الكامل ، من تحضير إلى تحليل العينات. تشمل الخطوات الرئيسية جمع الدم باستخدام إبرة 3 مم ، وتحلل الخلايا ، والتلوين ، وتحديد ملامح التدفق الخلوي. يعزز بزل الوريد الوريدي في الوجه كفاءة الجمع مع دعم ممارسات البحث الأخلاقية. هذه الطريقة العملية والقابلة للتكيف مناسبة لمجموعة واسعة من البروتوكولات التجريبية التي تتضمن أخذ عينات من دم الفئران والتحليل الخلوي.

المقدمة

يعد جمع الدم الفعال والقابل للتكرار والحد الأدنى من التوغل أمرا ضروريا للعديد من دراسات الفئران ، لا سيما تلك التي تتطلب أخذ عينات متكررة. يوفر هذا البروتوكول طريقة مبسطة لجمع كميات صغيرة من الدم باستخدام بزل وريد الوجه ، متبوعا بتحلل خلايا الدم الحمراء ، وتلوين الأجسام المضادة ، وتحليل قياس التدفق الخلوي. يعد سير العمل هذا مناسبا تماما للتطبيقات عالية الإنتاجية مع تقليل التعقيدات التقنية.

يمكن أن تتطلب العديد من طرق جمع الدم ، مثل النزيف الحججي الرجعي أو شق وريد الذيل ، إجراءات تنطوي على الحرارة والتخدير1 وأوقات المناولة الطويلة ، والتي يمكن أن تسبب ضائقة كبيرة للحيوان2. في المقابل ، يوفر بزل وريد الوجه باستخدام إبرة الوخز بديلا بسيطا وسريعا يدعم التصميم التجريبي الأخلاقي والقابل للتكرار. تم التحقق من صحة هذه الطريقة في دراسات سابقة كبديل إنساني لأخذ عينات الدم بكميات صغيرة في الفئران3.

نوضح هذه الطريقة عن طريق التنميط الظاهري للخلايا المناعية من الفئران المعدلة وراثيا والمراسلة ، بما في ذلك الفئران المراسلة TdTomato والفئران MD4-IgHEL. يتطلب هذا الأخير تلطيخها بالأجسام المضادة ضد CD19 و IgMa ، وهو نمط خيفي IgM.

بينما تم تطوير هذا البروتوكول لتنميط خلايا الدم ، يمكن تكييفه بسهولة لاستخدامات أخرى ، بما في ذلك تحليل السيتوكين في الدم ، أو اكتشاف الأجسام المضادة المحددة ، أو قياسات الجلوكوز ، عن طريق حذف خطوة تحلل خلايا الدم الحمراء. بشكل عام ، تعمل هذه التقنية على تحسين جودة البيانات والكفاءة التجريبية مع التسبب في الحد الأدنى من ضائقة ، مما يجعلها مفيدة على نطاق واسع عبر تطبيقات البحث المتنوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إيواء الفئران في بيئة محددة خالية من مسببات الأمراض في كلية دارتموث هيتشكوك الطبية ، وهي مؤسسة معتمدة من AAALAC ، واستخدمت وفقا لبروتوكول معتمد بموجب لجنة رعاية المؤسسية واستخدامها.

1. جمع المواد

  1. قم بإعداد أنابيب زراعة سعة 5 مل ، تحتوي كل منها على 1.5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC) (10X RBC Lysis المخفف بالماء المعقم). استخدم أنبوبا واحدا لكل فأرة.
  2. اجمع صندوقا من إبرة الوخز 3 مم (إبرة واحدة لكل فأر).
  3. اجمع صندوقا من إسفنج الشاش (إسفنجة شاش واحدة لكل فأر).
  4. اجمع ماصات النقل وأنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 1x HBSS مع 0.5 ملي مولار EDTA (يكفي لما يصل إلى 20 فأرا).
    ملاحظة: يستخدم هذا المخزن المؤقت لإيقاف تفاعل التحلل. إذا كانت المخزن المؤقت مطلوبة فقط للتنميط الظاهري وليس المزيد من التحليل النهائي ، فيمكن استخدام معظم المخازن المؤقتة المحايدة ذات الأس الهيدروجيني 7.2-7.4 بدلا من HBSS.
  5. أحضر دلو ثلج ، ومخزن تحلل RBC إضافي 1x ، وأنابيب إضافية سعة 5 مل ، وماصات نقل.

2. وضع العلامات على الماوس والأنبوب

  1. قم بتسمية كل بطاقة قفص وماوس بمعرف نمط ظاهري يتوافق مع التسميات الموجودة على كل أنبوب للمساعدة في تمييز النتائج المرتبطة بالماوس. تتضمن المعرفات شائعة الاستخدام ألوان علامات دائمة مختلفة (على سبيل المثال ، الأحمر والأزرق والأخضر والأسود) على ذيول الفئران ، والتي تتوافق مع العلامات الموجودة على الأنبوب.
    ملاحظة: قم دائما بتضمين ماوس تحكم للنمط الظاهري. بالنسبة للفئران المراسلة ، تأكد من وجود سيطرة سلبية على المراسل. بالنسبة للفئران المعدلة وراثيا، قم بتضمين ماوس من النوع البري كعنصر تحكم.
  2. رتب الأنابيب المصنفة في رف مع وجود دلو ثلج قريب لتخزين الأنابيب مباشرة بعد جمع الدم.
  3. افتح جميع المشارط اللازمة للإجراء.
  4. افتح جميع إسفنج الشاش اللازم للإجراء.

3. التعامل مع الماوس وجمع العينات

  1. استخدم اليد المهيمنة لإمساك الماوس من الذيل ووضعه على رف تغذية سلكي أو أي سطح مستو.
  2. استخدم إصبع السبابة والإبهام غير المهيمنين لتنظيف الماوس عن طريق المناورة من الذيل باتجاه منطقة عنق الرحم.
  3. استخدم الأصابع المتبقية لتأمين الذيل ، وتقليل حركة الماوس.
  4. استخدم اليد المهيمنة لاسترداد إبرة وخز مفتوحة مقاس 3 مم.
  5. حدد موقع البقعة الصغيرة الخالية من الشعر خلف الفم مباشرة وتتبع خطا مستقيما نحو الأذن. توقف حيث يتقاطع الخط مع الزاوية الخارجية للعين (الشكل 1).
  6. أدخل إبرة الوخز عند هذا التقاطع لضمان إمدادات دم وافرة.
  7. استخدم الحافة الجانبية المسطحة لإبرة الوخز لجمع قطرة دم واحدة.
  8. قم بإيداع إبرة الوخز بالكامل ، مع عينة الدم ، في الأنبوب المسمى الذي يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء.
  9. حرك الأنبوب برفق لضمان خلط العينة بأكملها في المخزن المؤقت. قد يتسبب الخلط غير المكتمل في تخثر وسوء جودة البيانات.
  10. استخدم إسفنجة الشاش لتطبيق ضغط لطيف على موقع الثقب لمدة 5-10 ثوان.
  11. أعد الماوس إلى قفصه.
  12. حافظ على نسبة عازلة الدم إلى التحلل أكبر من 1:10.
  13. كرر الخطوات الواردة في هذا القسم لكل ماوس إضافي.

4. تحلل العينة وإعدادها وتحليلها

  1. انتظر لمدة 7-10 دقائق بعد بدء التحلل ، أضف ما يقرب من 2 مل من 1x HBSS مع 0.5 ملي EDTA (أو وسائط أخرى).
  2. أنابيب الطرد المركزي في 400 جم لمدة 5 دقائق. تحضير كوكتيلات الأجسام المضادة خلال هذا الوقت.
  3. تخلص من الطواقي.
  4. قم بإزالة الوخز من الأنابيب باستخدام الملقط.
  5. أضف 30 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المصمم لتحديد مجموعات الخلايا المطلوبة.
    ملاحظة: للنمط الظاهري MD4 IgHEL الفئران, يتكون كوكتيل لدينا من 1 مل من HBSS, 25 ميكرولتر من IgMa PerCP cy-5.5, و 25 ميكرولتر من CD19 APC.
  6. أعد تعليق الخلايا عن طريق الدوامة لمدة 2-3 ثوان واحتضان لمدة 25-30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بتشغيل مقياس التدفق الخلوي وقم بتكوين مخططات التدفق وفقا لاحتياجات التجربة.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لتدوير الخلايا بعد التلوين إذا كان الهدف هو التنميط الظاهري.
  8. أضف 150-25 ميكرولتر من HBSS أو وسائط أخرى إلى كل عينة باستخدام ماصة نقل. إذا لزم الأمر ، يمكن إضافة DAPI بتركيز نهائي قدره 1. ميكروغرام / مل (استخدم 10 ميكرولتر من الوسائط المحتوية على DAPI).
  9. دوامة كل عينة لمدة 2-3 ثوان قبل الاستحواذ مباشرة.
  10. احصل على البيانات من 8,000-10,000 حدث / ثانية ، بهدف 100,000 خلية إذا كان التحلل فعالا.
  11. تحليل البيانات المكتسبة ، كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام قياس التدفق الخلوي ، يوضح الشكل 2 الدم المتحلل من الفئران المراسلة من النوع البري (WT) و PF4-Cre TdTomato ، المحضرة باستخدام البروتوكول الموضح أعلاه. تعرض المجموعة الأولى من مخططات التدفق التشتت الجانبي (SSC) ، والذي يعكس دقة الخلية ، مقابل التشتت الأمامي (FSC) ، مما يشير إلى حجم الخلية. لوحظ الحطام الخلوي والصفائح الدموية بالقرب من أصل المحاور ، بينما تبدو الخلايا الليمفاوية أصغر مقارنة بالعدلات الأكثر حبيبات. يشير ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر بروتوكول جمع الدم الأوريدي المحسن هذا بديلا فعالا وبسيطا للطرق الأخرى الشائعة الاستخدام ، مثل الوريد الذيل أو النزيف الحجاجي الرجعي. في حين أن البروتوكول بسيط ومباشر ، يجب اتباع بعض الخطوات الحاسمة بعناية. أهم خطوة للتنفيذ بشكل صحيح هي الموضع الصحيح لموقع الثقب4. يضمن استهداف الموقع المناسب على الخد تدفق دم كافيا مع الحد الأدنى من الضيق للفأر. يعد إيداع عينة الدم على الفور في مخزن التحلل المبرد مسبقا أمرا ضروريا أيضا ، لأن هذا يمنع التخثر ويحافظ على سلامة الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة: R35 HL155458 (CVJ.)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الجسم المضاد للفأر من نوع APC CD19الأسطورة الحيوية152410CD19 APC
الطرد المركزي 5810 R، بدون دوار، 120 فولت، 50/60 هرتزإبندورف22625501الطرد المركزي
إسفنجات الشاش من ديرماسيا 8 طبقات 2" × 2"كوفيديين441211غواز بونجز
مطارق نقل متدرجة قابلة للتخلصفيشربراند13-711-91 صباحاماصة النقل
مطبعة ErgoOne ذات القناة الواحدة (200 وميكرو؛ L)يو إس إيه ساينتيفك7100-2200بيبيتي
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (محلول 0.5 م/درجة حموضة 8.0)فيشربراندBP2482-100EDTA 5 M   
محلل خلايا FACSymphony A3بكالوريوس العلوم الحيوية660937مقياس التدفق الخلوي
فيشربراند   خلاط الدوامة التناظريةفيشربراند02-215-414الدوامة
جولدنرود أنيمال لانست 3 مم معقم 5 صواني من 200العصا الذهبيةGR 3MMلانسيت 3 مم
ملقط جريفأدوات العلوم الدقيقة11051-10الملقط
هانك' محلول الملح المتوازن، 1X بدون الكالسيوم والمغنيسيومكورنينغ21-021-CVRHBSS
PerCP/Cyanine5.5 مضاد للفئران IgMa  الأجسام المضادةالأسطورة الحيوية408612IgMa PerCP cy-5.5
مخزن تحليل RBC (10x)الأسطورة الحيوية420301مخزن تحليل RBC
أنابيب اختبار البوليسترين ذات القاع المستدير بدون غطاءفيشربراندFB1496110أنابيب الزراعة
أقلام تحديد دائمة من شاربي، رأس إزميلقلم واضح38254PPشاربيز 
تم اختباره لوجود USP في مياه معقمة  كورنينغ25-055-CIمياه بدرجة زراعة الخلايا
عبوات Tip Pipette Tip (200 وميكرو؛ L Natural Beveled)يو إس إيه ساينتيفك1111-1730أطراف البيبيت

المراجع

  1. Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
  2. Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
  3. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  4. Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
  5. Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
  6. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
  7. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  8. Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
  9. Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
  10. Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
  11. Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
  12. Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

طريقة جمع الدمأخذ العينات بأقل تدخل جراحيقياس التدفق الخلويتلوين الأجسام المضادةتحلل كريات الدم الحمراءالفئران المعدلة وراثياًتحليل الصفائح الدمويةالتنميط الظاهري الخلوي
بزل وريد الوجه لجمع دم الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.